FI121070B - Luun morfogeneettinen proteiini 6, sitä koodaava DNA, nukleotidivektori, rekombinantti isäntäsolu, farmaseuttinen koostumus ja osteogeeninen väline - Google Patents

Description

Luun morfogeneeitinen proteiini 6, sitä koodaava DNA, nukleotidivektori, re= kombinantti isäntäsolu, farmaseuttinen koostumus ja osfeogeeninen väline 5 Keksinnön alue Tämä keksintö liittyy luun muodostusta indusoiviin proteiineihin, joita kutsutaan luun morfogeneettisiksi proteiineiksi (BMP), varsinkin BMP-6-proteiiniin; nukleiini-happomolekyyleihin, jotka koodaavat mainittuja proteiineja; vektoreihin, jotka sisäl-10 tävät mainittuja nukleiinihappomolekyylejä sekä isäntäsoluihin, jotka ekspressoivat mainittua proteiinia. Tämä keksintö liittyy myös näiden luun morfogeneettisten proteiinien käyttöön hoidettaessa häiriöitä, kuten häiriöitä, jotka liittyvät luun ja ruston muodostukseen. Tämä keksintö lisäksi liittyy osteogeenisiin välineisiin ja farmaseuttisiin koostumuksiin, jotka sisältävät kyseisiä proteiineja.

15

Keksinnön tausta

Lancroix havaitsi vuonna 1945 luun muodostukseen liittyvän ilmiön, kun hän osoitti, että hapan alkoholi-luuekstrakti indusoi heterotrooppisen luun muodostuksen 20 ektooppisissa paikoissa. Kaksikymmentä vuotta myöhemmin Urist työtovereineen dekalsifioi luumatriksin ja kun tätä implantoitiin lihakseen, hän huomasi implantoin-tikohtaan muodostuvan uutta rustoa ja luuta. Nämä havainnot johtivat luuta indusoivan aineen, joka nimettiin BMP:ksi, eristämiseen ja puhdistamiseen eri eläinlajien luumatriksista ja vuosia myöhemmin näiden uusien proteiinien cDNA:n kloona-25 ukseen ja karakterisointiin. BMP:n biologista aktiivisuutta on määritetty bioanalyy-ry sillä, joissa BMP implantoidaan rotan tai hiiren lihastaskuun, tai nisäkässoluviljel- y ; missä, joissa mitataan alkaalista fosfataasia (ALP).

Aikaisemmat tutkimukset vuodesta 1965 alkaen ovat osoittaneet, että BMP:t kuu-30 luvat TGF^-superperheeseen, ja kuten muillakin tämän geeniperheen jäsenillä, niillä on moninaisia vaikutuksia solun liikkuvuuteen, kasvuun ja erilaistumiseen, varsinkin luun muodostuksen ja kudosten korjausprosessien aikana, mutta myös , - embryogeneesiin ja syöpiin. Ne ovat molekyylikooltaan pieniä, hydrofobisia giyko- proteiineja, jotka liukenevat kaotrooppisiin aineisiin, kuten ureaan ja guanidiinihyd-35 rokloridiin mutta ovat resistantteja useiden proteaasien, kuten kollagenaasien, vaikutukselle.

2 BMP:t tuotetaan suurina prekursorimolekyyleinä, jotka prosessoidaan proteolyytti-sesti kypsiksi peptideiksi translaation jälkeen. Kuten muutkin TGF-p-superperheen jäsenet, BMP:t sisältävät seitsemän kysteiinitähteen jonon kypsässä C-terminaalisessa osassa. Kypsissä BMP-monomeereissä näiden kysteiinien välissä 5 on kolme disulfidisidosta ja yksi disulfidisidos, joka yhdistää kaksi monomeeriä, jolloin syntyy biologisesti aktiivinen dimeeri.

BMP:n vaikutus välittyy kohdesolujen solukalvolla sijaitsevien spesifisten resepto-reiden kautta. BlVIP-reseptorit ovat seriini-treoniini-kinaaseja, jotka ovat samankal-10 täisiä TGF-p-reseptoreiden kanssa ja ne jaetaan kahteen alaryhmään: tyypin I ja tyypin II reseptoreihin. BMP:t kykenevät sitoutumaan tiukasti ainoastaan sellaiseen reseptoriin, joka muodostaa heterotetrameerisen kompleksin. Tällaisen kompleksin muodostuminen on edellytys sille, että tapahtuu BMP:n signaalin siirtyminen (signal transduction). Kohdesolun sisällä BMP-signaalit siirretään tumaan käyttäen 15 spesifisiä signaalin siirtoon erikoistuneita molekyylejä nimeltään Smadit, jotka kykenevät myös vaimentamaan BMP-signaaleja.

Tähän mennessä on karakterisoitu 16 erilaista BMP-molekyyliä, joista seitsemän (BMP:t 2-7 ja 9) on osoitettu kykenevän indusoimaan luun muodostuksen kun ne 20 on implantoitu ektooppisiin kohtiin. Kypsän osan aminohapposekvenssin perusteella BMP:t jaetaan kahteen alaryhmään. BMP:t 2 ja 4 ovat 86 % identtisiä keskenään ja BMP:t 5, 6 ja 7 ovat 78 % identtisiä. Näiden kahden alaryhmän välinen identtisyys on vain noin 56 %. BMP-3:n aminohapposekvenssi on noin 45 % samankaltainen kuin BMP-2:n ja BMP-4:n sekvenssi ja BMP-9 on 50-55 % identtinen * 25 BMP:iden 2, 4, 5, 6 ja 7:n kanssa. Johtuen suuresta homologiasta ja vähäisestä eroavuudesta molekyylien koossa, BMPdden erottaminen toisistaan, puhdistaminen ja identifioiminen proteiinitasolla on melko vaikeaa, aikaa vievää ja kallista. Tästä syystä nykyään useimmat BMP:t tuotetaan käyttäen hyväksi molekyylibiologian menetelmiä. Erilaisia rekombinanttiproteiinitekniikoita on kokeiltu ja sekä eu-30 karyootti- että prokaryoottisysteemejä on käytetty.

Suurin osa tutkimuksesta on kohdistunut ihmisen rekombinantti-BMP:hen, mutta mielenkiintoisen tutkimusalueen muodostaa myös Ce/v/dae-heimo, koska niissä tapahtuu tehokas luun induktio sarvissa. Sarvet ovat luuta sisältäviä kallon raken-35 nelmia, jotka ovat tyypillisiä Ce/v/dae-heimolle, ja jotka eroavat Bovidaen sarvista kasvutapansa vuoksi. Sarvet kasvavat sarven kärjestä ja urokset pudottavat ne kerran vuodessa. On väitetty, että sarvet ovat nisäkkäiden keskuudessa nopeimmin kasvavat rakennelmat ja näiden rakenteiden tiedetään olevan ainoita, jotka 3 uusiutuvat täydellisesti joka vuosi. Sarvien muodostuessa tapahtuu tietynlainen endokondraalinen ossifikaatio, jossa prosessi etenee runsaan verisuoniston omaavan ruston kautta, joka kalsifioituessaan muodostuu lopulta luuksi. Sarvet muodostavat mielenkiintoisen mallin mineralisoituvan kudoksen regeneraatiosta täysikas-5 vuisessa eläimessä ja luun uusiutuminen jatkuu siihen saakka kunnes sarvet pudotetaan. Vaikka sarvien hämmästyttävän kasvunopeuden perimmäistä syytä ei ole selvitetty, sarvissa tiedetään olevan useita BMP-proteiineja. Hirvieläimen sarvien on osoitettu tuottavan BMP-2:ta ja BMP-4:ää (Feng et ai. 1997 Biochim Biophys Acta 1350:47-52; Feng et ai. 1995 Biochim Biophys Acta 1263:163-168). Lisäksi 10 poron sarvissa ekspressoidaan BMP-3b-proteiinia (Kapanen et ai. 2002 J Biomed Mat Res 59:78-83). Kuitenkin, on myös mahdollista, että sarvissa on yksi tai useampi tuntematon tekijä/tekijöitä, joka saa aikaan sarven nopean kasvun.

Osteoinduktiivisen ominaisuutensa vuoksi sekä BMP:t, jotka on uutettu deminerali-15 soidusta luumatriksista että BMP:t, jotka on tuotettu käyttäen rekombinanttitekniik-kaa, ovat hyvin mielenkiintoisia ja erittäin potentiaalisia vaihtoehtoja luusiirrännäi-sille. Erilaisia BMP-proteiineja on käytetty useissa kokeellisissa ja kliinisissä tutkimuksissa.

20 Luun morfogeneettinen proteiini 6 on eristetty eri lähteistä käsittäen eräät nisäkäslajit kuten hiiri, rotta, ihminen ja nauta. Kuitenkaan sitä ei ole karakterisoitu hir-vieläimistä, päinvastoin kuin BMP-2, BMP-3b ja BMP-4, jotka kaikki on kloonattu /*, joko peuran tai poron sarvista, jotka molemmat kuuluvat Cerv/dae-heimoon (Feng et ai. 1997; Feng et ai. 1995; Kapanen et ai. 2002). Ottaen huomioon, että BMP-6 25 on tärkeä kondrogeneesin säätelijä, on todennäköistä, että sitä ekspressoidaan sarvissa kuten ekspressoidaan muitakin BMP-geeniperheen jäseniä, jotka on jo kloonattu.

Tähän mennessä BMP-3b on ainoa BMP, joka on karakterisoitu poron sarvikudok-30 sesta (Kapanen et ai. 2002).

US 5399677 esittää DNA-molekyylejä, jotka koodaavat luun morfogeneettisten proteiinien mutanttimuotoja. BMP:n mutanttimuotoja voidaan tuottaa bakteereissa ja laskostaa biologisesti aktiiviseen muotoon joko BMP:n homodimeeriksi tai hete-35 rodimeeriksi. Menetelmä, jolla kyseinen mutantti BMP tehdään, on myös esitetty. Kyseiset mutanttimuodot ovat hyödyllisiä, koska bakteeri-isännässä tuotettuna ne ovat laskostuneet virheettömästi.

4 WO 98/51354 esittää osteogeenisiä välineitä ja niiden käyttömenetelmiä luu- ja rustovikojen korjaamiseksi. Menetelmä uuden luun kasvattamiseksi vaurioituneeseen luun kohtaan nisäkkäällä sisältää vaiheen, jossa kalsiumfosfaattimatriksi, joka sisältää ainakin yhtä osteogeenistä proteiinia, implantoidaan vauriokohtaan. Kysei-5 set osteogeeniset proteiinit käsittävät useita morfogeenejä, kuten luun morfoge-neettisiä proteiineja.

US 6207 813 esittää puhdistetun ihmisen BMP-6-proteiinin ja prosesseja sen tuottamiseksi. Julkaisu myös esittää yleisesti tunnettuja farmaseuttisia koostumuksia, 10 lääkinnällisiä käyttöjä ja menetelmiä, joissa käytettiin kyseistä ihmisen BMP-6-proteiinia. BMP-6 on paikallistettu hypertrofiseen rustoon ja se on tärkeä säätelijä kondrosyyttien maturaatioprosessissa. Kun CHO-soluja, jotka yliekspressoivat hiiren BMP-6-proteiinia, laitettiin suoraan atymisten karvattomien hiirten ihonalaiseen kudokseen, niille muodostui kasvaimia, joita ympäröi laaja sidekudosalue, joka si-15 sälsi suuren määrän rustoa ja luuta. Tämä viittaa siihen, että BMP-6 indusoi endo-kondraalisen luun muodostumisen in vivo. BMP-6:n on myös osoitettu lisäävän pluripotenttien mesenkymaalisten kantasolujen osteoblastista differentaatiota in vitro tapauksissa, joissa solut on transfektoitu vektorilla, joka yliekspressoi hiiren BMP-6-proteiinia. Lisäksi rekombinantin ihmisen BMP-6:n on osoitettu osallistuvan 20 luuytimen strooman solujen osteoblastiseen differentaatioon in vitro. CHO-soluissa tuotetun rekombinantin ihmisen BMP-6:n osteoinduktiivinen aktiivisuus on toden-r% nettu rotan lihaksen in vivo -testillä. Kaikesta huolimatta, mistä tahansa lähteestä peräisin olevan rekombinantin BMP-6:n, joka on tuotettu E. coli systeemissä, bio-> logista aktiivisuutta ei ole julkaistu. Kukaan ei myöskään ole julkaissut tietoja sei- ’ 25 laisen BMP-6-proteiinin biologisesta aktiivisuudesta, joka on kloonattu minkä ta-I , hansa Cervidae-heimoon kuuluvan eläimen sarvikudoksesta.

EP 1131087 esittää morfogeneettisten proteiinien, kuten BMP:n, lisäkäytön. On osoitettu, että syöpäsolujen joutuminen kosketuksiin morfogeenien kanssa inhiboi V 30 syöpäsolujen kasvua ja saa aikaan niiden erilaistumisen pois syöpäsolun fenotyypistä. Morfogeenien käyttö voi vaikuttaa syöpäsolujen solukohtaloon ja osaltaan lieventää syövän oireita. BMP-6 kuuluu esitettyihin edullisiin morfogeeneihin.

Vaikka joidenkin BMP-proteiinien käyttösovelluksia luun ja ruston muodostuksen ' : 35 indusoijina, samoin kuin syövän oireiden lievittämisessä, tunnetaan, tarvetta on kuitenkin saada vieläkin parempia menetelmiä näiden proteiinien eristämiseksi ja varsinkin parempien morfogeneettisten proteiinien saamiseksi, esimerkiksi sellaisten, jotka toimivat tehokkaammin luun indusoijina tai ovat liukoisempia kuin aikai 5 semmin. Sellaisilla proteiineilla olisi käyttöä paremmissa terapeuttisissa menetelmissä ja sovelluksissa.

Keksinnön yhteenveto 5

Yllättäen tämän keksinnön uudella BMP-6-proteiinilla, joka on eristetty porosta, ja jolla on suuri homologia sekvenssin suhteen verrattuna muihin jo tunnettuihin luun morfogeneettisiin proteiineihin, on erittäin hyödyllisiä ominaisuuksia, jotka liittyvät luun ja ruston muodostukseen. Kyseiset ominaisuudet ovat huomattavasti parem-10 pia kuin jo tunnetuilla BMP-proteiineilla. Kyseiset, tämän keksinnön mukaiset luun morfogeneettiset proteiinit ja niiden homologit ovat hyödyllisiä luun ja ruston in-dusoijina useanlaisissa sovelluksissa, kuten terapeuttisissa sovelluksissa. Eristetty luun morfogeneettinen proteiini voi myös sisältää proteiinin propeptidi-osan. Tämän osan mukanaolo voi stabiloida BMP;tä ja muuntaa sen toiminnallista aktiivi-15 suutta.

Lisäksi tämän keksinnön BMP-6-proteiinin cDNA:ta lyhennettiin, aiheuttamatta muutoksia proteiinin sekvenssiin, ja tuotettaessa sitä rekombinanttiproteiinina isän-täsolusysteemissä, saatiin mahdollisimman korkea ekspressiotaso. Hepariinin si-20 toutumiskohta (HBS) lisättiin rdBMP-6 geenin eteen ja tämä lisäys mahdollisti ekspression myös E co//TOPI 0 soluissa, joissa ekspressio oli estynyt pelkällä (ilman HBS) rdBMP-6:llä.

Esillä oleva keksintö tarjoaa eristetyn luun morfogeneettisen proteiinin 6 (BMP-6), 25 joka sisältää konsensussekvenssin P-G/S/N-R/K-R/H-R/K-Q/N-Q-A/S/N-R-N/S-77 R/A/K-S/A-T/S/N-P ja aminoterminaalisessa päässään hepariinia sitovan kohdan, 77 joka sisältää aminohapposekvenssin AKHKQRKRGT.

Toinen tämän keksinnön näkökulma liittyy mainittuun eristettyyn luun morfogeneet-30 tiseen proteiiniin, joka sisältää BMP-propeptidin.

Eräs tämän keksinnön näkökulma liittyy eristettyyn DNA-molekyyliin, joka koodaa mainittua morfogeneettistä proteiinia.

35 Vielä lisäksi tämän keksinnön eräs näkökulma liittyy nukleiinihappovektoriin, joka J sisältää mainitun eristetyn DNA-molekyylin.

6

Vielä lisäksi tämän keksinnön eräs näkökulma liittyy rekombinantti-isäntäsoluun, joka sisältää mainitun DNA-molekyylin tai edellä mainitun nukleiinihappovektorin.

Vielä lisäksi tämän keksinnön eräs näkökulma liittyy luun morfogeneettiseen prote-5 iiniin, jota on tuotettu kasvattamalla kyseistä isäntäsolua siten, että se ekspressoi mainittua luun morfogeneettistä proteiinia ja mainittu luun morfogeneettinen proteiini on otettu talteen mainitusta isäntäsolusta.

Vielä lisäksi tämän keksinnön eräs näkökohta liittyy rekombinantti-isäntäsoluun, 10 joka ekspressoi mainittua luun morfogeneettistä proteiinia.

Vielä lisäksi tämän keksinnön eräs näkökohta liittyy farmaseuttiseen koostumukseen, joka sisältää mainitun luun morfogeneettisen proteiinin.

15 Vielä lisäksi tämän keksinnön eräs näkökohta liittyy mainittuun, eristettyyn luun morfogeneettiseen proteiiniin käytettäväksi lääkeaineena.

Vielä lisäksi tämän keksinnön eräs näkökohta liittyy mainitun, eristetyn luun morfogeneettisen proteiinin käyttöön valmistettaessa lääkeainetta, jota voidaan käyttää 20 luuhun ja rustoon liittyviin häiriöihin, joissa regeneraatio, vaurion korjaaminen tai kasvu on toivottavaa, tai muihin tauteihin, kuten syöpiin.

Vielä lisäksi tämän keksinnön eräs näkökohta liittyy osteögeeniseen välineeseen, jolla hoidetaan mainittuja häiriöitä, joka väline sisältää kyseisen luun morfogeneet-;V,' 25 tisen proteiinin.

; Vielä lisäksi tämän keksinnön eräs näkökohta liittyy menetelmään, jolla ruston ja/tai luun muodostusta indusoidaan käsittelemällä mainittua rustoa ja/tai luuta mainitulla eristetyllä luun morfogeneettisella proteiinilla.

30

Vielä lisäksi tämän keksinnön eräs näkökohta liittyy menetelmään, jolla hoidetaan kyseisiä luuhun ja rustoon liittyviä häiriöitä, joissa regeneraatio, vaurion korjaaminen tai kasvu on toivottavaa, tai muita sairauksia, kuten syöpiä, antamalla mainittua eristettyä luun morfogeneettistä proteiinia potilaalle, joka kärsii mainitusta häiri-35 östä.

7

Kuvien lyhyt yhteenveto

Kuva 1 esittää plasmideja, jotka sisältävät useita eri inserttejä PCR- vektorissa pGEM-T® (Promega).

5

Kuva 2 esittää plasmideja, jotka sisältävät useita eri inserttejä ekspressiovek-torissa pTrchis2A (Invitrogen).

Kuva 3 esittää plasmideja, jotka sisältävät useita eri inserttejä ekspressiovek-10 torissa pET-22b(+) (Novagen).

Kuva 4 esittää plasmidin, joka sisältää insertin ekspressiovektorissa pl- VEX2.4C (Roche) RTS500 -systeemissä.

15 Kuva5 esittää pMU20~ ja pMU90-plasmideissa tuotetun poron BMP-6- proteiinin kypsän osan aminohappo- ja nukleotidisekvenssit. Kypsä osa poron BMP-6-proteiinista on reunustettu, mutatoidut nukleotidikodonit on osoitettu harmailla laatikoilla ja muutetut nukleotidit on merkitty lihavoiduilla kirjaimilla. Kysteii-nit, jotka ovat tyypillisiä TGF-p-geeniperheelle, on myös merkitty lihavoituina.

20

Kuva 6 esittää pTrcHBSrd6A- ja pTrcHBSrdö-plasmideissa tuotetun poron BMP-6-proteiinin kypsän osan ja hepariinin sitoutumiskohdan (HBS) aminohappoja nukleotidisekvenssit. Hepariinin sitoutumiskohta on merkitty kursiivilla ja lihavoitu. Kypsä osa poron BMP-6-proteiinista on reunustettu, mutatoidut nukleotidikodo-25 nit on merkitty harmailla laatikoilla ja muutetut nukleotidit on merkitty lihavoituina. Kysteiinit, jotka ovat tyypillisiä TGF-p-geeniperheelle, on myös merkitty lihavoituina.

Kuva 7 esittää pETrd6A- ja pETrd6-plasmideissa tuotetun poron BMP-6-30 proteiinin kypsän osan aminohappo- ja nukleotidisekvenssit. Kypsä osa poron BMP-6-proteiinista on reunustettu, mutatoidut nukleotidikodonit on merkitty harmailla laatikoilla ja muutetut nukleotidit on merkitty lihavoiduilla kirjaimilla. Kysteiinit, jotka ovat tyypillisiä TGF^-geeniperheelle, on merkitty lihavoituina.

35 Kuva 8 esittää pTrcETrd6A-ja pTrcETrd6-plasmideissa tuotetun poron BMP-6-proteiinin kypsän osan ja hepariinin sitoutumiskohdan (HBS) aminohappo- ja nukleotidisekvenssit. Hepariinin sitoutumiskohta on merkitty kursiivilla ja lihavoitu. Kypsä osa poron BMP-6-proteiinista on reunustettu, mutatoidut nukleotidikodonit 8 on merkitty harmailla laatikoilla ja muutetut nukleotidit on merkitty lihavoiduilla kirjaimilla. Kysteiinit, jotka ovat tyypillisiä TGF-p-geeniperheelle, on myös merkitty lihavoituina.

5 Kuva 9 esittää pMU200-plasmidissa tuotetun poron BMP-6 rekombinanttipro-teiinin kypsän osan aminohappo- ja nukleotidisekvenssit. Kypsä osa poron BMP-6-proteiinista on reunustettu. Kysteiinit, jotka ovat tyypillisiä TGF-β geeniperheelle, on myös merkitty lihavoituina.

10 Kuvat 10A ja B (jatkuu) esittävät osan poron BMP-6:n aminohappo-ja nukleotidi-sekvenssistä. Kypsä osa on reunustettu ja kysteiinit, jotka ovat tyypillisiä TGF-β-geeniperheelle, on merkitty lihavoiduilla kirjaimilla. Aminohapot 1-118 ennen kypsää osaa edustavat BMP-propeptidiä.

15 Kuva 11 esittää Coomassie Blue -väriaineella värjättyä SDS-PAGE-geeliä, jossa on puhdistamisen aikana kerättyjä fraktioita A) rdBMP-6-proteiinista ja B) rdBMP-6-proteiinista, joka sisältää hepariinin sitoutumiskohdan. Vyöhykkeet edustavat 1) lähtömateriaali; 2) standardi; 3) pylvään läpi kulkenut materiaali; 4) ensimmäinen pesu; 5) toinen pesu; 6) eluutio 1; 7) eluutio 2; 8) eluutio 3; ja 9) eluutio 20 4 (rd-BMP-6-HBS).

Kuva 12 esittää röntgenkuvia hiiren takajalan lihaksista. A) istutettu implantti, joka sisältää ihmisen BMP-6-proteiinia (verrokki) ja B) istutettu implantti, joka sisältää tämän keksinnön BMP-6-proteiinia.

25

Keksinnön yksityiskohtainen kuvaus

Aikaisemmin tunnettujen BMP-6-proteiinien kypsien osien keskinäinen homologia on korkein hiiren ja rotan välillä (98 %) ja rotan ja ihmisen välillä (98 %) (taulukko ’ 30 1). Poron BMP-6:n kypsän osan kloonaus ja karakterisointi osoittivat, että sillä on korkein homologia naudan BMP-6:n kanssa (Wozney et a/.1998). Aminohappota-; : solia vain yksi aminohappo oli erilainen verrattaessa näitä kahta polypeptidiä toi- siinsa ja homologia ylsi 99 %:iin (taulukko 1). Jopa nukleiinihappotasollakin homo logia poron ja naudan BMP-6 kypsien osien välillä oli 95 %, mikä on yhtä korkea 35 kuin hiiren ja rotan välillä (taulukko 1). Yleisesti ottaen BMP-6:lla on homologiaa myös muiden BMP-tyyppien kanssa, kuten esimerkiksi BMP-5:n ja BMP-7:n kanssa.

9

Alkuperä Poro Nauta Ihminen Hiiri Rotta nt ah nt ah nt ah nt ah nt ah

Poro 100 100 95 99 84 95 84 93 84 95

Nauta__95 99 100 100 84 94 85 92 85 92

Ihminen 84 95 84 94 100 100 88 96 88 98

Hiiri__84 93 85 92 88 96 100 100 95 98

Rotta I 84 I 95 l 85 l 94 I 88 | 98 I 95 I 98 Ϊ00 j 100

Taulukko 1 Eri nisäkkäistä peräisin olevien BMP-6 kypsien osien homologia nukleotidi- ja aminohappotasolla esitettynä prosentteina (%) (nt = nukleotidit; ah = 5 aminohapot)

Alla oleva linjaus esittää ihmisen ja poron BMP-6-proteiinin kypsien osan aminohapposekvenssit (vertailu tehty käyttäen ClustalX 1.8 -ohjelmaa (Thompson, J.D., Higgins, D.G. and Gibson, T.J. (1994) Nucleic Acids Research, 22: 4673-4680), 10 rdBMP-6 = poron BMP-6, hBMP-6 = ihmisen BMP-6, tähti osoittaa identtiset aminohapot). Kypsien osien aminohapposekvenssit eroavat toisistaan aminoterminaa-lisen pään alueella seitsemän aminohapon suhteen. Keskeisimmät eroavuudet aiheutuvat todennäköisesti rdBMP-6-proteiinin proliineista, Pro3 ja erityisesti Pro16, jotka todennäköisesti vaikuttavat kypsän proteiinin laskostumiseen tai ra-15 kenteeseen. Poron BMP-6:n lähin vastine on ihmisen BMP-6, jonka aktiivisuus on määritetty.

I rdBMP-6 SAPGRRRQQARNRSTPAQDVSRASSASDYNSSELKTACRKHELYVSFQDLGWQDWIIAPK

; hBMP-6 SASSRRRQQSRNRSTQSQDVARVSSASDYNSSELKTACRKHELYVSFQDLGWQDWIIAPK

20 ** *****.***** ;***.* ******* ******************** **********

rdBMP-6 GYAANYCDGECSFPLNAHMNATNHAIVQTLVHLMNPEYVPKPCCAPTKLNAISVLYFDDN

hBMP-6 GYAANYCDGECSFPLNAHMNATNHAIVQTLVHLMNPEYVPKPCCAPTKLNAISVLYFDDN

k'k-k'ic-ic-k^'k'k'k-k-fi'k-k-k^e-k'k-A--k -k-fr-k-k-k-k^k-k-fc-k-k-k-k-k-if-k-k-k-k-k k-k'ik’k’k’kifir 0': 25

:,,,; rdBMP-6 SNVILKKYRNMVVRACGCH

hBMP-6 SNVILKKYRNMVVRACGCH

j ******************* 30 ’’Keksinnön BMP-6-proteiini” tai ’’keksinnön luun morfogeneettinen proteiini” viittaa-vat proteiiniin, jolla on luun morfogeneettistä aktiivisuutta (tai morfogeenistä, joita molempia sanoja voidaan käyttää synonyymeinä), kuten porosta eristetyllä BMP-6-proteiinilla, joka on kuvattu tässä asiakirjassa (SEQ ID NO:1 oheisessa sekvenssi- 10 listauksessa tai rdBMP-6 yllä olevassa linjauksessa), ja sisältää sen homologit, analogit, johdannaiset ja fragmentit. Määritelmä viittaa myös edellä oleviin modifikaatioihin, kuten BMP:hen, joka sisältää spesifisen funktionaalisen sekvenssin, esimerkiksi hepariinin sitoutumiskohdan, propeptidin tai vastaavan. Sellaiset homo-5 logit tai johdannaiset sisältävät kyseessä olevan proteiinin toiminnalliset johdannaiset, kuten proteiinit, jotka ovat peräisin alkuperäisestä BMP-6-proteiinista tai minkä tahansa muun lajin mistä tahansa muusta BMP:stä. Johdannaiset voivat erota pituutensa suhteen ja ne voivat sisältää aminohappolisäyksiä, poistoja tai substituutioita, kuten alan ammattilaiset hyvin tietävät. Tunnusomaisena piirteenä tämän 10 keksinnön luun morfogeneettiselle proteiinille, esimerkiksi kuten on esitetty edellä olevassa linjauksessa, ovat ne aminohapot, jotka ovat erilaisia kuin muissa tunnetuissa BMP-6-proteiineissa, kuten ne aminohapot, jotka ovat erilaisia ihmisen vastineen kanssa, erityisesti Pro3 ja Pro16. Todennäköisesti alueet, joissa nämä aminohapot sijaitsevat, ovat konservoituneita tämän keksinnön luun morfogeneettises-15 sa proteiinissa. Nämä voivat olla SEQ ID NO: 1 :n tai sen homologin aminohapot 3-23, tai edullisemmin aminohapot 3-16. Aminohapot 3 ja 16 ovat proliineja, joilla on voimakas vaikutus kypsän proteiinin laskostumiseen ja siten myös proteiinin toimintaan. Aminohapot 3 ja 23 määrittävät alueen, jossa sijaitsevat ne aminohapot, jotka ovat erilaisia verrattuna ihmisen BMP-6-vastineeseen.

20

Toisaalta, lisäykset, poistot ja substituutiot, jotka sijaitsevat kaukana mainitusta tunnusomaisesta alueesta, eivät todennäköisesti aiheuta oleellista muutosta keksinnön BMP-proteiinin toimintaan, tehoon tai laskostumiseen. Esimerkiksi homologit, joissa on poistoja, kuten muutaman aminohapon poisto, edullisesti 1-10 ami-\ 25 nohappoa, edullisemmin 1-5 aminohappoa, edullisimmin 1-3 aminohappoa, joko »"V karboksyyli- tai aminoterminaalisessa päässä, jolloin polypeptidi on kooltaan lyhy- ” , empi, ovat tämän keksinnön suojapiirissä kunhan kyseiset poistot eivät vaikuta keksinnön BMP-proteiinin tunnusomaisiin aminohappoihin. On edullista, että kyseessä olevilla homologeilla on alkuperäisen poron BMP-4-proteiinin hyödyllisiä 30 ominaisuuksia, jotka liittyvät mainittuihin tunnusomaisiin aminohappoihin Pro6 ja/tai Pro21 ja/tai niiden ympärillä olevaan alueeseen. Mainituissa homologeissa voi olla aminohapposubstituutioita, joilla ei ole olennaisesti vaikutusta mainitun proteiinin toimintaan ja tehoon. Esimerkiksi aminohappo, joka ei sijaitse aktiivisessa kohdassa tai sen läheisyydessä, voidaan korvata toisella, jolla on samankaltainen rakenne 35 ja/tai kemialliset ominaisuudet (esimerkiksi hydrofobisuus tai hydrofiilisyys), tämä tarkoittaa konservatiivista aminohapon vaihtoa, niin kauan kuin kyseessä oleva substituutio ei olennaisesti muuta kypsän proteiinin toimintaa tai laskostumista. Tällaisia substituutioita tunnetaan ja ymmärretään hyvin alalla. Esimerkkinä näistä 11 aminohappojen ominaisuuksista eri ryhmiin jaettuina ovat hydrofobiset (Met, Ala, Vai, Leu, lie), neutraalit hydrofiiliset (Cys, Ser, Thr), happamat (Asp, Glu), emäksiset (Asn, Gin, His, Lys, Arg), aminohapot, jotka vaikuttavat ketjun orientaatioon (Gly, Pro) ja aromaattiset (Trp, Tyr, Phe) aminohapot. Substituutiot kyseessä ole-5 vien ryhmien sisällä eivät todennäköisesti saa aikaan merkittäviä muutoksia poly-peptidiketjun tukirangan rakenteeseen (esimerkiksi laskos tai helikaalinen konfor-maatio), varaukseen tai molekyylin hydrofobisuuteen tai sivuketjujen kokoon.

Tämän keksinnön BMP-homologit käsittävät esimerkiksi minkä tahansa luun mor-10 fogeneettisen proteiinin, joka sisältää tai se on modifioitu siten, että se sisältää ainakin osan konservoituneista aminohapoista tai sekvenssistä, kuten edellä on esitetty tai vastaavan alueen homologisessa BMP-proteiinissa, jossa numerointi on erilainen. Myös mikä tahansa tällä hetkellä tuntematon BMP-6-proteiini, mistä tahansa lajista, joka on modifioitu, kuten edellä on esitetty, on tämän keksinnön suo-15 japiirissä.

Verrattuna tunnettuun ihmisen BMP-6-proteiiniin, poron BMP-6-proteiinissa on seitsemän substituoitua aminohappoa P3, G4, A10, P16, A17, S21 ja A23, jotka on määritelty SEQ ID N:0 1:ssä esitetystä kypsästä BMP-6-proteiinista. Nämä amino-20 hapot ovat tunnusomaisia tämän keksinnön BMP:lle. Vielä spesifisemmin, P3 ja/tai P16 ovat erityisen tunnusomaisia tämän keksinnön BMP:lle.

Tämän keksinnön eräässä toteutusmuodossa BMP on mikä tahansa BMP tai sen homologi, johdannainen tai fragmentti, joka sisältää kahden proliinin välissä olevan ‘ 25 konsensussekvenssin: P-G/S/N-R/K-R/H-R/K-Q/N-Q-A/S/N-R-N/S-R/A/K-S/A- T/S/N-P. Tämä konsensussekvenssi on määritetty eri lajien useiden samankaltaisti'/ ten BMP-6-, BMP-5-ja BMP-7-proteiinien sekvenssien linjauksien perusteella, ku ten on esitetty allaolevassa ClustalX linjauksessa. Kyseinen konsensussekvenssi vastaa aminohappoja 3-16 SEQ ID NO: 1:ssä. Eräässä keksinnön toteutusmuo-30 dossa keksinnön BMP on mikä tahansa BMP tai sen homologi, johdannainen, tai fragmentti, joka sisältää vastaavan konsensussekvenssin, joka on määritetty BMP-6 perheen mukaan: P-G/S-R-R-R-Q-Q-A/S-R-N-R/A-S-T-P. Myös muita konsen-sussekvenssejä voidaan määritellä, esimerkiksi sellainen, jossa määritellään alue, joka on toisen proliinin ympärillä (Pro16 SEQ ID N:0 1:ssä), kuten R-N/S-R/A/K-35 S/A-T/S/N-P-A-Q-D-V, tai samankaltainen sekvenssi, joka eroaa pituuden suhteen, esimerkiksi 1-5 aminohappoa. Vastaavia konsensussekvenssejä voidaan määrittää alla olevasta linjauksesta tai vastaavista linjauksista, jotka on tehty linjaamalla erilaisia läheistä sukua olevia BMP-proteiineja. Linjatut BMP-6-, BMP-5-, ja BMP-7- 12 sekvenssit ovat porosta, naudasta, rotasta, hiirestä, ihmisestä, kanasta ja afrikkalaisesta kynsisammakosta (Xenopus laevis).

BMP6_REINDEER SAPGRRRQQARNRSTPAQDVSRASSASDYNSSELKTACRKHELYVSFQDLGWQDWIIAPK

5 BMP6_B0VINE SAPGRRRQQARNASTPAQDVSRASSASDYNSSELKTACRKHELYVSFQDLGWQDWIIAPK

BMP6_RAT SASSRRRQQSRNRSTQSQDVSRGSSASDYNSSELKTACKKHELYVSFQDLGWQDWIIAPK

BMP6JVIOUSE SASSRRRQQSRNRSTQSQDVSRGSGSSDYNGSELKTACKKHELYVSFQDLGWQDWIIAPK

BMP6_H0MAN SASSRRRQQSRNRSTQSQDVARVSSASDYNSSELKTACRKHELYVSFQDLGWQDWIIAPK

BMP5_H0MAN -AANKRKNQNRNKSSSHQDSSRMSSVGDYNTSEQKQACKKHELYVSFRDLGWQDWIIAPE

10 BMP5_CHICKEN AANNKRKNQNRNKSSSHQESSRMPSVGDYNTSEQKQACKKHELYVSFRDLGWQDWIIAPE

BMP5_M00SE -AASKRKNQNRNKSNSHQDPSRMPSAGDYNTSEQKQACKKHELYVSFRDLGWQDWIIAPE

BMP7_XENOPUS SAGGKHRNQNRSKAPKSQEALRVSNIAENSSTDQKQACKKHELYVSFKDLGWQDWIIAPE ' k ·»«·}>r k · k · -k · ·· k kk· kk kkkkkk »kkkkkkkkkkk·

15 BMP6_REINDEER GYAANYCDGECSFPLNAHMNATNHAIVQTLVHLMNPEYVPKPCCAPTKLNAISVLYFDDN

BMP 6_B0VINE GYAANYCDGECSFPLNAHMNATNHAIVQTLVHLMNPEYVPKPCCAPTKLNAISVLYFDDN

BMP6_RÄT GYAANYCDGECSFPLNAHMNÄTNHAIVQTLVHLMNPEYVPKPCCAPTKLNAISVLYFDDN

BMP6_MOUSE GYAANYCDGECSFPLNAHMNATNHAIVQTLVHLMNPEYVPKPCCAPTKLNAISVLYFDDN

BMP6_HÖMAN GYAANYCDGECSFPLNAHMNÄTNHAIVQTLVHLMNPEYVPKPCCAPTKLNAISVLYFDDN

20 BMP5_HUMAN GYAAFYCDGECSFPLNAHMNATNHAIVQTLVHLMFPDHVPKPCCAPTKLNAISVLYFDDS

BMP5_CHICKEN GYAAFYCDGECSFPLNAHMNATNHAIVQTLVHLMFPDHVPKPCCAPTKLNAISVLYFDDS

j' . , BMP5_MOUSE GYAAFYCDGECS FPLNAHMNATNHAIVQTLVHLMFPDHVPKPCCAPTKLNAISVLYFDDS

BMP7_XENOPUS GYAAFYCEGECAFPLNSYMNATNHAIVQTLVHFINPDTVPKPCCAPTQLNPISVLYFDDS

k k k k kk»kkk^kkkk»*kkkkkkkkkkkkkk·· k · kkkkkkkkk·kk k k k k k k k k 25

5 . BMP6_REINDEER SNVILKKYRNMVVRÄCGC H

BMP6_BOVINE SN VILKK YRNMVVRACGCII

BMP6_RAT SNVILKKYRNMVVRACGCH

BMP6_MOUSE SNVILKKYRNMVVRACGCH

30 BMP6_HOMAN SNVILKKYRNMVVRACGCH

BMP5__H0MAN SNVILKKYRNMVVRSCGCH

’ BMP5__CHICKEN SNVILKKYRNMVVRSCGCH

, : ; BMP5J40USE SNVILKKYRNMVVRSCGCH

BMP7_XENOPUS SNVILKKYRNMVVRACGCH

35 k k kk-k k kk k k k kk k * kkk k

Eräässä keksinnön toteutusmuodossa kyseessä oleva BMP on mikä tahansa BMP, sen homologi tai fragmentti, joka käsittää SEQ ID NO: 1:n aminohapot 3-16.

13

Kyseisien aminohappojen paikkanumerot on laskettu minkä tahansa yleisen BMP-6-proteiinin kypsän osan, kuten SEQ ID NO:1:ssä esitetyn proteiinin tai sen homologin, johdannaisen tai fragmentin, aminoterminaalisesta päästä lukien, joissa ami-noterminaalinen sekvenssi alkaa aminohapoilla SA, kuten esimerkiksi porolla (kat-5 so yllä oleva sekvenssilinjaus tai SEQ ID NO: 1), tai vastaavalta alueelta. Jos kyseisen homologin aminohapposekvenssissä on numerointiin vaikuttavia lisäyksiä tai poistoja, tämä pitää ottaa huomioon kun määritellään mainittujen olennaisten aminohappojen paikkoja, esimerkiksi linjaamalla sekvenssit, kuten on kerrottu, ja sen jälkeen määrittämällä kyseisten aminohappojen paikat. Kuitenkin minkä tahan-10 sa kyseessä olevista BMP-6-proteiinin homologeista, johdannaisista tai fragmenteista pitäisi olennaisilta osiltaan pitää sisällään sellainen toiminta ja tehokkuus, joka on tässä esitetty. Koska kuitenkin kaikki tunnetut BMP-6-proteiinit ovat hyvin konservoituneita, kyseisten olennaisten aminohappojen paikan määritys on yksiselitteinen, kuten ihmisen BMP-6:n tapauksessa. Kyseiset paikat voidaan myös hel-15 posti määrittää muista BMP-proteiineista (katso edellä olevaa linjausta). Yleensä näiden homologia-aste aminohappotasolla voi olla ainakin 70 %, edullisesti 80 %, edullisemmin 90 % ja edullisimmin 93 %.

Eräässä keksinnön toteutusmuodossa BMP on mikä tahansa BMP tai sen homolo-20 gi, johdannainen tai fragmentti, joka sisältää SEQ ID NO: 1:n aminohapot 3-23. Eräässä keksinnön toteutusmuodossa BMP on BMP-6-proteiini. Vielä eräässä keksinnön toteutusmuodossa BMP on BMP tai sen homologi, johdannainen tai fragmentti, joka sisältää SEQ ID NO: 1:n aminohapposekvenssin. Homologien, johdannaisten, tai fragmenttien, jotka mainitaan näissä toteutusmuodoissa, pitäisi 25 sisältää ainakin yksi tunnusomainen aminohappo, joka on kuvattu edellä. Kyseessä oleviin homologeihin, johdannaisiin tai fragmentteihin eivät sisälly tunnetut BMP-6-proteiinit sellaisenaan, kuten hBMP-6, koska ne eivät sisällä aminohappoja, jotka ovat luonteenomaisia tämän keksinnön BMP-proteiinille. Kuitenkin, jos jo tunnettu BMP modifioidaan siten, että se sisältää ainakin yhden kyseessä olevan tun-30 nusomaisen aminohapon, sitä voidaan pitää tällaisena homologina, johdannaisena tai fragmenttina.

Lisäksi edellä kuvattu BMP sisältää hepariinia sitovan kohdan (HBS). Yleisesti ottaen tämä on aminohapposekvenssi, joka kykenee sitomaan hepariinia. Kyseinen 35 hepariinin sitoutumiskohta sijaitsee mainitun BMP:n aminoterminaalisessa päässä, kuten ennen SEQ ID NO:1:n sekvenssiä tai sen funktionaalista homologia. Eräässä keksinnön toteutusmuodossa hepariinin sitoutumiskohta sisältää aminohapposekvenssin AKHKQRKRGT (kuva 8) tai QAKHKQRKRGT (kuva 6). Mainittu he- 14 pariinin sitoutumiskohta voi myös olla sen toiminnallinen homologi, johdannainen tai fragmentti.

Eräässä keksinnön toteutusmuodossa yllä kuvattu BMP sisältää SEQ ID NO: 2:ssa 5 esitetyn propeptidin tai sen funktionaalisen homologin, johdannaisen tai fragmentin. Kyseisellä propeptidillä on rooli BMP-proteiinin kontrolloinnissa ja proteiinin oikeanlaisessa laskostumisessa. Samankaltaisia propeptidejä tunnetaan alalla (katso Regulation of bone morphogenetic protein activity by pro domains and proprotein convertases. Constam DB, Robertson EJ. J Cell Biol. 1999 Jan 11; 10 144(1):139-49). BMP-propeptidi tai sen homologi voidaan liittää BMP-proteiinin aminoterminaaliseen päähän, kuten BMP-6-proteiiniin, jossa propeptidi mahdollistaa kypsän proteiinin laskostumisen. Sittemmin propeptidi voidaan katkaista pois.

Eräs tämän keksinnön toteutusmuoto tarjoaa nukleiinihappomolekyylin, kuten 15 DNA- tai RNA-molekyylin, joka koodaa mainittua tämän keksinnön BMP:tä, joko hepariinin sitoutumiskohdan tai propeptidin kanssa tai ilman. Johtuen geneettisen koodin degeneratiivisuudesta on olemassa useita erilaisia nukleiinihapposekvens-sejä, jotka koodaavat keksinnön BMP:tä, kyseistä hepariinia sitovaa kohtaa tai propeptidiä. Kaikki sellaiset nukleiinihappovariantit ovat tämän keksinnön suojapii-20 rissa. Edullisesti kyseinen nukleiinihappomolekyyli on DNA-molekyyli. Ei-rajoittavia esimerkkejä kyseisistä DNA-sekvensseistä on esitetty kuvissa 5-10.

Eräs tämän keksinnön toteutusmuoto tarjoaa replikoituvan vektorin, joka sisältää edellä kuvatun nukleiinihappomolekyylin, yhdistettynä toiminnallisesti sellaiseen 25 sekvenssiin, joka kontrolloi sen ekspressiota. Tällaisia vektoreita voidaan käyttää tuottamaan keksinnön mukaisia BMP-rekombinanttiproteiineja sopivassa isän-täsysteemissä.

Nukleiinihappo, joka koodaa tämän keksinnön BMP:tä, voidaan liittää kyseiseen 30 replikoituvaan vektoriin kloonausta tai ekspressiota varten. Useita vektoreita on yleisesti saatavilla. Vektori voi olla esimerkiksi plasmidin, kosmidin, viruspartikkelin tai faagin muodossa. Tarkoituksenmukainen nukleiinihapposekvenssi voidaan liittää vektoriin käyttäen useaa eri menettelytapaa. Yleensä, DNA liitetään sopivaan restriktioendonukleaasin katkaisukohtaan käyttäen alalla hyvin tunnettuja mene-35 telmiä. Vektorin rakenneosana voi olla esimerkiksi yksi tai useampi signaalise-kvenssi, replikaation alkamiskohta, yksi tai useampi markkerigeeni, enhancer-elementti, promoottori ja transkription lopettamissekvenssi. Rakennettaessa tällaisia sopivia vektoreita, jotka sisältävät yhden tai useamman näistä komponenteista, 15 käytetään hyväksi normaaleja ligaatiotekniikoita, jotka alan ammattilainen tuntee hyvin.

Yleensä kyseinen BMP voidaan tuottaa geeniteknologisesti ekspressoimalla sitä 5 missä tahansa sopivassa isäntäsolussa, kuten bakteerisolussa. Tällaiset menetelmät ovat alalla hyvin tunnettuja ja niistä löytyy tietoa kirjallisuudesta. Oleellista on, että proteiini laskostuu oikeanlaiseen muotoon ekspression aikana ja että se sisältää kaikki tarpeelliset post-translationaaliset modifikaatiot.

10 Ei ole aina mahdollista tuottaa ja puhdistaa tiettyjä proteiineja asianmukaisesti, esimerkiksi liukoisuuteen ja uudelleenlaskostumiseen liittyvistä ongelmista johtuen. Yleensä E. coli ei voi tehdä post-translationaalisia modifikaatioita, jotka ovat tyypillisiä nisäkässolusysteemeille. Kuitenkin tämän keksinnön tekijät ovat tuottaneet poron BMP-6-proteiinin kypsän osan rekombinanttiproteiinina E. colissa ja puhdis-15 tamisen ja uudelleen laskostumisen jälkeen osoittaneet sen olevan biologisesti aktiivisessa muodossa.

Eräs tämän keksinnön toteutusmuoto tarjoaa isäntäsolun, joka sisältää nukleotidi-molekyylin tai nukleotidivektorin, joka on kuvattu edellä. Käyttökelpoisia soluja ovat 20 kaikki prokaryoottiset ja eukaryoottiset solut, jotka kykenevät ekspressoimaan tämän keksinnön proteiinia. Tällaiset isäntäsolut ovat hyvin tunnettuja alalla ja alan ammattilainen voi helposti valita sopivan isäntäsolun. Eräs toteutusmuoto tarjoaa BMP:n, joka on tuotettu kasvattamalla mainittuja soluja siten, että ne ekspressoivat kyseistä proteiinia ja ottamalla talteen mainittu tuotettu proteiini kyseisestä isän-* 25 täsolusta. Mitä tahansa käyttökelpoista menetelmää voidaan käyttää proteiinin tal- teenottamiseen ja puhdistamiseen ja sellaiset menetelmät ovat alalla hyvin tunnettuja.

Tämän keksinnön BMP:tä voidaan käyttää hoidettaessa häiriöitä, jotka kohdistuvat 30 luun, ruston, jänteen tai hampaiden vikoihin tai sairauksiin tai muuhun vastaavaan, jossa niiden uudistuminen, korjaaminen tai kasvu on toivottavaa, tai myös muihin sairauksiin. Tämän keksinnön proteiinia voidaan käyttää myös haavojen parantamiseen, kuten palovammoihin, leikkaushaavoihin ja mahahaavoihin ja vastaaviin kudosten korjauksiin ja myös syövän hoitoon, kuten on esitetty julkaisussa 35 EP1131087. Koska BMP-proteiinilta yleisesti puuttuu lajispesifisyys, potilas, joka kärsii kyseisestä viasta, voi olla mikä tahansa soveltuva eläin, edullisesti nisäkäs, kuten ihminen, ja hoidossa käytettävä BMP-proteiini voi olla alkuperältään mistä tahansa sopivasta lähteestä peräisin. Samankaltaisten BMP-proteiinien käyttö mo- 16 nissa terapeuttisissa sovelluksissa tunnetaan alalla hyvin (katso esimerkiksi US 6245889 ja WO 98/51354).

’’Häiriöt, jotka liittyvät luun, ruston, jänteen tai hampaiden vikoihin” tässä käytettynä 5 viittaa yleisesti mihin tahansa vaivaan, jossa luun, ruston, jänteen tai hampaiden paraneminen tai uudelleen rakentaminen, ts. regeneraatio, on toivottavaa. Ei-rajoittavia esimerkkejä hoitotoimenpiteistä, jotka kohdistuvat luun, ruston, jänteen tai hampaiden häiriöihin tai sairauksiin tai vastaaviin, ovat luun ja hammaskudok-sen regeneraatio, korjaaminen ja kasvu; luun regeneraatio, korjaaminen ja kasvu 10 nisäkkäillä, kuten ihmisellä; hoitotoimenpiteet luun muodostuksessa tai regeneraa-tiossa tapahtuneiden poikkeavuuksien korjaamiseksi; haavan paraneminen, ek~ tooppinen luun indusointi ja segmentaalisten luuvaurioiden parantaminen selkärankaisilla; hoitotoimenpiteet luurangan häiriöiden ja epämuodostumien korjaamiseksi; suurten luuvaurioiden korjaaminen, jotka johtuvat traumasta, kasvainten 15 poistamisesta tai synnynnäisistä epämuodostumista, implantoidun sisäisen proteesin vuoksi vähentyneiden luuvarastojen rekonstruointi korjausoperaatioissa tai luunmurtumien hidastunut paraneminen tai yhteen liittymättömät luunmurtumat; luun ja ruston vikojen korjaaminen, kuten ’’critical size defectit”, "non-critical size defectit", yhteen liittymättömät murtumat, segmentaaliset yhteen liittymättömät 20 murtumat; akuutit murtumat, rustoviat, luu-rusto defektit, rustonalaisen luun viat, paikallinen luun ja ruston muodostus; viat, jotka johtuvat rappeuttavista sairauksis-; . . ta; hampaisiin liittyvät sovellukset, joissa korjataan hammaskudosta, alveolaarista luuta, hammassementtiä, hampaanjuuren membraania, täytetään hampaan juuri-kanavan sisältöä, hammasimplantin kiinnityksen kehittäminen ja parantaminen, ä 25 Lisää esimerkkejä näistä häiriöistä löytyy julkaisusta Ann Rheum Dis, Volume 62, 2003, 73-78: Reddy AH: Cartilage morphogenic proteins: role in joint development, homeostasis and regeneration.

Muita sairauksia, joissa tämän keksinnön BMP on hyödyllinen, ovat esimerkiksi 30 syöpä, fibromyalgia, psoriasis ja muut dermatologiset häiriöt, ja reumaattiset häiriöt ja vastaavat. Esimerkkejä tällaisista syövistä ja menetelmistä ja koostumuksista, joilla niitä hoidetaan, on esitetty julkaisussa EP1131087.

Eräs keksinnön toteutusmuoto tarjoaa BMP:n, kuten BMP-6, käytettäväksi missä tahansa tässä kuvatussa sovelluksessa yhdessä yhden tai useamman muun mor-35 fogeneettisen proteiinin kanssa, kuten toisen BMP-tyypin tai vastaavan kanssa. Yleensä tällä saavutetaan synergiaetuja, kuten alalla tiedetään. Esimerkkeinä muista sopivista BMP-proteiineista ovat, mutta eivät ole rajoittuneet vain näihin, BMP-1, BMP-2, BMP-3, BMP-4, BMP-5, jokin muu BMP-6, BMP-7 ja BMP-8. Myös 17 muita terapeuttisesti hyödyllisiä aineita voidaan käyttää, kuten epidermaalista kasvutekijää, fibroplastista kasvutekijää ja tranformoivaa kasvutekijää (US 6 245 889). Eräässä keksinnön toteutusmuodossa kyseessä oleva täydentävä morfogeneetti-nen proteiini on peräisin porosta, kuten jokin muu poron BMP-proteiini. Eräässä 5 keksinnön toteutusmuodossa BMP tarjotaan käytettäväksi dimeerinä, homodimee-rinä tai heterodimeerinä yhdessä toisen BMP-proteiinin kanssa, kuten on kuvattu edellä. Vielä eräässä toteutusmuodossa BMP tarjotaan käytettäväksi dimeerimuo-dossa tai yhdessä jonkin muun tekijän tai proteiinin kanssa, kuten on kuvattu edellä, lääkeaineen valmistukseen, jolla lääkitään häiriöitä, joita on kuvattu selitysosas-10 sa.

Eräs keksinnön toteutusmuoto tarjoaa käyttöön osteogeenisen välineen, kuten implantin, joka sisältää tämän keksinnön BMP:tä. Osteogeeninen väline voi sisältää bioyhteensopivan matriksin, kuten kalsiumfosfaatti-, karboksimetyyliselluloosa-, 15 kollageenimatriksin tai näiden yhdistelmiä. Eräässä toteutusmuodossa kyseinen kalsiumfosfaattimatriksi on hydroksiapatiittimatriksi. Kyseinen matriksi voi mahdollistaa BMP-proteiinin hitaan vapautumisen ja/tai sopivan ympäristön BMP-proteiinin luovuttamiselle. Osteogeeninen väline saattaa myös sisältää metallisen implantin, jota mainittu bioyhteensopiva matriksi ympäröi. Eräs esimerkki kyseises-20 tä metallista on titaani. Joitakin esimerkkejä tällaisista osteogeenisistä välineistä on esitetty julkaisussa WO 98/51354.

Ei-rajoittavia esimerkkejä erilaisista tukimateriaaleista, kantajista tai tuista, joiden avulla muodostetaan esimerkiksi erilaisia osteogeenisiä välineitä tai vastaavia, 25 joissa on tämän keksinnön proteiinia, ovat ilmiasultaan seuraavissa erilaisissa muodoissa: pulveri, pesusienimäinen, liuska, kalvo, geeli, verkko tai liuos tai suspensio; puolikiinteä liuosmainen kantaja, jota voidaan käyttää lihaksensisäisiin, suonensisäisiin, luuytimensisäisiin tai nivelensisäisiin injektioihin; eristetyt mesen-kymaaliset kantasolut, mikä tahansa farmaseuttisesti hyväksyttävä kuljetin; jauhe-30 tut auto-ja allograftit, mikä tahansa farmaseuttisesti hyväksyttävä matriksi, materiaali, joka on valittu ryhmästä, joka käsittää hydroksiapatiitin, kollageenin, polymeerejä (esimerkiksi polymaitohappo- ja polyglykolihappo-polymeerit), synteettiset polymeerit, hyaluronihappo, α-BSM, kalsiumfosfaatti, trikalsiumfosfaatti, ei-huokoinen keraaminen biopolymeeri, ei-huokoinen resorboituva biopolymeeri, koralli, de-35 mineralisoitunut luu, biolasi, mikä tahansa biohajoava materiaali ja näiden yhdistelmät; sitoutumiseen käytetyt aineet, jotka on valittu seuraavasta ryhmästä: man-nitoli, dekstraanit, valkovaseliini, alkyyli- ja metyyliselluloosat, kostuttavat aineet kuten natriumsuolat, fobriiniliima, nisäkäsperäinen fibrinogeeni ja trombiini ja näi- 18 den yhdistelmät ja sekoitukset. Osteogeeninen väline voi olla esimerkiksi rakenteellisesti stabiili, kolmiulotteinen implantti, joka on muodoltaan kuutio, sylinteri tai blokki tai anatomisesti muotoiltu tai injektoitavassa muodossa. Esimerkkejä osteo-geenisistä välineistä, hyödyllisistä materiaaleista ja tekniikoista on tuotu esiin kir-5 jassa Skeletal reconstruction and bioimplantation (T. Sam Lindholm, 1997, Sprin-ger-Verlag, Heidelberg, Germany).

Eräs keksinnön toteutusmuoto tarjoaa farmaseuttisen koostumuksen, joka sisältää terapeuttisesti tehokkaan määrän tämän keksinnön BMP:tä farmaseuttisesti sopi-10 vassa kuljettimessa tai kantajassa. Kyseisiä farmaseuttisia koostumuksia voidaan käyttää sellaisten häiriöiden hoitamiseen, jotka liittyvät luun, ruston, jänteen tai hampaiden vaurioihin tai muihin sairauksiin, haavoihin ja muihin kudosvaurioihin tai mihin tahansa häiriöihin, joita on kuvattu tässä tekstissä.

15 Eräs keksinnön toteutusmuoto tarjoaa menetelmän, jolla voidaan indusoida luun, ruston, jänteen, hampaiden tai vastaavien muodostuminen, jossa kyseistä luuta, rustoa, jännettä, hammasta tai vastaavaa käsitellään tämän keksinnön BMP:llä tai sen yhdistelmillä kuten on kuvattu edellä, in vitro tai in vivo. Vielä eräs keksinnön toteutusmuoto tarjoaa menetelmän, jolla hoidetaan niitä häiriöitä, joita on kuvattu 20 selityksessä, käsittäen eristetyn keksinnönmukaisen BMP:n antamisen potilaalle, joka kärsii kyseisistä häiriöistä. Kyseistä BMP:tä voidaan antaa farmaseuttisena koostumuksena tai osteogeenisenä välineenä, kuten on kuvattu edellä. Täydentäviä morfogeneettisiä proteiineja tai muita hyödyllisiä aineita voidaan antaa yhdessä kyseessä olevan tämän keksinnön BMP:n kanssa, kuten on kuvattu edellä, lisää-25 mään terapeuttista vaikutusta.

’ Seuraavassa selvityksessä ja esimerkeissä kuvataan sitä, miten poron rekombi- nantti-BMP-6:n kypsä osa hepariinia sitovan kohdan (HBS) kanssa tai ilman sitä, kuten on esitetty tämän keksinnön eräissä toteutusmuodoissa, tuotetaan E. colis-30 sa. Puhdistamisen ja laskostamisen jälkeen osteoinduktiivinen aktiivisuus varmistettiin bioanalyysillä hiiren takajalan lihastaskussa. Tämä in vivo -bioanalyysi on ollut BMP:n aktiivisuuden määrityksen standardimenetelmä jo proteiinin keksimisestä lähtien. Se käsittää BMP:n implantoimisen hiiren takajalan lihakseen ja heterotrooppisen uuden luun indusoitumisen arvioinnin radiologisesti ja histologisesti 35 10-21 päivän kuluttua implantaatiosta.

BMP:n aktiivisuuden määrityksessä kuva-analyysi tehdään lähettämällä röntgensäde luun lävitse, jolloin se nähdään filmillä röntgenpositiivisena tummentumana 19 verrattaessa sitä pehmytkudokseen. Tämä mahdollistaa vastamuodostuneen luun radiograaffisen havaitsemisen ja radiomorfometrisen kvantitaation, joka on saatu aikaan implantoimalia BMP:tä tai muuta luuta indusoivaa ainetta heterotooppiseen tai ortotooppiseen paikkaan.

5

Osteoinduktiivisuus havaittiin kaikissa kolmessa tutkitussa ryhmässä (1 mg, 3 mg, ja 5 mg rekombinanttia poron BMP-6-proteiinia) ja vaste kohosi annosta lisättäessä (taulukko 2). Verrattaessa poron BMP-6 rekombinanttiproteiinia ihmisen vastaavaan, poron BMP-6 oli tehokkaampi luun muodostuksen indusoija, joten se on po-10 tentiaalinen aine kliinisiin sovelluksiin.

Annos__1 mg 3 mg 5 mg

Poron BMP-6__-__(+) -__k____(+) +__++ + ~

Poron BMP-6-HBS ---+++ (+) - (+) +(+) + +(+)

Ihmisen BMP-6__+ - - (+) - (+) (+) - +__(+)

Naudan BMP-6........k - (+) + 15 Taulukko 2. Poron ja ihmisen BMP-6-proteiinien osteoinduktiivisen vasteen vertailu eri annoksilla (k= lopetettu).

In vivo -bioanalyysin tulokset on esitetty kuvassa 12. Kuva 12A on verrokki, jossa implanttina on käytetty ihmisen BMP-6:tta ja 12B on implantti, joka sisältää tämän 20 keksinnön BMP-6-proteiinia. Bioanalyysi toteutettiin kuten on esitetty julkaisussa Marshall R. Urist, J.J. Chang, A. Lietze, Y.K. Huo, A.G. Brownell and J.DeLange (1987): Preparation and Bioassay of Bone Morphogenetic Protein and Polypeptide Fragments, Methods Enzymol 146: 294-312.

25 Aluksi rekombinantin rdBMP-6:n kypsän Osan ekspressointi E. colissa tuotti suuria vaikeuksia. Jopa mutaatioilla, jotka tehtiin tiettyihin kodoneihin, jotta rdBMP-6 ko~ donikäyttö muistuttaisi E. colin kodonikäyttöä, ei ollut parantavaa vaikutusta eks-pressiotasoon. Tämän vuoksi tutkijat olettivat, että huono ekspressoitavuus johtuisi rdBMP-6:n kypsän osan N-terminaalisen alueen korkeasta GC-pitoisuudesta. Kos-30 ka hepariinia sitova kohta (HBS) on poron BMP-2 kypsän osan alussa ja sen GC-pitoisuus on matala, tehtiin konstrukti, jossa HBS sijoitettiin rdBMP-6:n kypsän 20 osan alkuun ja tällä tavalla keksijät kykenivät parantamaan rekombinatti-rdBMP-6:n ekspressiotasoa.

HBS, joka sijaitsee rdBMP-2:n N-terminaalisessa osassa, sisältää 10 emäksistä 5 aminohappoa ja muistuttaa tunnettuja tai esitettyjä muiden kasvutekijöiden heparii-nia sitovia kohtia. Näiden kohtien otaksutaan olevan tärkeitä proteiinien säilyvyyden ja stabiilisuuden kannalta ja ne voivat suoraan edistää proteiinien biologista aktiivisuutta. On myös mahdollista, että kehityksen aikana HBS sisältävän proteiinin vuorovaikutuksella ekstrasellulaarisen matriksin kanssa saattaisi olla tärkeä 10 merkitys morfogeneettisen gradientin luomisessa, jolla rajoitetaan proteiinin vapaata diffuntoitumista. Siksi otaksuttiin, että HBS kykenisi myös parantamaan rekom-binantin rdBMP-6:n biologista aktiivisuutta pidentämällä aikaa ennen kuin proteiini häviää implantaatiokohdasta, mikä myös osoitettiin bioanalyysilla.

15 Esimerkit

Esimerkki 1: Poron BIWIP-6 cDNAm kloonaaminen ja sekvensointi 3’» päästä A. RNA eristäminen 20

Kolmivuotiaan urosporon sarvet leikattiin irti ja jäädytettiin nestetypessä välittömästi teurastuksen jälkeen. Jäätyneet sarvet leikattiin 0,5 cm:n palasiksi ja säilytettiin -70 °C:ssa. Poron sarven mRNA eristettiin käyttäen QuickPrep® Micro mRNA Purification Kit -pakkausta (Pharmacia Biotech). Osa poron sarven kappaleesta pilkot-25 tiin pieniksi palasiksi (noin 1 mm3) ja 0,1 g tätä kudosta lisättiin 0,6 mi:aan Extracti-on-puskuria, joka sisälsi guanidiinitiosyanaattia ja N-lauroyylisarkosiinia. Kudosta homogenisoitiin jäissä Ultra Turraksilla kolme kertaa 10 sekuntia ja jäähdytettiin homogenisointikertojen välillä. 1,2 ml Elution-puskuria lisättiin ja suspensiota homogenisoitiin vielä yhden kerran 10 sekunnin ajan. Lopputuloksena oli tasainen 30 suspensio.

Poron sarven homogenaatti ja Oligo(dT)-selluloosa sentrifugoitiin täydellä nopeudella [14,000 rpm, huoneenlämmössä, Centrifuge 5415 C (Eppendorf)) yhden minuutin ajan. Oligo(dT)-selluloosasakan päällä oleva puskuri poistettiin ja kirkas ku-35 doshomogenaatti pipetoitiin sen tilalle. Putkea käänneltiin ylösalaisin, jotta Oli-go(dT)-selluloosa saataisiin suspensioksi. Suspensiota sekoitettiin varovasti viiden minuutin ajan ja sentrifugoitiin täydellä nopeudella [14,000 rpm, huoneenlämmös- 21 sä, Centrifuge 5415 C (Eppendorf)] kymmenen sekunnin ajan. Supernatantti heitettiin pois.

Oligo(dT)-selluioosa suspensoitiin uudelleen High-Salt Buffer -puskuriin [10 mM 5 Tris-HCI (pH 7,5), 1 mM EDTA, 0,5 M NaCI] ja suspensio sentrifugoitiin täydellä nopeudella [14,000 rpm, huoneenlämmössä, Centrifuge 5415 C (Eppendorf)] kymmenen sekunnin ajan. Pesut High-Salt Buffer -puskurilla toistettiin viisi kertaa ja lisäksi kaksi kertaa Low Salt Buffer -puskurilla [10 mM Tris-HCI (pH 7,5), 1 mM EDTA, 0,1 M NaCI], Kolme ml Low Salt Buffer -puskuria lisättiin ja suspensio siir-10 rettiin MicroSpin-pylvääseen. MicroSpin-pylväs laitettiin Eppendorf-putkeen ja sentrifugoitiin täydellä nopeudella viiden sekunnin ajan. Pylvään Oligo(dT)-selluloosa huuhdeltiin kolme kertaa Low Salt Buffer -puskurilla.

Poron sarven mRNA eluoitiin MicroSpin-pylväästä puhtaaseen Eppendorf-putkeen 15 lisäämällä pylvääseen 0,2 ml 65 °C Elution Buffer -puskuria (QuickPrep® Micro mRNA Purification Kit, Pharmacia Biotech) ja sentrifugoimalla täydellä nopeudella [14,000 rpm, huoneenlämmössä, Centrifuge 5415 C (Eppendorf)] viiden sekunnin ajan. Eluutiovaihe toistettiin kaksi kertaa. Eristetty mRNA saostettiin lisäämällä jokaiseen eluanttiin 5 pl glykogeeniliuosta (5-10 mg/ml DEPC-käsitellyssä H20:ssa), 20 1/10 tilavuutta K-asetaattiliuosta (2,5 M kaliumasetaatti, pH 5,0) ja 0,5 ml absoluut tista etanolia (jäähdytettynä -20 °C:seen). Saostumisen annettiin tapahtua -20 °C:ssa ainakin 30 minuuttia ja mRNA sentrifugoitiin täydellä nopeudella [14,000 rpm, 4 °C:ssa, Centrifuge 5415 C (Eppendorf)] viiden minuutin ajan. Saostettu mRNA säilytettiin -70 °C:ssa niin kauan kunnes cDNA:n synteesi suoritettiin.

25 B. cDNA:n synteesi

Poron sarven mRNA:n käänteistranskriptio suoritettiin modifioiden Time Saver™ cDNA Synthesis Kit -pakkauksen (Pharmacia Biotech) ohjeita. 3 pg mRNA:ta läm-30 pödenaturoitiin 65 °C:ssa kymmenen minuutin ajan ja jäähdytettiin jäissä. 0,2 pmol DTT, 0,5 pg Oligo(dT)i2-i8-aluketta ja lämpödenaturoitu mRNA lisättiin First Strand ...... -reaktioseokseen, joka sisälsi seuraavia: FPLCpure™ Cloned Murine Reverse

Transcriptase, RNAguard™, RNase/DNase-Free BSA, dNTPs (dATP, dCTP, dGTP ja dTTP) vesipohjaisessa puskurissa (Time Saver™ cDNA Synthesis Kit, / 35 Pharmacia Biotech). Sekoitettua liuosta inkuboitiin 37 °C:ssa yhden tunnin ajan.

Inkubaation jälkeen First Strand -reaktioseos lisättiin Second Strand -reaktioseokseen, joka sisälsi E. colin RNasi H:ta ja E. colin DNA-polymeraasi l:tä ja dNTP:t vesipohjaisessa puskurissa (Time Saver™ cDNA Synthesis Kit, Phar- 22 mada Biotech). Liuosta sekoitettiin varovasti ja inkuboitiin huoneen lämpötilassa 30 minuuttia. Syntetisoitu cDNA säilytettiin +4 °C:ssa.

C. Poron sarven cDNA.n kartoittaminen 5

Osa poron BMP-6:n cDNA:ta monistettiin PCR-tekniikalla (Polymerase chain reaction) käyttäen alukkeita (5’-CGG(C)ATCTACAAGGACTGTGTT(G)G(A)TGGG -3’) ja (3’-GTCCGG(A)GCC(T)TGTGCCTGCCACTAA-5’) (taulukko 3), jotka oli suunniteltu jo tunnettujen eri nisäkäslajien (ihminen, rotta ja hiiri) BMP-6-geenien homo-10 logiaan perustuen. PCR-reaktioseos (50 pl) sisälsi 100 ng poron sarvesta valmistettua cDNA:ta, 40 pmoi kutakin aluketta, 0,4 mM dNTP:tä (PCR Core Kit, Roche) ja 0,7 U/μΙ Expand High Fidelity -entsyymiseosta (lämpöstabiili Taq polymeraasi + oikolukeva polymeraasi, Roche) Expand High Fidelity -puskurissa, joka sisälsi MgCta (Expand High Fidelity PCR System, Roche). Reaktio suoritettiin käyttäen 15 Mastercycler personal apparatus -laitetta (Eppendorf) seuraavan ohjelman mukaisesti: alkudenaturaatio 94 °C 4 minuuttia, ja seuraavat 25 sykliä: denaturaatio 94 °C, 1 minuutti, alukkeiden liittäminen 55 °C 1 minuutti, DNA ketjujen pidentäminen 72 °C 2 minuuttia. Loppuekstensio suoritettiin 72 °C:ssa 10 minuuttia.

23

Kloonauksessa käytetyt alukkeet _

Osa poron BMP-6:n cDNA:ta_______

5’-> 3’ CGG(C)ATCTACAAGGACTGTGTT(G)G(A)TGGG 3’—> 5’ GTCCGG(A)GCC(T)TGTGCCTGCCACTAA

Poron BMP-6:n kypsä osa_________

pTrcHis2A 5’-> 3’ GGATCCGTCGGCCCCCGGGCGGCGCCGGCAG

3’-> 5’ AAGCTTGTGGCAGCCACAGGCCCGGACGAC PIVEX2.4 5’—»· 3’ CCGCGGCTCGGCCCCCGGGCGGCGCCGGCAG

3’—» 5’ GGATCCTAGTGGCAGCCACAGGCCC pTrcHBS 5’—> 3’ GGTACCTCGGCCCCCGGGCGGCGCCGGCAG

_ 3’—>· 5’ AAGCTT GT GGCAGCCACAGGCCCGGACGAC

Poron BMP-6:n mutatoitu kypsä osa__________

pTrcHis2A 5'-* 3' GGATCCGTCGGCCCCGGGGCGCCGCCGCCAG

3’—> 5’ AAGCTT GT GGCAGCCGCAGGCGCGGACGAC pTrcHBS 5’—> 3’ GGTACCTCGGCCCCGGGGCGCCGCCGCCAG

3’-» 5’ AAGCTTGTGGCAGCCGCAGGCGCGGACGAC

;· Q

• Taulukko 3. Alukkeet, joita on käytetty poron BMP-6:n normaalin ja mutatoidun ; kypsän osan kloonaamisessa 5 D. Kloonaaminen pGEM-T®-vektoriin PCR-tuote puhdistettiin käyttäen Wizard® PCR Preps DNA Purification System -pakkausta (Promega) ja ligatoitiin pGEM-T®-vektoriin (kuva 1) käyttäen T4 DNA-10 ligaasia (pGEM-T® Vector System I; Promega). 0,3 pg puhdistettua PCR-tuotetta ja 2,3 pg/ml pGEM-T®-vektoria lisättiin ligaatiopuskuriin, joka sisälsi 18 mM Tris-HCI (pH 7,8), 6 mM MgCfe, 6 mM DTT, 0,3 mM ATP, 3 % polyetyleeniglykolia ja 0,14 U/μΙ T4 DNA ligaasia kokonaistilavuuden ollessa 66 μΙ. Reaktion annettiin tapahtua +16 °C:ssa vesihauteessa, joka viileni yön aikana +4 °C:ksi. Syntynyttä, uutta 15 plasmidia kutsuttiin nimellä pMSU1 (kuva 1).

24 E. Kompetenttien Escherichia coli TOP 10 F' -solujen valmistaminen

Kompetentit Escherichia coli TOP 10 F' -solut valmistettiin kalsiumklori-di/magnesiumkloridi-meneteimällä. 2 ml LB-kasvatuslientä inokuloitiin E. Coli TOP 5 10 F' -soluilla ja kasvatettiin yön yli 37 °C:ssa ravistellen (225 rpm). Seuraavana aamuna 100 ml: iin tuoretta LB-kasvatuslientä lisättiin 1 ml yli yön kasvatettua kasvustoa ja sitä kasvatettiin ravistellen (225 rpm) 37 °C:ssa niin kauan kunnes ODeoo > = 0,5-0,6. Kasvatetut solut kerättiin sentrifugoimalia (2,500 x g, 5 minuuttia), sus-pendoitiin 10 ml:aan 0,1 M MgCh-liuosta ja kerättiin uudelleen sentrifugoimalia 10 (2,500 x g, 5 minuuttia). MgCI2-käsittelyn jälkeen solut suspendoitiin 10 ml:aan 0,1 M CaCI2-liuosta, inkuboitiin jäähauteessa 30 minuuttia ja kerättiin taas sentrifugoi-malla (2,500 x g, 5 minuuttia). CaCh-käsittely toistettiin, muuttaen sitä kuitenkin niin, että toisella kerralla käytettiin 3,5 ml CaCI2-liuosta ja inkuboimalla soluja yhden tunnin ajan. Suspensioon lisättiin glyserolia (lopullinen konsentraatio 14 % 15 (v/v)) ja suspensio jaettiin 200 pl:n eriin. Kompetentit E. coli TOP 10 F' -solut pa kastettiin nestetyppeen ja säilytettiin -70 °C:ssa.

F. Kompetenttien Escherichia coli TOP 10 F' -solujen transformointi ja sellaisten kloonien valitseminen, jotka sisältävät poron BMP-6:n.

20

Kompetentit Escherichia coli TOP 10 F' -solut sulatettiin jäähauteessa 15 minuutin Γν, ajan. 20 μΙ ligaatioseosta (kuvattu edellä) lisättiin 100 pl:aan TCM-liuosta (10 mM

Tris-HCI, 10 mM CaC^, 10 mM MgCI2, pH 7,0) ja sekoitettiin 200 μΙ:η kanssa kompetentteja E. coli -soluja. Seosta inkuboitiin jäissä 30 minuuttia ennen lämpöshok-25 kia (43 °C, 3 minuuttia). Lämpökäsittelyn jälkeen lisättiin 800 μΙ LB-kasvatuslientä ja solujen annettiin elpyä 37 °C:ssa 30 minuuttia. Transformoidut solut kerättiin sentrifugoimalia täydellä nopeudella 2 minuutin ajan ja suspendoitiin 30 pl:aan kasvatuslientä. Solususpensio maljattiin kahdelle LB maljalle, jotka sisälsivät 25 pg/ml ampisilliinia, 1 mmol IPTGitä (isopropyyli-p-D-tiogalaktopyranosidia) ja 2,4 30 nmol X-gal:ia (5-bromi-4-kioori-3-indolyyli^-D-galaktosidi) ja soluja kasvatettiin maljoilla yön yli 37 °C:ssa. Positiiviset kloonit havaittiin siitä, että ne olivat väriltään valkoisia IacZ-geenin a-komplementaation vuoksi. Menetelmä on kuvattu yksityiskohtaisesti kirjassa: Sambrook ja Russel (2001) Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York.

35 25 G. pMS U1 -plasm id ie n eristäminen ja cDNA-inserttien sekvensointi

Plasmidit eristettiin käyttäen Wizard® Plus Minipreps DNA Purification System -pakkausta (Promega) ja puhdistettiin lisäksi saostamalla etanolilla. cDNA:n identi-5 teetti varmistettiin sekvensoimalla ABI Prism -laitteella (Perkin-Elmer Corporation). Sekvensointireaktio suoritettiin käyttäen DYEnamic ET Terminator Cycle Sequencing Kit -pakkausta (Amersham Pharmacia Biotech) ja Mastercycler Personel PCR -laitetta (Eppendorf). Sekvensoinnissa käytettävät PCR-alukkeet olivat (5’-TAATACGAGTCACTATAGGGCGA-3’) ja (3’-ATTTAGGTAACACTATAGAATAC-10 5’) (taulukko 4) ja käytetty ohjelma: 25 sykliä denaturaatio 94 °C 30 sekuntia, aluk- keiden liittäminen 50 °C 15 sekuntia, ketjun pidentäminen 60 °C. Monistetut PCR-tuotteet saostettiin etanolilla. 10 pl.aan reaktioseosta lisättiin 1 μΙ 1,5 M Na-asetaatti-250 mM EDTA -puskuria ja 95-100% etanolia niin paljon, että etanolin lopullinen konsentraatio oli 75 %. Saostumisen annettiin tapahtua jäähauteessa 7 15 minuutin ajan ja sen jälkeen seosta sentrifugoitiin 20 minuuttia. Supernatantti heitettiin pois ja sakka pestiin huoneenlämmössä 125 pl:lla 70 % etanolia. Seos sentrifugoitiin pikaisesti ja pesussa käytetty etanoli poistettiin niin tehokkaasti kuin mahdollista. Sakka kuivattiin 37 °C:ssa muutaman minuutin ajan, kunnes kaikki etanoli oli haihtunut. ABI Prism -laitteisto oli lääketieteellisen biokemian ja molekyy-20 libiologian laitoksella Oulun yliopistossa ja varsinainen sekvensointi suoritettiin siellä. Osa poron BMP-6:n cDNA:n nukleotidisekvenssistä ja vastaavasta aminohapposekvenssistä on esitetty kuvassa 10.

Sekvensointialukkeet _____

pGEM-T@-plasmidit 5’->3’ TAATACGACTCACTATAGGGCGA

3’—>5' ATTTAGGT G AC ACTATAGAATAC

pT rcHis2A-plasmid it 5'->3' AGAGGTATATATTAAT GTATCG

; 3’—>5’ AT GGT CG ACGGCGCTATT CAG

7 plVEX2.4c-plasmidit 5’->3 TAATACGACTCACTATAGGGCGA

3’—>55 GCTAGTTATTGCTCAGCGG

: Λ 25 / , Taulukko 4. Alukkeet, joita on käytetty poron BMP-6:n normaalin ja mutatoidun kypsän osan sekvensoinnissa 26

Esimerkki 2: Poron BfVIP-6:n normaalin ja nukieotidimuiatoidun kypsän osan rekombinanttiproteiinin ekspressio Escherichia coii TOP 10 F', Origami B (DE3) ja Rosetta (DE3) -soluissa 5 A. Poron BMP-6:n kypsän osan monistaminen ekspressiovektoria varten

Poron BMP-6:n kypsä osa monistettiin pMSU1-plasmidista PCR-menetelmällä käyttäen homologisia alukkeita: (5’-GGATCCGTCGGCCCCCGGGCGGCGCCGGCAG-3’)ja 10 (3’-AAGCTTGTGGCAGCCACAGGCCCGGACGAC-5’) ja mutatoidulle kypsän osan versiolle seuraavia alukkeita: (5’- GGATCCGTCGGCCCCGGGGCGCCGCCGCCAG-3’) ja (3’-AAGCTTGTGGCAGCCGCAGGCGCGGACGAC-5’) (katso esimerkki 2 osa B). Alukkeet ovat myös nähtävissä taulukossa 3. Ensim-15 mäisen alukkeen 5’-päässä oli tunnistuskohta Bam Hl -restriktioentsyymille ja toisen alukkeen 3’-päässä oli tunnistuskohta Hind III -entsyymille.

50 μΙ:η reaktioseos sisälsi pMSU-plasmidin (0,05 pg) ja molempien alukkeiden (40 pmol) lisäksi 0,4 mM dNTP:itä (PCR Core Kit, Roche) ja 0,7 U/μΙ Expand High Fi-20 delity -entsyymiseosia (termostabiili Taq-polymeraasi + oikolukeva polymeraasi, Roche) ja Expand High Fidelity -puskuria, joka sisälsi MgCb (Roche). PCR-reaktio tehtiin Mastercycler Personel -laitteessa (Eppendorf) seuraavan ohjelman mukaisesti: alkudenaturaatio 94 °C 4 minuuttia, ja seuraavat 25 sykliä: denaturaatio 94 °C, 1 minuutti, alukkeiden liittäminen 55 °C 1 minuutti, DNA-ketjujen pidentäminen 25 72 °C 2 minuuttia. Loppuekstensio suoritettiin 72 °C:ssa 10 minuuttia. PCR-tuote puhdistettiin PCR-reaktioseoksesta käyttäen Wizard® PCR Preps DNA Purification System -pakkausta (Promega) ja ligatoitiin pGEM-T®-vektoriin. Syntyneitä, uusia plasmideja, jotka sisälsivät poron BMP-6:n normaalin ja nukieotidimuiatoidun kypsän osan, kutsuttiin nimillä pMU2 ja pMU8 (kuva 1).

30 B. Poron BMP-6:n normaalin ja nukieotidimuiatoidun kypsän osan subkloonaami-nen pGEM-T®-vektorista ekspressiovektoriin pTrcHis 2A (Invitrogen) ja transfor-mointi kompetentteihin Escherichia coli TOP 10 F', Origami B (DE) ja Rosetta (DE) -soluihin : 35

Poron BMP-6:n normaalin ja nukleotidimutatoidun kypsän osan subkloonaminen pGEM®-T vektorista ekspressiovektoriin pTrcHis 2A (kuva 2) toteutettiin irrottamalla kypsät osat pGEM®-T-vektorista Bam Hl ja Hind III -restriktioentsyymeillä ja liga- 27 toimalla insertti pTrcHis 2A -vektoriin, joka oli digestoitu samoilla entsyymeillä. pGEM®-T-konstruktien ja pTrcHis 2A:n (1 pg) digestio Bam Hl (Roche) ja Hind III (Roche) -entsyymeillä suoritettiin 10 pl:ssa 10 mM Tris-HCI, 10 mM NaCI, 5 mM MgCI2, 1 mM 2-merkaptoetanoli, pH 8,0 (SuRE/Cut B, Roche) käyttäen 1 U/μΙ ku-5 takin restriktioentsyymiä. Reaktion annettiin tapahtua 1,5 tuntia 37 °C:ssa, jonka jälkeen restriktioentsyymit inaktivoitiin 65 °C:ssa 20 minuutin ajan ja pakastettiin -20 °C:seen. Ligaatio (ligaasin pitoisuus 0,1 U/μΙ) suoritettiin 2X Rapid Ligation Buffer -puskurissa (tullut pGEM-T®-vektorin (Promega) mukana) +16 °C asteen vesi-hauteessa, jonka annettiin hitaasti jäähtyä + 4 °C:seen yön aikana.

10

Uusi konstrukti tarkistettiin sekvensoimalla (menetelmä on kuvattu esimerkissä 1, osassa G) käyttäen alukkeita: (5’-AGAGGTATATATTAATGTATCG-3’) ja (3*-ATGGTCGACGGCGCTATTCAG-5’). Ekspressiovektoria, joka sisälsi pTrcHis 2A:n ja poron BMP-6:n normaalin kypsän osan cDNA:n, kutsuttiin nimillä pMU20, ja vek-15 toria, joka sisälsi pTrcHis 2A:n ja poron BMP-6:n mutatoidun kypsän osan cDNA:n, kutsuttiin nimellä pMU90 (kuva 2). Kompetentit Escherichia coli TOP 10 F' -solut transformoitiin kuten on kuvattu esimerkissä 1, osa F ja Origami B (DE3) ja Rosetta (DE3) -solut transformoitiin valmistajan (Novagen) ohjeiden mukaan.

20 C. Nukleotidimutaatiot, joilla muutettiin poron BMP-6:n luonnollisen kypsän osan kodonit Escherichia colin kannalta sopivammiksi kodoneiksi

Mahdollisimman korkean ekspressiotason saavuttamiseksi poron BMP-6;n kypsän osan kahdeksan kodonia mutatoitiin yleisemmin käytetyiksi E. colin kodoneiksi.

\ 25 Mutatoidut kodonit koodasivat aminohappoja P6, R8, R10, P99, P103, R132, R137 ja C139 (kuva 5). Mutaatioiden ansiosta käytettyjen kodonien kodonifrekvenssi nousi dramaattisesti (erot on kuvattu taulukossa 6). Mutaatiot P6, R8, R10, R137 ja C139 tehtiin käyttäen PCR-tekniikkaa (katso esimerkki 2 osa A) ja mutaatiot P99, P103 ja R132 suoritettiin käyttäen QuickChange™ Site-Directed Mutagenesis Kit 30 -pakkausta (Stratagene) noudattaen valmistajan ohjeita sen jälkeen kun kypsä osa : oli subkloonattu plasmidiin pTrcHis 2A (katso esimerkki 2, osa B). Mutaatioiden tekemisessä käytetyt oligot on esitetty taulukossa 5.

28

Alukkeet täydentäville mutaatioille (pMU80 ->pMU9Q)___________

P99 ja P103 5’^3’ CCTCATGAACCCGGAGTACGTCCCGAAGCCGTGCTGTGCG

3’-»5’ CGCACAGCACGGCTTCGGGACGTACTCCGGGTTCATGAGG R132 5W3’ CCTGAAAAAGTACCGCAACATGGTCGTCCGCGCC

_ 3’—*5' G GCG CGGACGACCATGTTGCGGTACTTTTTCAGG_

Taulukko 5. Poron BMP-6 mutaatioissa käytetyt alukkeet.

5. ___^

Aminohappo Alkuperäinen kodo- Mutatoitu kodoni/ __ni/frekvenssi frekvenssi_ F6__CCC /5,1 CCG/22,0 R8__CGG / 5,4___CGC/20,6 R10__CGG / 5,4 CGC / 20.6 P99__CCC/5,1 CCG/22,0 P103__CCC/5,1__CCG/22,0 R132__AGG /1,7 CGC/20,6 R137__CGG / 5,4__CGC / 20,6 C139 l TGT/5,1 TGC/6,2

Taulukko 6. Poron BMP-6:n kypsään osaan tehtyjen paikkakohdennettujen mutaatioiden aiheuttamat muutokset aminohappokodoneiden frekvensseihin. Aminohapot on numeroitu rekombinantin rdBMP-6:n, joka on tuotettu plasmidissa pMU90, 10 sekvenssin perusteella (katso kuva 5).

D. Poron BMP-6:n normaalin ja nukleotidimutatoidun kypsän osan liittäminen pET22b(+) (Novagen) ekspressiovektoriin ja transformoiminen kompetentteihin Escherichia coii Origami B (DE3) ja Rosetta (DE3) -soluihin 15

Poron BMP-6:n normaalin ja nukleotidimutatoidun kypsän osan subkloonaaminen ekspressoivaan vektoriin pET22b(+) (Novagen) (kuva 3) suoritettiin, kuten on kuvattu edellä (katso esimerkki 2 osa B). Syntynyttä uutta plasmidia, joka sisälsi ’ : : pET22b(+)vektorin ja siihen ligatoidun poron BMP-6:n normaalin kypsän osan 20 cDNA-molekyylin kutsuttiin nimellä pETrd6A ja plasmidia, joka sisälsi pET22b(+)vektorin ja siihen ligatoidun poron BMP-6:n mutatoidun kypsän osan 29 cDNA-molekyylin, kutsuttiin nimellä pETrd6 (kuva 3). Kompetentit Origami B (DE3) ja Rosetta (DE3) -solut transformoitiin kuten on kuvattu edellä.

E, Poron BMP-6:n kypsän osan rekombinanttiproteiinin ekspressio Escherichia coli 5 -kasvustoissa ja solujen kerääminen E. coli -soluja [TOP 10, Origami B (DE3) tai Rosetta (DE3)], jotka sisälsivät joko pMU20, pMU90, pETrd6A tai pETrd6 -plasmidin, kasvatettiin yön yli 50 ml:ssa SOB-kasvatuslientä, joka sisälsi ampisilliinia (50 pg/ml) ja Rosetta (DE3) -10 solukasvusto myös kloramfenikolia (35 pg/ml), +37 °C:ssa ravistellen (225 rpm). Seuraavana aamuna 1200 ml:aan SOB-kasvatusmediumia, joka sisälsi edellä mainitut antibiootit, lisättiin 24 ml yön yli kasvanutta kasvustoa ja kasvatusta jatkettiin + 37 °C:ssa ravistellen (225 rpm) kunnes OD 6oo oli 0,6, jolloin solut ovat logaritmisen kasvuvaiheen puolivälin paikkeilla. Tässä vaiheessa rekombinanttiproteii-15 nin indusointi suoritettiin lisäämällä IPTG:tä siten, että lopullinen konsentraatio oli 1 mM. Induktion jälkeen soluja kasvatettiin neljästä viiteen tuntiin, jonka jälkeen ne kerättiin sentrifugoimalla. Nukleotidisekvensseistä johdetut rekombinanttiproteiinien aminohapposekvenssit on esitetty kuvassa 5 (pMU20/pMU90) ja kuvassa 7 (pETrd6A/pETrd6).

20

Esimerkki 3: Poron BMP-6:n nukleotidimutatoidun kypsän osan rekombinanttiproteiinin puhdistaminen ja laskostaminen A. Inkluusiokappaleiden peseminen 25

Kerätyt solut suspendoitiin ravistellen 50 mM Na-fosfaattipuskuriin (pH 7,0, 220 g soluja/1 litra puskuria). Suspensio sentrifugoitiin 5500 x g 45 minuuttia +4 °C:ssa. Pesu Na-fosfaattiliuoksella toistettiin kerran. Solupelletti punnittiin ja säilytettiin -70 °C:ssa yön yli. Pakastettu pelletti, jossa oli osittain särkyneitä soluja, sulatettiin ja 30 suspendoitiin (25 mg/ml) 20 mM Tris-HCI-puskuriin, pH 8,5, joka sisälsi 0,5 mM EDTA, ravistellen 2 minuuttia. Suspensio sentrifugoitiin 26 000 x g 30 minuutin ajan +4 °C:ssa ja Tris-HCI-EDTA pesu toistettiin kerran. Saatu solupelletti punnittiin. Viimeisen pesun jälkeen solupelletti suspendoitiin (35 mg/ml) ravistellen (200 rpm/minuutti, yön yli, huoneenlämmössä) lyysipuskuriin (6 M GuHCI - 20 mM Na-35 fosfaatti - 0,5 M NaCI, pH 8,0), jolloin kaikki loput kokonaiset E. coli -solut särkyvät ja inkluusiokappaleet saadaan liukoisiksi. Suspensio sentrifugoitiin (26,000 x g, 45 minuuttia, huoneenlämmössä), pelletti heitetään pois ja rekombinanttiproteiini jää 30 liukoisena supernatanttiin. Lopuksi supernatantti suodatetaan 45 pm suodattimen läpi, jotta päästään varmasti eroon kaikista solurippeistä.

B. Saostus isoelektrisessä pisteessä (pl) 5

Nukleotidimutatoitu poron BMP-6-rekombinanttiproteiini, jota ekspressoitiin pETrd6-plasmidissa Escherichia coli Origami B (DE3) tai Rosetta (DE3) -soluissa, saostettiin isoelektrisessä pisteessään pH 9,69. Isoelektrinen piste määritettiin tie-tokonelaskennan avulla poron BMP-6-rekombinantin aminohapposekvenssistä 10 (kuva 7). Sakka kerättiin sentrifugoimalla (12 000 x g, 30 min, huoneenlämmössä) ja suspensoitiin lyysipuskuriin (6 M GuHCI - 20 mM Na-fosfaatti - 0,5 M NaCI; pH 8,0).

C. immobilisoitu metalliaffiniteettikromatografia (IMAC) 15

Escherichia coli -solut lyysattiin heilutelemalla 6 M GuHCI - 20 mM Na-fosfaatti -0,5 M NaCI (pH 8,0) -liuoksessa kahden tunnin ajan ja suodatettiin 45 pm suodattimen läpi. IMAC-menetelmässä käytettiin valmiiksi pakattuja HiTrap Chelating HP -affiniteettipyIväitä (Amersham Pharmacia Biotech). Pylväsmatriksit varattiin Co2+-, 20 Cu2+- tai Ni2+-ioneilla valmistajan ohjeen mukaan. Puhdistuksen ideana on se, että rdBMP-6-proteiinin päässä oleva ”His-tag”-epitooppi sitoutuu metalli-ioneilla varattuun pylvääseen ja E. colista peräisin olevat solujätteet viilaavat pylvään läpi. Suodatettu, pesujen jälkeinen supernatantti saatettiin pylvään pintaan pylvään varaamisen jälkeen. Suurin osa epäpuhtauksista poistettiin pesemällä pylvästä lyysipus-25 kurilla (6 M GuHCI - 20 mM Na-fosfaatti - 0,5 M NaCI, pH 8,0) 5-10-kertaisella pylvään tilavuudella. Toinen pesukerta, määrältään 5-10-kertainen pylvään tilavuus, suoritettiin lyysipuskuriila, jossa 6 M GuHCI :n tilalla oli 6 M urea. Poron rekombi-nantti BMP-6 eluoitiin HiTrap-pylväästä käyttäen pH-gradienttia pH 7,0:sta pH 4,0:aan (6M urea - 20 mM Na - fosfaatti - 0,5 M NaCI). Fraktiot analysoitiin SDS-30 PAGEdia ja puhtaimmat rekombinantti-rdBMP-6:tta sisältävät fraktiot yhdistettiin laskostamista varten.

D. Rekombinantti-rdBMP-6:n kypsän osan laskostaminen 35 BMP-6-fraktiot, jotka oli analysoitu SDS-PAGE:lla, yhdistettiin ja dialysoitiin vettä vastaan. Dialyysissä saostunut proteiini kerättiin sentrifugoimalla ja suspendoitiin inkuboiden kaksi tuntia 25 °C:ssa 8 M urea - 0,1 M Tris/HCI, pH 8 -liuokseen, joka lisäksi sisälsi 100 mM DTT, 1 mM EDTA. pH laskettiin pH:hon 3-4 lisäämällä tipoit- 31 tain 1 M HCI:a. DTT poistettiin täysin dialysoimalia kaksi tuntia 25 °C:ssa 6 M urea -10 miVJ HCI -liuosta vastaan. Dialyysiä jatkettiin +4 °C:ssa yön yli 6 M ureaa vastaan. Rekombinantin rdBMP-6:n laskostaminen suoritettiin kaksivaiheisessa dialyysissä. Ensimmäinen dialyysiliuos oli 20 mM Tris-HCI - 150 mM NaCI - 3 M urea 5 (pH 7,5). Dialyysipuskuri vaihdettiin ainakin kuusi kertaa kahden tai kolmen päivän aikana. Näyte, josta suolat oli poistettu, sentrifugoitiin ja pelletti kuivattiin lyofilisoi-malla. Tässä vaiheessa BMP-6:n puhtausaste oli 75 % ja se laskostui 50-prosenttisesti määritettynä ei-pelkistävällä SDS-PAGE:lla. Poron rekombinantin BMP-6:n laskostuneen dimeerin määrä kvantitoitiin densitometrillä Coomassie Bril-10 liant Blue -värjätyistä geeleistä.

Esimerkki 4; Hepariinia sitovan kohdan liittäminen poron BMP-6:n kypsän osan eteen 15 A. Hepariinia sitovaa kohtaa koodaavan DNA-fragmentin liittäminen pTrcHis 2A -vektoriin

Kaksi komplementaarista aluketta, jotka on esitetty taulukossa 7, suunniteltiin käyttäen poron BMP-2:n hepariinia sitovaa kohtaa (HBS) mallina. Bam Hl ja Κρη I 20 -restriktioentsyymien katkaisukohdat lisättiin HBS:n 5’- ja 3’-päihin, kyseisessä järjestyksessä. Alukkeet denaturoitiin aluksi +100 °C:ssa 5 minuutin ajan ja sitten annettiin liittymisen tapahtua pienen vesihauteen jäähtyessä +100 °C:sta ensin huoneen lämpötilaan ja sitten +4 °C:seen (1 tunti). Sekä liitetty HBS-fragmentti (1 pg) että pTrcHis 2A -vektori (0,5 pg) digestoitiin Bam Hl (1 U/pl) ja Κρη I (2U/pl) 25 -entsyymeillä MuIti-Core-puskurissa (Promega) +37 °C:ssa 1,5 tuntia ja ligaatio suoritettiin +16 °C:n vesihauteessa, jonka annettiin hitaasti jäähtyä +4 °C:seen yön aikana. Uusi muodostunut konstrukti tarkistettiin sekvensoimalla (katso esimerkki 2 osa B) ja plasmidia kutsuttiin nimellä pTrcHBS (kuva 2).

HBS:n kloonauksessa käytetyt alukkeet____

5’->3’ CGGGATCCGCAAGCAAAACATAAACAGCGCAAACGCGGTACCCC 3’—>5’ GGGGTACCGCGTTTCCGCTGTTTATGTTTTGCTTGCGGATCCCG

Taulukko 7. Alukkeet, joita on käytetty poron BMP-6:n nukleotidimutatoidun kypsän osan kloonauksessa 30 32 B. Poron BMP-6:n normaalin ja nukleotidimutatoidun kypsän osan liittäminen pTrcHBS-vektoriin ja kompetenttien Escherichia coli TOP 10 F', Origami B (DE3) ja Rosetta (DE3) -solujen transformaatio 5 Poron BMP-6:n normaalin ja nukleotidimutatoidun kypsän osan liittämiseksi pTrcHBS-vektoriin kypsä osa monistettiin pMSU1-vektorista (kuva 1). Käytetyissä alukkeissa oli Κρη I -restriktiokohta alukkeen 5’-pään alussa ja Hind III -restriktiokohta alukkeen 3’-päässä. Poron BMP-6:n luonnollisen kypsän osan monistamisessa käytetyt alukkeet olivat: 10 (5’-GGTACCTCGGCCCCCGGGCGGCGCCGGCAG-3’) ja (3’-AAGCTTGTGGCAGCCACAGGCCCGGACGAC-5’) ja poron BMP-6:n muta-toidun kypsän osan monistamisessa käytetyt alukkeet olivat: (5’-GGTACCTCGGCCCCGGGGCGCCGCCGCCAG-3’)ja (3’-AAGCTTGTGGCAGCCACAGGCCCGGACGAC-5’).

15 Alukkeet ovat myös taulukossa 3. PCR-reaktiot, PCR-tuotteiden puhdistaminen ja ligatoiminen pGEM®-vektoriin suoritettiin kuten on kerrottu esimerkissä 1 osa C ja D. pGEM®-vektoria, joka sisälsi poron BMP-6:n luonnollisen kypsän osan, kutsuttiin nimellä pMU12 ja pGEM®-vektoria, joka sisälsi poron BMP-6 mutatoidun kypsän osan, kutsuttiin nimellä pMU11. Molemmat konstruktit on esitetty kaavamai-20 sesti kuvassa 1.

Poron BMP-6:n mutatoidun kypsän osan subkloonaaminen pGEM®-vektorista * -pTrcHBS-vektoriin toteutettiin samalla tavalla kuin saman insertin subkloonaami- f ; nen pTrcHis 2A -vektoriin, kuten on kerrottu esimerkissä 2, osa B. Ainoa ero oli, * , \ 25 että Κρη I -restriktioentsyymi korvasi Bam Hl -entsyymin ja käytetty puskuri oli Mul- 5 ti-Core-puskuri (Promega). Transformaatiot suoritettiin, kuten on kuvattu esimer- ’ kissä 1 osa F ja esimerkissä 2 osa B. Uusia konstrukteja kutsuttiin nimillä pTrcHBSrd6A (alkuperäinen kypsä osa) ja pTrcHBSrdö (mutatoitu kypsä osa) (kuva 2), ja molemmat konstruktit tarkistettiin sekvensoimalla (katso esimerkki 2 osa ; 30 c).

: : C. Poron BMP-6:n normaalin ja mutatoidun kypsän osan, joka sisältää hepariinia sitovan alueen, liittäminen pET22b(+)-vektori in ja transformoiminen kompetenttei-hin Escherichia coli Origami B (DE3) ja Rosetta (DE3) -soluihin 35

Poron BMP-6 normaalin ja mutatoidun kypsän osan, joka sisältää hepariinia sitovan alueen, liittäminen pET22b(+) vektoriin suoritettiin täysin samalla tavalla kuin poron BMP-6 normaalin ja mutatoidun kypsän osan subkloonaminen 33 pGEM®-vektorista pTrcHBS-vektoriin, joka on esitetty esimerkissä 2 osa B. Transformaatiot suoritettiin kuten on esitetty esimerkissä 1 osa F ja esimerkissä 2 osa C. Uusia konstrukteja kutsuttiin nimillä pETHBSrdöA (poron BMP-6:n alkuperäinen kypsä osa) ja pETHBSrd6 (poron BMP-6:n mutatoitu kypsä osa) (kuva 3).

5 D. Poron rekombinantin BMP-6:n, joka sisältää hepariinia sitovan alueen, kypsän osan ekspressio Escherichia coli -kasvustoissa ja solujen kerääminen

Ekspressio suoritettiin, kuten on kuvattu aikaisemmin esimerkissä 2 osa E. Re-10 kombinanttiproteiinien aminohapposekvenssit ja vastaavat nukleiinihapposekvens-sit on esitetty kuvassa 6 (pTrcHBSrd6A/pTrcHBSrd6) ja kuvassa 8 (pETHBSrd6A/pETHBSrd6).

Esimerkki 5: Poron rekombinantin BMP-S.n, joka sisältää hepariinia sitovan 15 kohdan, mutatoidun kypsän osan puhdistaminen ja laskostaminen (HBSrdBMP-6) A, HBSrdBMP-6:n puhdistaminen IMAC-menetelmällä 20 Escherichia coli -solut hajotettiin ravistamalla soluja 2 tuntia 6 M GuHCI - 20 mM Na-fosfaatti - 0,5 M NaCI (pH 8,0) -puskurissa ja suodatettiin 45 pm suodattimen läpi. IMAC-puhdistusmenetelmässä käytettiin valmiiksi pakattuja HiTrap Chelating HP -affiniteettipylväitä (Amersham Pharmacia Biotech). Pylväsmatriksit varattiin Co2+-, Cu2+- tai Ni2+-ioneilla valmistajan ohjeen mukaan. Suodatettu lysaatti laitet-25 tiin pylvääseen ja pestiin lyysipuskurilla, jonka määrä oli 15-kertainen pylvään mat-riksiin verrattuna. Toinen pesu suoritettiin 40-kertaisella pylvään matriksin tilavuudella käyttäen 6 M urea - 20 mM Na-fosfaatti - 0,5 M NaCI (pH 7,5) -puskuria. Kolmas pesuliuos oli 0,05 M imidatsoli, joka oli lisätty toiseen pesupuskuriin, ja pesunesteen tilavuus oli 15-kertainen pylvään tilavuus. Rekombinantti HBSrdBMP-6 30 eluoitui pylväästä imidatsoligradientilla, joka alkoi 0,05 M imidatsolikonsentraatiolla ja päättyi 0,5 M imidatsolikonsentraatioon 6 M urea - 20 mM Na-fosfaatti - 0,5 M NaCI (pH 7,5) -puskurissa. Fraktiot analysoitiin SDS-PAGE:lla ja ne fraktiot, joissa oli kaikkein puhtainta HBSrdBMP-6-rekombinanttia, yhdistettiin ja dialysoitiin 100 mM Na-fosfaattipuskuria (pH 7,5) vastaan viikonlopun yli. Saostunut rekombinant-35 tiproteiini kerättiin sentrifugoimalla ja liuotettiin 8 M urea -100 mM Na-fosfaatti -10 mM Tris-HCI (pH 7,5) -puskuriin. Ennen puhdistamista hepariiniaffiniteettipylvääs-sä rekombinanttiproteiiniliuos suodatettiin 45 pm suodattimen läpi.

34 B. Rekombinantin HBSrdBMP-6:n puhdistaminen hepariiniaffiniteettipylväässä.

IMAC-pylvään jälkeinen suodos annosteltiin valmiiseen HiTrap Heparin HP -pylvääseen (Amersham Pharmacia Biotech), joka oli tasapainotettu 8 M urea -5 100 mM Na-fosfaatti - 10 mM Tris-HCI (pH 7,5) -puskurilla. Pylväs pestiin 20- kertaisella pylväsmatriksin tilavuudella samaa puskuria ja rekombinantti HBSrdBMP-6 eluoitiin hepariinipylväästä NaCI-gradientilla, joka alkoi 0 M ja päättyi 2 M NaCI -pitoisuuteen samassa puskurissa. Fraktiot analysoitiin SDS-PAGE:lla ja Western blot -menetelmillä ja puhtaimmat HBSrdBMP-6-fraktiot yhdistettiin. Wes-10 tern blot -menetelmässä käytettiin spesifisiä vasta-aineita, jotka oli tuotettu His6:ta ja BMP-6:ta vastaan. Yhdistetyt fraktiot olivat valmiita laskostamista varten.

C. Rekombinantin HBSrdBMP-6:n laskostaminen 15 Rekombinantin HBSrdBMP-6:n laskostaminen suoritettiin samalla tavalla kuin rekombinantin rdBMP-6:n laskostaminen, kuten on kuvattu esimerkissä 3 osa D.

Esimerkki 6. Poron BMP-6-rekombinanttiproteiinin mutatoidun kypsän osan, joka joko sisältää hepariinia sitovan alueen tai ei sisällä, biologisen aktiivi-20 suuden testaaminen

Lyofilisoidun rekombinantin HBSrdBMP-6:n biologinen aktiivisuus testattiin implan-toimalla hiiren reisilihaksen taskuun vähemmän kuin 1 mg rekombinanttia HBSrdBMP~6:ta absorboituna Lyostrypt®-kollageenihuopaan. 21 päivän kuluttua 25 takajalat röntgenkuvattiin ja implantointikohdat leikeltiin ja fiksattiin 10 % neutraalissa formaliiniliuoksessa. Fiksatut implantit leikattiin 4 pm:n leikkeiksi ja värjättiin hematoksyliini-eosiiniliuoksella. Leikkeitä tarkasteltiin valomikroskoopilla.

Uuden luun muodostus evaluoitiin röntgenkuvauksen avulla määrittämällä pinta-ala 30 ja optinen tiheys. Röntgenkuvat siirrettiin tietokoneelle käyttäen optista skanneria (HP Scan Jet, Hewett-Packard, USA). Ektooppisen ja orthotooppisen uuden luun muodostuminen arvioitiin röntgenkuvissa nähtävän kalsifioidun kudoksen pinta-alan suhteen (mm2) käyttäen Scion Image Beta 4.02 (Scion Corp., USA) -ohjelmaa. Tietyn alueen keskimääräinen optinen tiheys (mmAl) mitattiin samalla 35 laitteella. Optisen tiheyden kalibrointi suoritettiin käyttäen alumiinista valmistettua levyä (AI), jossa oli 0,25 mmAl askelmat, ja jonka kalibroitu tiheys antoi vaihtelu-alueen 4 mmAl asti. Myös samalla menetelmällä tuotetun ihmisen rekombinantin 35 BMP-6:n kypsän osan biologista aktiivisuutta testattiin vertailun vuoksi edellä kuvatulla biotestillä.

Esimerkki 7: Poron rekombinantin BWlP-6:n kypsän osan ekspressio Rapid 5 Translation System RTS 500:ssa A RTS 500 -ekspressiovektorin pIVEX 2,4c (Roche) rakentaminen

Poron BMP-6:n alkuperäisen kypsän osan monistaminen, PCR-tuotteen puhdista-10 minen, ligaatio pGEM-T®-vektoriin (kuva 1), transformaatio kompetentteihin Escherichia co//TOPI 0 F' -soluihin (Invitrogen), plasmidin puhdistaminen ja inserttien sekvensointi tehtiin muutoin samoin kuin on kuvattu esimerkissä 1, paitsi poron BMP-6 kypsän osan monistamiseen käytettiin seuraavia alukkeita: (5’- CCGCGGCTCGGCCCCCGGGCGGCGC-3’) 15 ja (3’-GGATCCTAGTGGCAGCCACAGGCCC-5’) (taulukko 3) ja konstruktia kutsuttiin nimellä pMU2/2 (kuva 1). Konstruktin sekvensoinnissa käytetyt alukkeet olivat: (5’-TAATACGACTCACTATAGGGCGA-3’) ja (3’-GCTAGTTATTGCTCAGCGG-5’) (taulukko 4). Monistamiseen käytetyissä alukkeissa oli Ksp I (Sac il) -restriktioentsyymin katkaisukohta 5’-päässä ja Bam Hl 20 -katkaisukohta alukkeen 3’-päässä, ja näitä kohtia käytettiin hyväksi poron BMP-6:n kypsän osan subkloonauksessa. Plasmidit pMU2/2 ja pIVEX 2,4c (0,5 pg) di-gestoitiin käyttäen 10 mM Tris-HCI, 10 mM MgCI2 1 mM ditioerytritolia, pH 7,5 (SuRE Cut Buffer L, Roche) -puskuria ja kutakin 1 U/μΙ entsyymiä, kokonaistilavuuden ollessa 10 pL Restriktioentsyymit inaktivoitiin ennen ligaatiota ja ligaatiore-25 aktio suoritettiin kuten on esitetty esimerkissä 2, osassa C. Uutta konstruktia kutsuttiin nimellä pMU500 (kuva 4).

B. Rekombinantin BMP-6:n kypsän osan tuottaminen RTS 500 -systeemissä 30 RTS 500 -reaktio suoritettiin noudattaen Rapid Translation System RTS 500 E. coli Template Kit Instruction Manual -ohjeita. Rekombinanttiproteiinin aminohapposekvenssi ja vastaava nukleotidisekvenssi on esitetty kuvassa 9.

36

Tulokset

Poron BMP-6:n osittaisen cDNA.n kloonaus 5 Nukleotidisekvenssi, joka saatiin ABI Prism -sekvensointireaktioista, analysoitiin tietokoneen avulla ja sitä verrattiin jo tunnettuihin BMP-sekvensseihin. Uusi kloonattu cDNA osoittautui homologiavertailujen perusteella kaikkein homologisimmak-si naudan BMP-6:n kanssa (nukleotidihomologia 95,0 % ja aminohappohomologia 99,1 %, US 6 207 813). BMP-6-proteiinien nukleotidi-ja aminohappohomologiat eri 10 nisäkkäiden välillä on esitetty taulukossa 1. Poron BMP-6:n nukleotidisekvenssi ja vastaava poron BMP-6:n osittaisen cDNA.n aminohapposekvenssi on esitetty kuvassa 10.

Poron BMP-6:n kypsän osan ekspressointi 15

Ensiksikin, poron BMP-6:n kypsä osa kloonattiin pTrcHis2A vektoriin, transformoitiin E. co//TOP 10 -soluihin, jolloin saatiin pMU20-vektori. Rekombinanttiproteiinin tuotanto indusoitiin IPTG:llä. Rekobinanttiproteiinin tuotto varmistettiin SDS-PAGE:lla, mutta induktiota ei havaittu. Tämän arveltiin johtuvan monista sellaisista 20 rdBMP-6:n kodoneista, jotka ovat harvoin käytössä E. colissa. Nämä kodonit muta-toitiiin sopivammiksi E. colin translaatiosysteemille ja plasmidi pMU90 luotiin. Tästä huolimatta rekombinanttiproteiinin induktiota ei havaittu analysoitaessa SDS-PAGE:lla, Päädyttiinkin johtopäätökseen, että indusoitumattomuus johtunee rdBMP-6-proteiinin koodaavan alueen alussa olevasta korkeasta GC-25 pitoisuudesta. Havaittiin myös, että poron BMP-2:n kypsän osan alussa olevan hepariinia sitovan kohdan GC-pitoisuus oli hyvin alhainen ja lisättäessä se poron BMP-6:n kypsän osan alkuun sitä voitaisiin myös käyttää hyväksi puhdistuksissa. Siksi pTrcHBS-vektori rakennettiin. Kloonaamalla rdBMP-6:n alkuperäinen kypsä osa ja mutatoitu kypsä osa pTrcHBS-vektoriin saatiin vektorit pTrcHBSrd6A ja 30 pTrcHBSrd6. Molempien rekombinanttien, HBSrdBMP~6A ja HBSrdBMP-6, menestyksellinen induktio varmistettin SDS-PAGE:lla, mutta mutatoidun HBSrdBMP-; 6:n ekspressiotaso oli huomattavasti korkeampi.

Koska vielä ei ollut käytössä vektoria pelkän rdBMP-6:n kypsän osan rekombinant-35 tiproteiinin tuottoon, päätettiin kokeilla toisenlaista vektorisysteemiä ja erilaista E. coli -solulinjaa. pET22b(+) (Novagen), jossa on His6-tag ja pelB-johtoalue, valittiin uudeksi ekspressiovektoriksi ja Rosetta (DE3) (Novagen) ja Origami B (DE3) (Novagen) uusiksi E. coli -linjoiksi. Poron BMP-6:n alkuperäinen ja mutatoitu kypsä 37 osa, joka joko sisälsi hepariinia sitovan alueen tai ei sisältänyt sitä, kloonattiin pET22b(+)-vektoriin ja neljää uutta plasmidia kutsuttiin nimillä: pETrd6A, pETrd6, pETHBSrd6A ja pETHBSrdö ja sekä Rosetta (DE3) että Origami B (DE3) -solut transformoitiin näillä vektorilla kukin erikseen. Analysoitaessa SDS-PAGE:lla ha-5 valttiin kaikilla yhdistelmillä rdBIVIP-6:n tai HBSrdBMP-6:n ekspressio. Kuitenkin, kuten on aikaisemmin kuvattu pTrcHBSrd6A:n ja pTrcHBSrd6:n suhteen, nukleoti-dimutaatiot kypsässä osassa saivat aikaan dramaattisen lisäyksen ekspres-siotasoon, kun joko pelkkää poron BMP-6:tta tai sellaista, jossa oli hepariinia sitova kohta, ekspressoitiin. Ekspressiokokeiden perusteella pääasiassa Rosetta (DE3) -10 soluja, jotka sisälsivät pETrdö- tai pETHBSrd6-vektorin, käytettiin tuottamaan rdBMP-6- tai HBSrdBMP-6-rekombinanttiproteiinia.

rdBMP-6:n puhdistaminen 15

Poron rdBMP-6-rekombinanttiproteiinia tuotettiin E, colissa. Pesujen, isoelektriseen pisteeseen perustuvan saostuksen ja inkluusiokappaleiden solubilisaation jälkeen rekombinantin poron rdBMP-6:n pitoisuus oli 85 %.

20 Seuraava puhdistusvaihe oli immobilisoitu metalliaffiniteettikromatografia (IMAC). Näyte eluoitiin pylväästä käyttäen pH-gradienttia ja rdBMP-6-proteiinin puhtaus oli vähintään 75 % määritettynä SDS-PAGE:lla. Eristetyn rdBMP-6-proteiinin kypsän osan molekyylipaino oli 20 300 Da määritettynä elektroforeettisen liikkuvuuden perusteella SDS-PAGE:lla pelkistävissä olosuhteissa (kuva 11).

25 rdBMP~6~HBS:n puhdistaminen

Poron rdBMP-6-HBS-rekombinanttiproteiinia tuotettiin E. colissa inkluusiokappa-30 leissa (IBs). Pesujen, isoelektriseen pisteeseen perustuvan saostuksen ja inkluusiokappaleiden solubilisaation jälkeen rekombinantin poron rdBMP-6-HBS:n pitoisuus oli 85 %.

: Seuraava puhdistusvaihe oli immobilisoitu metalliaffiniteettikromatografia (IMAC).

35 Näyte eluoitiin pylväästä käyttäen pH-gradienttia ja rdBMP-6-HBS-proteiinin puhtaus oli vähintään 75 % määritettynä SDS-PAGE:lla. Eristetyn rdBMP-6-HBS-proteiinin kypsän osan molekyylipaino oli 21 600 Da määritettynä elektrofo- 38 reettisen liikkuvuuden perusteella SDS-PAGE:lla pelkistävissä olosuhteissa (kuva 11).

rdBMP-6:n ja rdBMP-6-HBS:n laskostaminen ja aktiivisuuden testaaminen 5 Denaturoituneiden rdBMP-6- ja rdBMP-6-HBS-proteiinien in vitro -laskostuminen kvantitoitiin mittaamalla laskostunut dimeeri Coomassie Brilliant Blue -värjätyiltä geeleiltä densitometrisesti. Ei-pelkistävistä SDS-PAGE-geeleistä määritetty proteiinin laskostuminen oli 50 %.

10 rdBMP-6-proteiinin osteoinduktiivinen aktiivisuus lisääntyi annoskokoa suurennettaessa (taulukko 2). Poron rdBMP-6-rekombinanttiproteiini osoittautui huomattavasti tehokkaammaksi luun muodostuksen indusoijaksi kuin ihmisen vastaavaa. Poron rdBMP-6-HBS:n luuta muodostava aktiivisuus oli suhteessa verrattuna rdBMP~6:n aktiivisuuteen, kun taas naudan BMP-6 sai vaikutuksen aikaan vain 15 suurimmalla käytetyllä määrällä.

Tämä keksintö on kuvattu korostaen joitakin edullisia toteutusmuotoja ja sovelluksia. Kuitenkin alan ammattilaisille on ilmeistä, että variaatioita esiintuoduista toteutusmuodoista voidaan tehdä ja käyttää ja, että keksintöä voidaan käyttää seuraavi-20 en vaatimusten puitteissa muullakin tavalla kuin mitä on tässä täsmällisesti esitetty.

39

SEQUENCE LISTING

<110> BBS-Bioactive Bone Substitutes Oy 5 <120> Bone morphogenetic proteins <130> OP10087 5 <160> 2 10 <170> Patentin version 3.1 <210> 1 <211> 139

15 <212> PRT

<213> Rangifer tarandus tarandus <4 00> 1 20 Ser Ala Pro Gly Arg Arg Arg Gin Gin Ala Arg Asn Arg Ser Thr Pro 15 10 15

Ala Gin Asp Val Ser Arg Ala Ser Ser Ala Ser Asp Tyr Asn Ser Ser 20 25 30 25

Glu Leu Lys Thr Ala Cys Arg Lys His Glu Leu Tyr Val Ser Phe Gin 35 40 45

Asp Leu Gly Trp Gin Asp Trp lie lie Ala Pro Lys Gly Tyr Ala Ala 30 50 55 60

Asn Tyr Cys Asp Gly Glu Cys Ser Phe Pro Leu Asn Ala His Met Asn 65 70 75 80 > 35 Ala Thr Asn His Ala lie Val Gin Thr Leu Val His Leu Met Asn Pro I . 85 90 95

Glu Tyr Val Pro Lys Pro Cys Cys Ala Pro Thr Lys Leu Asn Ala lie 100 105 110 40 ’V Ser Val Leu Tyr Phe Asp Asp Asn Ser Asn Val lie Leu Lys Lys Tyr •J * 115 120 125

Arg Asn Met Val Val Arg Ala Cys Gly Cys His 45 130 135

<210> 2 <211> 118 <212> PRT

50 <213> Rangifer tarandus tarandus <400> 2

Arg lie Tyr Lys Asp Cys Val Val Gly Ser Phe Lys Asn Gin Thr Phe 55 1 5 10 15

Leu lie Ser lie Tyr Gin Val Leu Gin Glu His Gin His Arg Asp Ser 20 25 30 1

Asp Leu Phe Leu Leu Gly Thr Arg Ala Val Trp Ala Ser Glu Ala Gly 40 35 40 45

Trp Leu Glu Phe Asp lie Thr Ala Thr Ser Asn Leu Trp Val Leu Thr 50 55 60 5

Pro Gin His Asn Met Gly Leu Gin Leu Ser Val Val Thr Arg Asp Gly 65 70 75 80

Leu Ser lie Ser Pro Gly Ala Ala Gly Leu Val Gly Arg Asp Gly Pro 10 85 90 95

Tyr Asp Lys Gin Pro Phe Met Val Ala Phe Phe Lys Ala Ser Glu Ala 100 105 110 15 His Val Arg Ser Ala Arg 115

Claims (19)

1. Eristetty luun morfogeneettinen proteiini 6 (BMP-6), tunnettu siitä, että se sisältää konsensussekvenssin P-G/S/N-R/K-R/H-R/K-Q/N-Q-A/S/N-R-N/S-R/A/K-

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen luun morfogeneettinen proteiini 6, tunnettu siitä, että se sisältää SEQ ID NO: 1:n aminohapot 3-16. 10

3. Patenttivaatimuksen 1 mukainen luun morfogeneettinen proteiini 6, tunnettu siitä, että se sisältää SEQ ID NO: 1:n aminohapposekvenssin.

4. Jonkin edellisen patenttivaatimuksen mukainen luun morfogeneettinen pro-15 teiini 6, tunnettu siitä, että se lisäksi sisältää SEQ ID NO: 2:n BMP-propeptidin.

5. Eristetty DNA-molekyyli, tunnettu siitä, että se koodaa jonkin edellisen patenttivaatimuksen mukaista luun morfogeneettistä proteiinia.

5 S/A-TYS/N-P ja aminoterminaalisessa päässään hepariinia sitovan kohdan, joka sisältää aminohapposekvenssin AKHKQRKRGT.

6. Nukleotidivektori, tunnettu siitä, että se sisältää patenttivaatimuksen 5 mu kaisen eristetyn DNA-molekyylin.

7. Rekombinantti-isäntäsolu, tunnettu siitä, että se sisältää patenttivaatimuk-sen 6 mukaisen nukleotidivektorin. 25

8. Patenttivaatimuksen 7 mukainen rekombinantti-isäntäsolu, tunnettu siitä, että se on E. coliTOP10, Origami B (DE3) tai Rosetta (DE3) -solu.

9. Farmaseuttinen koostumus, tunnettu siitä, että se sisältää jonkin patentti-30 vaatimuksen 1-4 mukaisen luun morfogeneettisen proteiinin.

10. Patenttivaatimuksen 9 mukainen farmaseuttinen koostumus, tunnettu siitä, että se sisältää kyseistä luun morfogeneettistä proteiinia homodimeerinä, tai hete-rodimeerinä jonkin toisen luun morfogeneettisen proteiinin kanssa. 35

11. Patenttivaatimuksen 9 tai 10 mukainen farmaseuttinen koostumus, tunnettu siitä, että se sisältää lisäksi jonkin muun luun morfogeneettisen proteiinin, epider-maalisen kasvutekijän, fibroblastisen kasvutekijän tai transformoivan kasvutekijän.

12. Jonkin patenttivaatimuksen 1-4 mukaisen luun morfogeneettisen proteiinin käyttö valmistettaessa lääkeainetta, jolla hoidetaan luuhun, rustoon, jänteisiin tai hampaisiin liittyviä häiriöitä, joissa niiden regeneraatio, korjaus tai kasvu on toivottavaa. 5

13. Jonkin patenttivaatimuksen 1-4 mukaisen luun morfogeneettisen proteiinin käyttö valmistettaessa lääkeainetta, jolla hoidetaan syöpää, fibromyalgiaa, psoriasista ja muita dermatologisia häiriöitä, ja reumaattisia vaivoja.

14. Osteogeeninen väline, tunnettu siitä, että se sisältää jonkin patenttivaati muksen 1-4 mukaisen luun morfogeneettisen proteiinin.

15. Patenttivaatimuksen 14 mukainen osteogeeninen väline, tunnettu siitä, että se sisältää kyseistä luun morfogeneettistä proteiinia homodimeerinä, tai heterodi- 15 meerinä jonkin toisen luun morfogeneettisen proteiinin kanssa.

16. Patenttivaatimuksen 14 tai 15 mukainen osteogeeninen väline, tunnettu siitä, että se lisäksi sisältää jonkun toisen luun morfogeneettisen proteiinin, epi-dermaalisen kasvutekijän, fibroblastisen kasvutekijän tai transformoivan kasvuteki- 20 jän.

17. Jonkin patenttivaatimuksen 14-16 mukainen osteogeeninen väline, tunnettu siitä, että se sisältää biologisesti yhteensopivan matriksin.

18. Patenttivaatimuksen 17 mukainen osteogeeninen väline, tunnettu siitä, että kyseinen biologisesti yhteensopiva matriksi sisältää kalsiumfosfaattia, karboksime-tyyliselluloosaa tai kollageenia tai näiden yhdistelmistä.

19. Menetelmä luun, ruston, jänteen tai hampaan luun muodostuksen indusoi-30 miseksi in vitro, tunnettu siitä, että jonkin patenttivaatimuksen 1-4 mukaisella luun ; morfogeneettisellä proteiinilla käsitellään kyseistä luuta, rustoa, jännettä tai ham- ' masta.