ES2642591T3 - Proteína morfogenética ósea 3 y dispositivos osteogénicos y productos farmacéuticos que contienen la misma - Google Patents

Description

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DESCRIPCION

Protema morfogenetica osea 3 y dispositivos osteogenicos y productos farmaceuticos que contienen la misma Campo de la invencion

La presente invencion se refiere a protemas que inducen la formacion osea llamadas protemas morfogeneticas oseas (BMP), especialmente la BMP-3c, moleculas de acido nucleico que codifican dichas protemas, vectores que contienen dichas moleculas de acido nucleico, y celulas huesped que expresan dichas protemas. La presente invencion se refiere tambien al uso de dichas protemas morfogeneticas oseas para tratar trastornos, tales como trastornos relacionados con la formacion de huesos y cartflagos. La presente invencion se refiere ademas a dispositivos osteogenicos y composiciones farmaceuticas que contienen dichas protemas.

Antecedentes de la invencion

El fenomeno de la osteoinduccion fue reconocido por Lancroix en 1945 cuando demostro que los extractos oseos de alcohol acido indudan la formacion osea heterotopica en sitios ectopicos. Veinte anos mas tarde, Urist y sus colaboradores descalcificaron la matriz osea y observaron la formacion de nuevo cartflago y hueso cuando se implantaron por via intramuscular. Estos descubrimientos condujeron al aislamiento y purificacion del agente inductor oseo denominado BMPs a partir de la matriz osea de diferentes especies y anos despues a la clonacion y caracterizacion de varios ADNc que codifican estas nuevas protemas. La actividad biologica de las BMPs se ha determinado mediante bioensayo en musculos de rata o de raton o mediante mediciones de ALP en cultivos de celulas de marnfferos.

Estudios anteriores desde 1965 han demostrado que las BMPs son parte de la superfamilia TGF-p, y como todos los miembros de la familia tienen multiples efectos sobre la migracion celular, el crecimiento y la diferenciacion, especialmente en la formacion osea y en la reparacion de tejidos, pero tambien en la embriogenesis o el cancer. Son glicoprotemas hidrofobas de bajo peso molecular que son solubles a agentes caotroficos, tales como urea y clorhidrato de guanidinio, pero son resistentes a varias proteasas, por ejemplo, colagenasas.

Las BMPs se producen como grandes moleculas precursoras que se procesan proteolfticamente a peptidos maduros despues de la traduccion. Al igual que todos los miembros de la superfamilia TGF-p, las BMPs tienen el patron de siete restos de cistema en su region C-terminal madura. Entre estas cistemas hay tres enlaces disulfuro dentro de monomeros BMP maduros, y un enlace disulfuro que combina dos monomeros en un dfmero BMP activo biologicamente.

Las BMPs actuan a traves de receptores transmembrana espedficos situados en la superficie celular de las celulas diana. Los receptores de BMP son serin-treonina quinasas que se asemejan a los receptores de TGF-p y se dividen en dos subgrupos: receptores de tipo I y tipo II. Las BMPs pueden unirse fuertemente solo al complejo heterotetramerico de estos receptores. Esta formacion compleja es esencial para la transduccion de senales BMP. Dentro de la celula diana, las senales BMP se transmiten al nucleo a traves de moleculas de senal espedficas llamadas Smads, que tambien son responsables de la supresion de las senales BMP.

Hasta ahora, se han caracterizado 16 BMPs diferentes y siete de ellas (BMPs 2-7 y 9) han demostrado ser capaces de inducir la formacion osea cuando se implantan en sitios ectopicos. Segun la secuencia de aminoacidos de la parte madura, estas BMPs se dividen en dos subgrupos. Las BMPs 2 y 4 son identicas al 86%, y las BMPs 5, 6 y 7 son identicas al 78%. Entre estos dos grupos la identidad es solo aproximadamente de 56%. La secuencia de aminoacidos de BMP-3 es aproximadamente 45% igual a las BMPs 2 y 4, y la BMP-9 es 50-55% identica a las BMPs 2, 4, 5, 6 y 7. Debido a la alta homologfa y a la pequena variedad en tamano, las BMPs resultan ser muy diffciles, arduas y costosas de separar, purificar e identificar unas de otras a nivel proteico. Esta es la razon por la cual la mayona de las BMPs se producen en la actualidad utilizando herramientas de biologfa molecular. Se han probado diferentes tipos de tecnicas de protema recombinante y se han utilizado tanto sistemas eucariotas como procariotas.

La mayona de las investigaciones se han centrado en las BMPs recombinantes humanas, pero con respecto a la induccion osea eficaz de los cuernos, la familia Cervidae constituye un area de investigacion interesante. Las cornamentas son organos craneales oseos tfpicos de la familia Cervidae y difieren de los cuernos de la familia Bovidae en su patron de crecimiento. Las cornamentas crecen desde la punta y los machos las desechan una vez al ano. Se ha sugerido que las cornamentas son las estructuras de mas rapido crecimiento de las especies de mairnferos y se sabe que son las unicas estructuras que se regeneran completamente cada ano. Los cuernos se forman mediante modificacion de la osificacion endocondral, lo que significa que el proceso se realiza a traves del modelo de cartflago altamente vascularizado que se calcifica y finalmente se transforma en hueso. Los cuernos constituyen un interesante modelo de regeneracion del tejido mineralizado adulto y se ha demostrado que la remodelacion osea continua hasta el momento de la formacion del cuerno.. Aunque la razon fundamental de la sorprendente velocidad del crecimiento de la cornamenta no se ha resuelto todavfa, se ha demostrado que los cuernos contienen varias BMPs. Se ha demostrado que la cornamenta de venado expresa BMP-2 y BMP-4 (Feng et al. 1997 Biochim Biophys Acta 1350: 47-52; Feng et al. 1995 Biochim Biophys Acta 1263:163-168). Ademas, las cornamentas de reno expresan BMP-3b (Kapanen et al. 2002 J Biomed Mat Res. 59:78-83). Sin embargo, tambien

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es posible que haya uno o mas factores totalmente descubiertos que son responsables de la velocidad de crecimiento del cuerno.

Debido a su capacidad osteoinductiva, tanto las BMPs extrafdas a partir de la matriz osea desmineralizada, como las BMPs producidas por la tecnica recombinante, son alternativas muy interesantes y altamente potenciales al injerto oseo. Se han utilizado diferentes BMPs en muchos estudios experimentales y clmicos.

La BMP-3 y 3b son moleculas reguladoras importantes en la induccion osea y en la osteogenesis. Se ha demostrado que la BMP-3 es un componente principal de la osteogenesis, que tiene actividad osteogenica, pero todavfa hay cierta informacion contradictoria de la actividad biologica de la BMP-3 humana recombinante. Segun algunos estudios, posee actividad osteogenica, pero algunos estudios afirman justo lo contrario, y se ha demostrado que desempena un papel inhibitorio en el proceso de formacion de hueso siendo tambien un regulador negativo de la densidad osea. Por ejemplo, WO 02/43759 describe metodos y composiciones para el tratamiento de defectos y enfermedades que implican osteoporosis o afecciones osteopenicas. Dichos metodos comprenden la aplicacion en el sitio osteoporotico o de las afecciones osteopenicas, de una composicion que comprende un inhibidor o antagonista de BMP-3.

Hasta ahora, la BMP-3b ha sido la unica BMP caracterizada en tejido de cornamenta de renos (Kapanen et al. 2002). No se asigno ninguna funcion apropiada para la BMP-3c y se estimo que era un factor dispensable en vista del desarrollo normal. Se encontro que la preparacion de la matriz de cornamenta de renos descalcificada y en polvo inducfa la mineralizacion del hueso.

US 6 245 889 describe protemas BMP-2 y BMP-4 humanas purificadas y procesos para producirlas. Tambien se describe una composicion farmaceutica que comprende dicha BMP-4. Como se conoce generalmente en la tecnica, estas protemas y composiciones pueden usarse en el tratamiento de defectos de hueso y cartflago y en la cicatrizacion de heridas y reparacion detejidos relacionados. Ademas, dicha composicion farmaceutica puede incluir una matriz capaz de suministrar dichas protemas BMP al sitio de dano oseo y/o cartflago, proporcionando una estructura para el hueso y el cartflago en desarrollo y optimamente capaz de ser reabsorbida en el cuerpo. Tales matrices pueden estar formadas de materiales actualmente en uso para otras aplicaciones medicas implantadas.

US 5 399 677 describe moleculas de ADN que codifican formas mutantes de protemas morfogeneticas oseas. Las formas mutantes de BMP pueden producirse bacterialmente y replegarse para producir homodfmeros o heterodfmeros de BMP activos biologicamente. Tambien se describe un metodo para preparar dicha BMP mutante. Dichas formas mutantes son utiles puesto que se pliegan correctamente cuando se producen en huespedes bacterianos.

WO 98/51354 describe dispositivos osteogenicos y metodos de uso de los mismos para la reparacion de defectos de hueso y cartflago. El metodo para producir un nuevo crecimiento oseo en un sitio de defecto oseo en un mamffero comprende la etapa de implantar en un sitio defectuoso una matriz de fosfato de calcio que comprende al menos una protema osteogenica. Dichas protemas osteogenicas incluyen varios morfogenos, tales como protemas morfogeneticas oseas.

EP 1131087 describe el uso adicional para protemas morfogeneticas, tales como protemas BMP. Se muestra que la exposicion de las celulas cancerosas a los morfogenos inhibe el crecimiento de las celulas cancerosas y hace que estas celulas se diferencien del fenotipo cancengeno. El uso de morfogeno puede influir en el destino de las celulas cancerosas y, a su vez, aliviar los smtomas del cancer.

WO94/01557 describe la protema BMP-3 humana y una composicion farmaceutica que contiene a la misma. La composicion puede utilizarse para la implantacion.

Aunque se conocen ya algunas aplicaciones de protemas BMP conocidas como inductores de formacion de hueso y cartflago o para aliviar los smtomas de cancer, todavfa existe la necesidad de mejores metodos para aislar dichas protemas, y de mejores protemas morfogeneticas, por ejemplo, unas que posean propiedades de formacion osea mas eficiente o que sean mas solubles. Tales protemas senan utiles para mejores metodos y aplicaciones terapeuticas. Tambien serian utiles, metodos para producir tales protemas.

Compendio de la invencion

Sorprendentemente, en la presente invencion, se descubrio una nueva protema de tipo BMP-3 a partir de renos, denominada en la presente memoria protema BMP-3c. A pesar de tener una alta homologfa de secuencia con protemas BMP-3 ya conocidas, la BMP-3c tiene propiedades muy ventajosas relacionadas con la formacion de huesos y cartflagos. Dichas propiedades son sustancialmente mejores que las propiedades de las protemas BMP conocidas correspondientes. Dichas protemas morfogeneticas oseas de la presente invencion son utiles para inducir la formacion de huesos y cartflagos en varios tipos de aplicaciones, tales como aplicaciones terapeuticas.

La protema BMP-3c de reno de la presente invencion es homologa al 95% a la protema BMP-3b de renos ya conocida y al 93% homologa a la BMP-3b humana conocida. Como una BMP-3b equivalente de reno era ya conocida, la nueva protema de la invencion se denomino BMP-3c.

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Un aspecto de la presente invencion se refiere a una protema morfogenetica osea 3 aislada (BMP-3) que contiene los aminoacidos esenciales de la secuencia de aminoacidos SEQ ID NO: 1.

Otro aspecto de la presente invencion se refiere a un sitio de union a heparina combinado con dicha protema morfogenetica osea. El sitio de union a heparina mejora la expresion de la protema BMP recombinante, y tambien mejora la actividad biologica de la misma.

En la presente memoria se describe una molecula de ADN aislada que codifica dicha protema morfogenetica osea.

Tambien se describe un vector de acido nucleico que contiene dicha molecula de ADN aislada.

Tambien se describe una celula huesped recombinante que contiene dicha molecula de ADN o el vector de acido nucleico mencionado anteriormente.

Otro aspecto mas de la presente invencion se refiere a una protema morfogenetica osea que se produce cultivando dicha celula huesped recombinante para expresar dicha protema morfogenetica osea, y recuperando dicha protema morfogenetica osea a partir de dicha celula huesped.

Tambien se describe una celula huesped recombinante que expresa dicha protema morfogenetica osea.

Otro aspecto mas de la presente invencion se refiere a una composicion farmaceutica que contiene dicha protema morfogenetica osea.

Otro aspecto mas de la presente invencion se refiere a dicha protema morfogenetica osea aislada para usar como un medicamento.

Otro aspecto mas de la presente invencion se refiere al uso de dicha protema morfogenetica osea aislada para fabricar un medicamento para trastornos relacionados con defectos oseos o cartilaginosos en donde se desea la regeneracion, reparacion o crecimiento de los mismos.

Otro aspecto mas de la presente invencion se refiere a un dispositivo osteogenico para tratar dichos trastornos, dicho dispositivo contiene dicha protema morfogenetica osea aislada.

Tambien se describe un metodo para inducir la formacion de cartflago y/o hueso para tratar dicho cartflago y/o hueso con dicha protema morfogenetica osea aislada.

Tambien se describe un metodo para tratar dichos trastornos relacionados con defectos oseos o cartilaginosos en donde se desea la regeneracion, reparacion o crecimiento de los mismos, u otras enfermedades, tales como el cancer, administrando dicha protema morfogenetica osea aislada a un paciente que padece de dichos trastornos.

Tambien se describe un metodo para mejorar la expresion de una protema BMP recombinante en un huesped bacteriano mediante la adicion de un sitio de union a heparina al amino terminal de dicha protema a expresar.

Tambien se describe un metodo para mejorar o potenciar la actividad biologica de una protema BMP recombinante mediante la adicion de un sitio de union a heparina al amino terminal de dicha protema.

Tambien se describe un metodo para expresar una protema BMP en un huesped bacteriano, tal como E coli, mediante la adicion de un sitio de union a heparina al amino terminal de dicha protema, en donde la protema muestra una inmunogenicidad disminuida cuando se compara con una BMP expresada,por ejemplo, en un huesped de levadura.

Breve descripcion de los dibujos

La Figura 1 muestra plasmidos que contienen insertos de rdBMP-3c en el vector pGEM-T® PCR (Promega).

La Figura 2 muestra plasmidos que contienen insertos de rdBMP-3c en el vector de expresion pTrcHis2 (Invitrogen).

La Figura 3 muestra plasmidos que contienen insertos de rdBMP-3c en el vector de expresion pET-22b(+) (Novagen).

La Figura 4 muestra las secuencias de aminoacidos y nucleotidos de la parte madura de BMP-3c de reno expresada a partir de pTrcrd3c. La parte madura de BMP-3c de reno aparece en el recuadro y los restos de cistema tfpicos para la superfamilia de TGF-p estan marcados con letras en negrita.

La Figura 5 muestra las secuencias de aminoacidos y nucleotidos de la parte madura de BMP-3c de reno expresada a partir de pETrd3c. La parte madura de BMP-3c de reno aparece en el recuadro y los restos de cistema tfpicos para la superfamilia de TGF-p estan marcados con letras en negrita.

La Figura 6 muestra el aminoacido parcial y la secuencia de nucleotidos de BMP-3c de reno. La parte madura aparece en el recuadro y los restos de cistema tipicos para los miembros de la superfamilia TGF-p estan marcados con letras en negrita.

La Figura 7 muestra imagenes de rayos X de un musculo de la extremidad posterior de raton: A) referencia y B) 5 implantadas con BMP-3c de la presente invencion.

La Figura 8 muestra una electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecilsulfato sodico (de sus siglas en ingles, SDS-PAGE) tenida con colorante Coomassie de las fracciones eluidas a partir de la columna HiTrap (Ejemplo 3C). Las bandas representan 1) material de partida, 2) curso del flujo, 3) primer lavado, 4) segundo lavado, 5) elucion por gradiente de pH, pH 8, 6) elucion por gradiente de pH, pH 6,2, 7) elucion por gradiente de pH, pH 5,3, y 8 ) elucion 10 por gradiente de pH, pH 4,0, 9) patron..

Descripcion detallada de la invencion

Entre las especies de mairnferos, la homologfa de las partes maduras previamente conocidas de BMP-3 es alta. La clonacion y caracterizacion de la parte madura de BMP-3c de reno revelo que a nivel de aminoacidos tiene la homologfa mas alta con la BMP-3b de reno (95%) y la BMP-3b humana (93%).

15 Las homologfas de nucleotidos y aminoacidos de las protemas BMP-3b y BMP-3 entre especies de mamfferos se presentan en la tabla 1 y en la tabla 2, respectivamente. La BMP-3b se ha caracterizado previamente a partir de seres humanos, ratones y ratas. La comparacion de la homologfa a nivel de nucleotidos oscila entre 87-92%, y a nivel de aminoacidos entre 94-97%. Ademas de los organismos anteriormente mencionados, la BMP-3b tambien ha sido clonada a partir de renos. La homologfa de aminoacidos de la BMP-3b de diferentes mamfferos oscila entre 9420 97%, y la homologfa de nucleotidos de 87-92%. La secuencia de nucleotidos de la BMP-3c de reno y la

correspondiente secuencia de aminoacidos del ADNc parcial de BMP-3c de reno se muestran en la Figura 6. Generalmente las BMP-3s tienen tambien homologfa con otros tipos de BMPs.

Tabla 1. Homologfa de las partes maduras de BMP-3b de diferentes mamfferos a nivel de nucleotidos y aminoacidos presentada como porcentajes (%) (nt = nucleotidos, aa = aminoacidos).

Organismo

Humano Raton Rata Reno rdBMP-3c

aa nt aa nt aa nt aa nt aa nt

Humano

100 100 92 88 92 87 89 88 93 89

Raton

92 88 100 100 97 96 87 86 91 87

Rata

92 87 97 96 100 100 87 85 91 86

Reno

89 88 87 86 87 85 100 100 95 96

rdBMP-3c

93 89 91 87 91 86 95 96 100 100

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Tabla 2. Homologfa de las partes maduras de BMP-3 de diferentes marnfferos a nivel de nucleotidos y aminoacidos presentada como porcentajes (%) (nt = nucleotidos, aa = aminoacidos).

Organismo

Humano Raton Rata rdBMP-3c

aa nt aa nt aa nt aa nt

Humano

100 100 94 88 97 87 81 69

Raton

94 88 100 100 97 92 73 71

Rata

97 87 97 92 100 100 80 71

rdBMP-3c

81 69 73 71 80 71 100 100

La siguiente alineacion muestra las secuencias de aminoacidos de las protemas BMP-3b maduras de reno y de ser 30 humano, y de BMP-3c de reno de la presente invencion (preparada con el programa ClustalX 1,8 (Thompson, J.D., Higgins, D.G. y Gibson, T.J. (1994) Nucleic Acids Research, 22: 4673-4680), rdBMP-3c = BMP-3c de reno, rdBMP- 3b = BMP-3b de reno, hBMP-3b = BMP-3b humana, los asteriscos muestran los mismos aminoacidos).

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rdBMP-3c

rdBMP-3b

hBMP-3b

RKKGQDVFMASSQVLDFDEKTMQKARKKQWDEPRVCSRRYLKVDFADIGWNEWIISPKSF

RKKGQDVFMASSQVLDFDEKTMQKA-KKQVGEPRVCSRRYLKVDFADIGWNEWIISPKSF

RKKGQEVFMAASQVLDFDEKTMQKARRKQWDEPRVCSRRYLKVDFADIGWNEWIISPKSF

rdBMP-3c

rdBMP-3b

hBMP-3b

DAYYCSGACEFPMPKMVRPSNHATIQSIVRAVGIVPGIPEPCCVPDKMSSLGVLFLDENR

DAYYCSGACEFPMPRWVRPSNHATIQSIVRAVGIVPGIPEPCCAPDKMSSLGVLFLDENR

DAYYCAGACEFPMPKIVRPSNHATIQSIVRAVGIIPGIPEPCCVPDKMNSLGVLFLDENR

★ ★ ★ ★ ★ ★★★★★★★★★★★

rdBMP-3c

rdBMP-3b

hBMP-3b

NVVLKVYPNMSVETCACQ

NVVLKVYPNMSVETCACQ

NVVLKVYPNMSVDTCACR

La "protema BMP-3 de la invention" o "protema morfogenetica osea de la invention" se refiere a una protema que tiene actividad morfogenetica osea (o morfogenica osea,ambas palabras se emplean de forma intercambiable), tal como la BMP-3c aislada a partir de renos como se describe en la presente memoria (SEQ ID NO: 1 del listado de secuencias adjunto o la rdBMP-3c en la alineacion anterior). Tambien se describen homologos, analogos, derivados y fragmentos de los mismos. Dichos homologos o derivados incluyen derivados funcionales de dicha protema, tales como protemas derivadas de la protema BMP-3c de reno original o cualquier BMP de cualquier especie. Los derivados pueden diferir en longitud y pueden contener inserciones, deleciones y sustituciones de aminoacidos, como bien sabe el experto en la tecnica. Una caracteristica de la BMP de la presente invencion, por ejemplo,como se describe en la alineacion anterior, es que los aminoacidos se diferencian de los de protemas BmP-3 conocidas, tales como que los aminoacidos difieren de los de la BMP-3c humana o de la BMP-3c de reno. Preferiblemente, las regiones que contienen estos aminoacidos se conservan en una BMP de la presente invencion. Los aminoacidos 26 y 104 definen la region que contiene aminoacidos que difieren de la BMP-3b equivalente de reno y los aminoacidos 6 y 138 definen la region que contiene aminoacidos que difieren de la BMP-3b equivalente humana.

Por otra parte, las inserciones, deleciones y sustituciones situadas lejos de dicha area caracteristica, probablemente no puedan causar cambios sustanciales en la funcion, efecto o plegado de la BMP de la presente invencion. En la presente memoria se describen ejemplos de homologos que tienen deleciones, tales como deleciones de pocos aminoacidos, preferiblemente 1-10 aminoacidos, mas preferiblemente 1-5 aminoacidos, lo mas preferiblemente 1-3 aminoacidos, en el carboxilo terminal o amino terminal, dando como resultado un polipeptido mas corto en donde dichas deleciones no afectan a los aminoacidos caracteristicos de la BMP de la invencion. Se prefiere que dichos homologos tengan las propiedades ventajosas de la protema BMP-3c de reno original, estando dichas propiedades relacionadas con dichos aminoacidos caracteristicos y/o la region que los rodea. Dichos homologos pueden tener sustituciones de aminoacidos que no afectan sustancialmente a la funcion y el efecto de la protema de la invencion. Por ejemplo, un aminoacido no localizado en el sitio activo o cerca de el puede estar sustituido por otro aminoacido que tenga propiedades estructurales y/o qmmicas similares (por ejemplo, hidrofobo o hidrofilo), es decir, una sustitucion conservadora de aminoacidos, siempre y cuando dicha sustitucion no altere sustancialmente la funcion o el plegamiento de la protema madura. Estos tipos de sustituciones son bien conocidos y comprendidos en la tecnica. Ejemplos de tales propiedades de aminoacidos divididos en grupos son, hidrofobicos (Met, Ala, Val, Leu, Ile), hidrofflicos neutros (Cys, Ser, Thr), acidos (Asp, Glu), basicos (Asn, Gin, His, Lys, Arg), restos que influyen en la orientation de las cadenas (Gly, Pro), y aminoacidos aromaticos (Trp, Tyr, Phe). Generalmente las sustituciones dentro de dichos grupos es problable que no causen cambios importantes en la estructura del esqueleto del polipeptido (por ejemplo, una conformation laminar o helicoidal), en la carga o hidrofobicidad de la molecula o en el volumen de la cadena lateral.

Los homologos de la BMP descritos en la presente memoria incluyen, por ejemplo, cualquier protema morfogenetica osea conocida, tal como la BMP-3 o equivalente de la misma, que contiene o se ha modificado para contener al menos parte de los aminoacidos o secuencias conservadas, como se ha descrito anteriormente o que corresponden al area en una protema BMP-3 homologa en el caso de que la numeration sea diferente. Tambien se describe cualquier protema BMP-3c actualmente desconocida de cualquier especie modificada como se describe anteriormente.

Cuando se compara con la protema conocida BMP-3b de reno, la BMP-3c tiene un aminoacido R26 insertado y cinco aminoacidos sustituidos W30, D31, K75, M76 y V104, calculados a partir de la protema BMP-3c madura como se describe en SEQ ID NO: 1. Cuando se compara con la protema BMP-3b humana conocida, la BMP-3c tiene nueve aminoacidos sustituidos D6, S11, K27, S66, M76, V95, S109, E133 y Q138 definidos a partir de la protema

BMP-3c madura como se describe en SEQ ID NO: 1. Estos aminoacidos son caracteristicos de la BMP de la presente invention. Sin embargo, como E133 y Q138 se encuentran en el extremo del carboxilo terminal de la protema madura, no pueden desempenar un papel importante en la funcion de la protema.

En una realization, la BMP de la presente invencion es cualquier BMP-3 que contiene una secuencia de consenso 5 de la familia BMP-3. Un ejemplo de dicha secuencia de consenso es la siguiente secuencia derivada de la siguiente alineacion de ClustalX en donde se alinean varias protemas BMP-3 de diferentes especies, correspondiendo dicha secuencia a los aminoacidos 26-104 de SEQ ID NO: 1. En dicha secuencia de consenso se fijan los aminoacidos caracteristicos de la rdBMP-3c que difieren de la rdBMP-3b conocida (un aminoacido R26 insertado y cinco aminoacidos sustituidos W30, D31, K75, M76 y V104) pero se permiten otras variaciones conservadoras entre la 10 familia BMP-3.

R-K-K-Q-W-D-E-P-R-V/N-C-S/A-R-R-Y-L-K-V-D-F-A-D-I-G-W-N/S-E-W-I-I-S-P-K-S-F-D-A- Y-Y-C-S-G-A-C-E/Q-F-P-M-P-K-M-V/L-R/K-P-S-N-H-A-T-I-Q-S-I-V-R-A-V-G-I/V-V-P/S-G- I-P-E-P-C-C-V

Tambien pueden definirse otras secuencias de consenso, por ejemplo aquellas que definen un area entre los aminoacidos 6-104, 6-109 o 6-138 de SEQ ID NO: 1, o secuencias similares que difieren en longitud, por ejemplo, por 1-20 aminoacidos. Dichas secuencias de consenso pueden definirse a partir de la alineacion de abajo o 15 alineaciones similares hechas mediante alineacion de diferentes protemas BMP relacionadas. Las secuencias de BMP alineadas son a partir de reno, ser humano, rata y rana de garras africana (Xenopus laevis).

BMP3C_ RENO BMP3_ HUMANA BMP3_RATA BMP3_ XENOPUS BMP 3 B_ RENO BMP3B_ HUMANA

RKKGQDVFMASSQVLDFDEKTMQKARKKQWDEPRVCSRRYLKVDFADIGWNEWIISPKSF KKKQRKGPHRK5QTLQFDEQTLKKARRKQWIEPRNCARRYLKVDFADIGWSEV7IISPKSF KKKQRKGPHQKGQTLQFDEQTLKKARRKQWIEPRNCARRYLKVDFADIGVJSEWIISPKSF KKKLRKGSRQKSQTLQFDEQTLKKARRKQWHEPRMCARRYLKVDFADIGWSEWIISPKSF RKKGQDVFMASSQVLDFDEKTMQKA-KKQVGEPRVCSRRYLKVDFADIGWNEWIISPKSF RKKGQEVFMAA5QVLDFDEKTMQKARRKQWDEPRVCSRRYLKVDFADIGWWEVJII5PKSF • * * . * *•***•*••** «** *** *************** *********

BMP3C RENO BMP3_ HUMANA BMP3_ RATA BMP3_ XENOPUS BMP3B_ RENO BMP3B HUMANA

DAYYCSGACEFPMPKMVRPSUHATIQSIVRAVGIVPGIPEPCCVPDKMSSLGVLFLDEMR DAYY C SGACQFPMPKSLKPSNHATIQSIVRAVGWPGIPEPCCVPEKMSSLSILFFDENK DAYYCSGACQFPMPKSLKPSMHATIQSIVRAVGWSGIPEPCCVPEKMSSLSILFFDEMK DAYY C SGACQFPMPKSLKPSNHATIQSIVRAVGWPGIPEPCCVPEKMSSLSILFLDENK DAYYCSGACEFPMPRWVRPSNHATIOSIVRAVGIVPGIPEPCCAPDKMSSLGVLFLDENR DAYYCAGACEFPMPKIVRPSNHATIQSIVRAVGIIPGIPEPCCVPDKMNSLGVLFLDENR *************** ******************* ******* * * * * * * ********

BMP3C_RENO BMP3_HUMANA BMP3_ RATA BMP3 XENOPUS BMP3B_RENO BMP3B HUMANA

NWLKVYPUMSVETCACQ HWLKVYPUMTVESCACR HWLKVY PNMTV D5CA C R NWLKVYPNMTVESCACR UWLKVYPNMSVETCACQ HWLKVYPUMSVDTCACR

En una realizacion de la presente invencion dicha BMP es una BMP-3 que comprende los aminoacidos 26-104 de la 20 SEQ ID NO: 1. Dichas posiciones de aminoacidos se calculan a partir del amino terminal de cualquier protema BMP- 3 madura general, tal como la protema BMP-3c de SEQ ID NO: 1 o un homologo, derivado o fragmento de la misma, en donde la secuencia en el amino terminal comienza con RKKGQ, como por ejemplo en reno (vease la alineacion de secuencia anterior o SEQ ID NO: 1), o en el area correspondiente. Si hubiera inserciones o deleciones de aminoacidos en la secuencia de aminoacidos de dicho homologo que afectan a la numeration, estas deben tenerse 25 en cuenta al definir la ubicacion de dichos aminoacidos esenciales, por ejemplo alineando las secuencias como se describe, y definiendo a continuacion las localizaciones de dichos aminoacidos. Sin embargo, cualquiera de dichos homologos de la BMP deberian tener sustancialmente la funcion y la eficacia descritas en la presente memoria. Debido a que todas las protemas BMP-3 conocidas estan altamente conservadas, definir la localization de dichos aminoacidos esenciales es ineqmvoca, tal como en el caso de la BMP-3b humana. Por ejemplo, en la rdBMP-3b hay 30 una deletion de un aminoacido cuando se compara con rdBMP-3c, como se muestra en la alineacion anterior, pero todavia se pueden definir facilmente los aminoacidos correspondientes en las secuencias comparadas. Ademas,

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dichas ubicaciones se pueden definir facilmente tambien a partir de otras BPMs (vease la alineacion anterior). Generalmente, dicho nivel de homologfa puede ser de al menos 70%, preferiblemente 80%, mas preferiblemente 93%, y lo mas preferiblemente 95% a nivel de aminoacidos.

En otra realizacion, la BMP de la presente invencion es una BMP-3 que contiene los aminoacidos 6-104 de la SEQ ID NO: 1. En otra realizacion, la BMP de la presente invencion es una BMP-3 que contiene los aminoacidos 6-109 de la SEQ ID NO: 1. En otra realizacion, la bMp de la presente invencion es una BMP-3 que contiene los aminoacidos 6-138 de la SEQ ID NO: 1. En otra realizacion, la bMp de la presente invencion es BMP-3 que contiene la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO: 1.

Otra realizacion de la presente invencion proporciona la BMP como se describe anteriormente con un sitio de union a heparina (HBS). Generalmente, esta es una secuencia de aminoacidos capaz de unirse a la heparina. En una realizacion, dicho sitio de union a heparina esta situado en el amino terminal de dicha BMP, tal como antes de la secuencia de SEQ ID NO: 1 u homologo funcional de la misma. En una realizacion, el sitio de union a heparina contiene la secuencia de aminoacidos AKHKQRKRGT. Tambien se describe la secuencia QAKHKQRKRGT. El sitio de union a heparina mejora la expresion de la protema BMP recombinante y tambien mejora la actividad biologica de la misma. Ademas, el sitio de union a heparina ayuda significativamente a la expresion de protemas morfogeneticas oseas recombinantes en celulas bacterianas, tales como E. coli.

Un ejemplo proporciona una molecula de acido nucleico, tal como una molecula de ADN o ARN, que codifica dicha BMP de la invencion. Debido a la degeneracion del codigo genetico, hay una serie de diferentes secuencias de acido nucleico que codifican la BMP de la invencion. Preferiblemente, dicha molecula de acido nucleico es una molecula de ADN. Ejemplos de dichas secuencias de ADN se describen en las figuras 4-6.

Un ejemplo proporciona un vector replicable que contiene la molecula de acido nucleico descrita anteriormente en asociacion operativa con una secuencia de control de la expresion del mismo. Tal vector puede usarse para producir BMP recombinante de la presente invencion en un sistema huesped adecuado.

El acido nucleico que codifica la BMP de la invencion puede insertarse en dicho vector replicable para la clonacion o para la expresion. Varios vectores estan disponibles publicamente. El vector puede estar, por ejemplo, en forma de un plasmido, cosmido, partfcula vmca o fago. La secuencia de acido nucleico apropiada puede insertarse en el vector mediante una variedad de procedimientos. En general, el ADN se inserta en un sitio o sitios de restriccion a endonucleasa apropiado usando tecnicas bien conocidas en la tecnica. Los componentes vectoriales pueden incluir, por ejemplo, una o mas secuencias senal, un origen de replicacion, uno o mas genes marcadores, un elemento potenciador, un promotor, y una secuencia de terminacion de la transcripcion. La construccion de tales vectores adecuados que contienen uno o mas de estos componentes emplea tecnicas de ligacion estandar que son bien conocidas por un experto en la tecnica.

Generalmente dicha BMP se puede producir recombinantemente mediante la expresion en cualquier celula huesped adecuada, tal como en una celula huesped bacteriana. Tales metodos son bien conocidos en la tecnica y se describen en la bibliograffa. Es esencial que la protema se pliegue correctamente durante la expresion y que contenga las modificaciones post-traduccionales necesarias.

No siempre es posible expresar y purificar ciertas protemas adecuadamente, por ejemplo debido a problemas de solubilidad o replegamiento. Generalmente E coli no puede realizar modificaciones post-traduccionales tfpicas de los sistemas celulares de mairnferos. Sin embargo, los inventores de la presente invencion han producido la parte madura de la BMP-3c recombinante de reno en E coli, y despues de la purificacion y el replegado demostraron que estaba en una forma activa biologicamente.

Hay ciertos beneficios cuando una protema, tal como una BMP, se expresa en un huesped bacteriano, tal como E coli. La protema generalmente muestra menor inmunogenicidad cuando se compara con una protema similar expresada, por ejemplo, en el huesped de levadura. Esto puede ser util mas tarde cuando se utiliza la protema, por ejemplo, administrada como un medicamento. E coli produce protemas sin modificaciones, tales como glicosilacion. Esto es particularmente util para las protemas para las que la glicosilacion no es un requisito, pero que podna ser un problema si la protema se produce en otros sistemas (por ejemplo, levadura), que puede sobre-glicosilar, o anadir carbohidratos inadecuados a la protema, lo que podna conducir a una actividad reducida o nula de la protema expresada, y crear potencialmente un riesgo de inmunogenicidad (Pedro de Noronha Pissarra: Recombinant DNA Proteins for the Biopharmaceutical Industry and the Future for Escherichia coli. Business Briefing: Pharma Outsourcing, Londres, 2004).

Un ejemplo describe una celula huesped que contiene la molecula de nucleotido o el vector de nucleotidos descrito anteriormente. Las celulas adecuadas incluyen todas las celulas procariotas y eucariotas que son capaces de expresar la protema de la invencion. Dichas celulas huesped son bien conocidas en la tecnica y un experto en la tecnica puede elegir facilmente una adecuada. Otro ejemplo proporciona una BMP producida cultivando dicha celula para expresar dicha protema, y recuperando dicha protema expresada a partir de dicha celula huesped. Se puede emplear cualquier metodo adecuado para recuperar o aislar la protema, y tales metodos son bien conocidos en la tecnica.

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La BMP de la invencion puede usarse para tratar trastornos relacionados con defectos o enfermedades del hueso, cartflago, tendon o periodonto,, o similares, en donde se desea la regeneracion, reparacion o crecimiento de los mismos. En un ejemplo, la protema de la invencion tambien se puede usar para curar heridas, tales como quemaduras, incisiones y ulceras, y para la reparacion de tejidos relacionados, y tambien para el tratamiento del cancer, como se describe en EP 1131087. Dado que las protemas BMP generalmente carecen de especificidad de especie, el paciente que padece dicho defecto puede ser cualquier animal adecuado, preferiblemente mairnfero, tal como el ser humano, y la protema BMP que se emplea para el tratamiento puede ser de cualquier origen adecuado. El uso de protemas BMP relacionadas para varios tipos de aplicaciones terapeuticas es bien conocido en la tecnica (vease, por ejemplo, US 6 245 889 y WO 98/51354).

"Trastornos relacionados con defectos del hueso, cartflago, tendon o dientes", como se emplea en la presente memoria, se refiere generalmente a cualquier trastorno conocido en el que se desee la curacion o reconstruccion, es decir, la regeneracion, del hueso, cartflago, tendon o periodonto, Ejemplos no limitantes de tratamientos de trastornos relacionados con defectos o enfermedades oseos, cartilaginosos, tendinosos o periodontales, o similares, son la regeneracion, reparacion y crecimiento del tejido oseo y periodontal; regeneracion, reparacion y crecimiento oseo en mamfferos, tales como en el ser humano; tratamiento de anomalfas en la formacion o regeneracion osea; cicatrizacion de heridas, induccion osea ectopica, y cicatrizacion de defectos oseos segmentarios en vertebrados; tratamiento de trastornos y deformaciones del esqueleto; reparacion de grandes defectos oseos originados por traumatismos, extirpacion de tumores o malformaciones congenitas, reconstruccion de los huesos gastados por una endoprotesis implantada en operaciones de revision, y curacion de fracturas retrasadas o no unidas; reparacion de defectos oseos y cartilaginosos, tales como defectos de tamano cntico, defectos de tamano no cntico, fracturas no unidas, fracturas no unidas segmentarias; fracturas agudas, defectos condrales, defectos osteocondrales, defectos subcondrales; formacion de huesos y cartflagos locales; defectos resultantes de enfermedades degenerativas; aplicaciones dentales, tales como la reparacion de tejidos periodontales, hueso alveolar, cemento dental, membrana de la rafz dentaria ,relleno del conducto radicular dentario, y mejora o potenciacion de la fijacion del implante dental. Ejemplos de tales trastornos se pueden encontrar en Ann Rheum Dis, Volumen 62, 2003, 73-78: Reddy AH: Cartilage morphogenetic proteins: role in joint development, homoeostasis.and regeneration.

Otros ejemplos de enfermedades en donde la BMP de la presente invencion es util son, por ejemplo, el cancer, especialmente el cancer de pulmon, fibromialgia, psoriasis y otros trastornos dermatologicos, y trastornos reumaticos, y similares. Ejemplos de tales canceres, y metodos y composiciones para su tratamiento, se describen en EP 1131087.

En una realizacion, la BMP-3 de la presente invencion puede proporcionarse, en cualquier aplicacion descrita en la presente memoria, junto con una o mas protemas morfogeneticas adicionales, tales como otra especie de protema BMP, o similar. Generalmente, esto proporciona un efecto sinergico, tal como se conoce en la tecnica. Ejemplos de otras protemas BMP adecuadas son, pero no se limitan a, BMP-1, BMP-2, otras BMP-3, BMP-4, BMP-5, BMP-6, BMP-7 y BMP-8. Tambien pueden proporcionarse otros agentes utiles terapeuticamente, tales como el factor de crecimiento epidermico, factor de crecimiento de fibroblastos, y factores de crecimiento transformantes (US 6 245 889). En una realizacion, dicha protema morfogenetica adicional se origina a partir de renos, tal como cualquier otra protema BMP de reno. En una realizacion, la BMP de la presente invencion se proporciona como un dfmero, como un homodfmero o como un heterodfmero junto con otra protema BMP como se ha descrito anteriormente. En otra realizacion, se utiliza la BMP como un dfmero o junto con otro factor o protema, como se describe anteriormente, para la fabricacion de un medicamento para tratar trastornos descritos en la memoria.

En una realizacion de la presente invencion se proporciona un dispositivo osteogenico, el cual es un implante, que contiene la BMP de la invencion. El dispositivo osteogenico puede contener una matriz biocompatible, tal como una matriz de fosfato de calcio, carboximetilcelulosa o colageno, o combinaciones de los mismos. En una realizacion dicha matriz de fosfato de calcio es una matriz de hidroxiapatita. Dicha matriz puede proporcionar una liberacion lenta de la protema BMP y/o proporcionar el entorno apropiado para la presentacion de la protema BMP. El dispositivo osteogenico tambien puede contener un implante de metal rodeado por dicha matriz biocompatible. Un ejemplo de dicho metal es titanio. Algunos ejemplos de tales dispositivos osteogenicos se describen en WO 98/51354.

Ejemplos no limitantes de los diferentes materiales estructurales, transportadores o de soporte para formar, por ejemplo, diferentes tipos de dispositivos osteogenicos, o similares, con la protema de la presente invencion, son un medio en forma de polvo, esponja, tira, pelmula, gel, banda o disolucion o suspension; un vehmulo lfquido semi- solido adecuado para inyeccion intramuscular, intravenosa, intramedular o intra-articular; celulas madre mesenquimales aisladas; cualquier vehmulo aceptable farmaceuticamente; autoinjerto o aloinjerto en forma de costra; cualquier matriz aceptable farmaceuticamente; un material seleccionado del grupo que comprende hidroxiapatita, colageno, polfmeros (por ejemplo, acido polilactico, acido poliglicolico), polfmeros sinteticos, acido hialuronico, a-BSM, fosfato de calcio, fosfato tricalcico, biopolfmeros ceramicos aporosos, biopolfmeros reabsorbibles aporosos, coral, hueso desmineralizado, biovidrio, cualquier material biodegradable y combinaciones de los mismos; agentes ligantes seleccionados del grupo que comprende manitol, dextranos, vaselina blanca, alquil y metilcelulosas, agentes humectantes, tales como sal de sodio, pegamento de fibrina, fibrinogeno y trombina de mamffero, y combinaciones y mezclas de los mismos. El dispositivo osteogenico puede ser, por ejemplo, un implante tridimensional estructuralmente estable, en forma de cubo, cilindro o bloque, o en la forma de una forma anatomica o

una forma inyectable. Ejemplos de dispositivos osteogenicos, materiales utiles, y tecnicas, se describen en el libro "Skeletal reconstruction and bioimplantation" (T. Sam Lindholm, 1997, Springer-Verlag, Heidelberg, Alemania).

En una realizacion de la presente invencion, se proporciona una composicion farmaceutica que contiene una cantidad eficaz terapeuticamente de BMP de la invencion, junto con un vehmulo o transportador aceptable 5 farmaceuticamente. Dichas composiciones farmaceuticas pueden usarse para tratar trastornos relacionados con defectos o enfermedades del hueso, cartflago, tendon o periodonto, heridas y otros defectos tisulares, o cualquier otro trastorno descrito en la presente memoria.

Un ejemplo describe un metodo para inducir la formacion de hueso, cartflago, tendon, diente, o similar, en el que dicho hueso, cartflago, tendon, diente, o similar, se trata con la BMP de la invencion o combinaciones de la misma 10 como se describe anteriormente, in vitro o in vivo. Otro ejemplo describe un metodo para tratar trastornos descritos en la memoria que comprende administrar la BMP aislada de la presente invencion a un paciente que padece de dichos trastornos. Dicha BMP puede administrarse como una composicion farmaceutica o como un dispositivo osteogenico descrito anteriormente. Otras protemas morfogeneticas u otros agentes utiles pueden administrarse conjuntamente con dicha BMP de la invencion, como se describe anteriormente, para potenciar el efecto terapeutico.

15 En la siguiente descripcion y ejemplos se describe como se produjo la parte madura de BMP-3c recombinante de reno, con y sin sitio de union a heparina (HBS), segun las realizaciones en E coli de la presente invencion. Despues de la purificacion y replegamiento, se verifico la actividad osteoinductiva mediante bioensayo en musculos tensos de raton. El bioensayo in vivo es un metodo estandar utilizado para ensayar la actividad de la BMP desde su descubrimiento. Este incluye la implantacion de BMP en el musculo de la extremidad posterior de un raton, y la 20 estimacion de la induccion heterotopica de hueso nuevo despues de 10-21 dfas por radiologfa e histologfa.

La osteoinduccion se observo en los cuatro grupos de estudio (1 mg, 3 mg, 5 mg, y 8 mg, de BMP-3c recombinante de reno) y aumento de manera dependiente de la dosis (Tabla 3).

BMP-3c,3e

Dosis

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Reno

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BMP-3C110

Dosis

1 mg 3 mg 5 mg 10 mg

Reno

- + (+) + ++ ++ + - + + +++ +

Tabla 3. Comparacion de las respuestas de osteoinduccion de protemas BMP-3c-i38 y BMP-3cno de reno, con 25 diferentes dosis.

Los resultados del bioensayo in vivo se muestran en la figura 7. La figura 7A es una referencia, y la 7B es una muestra implantada con BMP-3c de la presente invencion. El bioensayo se llevo a cabo como se describe en Marshall R. Urist, J.J. Chang, A. Lietze, Y. K. Huo, A. G. Brownell y R. J. DeLange (1987): Preparation and Bioassay of Bone Morphogenetic Protein and Polypeptide Fragments, Methods Enzymol 146: 294-312.

30 Hubo grandes dificultades para obtener la parte madura de rdBMP-3c recombinante expresada en E coli TOP10. Por lo tanto, los inventores asumieron que la mala expresion fue causada por el alto contenido de GC en la region N- terminal de la parte madura de rdBMP-3c. Debido a que el sitio de union a heparina (HBS), que existe en el comienzo de la parte madura de BMP-2 de reno, esta codificado por una secuencia de nucleotidos con bajo contenido de GC, se creo una construccion en la que se anadio esta secuencia HBS delante de la secuencia de la 35 parte madura de rdBMP-3c,y de esta manera los inventores lograron mejorar la expresion recombinante.

El HBS localizado en el N-terminal de rdBMP-2 contiene 10 restos de aminoacidos basicos y recuerda a sitios de union a heparina conocidos o postulados en otros factores de crecimiento. Tambien es posible que la interaccion entre la protema y el HBS y la matriz extracelular, pudiera tener un efecto importante en el establecimiento de los

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gradientes morfogeneticos durante el desarrollo, limitando la libre difusion de una protema. Por lo tanto, se supone que el HBS tambien podna mejorar la actividad biologica de rdBMP-3c recombinante prolongando la duracion de la desaparicion de la protema desde el sitio de implantacion.

Ejemplos

Clonacion de ADNc de BMP-3c de reno y analisis de comparacion de homolog^a

El producto de PCR, alrededor de 400 pb, se aislo y clono en el vector pGEM-T®. La secuencia de nucleotidos obtenida a partir de reacciones de ABI Prism, se analizo con ordenador y se comparo con secuencias de BMP humanas ya conocidas. Gracias a las investigaciones de homologfa, el ADNc recien clonado pareda ser mas homologo con la BMP-3b humana (homolog^a de nucleotidos 89% y homologfa de aminoacidos 93%) en comparacion con la BMP-3 humana (homologfa de nucleotidos 69% y homologfa de aminoacidos 81%). Cuando se comparo con todas las BMPs conocidas, el ADNc recien clonado pareda ser el mas homologo con la BMP-3b de reno (homologfa de nucleotidos 96% y homologfa de aminoacidos 95%). Por lo tanto, el ADNc de la presente invencion se denomino BMP-3c de reno.

Expresion de la parte madura de BMP-3c de reno en celulas TOP10, Rosetta y Origami de E. coli,

En estudios previos, la BMP-3 humana se ha producido en celulas CHO, en celulas E coli y usando el sistema retroviral. Ademas, la BMP-3 humana y la BMP-3b de rata se han producido como protemas recombinantes utilizando un sistema adenoviral. Sin embargo, no se ha producido ningun miembro de la subfamilia de BMP-3 de origen animal de ciervo, como protema recombinante.

Los 414 nucleotidos que corresponden a la parte madura larga de 138 aminoacidos de la BMP-3c de reno se subclonaron a partir del vector pGEM-T® en el vector pTrcHis2A,y se analizo la expresion de la protema recombinante en celulas TOP 10 E coli (Invitrogen), pero no se observo induccion. Se llego a la conclusion de que esto podna ser causado por un alto contenido de GC en el inicio de la rdBMP-3c. Tambien se observo que el sitio de union a heparina existente en el comienzo de la parte madura de BMP-2 de reno tema un contenido de GC muy bajo, y anadiendolo frente a la parte madura de BMP-3c de reno, tambien podna utilizarse como una parte del procedimiento de purificacion. Por lo tanto, la parte madura de BMP-3c/138 y BMP-3c/110 se clonaron en el vector pTrcHBS, y se obtuvieron pTrcH-BSBMP-3c/l38 y pTrcHBSBMP-3c/110. La induccion exitosa, tanto de HBSrdBMP- 3c/138 recombinante, como de HBSrdBMP-3c/1l0, se verifico por SDS-PAGE, y el nivel de expresion fue alto.

Para conseguir la expresion proteica de las protemas BMP-3c/138 y BMP-3c/110 de reno, se ensayo otro sistema de expresion de protemas. Por lo tanto, pET22b(+) con His6-marcador y pelB lfder se eligio como nuevo sistema de expresion del vector. Se construyeron los vectores pETrd3c/138 y pETrd3c/110. Se utilizaron para la expresion las lmeas Rosetta (DE3) (Novagen) y Origami B (DE3) (Novagen) de E coli. Mediante SDS-PAGe se verificaron las inducciones con exito de IPTG de rdBMP-3c recombinante con ambas construcciones .

Actividad biologica de BMP-3c/138 y BMP-3c/110 recombinantes de reno

Se ha demostrado actividad osteogenica en el bioensayo cuando se produce en celulas CHO o en el sistema E coli de la BMP-3 humana recombinante,, pero cuando se usaron sistemas retrovirales y adenovirales para producir BMP- 3 humana recombinante no se observo funcion osteogenica. Utilizando el sistema de vectores adenovirales, se ha observado que la BMP-3b actua de forma sinergica con la BMP-2 en el procedimiento de formacion osea, pero no produjo induccion osea por sf misma. No obstante, la BMP-3 de origen animal de venado (familia Cervidae) ni siquiera se ha clonado, y no ha se ha ensayado la actividad biologica de la BMP-3b de reno clonada anteriormente.

En este estudio se muestra que el nuevo miembro de la subfamilia BMP-3, la BMP-3c recombinante de reno, ,producida en celulas E coli, causan nueva formacion osea cuando se implantan en musculo tenso de raton con una esponja de colageno.

Ejemplo 1: Clonacion y secuenciacion de la parte 3 'del ADNc de BMP-3c de reno

A. Aislamiento de ARN

Los cuernos de un reno macho de 3 anos de edad se cortaron y congelaron en nitrogeno lfquido inmediatamente despues del sacrificio. Los cuernos congelados se cortaron en rebanadas de 0,5 cm, y se almacenaron a -70°C. El ARNm de la cornamenta de reno se aislo usando el Kit de Purificacion de ARNm QuickPrep® Micro (Pharmacia Biotech). Una parte de la rebanada del cuerno de reno se corto en pedazos pequenos (aproximadamente 1 mm3) y se anadio 0,1 g de este tejido a 0,6 ml de Tampon de Extraccion que contiene tiocianato de guanidinio y N-lauroil sarcosina. El tejido se homogeneizo mediante un homogeneizador Ultra Turrax 3 veces durante 10 segundos en hielo, y se enfrio entre cada homogeneizacion. Se anadieron 1,2 ml de Tampon de Elucion, y la suspension se homogeneizo ademas 1 vez durante 10 segundos. Se obtuvo una suspension uniforme.

El homogeneizado de cuerno de reno se centrifugo con Oligo(dT)-Celulosa a velocidad maxima [14.000 rpm, RT (Temperatura ambiente), Centnfuga 5415 C (Eppendorf)] durante 1 minuto. Se elimino el tampon del precipitado de

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Oligo(dT)-Celulosa, y el homogeneizado de tejido limpio se coloco en la parte superior del mismo. El tubo se invirtio para resuspender el precipitado de Oligo(dT)-Celulosa. La suspension se mezclo suavemente durante 5 minutos, y se centrifugo a velocidad maxima [14.000 rpm, RT, Centnfuga 5415 C (Eppendorf)] durante 10 segundos. El sobrenadante se desecho.

Se resuspendio Oligo(dT)-Celulosa en tampon de alta sal [Tris-HCl 10 mM (pH 7,5), EDTA 1 mM, NaCl 0,5 M] y la suspension se centrifugo a velocidad maxima [14.000 rpm, RT, Centnfuga 5415 C (Eppendorf )] durante 10 segundos. Los lavados con tampon de alta sal se repitieron 5 veces, y 2 veces mas con tampon de baja sal [Tris-HCl 10 mM (pH 7,5), EDTA 1 mM, NaCl 0,1 M]. Se anadio 3 ml de tampon de baja sal, y la suspension se transfirio a una Columna MicroSpin. La columna MicroSpin se coloco en un tubo Eppendorf, y se centrifugo a velocidad maxima durante 5 segundos. El Oligo(dT)-Celulosa de la columna se lavo 3 veces con tampon de baja sal.

El ARNm del cuerno de reno se eluyo de la columna MicroSpin a un tubo Eppendorf limpio anadiendo 0,2 ml de Tampon de Elucion a 65°C (Kit de Purificacion de ARNm QuickPrep® Micro, Pharmacia Biotech) a la columna, y centrifugando a velocidad maxima [14.000 rpm, RT, Centnfuga 5415 C (Eppendorf)] durante 5 segundos. La etapa de elucion se repitio dos veces. El ARNm aislado se precipito anadiendo 5 pl de solucion de glucogeno (5-10 mg/ml en agua tratada con DEPC (dietilpirocarbonato)), 1/10 de volumen de disolucion de acetato de K (acetato de potasio 2,5 M, pH 5,0), y 0,5 ml de etanol absoluto (enfriado a -20°C) a cada elucion. Se dejo que la precipitacion se produjera a -20°C durante al menos 30 minutos, y el ARNm se centrifugo a velocidad maxima [14.000 rpm, 4°C, Centnfuga 5415 C (Eppendorf)] durante 5 minutos. El ARNm precipitado se almaceno a -70°C hasta que se realizo la smtesis de ADNc.

B. Smtesis de ADNc

La transcripcion inversa del ARNm del cuerno de reno se realizo modificando las instrucciones del Kit de Smtesis de ADNc Time Saver™ (Pharmacia Biotech). Se desnaturalizo por calor 3 pg de ARNm a 65°C durante 10 minutos, y se enfrio en hielo. Se anadieron 0,2 jmol de DTT, 0,5 |jg de cebador Oligo(dT)12-18 y el ARNm desnaturalizado por calor, a la mezcla de reaccion de la Primera hebra que contema FPLCpuro Cloned Murine Reverse Tran-scriptase, RNAguard™, BSA libre de ARNasa/DNasa, dNTPs (dATP, dCTP, dGTP y dTTP) en tampon acuoso (Kit de Smtesis de ADNc Time Saver™, Pharmacia Biotech). La disolucion mixta se incubo a 37°C durante 1 hora. Despues de la incubacion, se anadio la mezcla de reaccion de la Primera hebra a la mezcla de reaccion de la Segunda hebra que contiene RNasa H de E. coli, y E coli ADN polimerasa I, y dNTPs en tampon acuoso (Kit de Smtesis de ADNc Time Saver™, Pharmacia Biotech). La disolucion se mezclo suavemente, y se incubo en RT durante 30 minutos. El ADNc sintetizado se almaceno a 4°C.

C. Seleccion de ADNc de cuerno de reno

Se amplifico la parte del ADNc de BMP-3c de reno mediante el metodo de PCR (reaccion en cadena de la polimerasa) utilizando cebadores degenerativos (5'-CGCAA(A/G)GACCGCA(A/G)GAAGAA(A/G)GGC-3') y (3'- TC(T/C)GT(A/G)GAGACCTGTGCCTG(T/C)CAA-5 ') disenados sobre la base de la homologfa de genes BMP-3b ya conocidos de las diferentes especies de mairnferos (ser humano, rata y raton). Ademas de 100 ng del ADNc de cuerno de reno, y 40 pmol de cada cebador, los 50 pl de mezcla de reaccion PCR conteman dNTPs 0,4 mM (PCR Core Kit, Roche) y 0,7 U/pl de mezcla de enzimas High Fidelity (polimerasa Taq termostable + valoracion de polimerasa, Roche) en tampon Expand High Fidelity con MgCh (Expand High Fidelity PCR System, Roche). La reaccion se realizo en el siguiente programa utilizando un aparato personal Mastercycler (Eppendorf): desnaturalizacion inicial a 94°C durante 4 minutos, y 25 ciclos de desnaturalizacion a 94°C durante 1 minuto, re- asociacion de los cebadores a 55°C durante 1 minuto, elongacion de las hebras de ADN a 72°C durante 2 minutos. La extension final se realizo a 72°C durante 10 minutos.

D. Clonacion en el vector pGEM®-T

Los productos de PCR se purificaron directamente a partir de la mezcla de reaccion de PCR mediante el Sistema de Purificacion de ADN Wizard® PCR Preps (Promega), y se ligo en el vector pGEM®-T (Figura 1) mediante la T4 ADN Ligasa (pGEM®-T Vector System I; Promega). Se anadieron 0,3 jg de producto de PCR purificado, y 2,3 jg/ml del vector pGEM®-T a un tampon de ligacion que contiene Tris-HCl 18 mM (pH 7,8), MgCh 6 mM, DTT 6 mM, ATP 0,3 mM, 3% de polietilenglicol y 0,14 U/jl de T4 ADN Ligasa en un volumen total de 66 jl. Se dejo que la reaccion se produjera en un bano de agua a +16°C que se dejo enfriar hasta +4°C durante la noche. El plasmido recien formado se denomino pGEMrd3c/142 (Figura 1).

E. La produccion de celulas competentes TOP10 F' de Escherichia coli

Las celulas competentes TOP10 F' de Escherichia coli Las se produjeron mediante el procedimiento cloruro de calcio/cloruro de magnesio. Se inocularon 2 ml de medio LB con celulas TOP10 F' de E coli, y se cultivaron durante la noche a 37°C con agitacion (225 rpm). A la manana siguiente se inocularon 100 ml de medio LB fresco con 1 ml de cultivo cultivado durante la noche, y el cultivo se cultivo a 37°C con agitacion (225 rpm) hasta un valor DO600 de 0,5-0,6. Las celulas cultivadas se recogieron por centrifugacion (2500 x g, 5 minutos), se resuspendieron en 10 ml de MgCl2 0,1 M, y se recogieron de nuevo mediante centrifugacion (2500 x g, 5 minutos). Despues del tratamiento con MgCl2, las celulas se resuspendieron en 10 ml de una disolucion de CaCl2 0,1 M, se incubaron en un bano de hielo

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durante 30 minutes, y se recogieron por centrifugacion (2500 x g, 5 minutes). El tratamiento se repitio con CaCl2, excepto que en la segunda vez se anadieron 3,5 ml de CaCl2, y que el tiempo de incubacion fue de 1 hora. Se anadio glicerol a la suspension hasta una concentracion final de 14% (v/v) y la disolucion se dividio en porciones de 200 |jl. Las celulas competentes TOP10 F' de E coli se congelaron en nitrogeno lfquido, y se almacenaron a -70°C.

F. Transformacion de las celulas competentes TOP10 F' de Escherichia coli y seleccion de clones que contienen BMP-3c de reno

Las celulas competentes TOP10 F' de Escherichia coli se disolvieron en un bano de hielo durante 15 minutos. Se anadieron 20 pl de mezcla de ligacion (descrita anteriormente) a 100 pl de TCM (Tris-HCl 10 mM, CaCh 10 mM, MgCl2 10 mM, pH 7,0), y se mezclo con 200 pl de celulas competentes E coli. La mezcla se incubo en un bano de hielo durante 30 minutos antes del choque termico (43°C, 3 minutos). Despues del choque termico se anadieron 800 pl de medio LB, y se permitio que las celulas se regeneraran durante 30 minutos a 37°C. Las celulas transformadas se recogieron por centrifugacion a velocidad maxima durante 2 minutos, y se resuspendieron hasta 30 pl de medio de cultivo. La suspension de celulas se sembro en dos placas de LB que contienen 25 pg/ml de ampicilina cubierta con 1 mmol de IPTG (isopropil-p-D-tiogalactopiranosido) y 2,4 nmol de X-gal (5-bromo-4-cloro-3-indolil-p-D- galactosido), y las celulas se cultivaron en las placas durante la noche a 37°C. Los clones positivos se reconocieron por formacion de color azul basado en la complementacion a del gen lacZ. El metodo se describe en detalle en Sambrook y Russel (2001), Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Nueva York.

G. Aislamiento de plasmidos pGEMrd3c y secuenciacion de insertos de ADNc

Los plasmidos se aislaron por el Sistema de Purificacion de ADN Wizard® Plus Minipreps (Promega), y luego se purificaron por precipitacion con etanol. La identidad del ADNc se confirmo por secuenciacion con ABI Prism (Perkin- Elmer Corporation). La reaccion de secuenciacion se realizo usando el kit de Secuenciacion DYEnamic ET Terminator Cycle (Amersham Pharmacia Biotech) y el aparato Mastercycler Personel (Eppendorf). Los cebadores en la reaccion de PCR para la secuenciacion fueron (5'-tAaTACGACTcAcTATAGGGCGA-3') y (3'- ATTTAGGTGACACTATAGAATAC-5') y el programa fue como sigue: 25 ciclos de desnaturalizacion a 94°C durante 30 segundos, re-asociacion a 50°C durante 15 segundos, elongacion a 60°C. Los productos de PCR amplificados se precipitaron mediante un metodo de precipitacion con etanol. En 10 pl de reaccion se anadieron 1 pl de acetato de sodio 1,5 M,, tampon EDTA250 mM, y etanol 95-100%, de manera que la concentracion final de etanol era del 75%. Se dejo que la precipitacion se produjera en un bano de hielo durante 7 minutos, y luego la mezcla se centrifugo durante 20 minutos. El sobrenadante se desecho, y el sedimento se lavo con 125 pl de etanol al 70% en RT. La disolucion se centrifugo brevemente, y el etanol de lavado se retiro con la mayor precision posible. El sedimento se seco a 37°C durante algunos minutos hasta que todo el etanol se evaporo completamente. El aparato ABI Prism se localizaba en el Departamento de Bioqmmica Medica y Biologfa Molecular, Universidad de Oulu, Finlandia, y la secuenciacion final se realizo allf La secuencia de nucleotidos y la correspondiente secuencia de aminoacidos de ADNc parcial de BMP-3c de reno se observa en la figura 6.

Ejemplo 2: Expresion de la parte madura de BMP-3c recombinante de reno en celulas TOP10 F' Origami B (DE3) y Rosetta (DE3) de Escherichia coli

A. Amplificacion de la parte madura de BMP-3c de reno para el vector de expresion

La parte madura de BMP-3c de reno se amplifico a partir del plasmido pGEM3c/142 mediante el metodo de PCR usando cebadores de homologfa (5'-GGATCCGAGGAAGAAGGGCCAGGATGTTTTC-3') y (3'-AAGCTTTTGG- CAGGCACAGGTCTCCAC-5') (vease el Ejemplo 2 Parte B). Existen sitios de reconocimiento para enzimas de restriccion Bam HI y Hind III en el extremo 5'- y 3'- de los cebadores, respectivamente.

Ademas de 0,05 pg de plasmido pGEMrd3c/142 y 40 pmol de cada cebador, los 50 pl de la mezcla de reaccion de PCR conteman dNTPs 0,4 mM (PCR Core Kit, Roche), y 0,7 U/pl de mezcla de enzimas Expand High Fidelity (polimerasa Taq termostable + valoracion de polimerasa, Roche) en tampon Expand High Fidelity con MgCh (Roche). La reaccion de PCR se llevo a cabo bajo el siguiente programa usando el aparato personal de Mastercycler (Eppendorf): desnaturalizacion inicial a 94°C durante 4 minutos, y 25 ciclos de desnaturalizacion a 94°C durante 1 minuto, re-asociacion de los cebadores a 55°C durante 1 minuto, elongacion de las hebras de ADN a 72°C durante 2 minutos. La extension final se realizo a 72°C durante 10 minutos. El producto de PCR se purifico directamente de la mezcla de reaccion de PCR usando Wizard® PCR Preps (Promega), y se ligo al vector pGEM®-T. El plasmido recien formado con la parte madura de BMP-3c de reno se denomino pGEMrd3c/138 (figura 1).

B. Subclonacion de la parte madura de BMP-3c de reno a partir del vector pGEM®-T para el vector de expresion pTrcHis 2A (Invitrogen) y transformacion de las celulas competentes TOP10 F'de Escherichia coli

La subclonacion de la parte madura de BMP-3c de reno a partir de pGEMrd3c/138 al vector de expresion pTrcHis 2A (figura 2) se realizo mediante la primera digestion de la parte madura de pGEMrd3c/138 usando las enzimas de restriccion Bam HI y Hind III, y luego ligando el inserto a pTrcHis 2A, digerido con las mismas enzimas. La digestion de pGEMrd3c/138, y pTrcHis 2A mediante las enzimas Bam HI (Roche) y Hind III (Roche), se realizo en 10 pl de Tris-HCl 10 mM, NaCl 10 mM, MgCh 5 mM2, 2-mercaptoetanol 1 mM,, pH 8,0 (SuRE/Cut Buffer B, Roche) con 1 U/pl de cada enzima de restriccion. Se dejo que la reaccion se produjera durante 1,5 horas a 37°C, y despues las

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enzimas de restriccion se inactivaron calentando a 65°C durante 20 minutos, y congelando a -20°C. La ligacion se realizo en 2x Rapid Ligation Buffer (suministrado con el vector pGEM®-T de Promega) en un bano de agua a + 16°C que se dejo enfriar lentamente hasta + 4°C durante la noche (concentracion de ligasa 0,1 U/pl).

La construccion recien formada se verifico mediante secuenciacion (el protocolo se describe en el Ejemplo 1 Parte G) usando cebadores (5'-AGAGGTATATATTAATGTATCG-3') y (3'-ATGGTCGACGGCGCTATTCAG-5'). El vector de expresion que contema pTrcHis 2A mas el ADNc de la parte madura de BMP-3c de reno, se denomino pTrcrd3c (figura 2). Las celulas competentes TOP10 F' de Escherichia coli se transformaron con pTrcrd3c como se describe en el Ejemplo 1 Parte F.

C. Insercion de la parte madura de BMP-3c de reno al vector de expresion pET22b(+) (Novagen) y transformacion de las celulas competentes Origami B (DE3) y Rosetta (DE3) de Escherichia coli

La subclonacion de la parte madura de BMP-3c de reno al vector de expresion pET22b(+) (Novagen) (figura 3) se realizo como se describe anteriormente (vease el Ejemplo 2, Parte B). Los plasmidos recien formados que contienen pET22b(+) mas el ADNc de la parte madura de BMP-3c de reno, se verificaron mediante secuenciacion utilizando cebadores (5-'GGATCCGAGGAAGAAGGGCCAGGATGTTTTC-3') y (3'-CGCAAGCTTTT-

GGCAGGCACAGgTcTCCAC-5') (vease el protocolo descrito en el Ejemplo 1 Parte G) y nombrado como pETrd3c (figura 3). Las transformaciones de las celulas Origami B (DE3) y Rosetta (DE3) se realizaron siguiendo las instrucciones del manual de usuario enviado con las celulas competentes (Novagen).

D. Expresion de la parte madura de BMP-3c recombinante de reno en cultivos celulares de Escherichia coli y recogida de las celulas

Se cultivaron celulas E coli [TOP10, Origami B (DE3) o Rosetta (DE3)] que contienen los plasmidos pTrcrd3c o pETrd3c durante toda la noche en 50 ml de medio SOB que contiene ampicilina (100 pg/ml), y para las celulas Rosetta (DE3) tambien cloramfenicol (34 pg/ml), a +37°C con agitacion (225 rpm). A la manana siguiente se inocularon 1200 ml de medio SOB, que contiene los antibioticos mencionados anteriormente, con 24 ml de cultivo cultivado durante la noche, y se incubaron a + 37°C con agitacion (225 rpm) hasta que el valor DO600 era de cuando las celulas estaban en fase de registro medio. En este punto se indujo la expresion de la protema recombinante anadiendo IPTG hasta la concentracion final de 1 mM. Despues de la induccion, las celulas se cultivaron durante 4 a 5 horas adicionales, y despues se recogieron por centrifugacion. Las secuencias de aminoacidos de las protemas recombinantes producidas con las respectivas secuencias de nucleotidos se presentan en la figura 4 (pTrcrd3c) y la figura 5 (pETrd3c).

Ejemplo 3: Purificacion y replegamiento de la parte madura de BMP-3c recombinante de reno

A. Lavado de cuerpos de inclusion

Las celulas recogidas se suspendieron en tampon fosfato sodico 50 mM (pH 7,0, 220 g de celulas/1 litro de tampon) mediante agitacion. La suspension se centrifugo a 5500 x g durante 45 minutos a +4°C. El lavado con fosfato sodico se repitio una vez. El sedimento de celulas se peso, y se almaceno a -70°C durante la noche. El sedimento congelado con celulas parcialmente en erupcion se descongelo y se suspendio en tampon Tris-HCl 20 mM con EDTA 0,5 mM (pH 8,5, 25 mg/ml) agitando 2 minutos. La suspension se centrifugo a 26.000 x g durante 40 minutos a + 4°C, y se repitio una vez el lavado Tris-HCl-EDTA. Se midio el sedimimento sobrante. En la ultima etapa de lavado, el sedimento se suspendio (200 rpm/minuto, durante la noche, RT) en tampon de lisis GuHCl 6 M - fosfato de sodio 20 mM - NaCl 0,5 M (pH 8,0, 35 mg/ml) cuando el resto de celulas E coli intactas erupcionan y los cuerpos de inclusion se hacen solubles. La suspension se centrifugo (26.000 x g, 45 minutos, RT), se desecho el sedimento y la protema recombinante en forma soluble en el sobrenadante restante. Finalmente, para asegurarse de deshacerse de todos los restos celulares, el sobrenadante se filtro a traves de un filtro de 45 pm.

B. Precipitacion segun punto isoelectrico (pl)

La BMP-3c recombinante de reno expresada a partir de pETrd3c en celulas Origami B (DE3) o Rosetta (DE3) de Escherichia coli, se precipito por precipitacion isoelectrica en pH 9,54 (pETrd3c/138) y pH 6,35 (pETrd3c/110). El punto isoelectrico se determino mediante calculos informaticos segun la secuencia de aminoacidos de la BMP-3c recombinante de reno (Figura 5). El precipitante se recogio por centrifugacion (12 000 x g, 30 minutos, RT) y se resuspendio en tampon de lisis (GuHCl 6 M - fosfato de sodio 20 mM - NaCl 0,5 M; pH 8,0).

C. Cromatografia de afinidad por metal inmovilizado (IMAC)

En el metodo IMAC, se usaron columnas de afinidad empaquetadas HiTrap Chelating HP (Amersham Pharmacia Biotech). Las columnas se cargaron con iones Co2+-, Cu2+-, o Ni2+, segun el manual de instrucciones aplicado por el proveedor. Despues de la carga de la columna, el sobrenadante filtrado de las etapas de lavado se aplico en la columna. La mayona de las impurezas se elimino lavando la columna con tampon de lisis (GuHCl 6 M - fosfato de sodio 20 mM - NaCl 0,5 M, pH 8,0) 5-10 veces el volumen del lecho. El segundo lavado se realizo con 5-10 veces el volumen del lecho de tampon en el que el tampon de lisis GuHCl6 M se reemplazo por Urea 6 M. La BMP-3c recombinante de reno se eluyo de la columna HiTrap mediante un gradiente de pH de pH 7,0 a pH 4,0 (urea 6 M -

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fosfato de sodio 20 mM - NaCI 0,5 M). Las fracciones se analizaron por SDS-PAGE y las que contienen rdBMP-3c recombinante aproximadamente puro se combinaron para replegarse.

D. Replegamiento de la parte madura de rdBMP-3c recombinante

Las fracciones de BMP-3c analizadas por SDS-PAGE se agruparon y se dializaron con agua. Despues de la dialisis, la protema precipitada se recogio por centrifugacion, y se resuspendio en urea 8 M, Tris/HCl 0,1 M, pH 8 en presencia de DTT 100 mM, EDTA 1 mM, y se incubo durante 2 horas a 25 grados. El pH se redujo a pH 3-4 por adicion gota a gota de HCl 1 M. El DTT se elimino completamente por dialisis con urea 6 M, HCl 10 mM, durante 2 horas a 25 grados. La dialisis se continuo a 4°C durante la noche con urea 6 M. El replegamiento de rdBMP-3c recombinante se realizo mediante dialisis en dos etapas. La primera disolucion de dialisis fue Tris-HCl 20 mM - NaCl 150 mM - urea 3 M (pH 7,5). El agua de dialisis se cambio al menos seis veces durante dos a tres dfas. La muestra desalada se centrifugo, y el sedimiento se seco por liofilizacion. En ese momento, la pureza de BMP-3c era del 75%, y su replegamiento medido por SDS-PAGE no reductora fue del 50%. La cuantificacion del dfmero replegado de BMP-3c recombinante de reno en geles tenidos con azul de Coomassie se realizo mediante densitometna..

Ejemplo 4: Adicion del sitio de union a heparina delante de la parte madura de BMP-3c/138 y BMP-3c/110 de reno

A. Adicion del fragmento de ADN que codifica el sitio de union a heparina al vector pTrcHis 2A

Se disenaron dos cebadores complementarios, vistos en la Tabla 4, usando el sitio de union a heparina (HBS) de la BMP-2 de reno como modelo. Se anadieron los sitios de restriccion para Bam HI y Kpn I en los extremos 5' y 3' del HBS, respectivamente. Los cebadores se desnaturalizaron primero a +100°C durante 5 minutos, y luego se re- asociaron permitiendo que un bano de agua pequeno de +100°C se enfriara a temperatura ambiente, y continuara hasta +4°C (1 hora). Tanto el fragmento HBS reasociado (1 |jg) como el vector pTrcHis 2A (0,5 |jg) se digirieron por Bam HI (1 U/jl) y Kpn I (2 U/jl) en tampon Multi-Core (Promega) a +37°C durante 1,5 horas, y se ligaron en un bano de agua a +16°C que se dejo enfriar hasta +4°C durante la noche. La construccion recien formada se comprobo por secuenciacion (vease el Ejemplo 2 Parte B) y se denomino pTrcHBS (figura 2).

Tabla 4. Cebadores utilizados en la clonacion del sitio de union a la heparina

Cebadores para la clonacion de HBS

5' ^3'

CGGGATCCGCAAGCAAAACATAAACAGCGCAAACGCGGTACCCC

3' ^5'

GGGGTACCGCGTTTCCGCTGTTTATGTTTTGCTTGCGGATCCCG

B. Amplificacion de las partes maduras de BMP-3c/138 y BMP-3c/110y clonacion en el vector pGEM®-T

Se crearon sitios de restriccion para Kpn I frente a las partes maduras de rdBMPs mediante el metodo de PCR. Las plantillas en estas reacciones fueron genes BMP clonados en el vector pTrcHis2A entre los sitios de restriccion Bam HI y Hind III (Ejemplo 2 Parte D). Los cebadores (Sigma-Genosys) disenados para estas reacciones estan en la tabla 5.

Tabla 5. Cebadores utilizados en la reaccion de PCR creando sitios de restriccion para Kpn y Hind III en BMPs

gen

cebador

BMP-3c/138

5' 5' GGTACCAGGAAGAAGGGCCAGGATGTTTTC 3 '

3'

5' AAGCTTTTGGCAGGCACAGGTCTCCACAG 3 '

BMP-3c/110

5' 5' GGTACCCAATGGGATGAGCCACGGGTC 3 '

3'

5' AAGCTTTTGGCAGGCACAGGTCTCCACAG 3 '

Las reacciones de PCR se realizaron con Expand High Fidelity System (Roche). Las reacciones inclrnan: tampon HF, MgCl2 1,5 mM, 200 jM de mezcla de dNTP, 0,8 jM de ambos oligos, 15 ng de ADN molde, y 3,5 U de mezcla de Enzimas de Alta Fidelidad. El programa utilizado en las reacciones fue: 94°C 4 minutos, 25 ciclos; 94°C 1 minuto, 55°C 1 minuto, 72°C 2 minutos, un ciclo; 72°C 10 minutos y la temperatura se redujo hasta 4°C.

Los tamanos de los productos de PCR se examinaron con geles de agarosa al 1%. El estandar utilizado en geles era 500 jg de 100 pb de escala (BioLabs) o de 100 pb de escala XIV (Roche). Una quinta parte de las reacciones de PCR se cargaron en geles de agarosa con tampon de carga de ADN con azul de bromofenol. Las muestras se

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hicieron correr en tampon TAE 1x (Tris 40 mM, acetato de sodio 10 mM, EDTA 1 mM pH 7,8) con 70 V durante 35 minutes, y se tomaron imagenes de los geles bajo luz UV.

Los productos de PCR se purificaron a partir de agarosa de baja temperatura de fusion al 1% de SeaPlague®GTG® (BioProducts) con el sistema de purificacion de ADN Wizard®PCR Preps (Promega) segun el protocolo del fabricante..

Los fragmentos de ADN purificados a partir de las reacciones de PCR se ligaron en el vector pGEM®-T con pGEM®- T y pGEM®-T Easy Vector System (Promega). Las reacciones inclman; Tampon de ligacion rapida, 50 ng de vector pGEM®-T,, 15-20 ng de inserto de ADN, y 3 U de T4 ADN Ligasa. Las ligaciones se realizaron en un bano de agua a 16°C que se dejo enfriar lentamente hasta 4°C durante la noche.

Antes de la transformacion las mezclas de ligacion se digerieron con 15 U de Bam HI (Roche) en tampon B (Roche) para eliminar posibles rastros de la plantilla de reaccion de PCR (BMP en pTrcHis2A). Las reacciones de digestion se incubaron 1,5 horas a 37°C.

C. Transformacion de plasmidos en celulas TOP10 de E. coli

Los plasmidos se transformaron en celulas TOP10 competentes de Escherichia coli (Invitrogen). Las celulas TOP10 se hicieron competentes con el procedimiento de cloruro de calcio/cloruro de magnesio (vease el Ejemplo 1 parte E).

La transformacion de los plasmidos se realizo de la siguiente manera: la mezcla de ligacion digerida se mezclo en 100 |jl de TCM y se anadio a 200 jl de celulas TOP10 competentes. Las celulas se incubaron durante 30 minutos en hielo, y luego 3 minutos a 43°C. Se anadieron 0,8 ml de medio LB-glucosa a las celulas y se mezclaron invirtiendo el tubo. Las celulas se dejaron crecer durante 45 minutos a 37°C, y se sembraron en placas LB- glucosa+AMP+IPTG+X-GAL.

Las colonias a partir de las transformaciones se inocularon en 5 ml de LB-glucosa + 100 jl/ml de medio de ampicilina, y se cultivaron durante la noche a 37°C con agitacion. Los plasmidos se aislaron a partir de los cultivos cultivados durante la noche con el sistema de purificacion de ADN Wizard® Plus Minipreps (Promega) segun el procedimiento de fabricacion.

Los plasmidos se purificaron adicionalmente con precipitacion con EtOH: se anadieron 5 jl de acetato de sodio 3 M pH 5,8 y 150 jl de etanol absoluto a los plasmidos purificados en agua, y se dejo precipitar el ADN a -20°C durante la noche. A la manana siguiente, las reacciones se centrifugaron en una microcentnfuga a 14000 rpm a 4°C, se elimino el sobrenadante, y se lavo el ADN precipitado con 500 jl de EtOH frte al 70%. Las muestras se centrifugaron de nuevo y se repitio la etapa de lavado. El ADN se seco al aire y se resuspendio en 20 jl de agua esteril.

Las secuencias de nucleotidos de los insertos se verificaron mediante secuenciacion. Las reacciones de secuenciacion conteman 5 jM de ambos cebadores y 150-300 ng de ADN plasirndico. Los cebadores de secuenciacion se muestran en la tabla 6.

Tabla 6. Cebadores de secuenciacion para los plasmidos pGEM®-T

cebador 5'

TAATACGACTCACTATAGGGCGA

cebador 3'

ATTTAGGTGACACTATAGAATAC

B. Adicion de la parte madura de BMP-3c/138 y BMP-3c/110 de reno a pTrcHBS y transformacion de celulas competentes TOP10 F' de Escherichia coli

La secuencia HBS se clono previamente en el vector pTrcHis2A entre los sitios de restriccion Bam HI y Kpn I (Ejemplo 4, parte A). Antes de la ligacion, tanto el plasmido pTrcHBS, como BMP-3c/138 y BMP-3c/110 en pGEM®- T, se digirieron primero con las enzimas Kpn I y Hind III. Las reacciones de digestion con Kpn I de BMP en pGEM®T conteman 800 ng de ADN plasirndico, 2xL de tampon (Roche), 150 ng de BSA, y 20 U de Kpn I (Roche). Las reacciones de digestion con Kpn I en pTrcHBS conteman 250 ng de ADN plasirndico, 2xL de tampon (Roche), 150 ng de BSA, y 20 U de Kpn I (Roche). Las reacciones se incubaron a 37°C durante 3 horas. Se anadio a las reacciones el tampon B (Roche) y 10 U de Hind III (Roche), y las reacciones se incubaron adicionalmente a 37°C durante 1 hora 30 minutos.

Las reacciones de ligacion conteman tampon Ligacion de Rapida (Promega), 125 ng del vector pTrcHBS digerido doblemente, 400 ng de BMP digerido doblemente en pGEM®-T, y 3 U de T4 ADN Ligasa (Promega). Las ligaciones se realizaron en un bano de agua a 16°C que se dejo enfriar lentamente hasta 4°C durante la noche. Las mezclas de ligacion se digirieron en tampon 1 xH (Roche) con 10 U de Pst I (Roche) y 12,5 U de EcoR I (Roche), para eliminar la BMP intacta en en los plasmidos pGEM®-T y pTrc HBS. Las reacciones se incubaron 1 hora 30 minutos a 37°C.

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Las BMP-3c/138 y BMP-3c/110 en los plasmidos pTrcHBS se transformaron en celulas competentes TOP10 de E coli, se amplificaron, purificaron y secuenciaron de la misma manera que se describe anteriormente para los plasmidos pGEM®-T. Los cebadores de secuenciacion para los plasmidos pTrcHis2A se muestran en la tabla 7. Las nuevas construcciones se denominaron pTrcHBSrd3c/138 y pTrcHBSrd3c/110 (Figura 2) en celulas TOP10, y se almacenaron como existencias de glicerol a -70°C. Las existencias de glicerol se fabricaron de acuerdo con el protocolo de fabricacion (Invitrogen).

Tabla 7. Cebadores de secuenciacion para los plasmidos pTrcHis2A

cebador 5'

AGAGGTATATATTAATGTATCG

cebador 3'

ATGGTCGACGGCGCTATTCAG

C. Expresion de las partes maduras de BMP-3c/138 y 3c/110 recombinante de reno con sitio de union a heparina en cultivos de celulas TOP 10 de Escherichia coli

Los ensayos de expresion piloto se realizaron como sigue; se inocularon 2 ml de medio SOB que contienen 50 pg/ml de ampicilina con una unica colonia TOP10 recombinante. Las celulas se cultivaron durante la noche a 37°C con agitacion (225 rpm). Por la manana se inocularon 20 ml de medio SOB fresco con 50 pg/ml de ampicilina con 0,4 ml del cultivo cultivado por la noche, y las celulas se cultivaron a 37°C con agitacion hasta que se alcanzo un valor DO600 de 0,6.

Se anadio IPTG hasta una concentracion final de 1 mM para inducir la produccion de protemas en las celulas. Despues de la induccion, las celulas se cultivaron durante 5 horas a 37°C con agitacion. Se recogieron muestras de 0,5 ml del cultivo en puntos de tiempo de 0 h, 1 h, 2 h, 3 h, 4 h y 5 horas despues de la induccion. Las muestras se centrifugaron a 14000 rpm durante 30 segundos, y los sedimentos celulares se resuspendieron en 50 pl de tampon de muestra Laemmli (BIO-RAD) que contiene 5% de p-mercaptoetanol.

Las muestras resuspendidas en tampon de muestra se hirvieron durante 5 minutos y se centrifugaron. Se cargaron 5 pl de cada muestra y 2 pl de patron Dual Color (BIO-RAD) en 16,8% de SDS-PAGE. Se separaron protemas de diferentes tamanos en tampon SDS (Tris 25 mM, Glicina 192 mM, SDS al 0,1%) a 200 V durante 1 hora 10 minutos. Los geles de SDS se tineron con Disolucion de Coloracion R-250 Azul Coomassie (BIO-RAD), y se elimino el exceso del colorante con una disolucion de acido acetico 1,7 M -metanol 2,5 M.

Para expresar cantidades mayores de protema recombinante se inocularon 50 ml de medio SOB que contiene 100 pg/ml de ampicilina con la colonia TOP10 recombinante. Las celulas se cultivaron durante la noche a 37°C con agitacion (225 rpm). A la manana siguiente se inocularon 1200 ml de medio SOB fresco con 50 pg/ml de ampicilina con 25 ml del cultivo cultivado durante la noche. Los cultivos de celulas recombinantes se cultivaron a 37°C con agitacion hasta que se alcanzo un valor DO600 de 0,6.

Para inducir la produccion de protema recombinante en las celulas se anadio IPTG hasta una concentracion final de 1 mM. Despues de la induccion, las celulas se cultivaron durante 5 horas a 37°C con agitacion. Despues de la incubacion, los cultivos se centrifugaron a 5000 rpm durante 17 minutos y se recogieron y pesaron los sedimentos celulares..

Las celulas se pre-lavaron suspendiendolas primero en H2O (g/5 ml) y se centrifugo a 10000 rpm con un rotor SS-34 durante 20 minutos. La segunda etapa de lavado se realizo con la misma proporcion de tampon fosfato de sodio 50 mM pH 7,0. La centrifugacion se repitio y se continuo el lavado con la misma proporcion de Tris 25 mM - tampon EDTA 10 mM pH 7,3. Al final de las celulas de prelavado se centrifugaron una vez mas, y se pesaron.

Ejemplo 5: Aislamiento y purificacion de la parte madura de BMP-3c/138 y BMP3c/110 recombinante de reno con sitio de union a heparina (HBSrdBMP-3c)

A. Recoleccion de celulas TOP10 de Escherichia coli y aislamiento y purificacion de cuerpos de inclusion

Se homogeneizaron 1 g de celulas (peso humedo) por 5 ml en fno, Tris 0,1 M, pH 7, tampon EDTA 1 mM. Se anadieron 1,5 mg de Lisozima (Roche) por gramo de celulas en la mezcla, y las celulas se incubaron 30 minutos a 4°C. Las celulas se interrumpieron con un homogenizador celular de alta presion Disruptor APV-2000. Se anadio MgCl2 hasta una concentracion final de 3 mM, y DNasa I (Roche) hasta una concentracion final de 10 pg/ml, y la mezcla se incubo durante 30 minutos a RT para digerir el ADN.

Se anadio a la disolucion la mitad del volumen de una mezcla de EDTA de 60 mM, Triton X-100 6%, NaCl 1,5 M, pH 7 y la mezcla se incubo durante 30 minutos a 4°C. Los cuerpos de inclusion se centrifugaron por centrifugacion a 12000 rpm durante 10 minutos a 4°C con un rotor SS-34. El sedimento se resuspendio en una proporcion de 8 ml por gramo de celulas en tampon Tris 0,1 M, pH 7 - EDTA 20 mM, y se repitio la etapa de centrifugacion. El cuerpo de inclusion aislado se peso y se almaceno a -20°C.

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B. Purificacion IMAC para HBSrdBMP-3c

El cuerpo de inclusion aislado se mezclo durante la noche con agitacion con 35 mg/ml hasta GuHCl 6 M, Na2HPO4 0,02 M, NaCl 0,5 M, pH 8 (tampon de lisis). A la manana siguiente la disolucion se centrifugo a 12000 rpm durante 20 minutes con un rotor SS-34. El sobrenadante se filtro a traves de un filtro Whatman GB 002 (Schleicher & Schuell). La centrifugacion y la filtracion se repitieron una vez mas, y la muestra se almaceno a 4°C.

La columna de afinidad HiTrap Chelating HP empaquetada (Amersham Biociences) se cargo con iones Co2+, y se ajusto con tampon de muestra (tampon de lisis, pH 8) segun el procedimiento de fabricacion. Se aplicaron 30-40 ml de la muestra de protema filtrada a la columna, y se lavo con 50 ml de tampon de lisis, pH 8. El segundo lavado se realizo con 50 ml de urea 6 M, Na2HPO4 0,02 M, NaCl 0,5 M, pH 8.

La protema deseada con el marcador His6 se eluyo de la columna con 200 ml de urea 6 M, Na2HPO4 0,02 M, NaCl 0,5 M, pH 4. En la etapa final, la columna se lavo con 200 ml de urea 6 M, Na2HPO4 0,02 M, NaCl 0,5 M, imidazol 0,5 M, pH 8. Se recogieron fracciones de 50 ml durante cada etapa. Las muestras de la fraccion se analizaron con SDS- PAGE y se combinaron las fracciones que contienen la mayor parte de la protema recombinante.

Ejemplo 6: Purificacion y replegamiento de la parte madura de BMP-3c/138 y BMP3c/110 recombinante de reno con sitio de union a heparina (HBSrdBMP-3c)

A. Purificacion IMAC para HBSrdBMP-3c

Se lisaron las celulas Escherichia coli por agitacion en GuHCl 6 M - fosfato de sodio 20 mM - NaCl 0,5 M (pH 8,0) durante 2 horas, y se filtro a traves de un filtro de 45 pm. En el metodo de purificacion IMAC, se usaron columnas de afinidad HiTrap Chelating HP empaquetadas (Amersham Pharmacia Biotech). Las columnas se cargaron con iones Co2+, Cu2+, o Ni2+ segun el manual de instrucciones aplicado por el proveedor. Se aplico el lisado filtrado a la columna, y se lavo con 15 veces el volumen del lecho del tampon de lisis. La segunda etapa de lavado se realizo con 40 veces el volumen del lecho de urea 6 M - fosfato de sodio 20 mM - NaCl 0,5 M (pH 7,5). En el tercer tampon de lavado se anadio imidazol 0,05 M en el segundo tampon de lavado y el volumen de lavado fue 15 veces el volumen del lecho. La HBSrdBMP-3c recombinante se eluyo de la columna mediante un gradiente de imidazol de 0,05 M a 0,5 M en urea 6 M - fosfato de sodio 20 mM - NaCl 0,5 M (pH 7,5). Las fracciones se analizaron mediante SDS-PAGE, y las que contienen la HBSrdBMP-6 recombinante mas altamente purificada, se combinaron y se dializaron con tampon de fosfato de sodio 100 mM (pH 7,5) durante el fin de semana. La protema recombinante precipitada se recogio por centrifugacion y se disolvio en urea 8 M - fosfato de sodio 100 mM - Tris-HCl 10 mM (pH 7,5). Antes de la purificacion de la columna de afinidad por heparina, la disolucion de protema recombinante se filtro a traves de un filtro de 45 pm.

B. Purificacion de la columna de afinidad por heparina para HBSrdBMP-3c recombinante

El filtrado obtenido despues de la purificacion IMAC, se aplico en una columna HiTrap Heparin HP lista para usar (Amersham Pharmacia Biotech) que se ajusto con urea 8 M - fosfato de sodio 100 mM - Tris-HCl 10 mM (pH 7,5). La columna se lavo entonces con 20 veces el volumen del lecho del mismo tampon, y se eluyo la HBSrdBMP-3c recombinante de la columna de heparina por gradiente de NaCl de 0 M a 2 M tambien en el mismo tampon. Se combinaron las fracciones con la pureza mas alta de HBSrdBMP-3c analizadas por SDS-PAGE y analisis Western blot. En el analisis de Western blot se usaron anticuerpos espedficos frente His6 y BMP-3c. Las fracciones combinadas estaban listas para el procedimiento de replegamiento.

C. Replegamiento de HBSrdBMP-3c /138 y HBSrdBMP-3c/110 recombinante

El replegamiento de HBSrdBMP-3c recombinante se realizo como se describe en el Ejemplo 3, parte D, para rdBMP- 3c recombinante.

Ejemplo 7: El ensayo de la actividad biologica de la parte madura de BMP-3c/138 y BMP-3c/110 recombinantes de reno, con y sin sitio de union a heparina

Se ensayo la actividad biologica de un liofilizado de BMP-3c/138, BMP-3c/110, HBSrdBMP-3c/138 y HBSrdBMP- 3c/110 recombinante de reno implantando 1 mg, 3 mg y 5 mg de protema recombinante absorbida en una esponja de colageno o capsula de gelatina Lyostrypt® en musculo tenso de raton Se uso BSA como control. Se realizo una radiograffa de las patas traseras, y los sitios del implante se diseccionaron y fijaron en una disolucion de formalina neutra al 10%. Los implantes fijos se cortaron en secciones de 7 pm, y se tineron con tincion de hematoxilina-eosina. Las secciones se examinaron con un microscopio optico. Se evaluo mediante radiograffas el area y la densidad optica de la nueva formacion osea Las imagenes radiograficas se transfirieron a un ordenador utilizando un escaner optico (HP Scan Jet, Hewlett Packard, EE.UU.). Se evaluaron las formaciones de hueso nuevo ectopico y ortopedico como las areas (mm2) de tejido calcificado visible en las radiograffas definidas mediante el uso del programa informatico Scion Image Beta 4.02 (Scion Corp., EE.UU.). Se midio la densidad optica media (mmAl) del area definida con el mismo equipo. La calibracion de la densidad optica se realizo utilizando una cuna de aluminio (Al) de 0,25 mmAl, dando un rango de densidad calibrado de hasta 4 mmAl.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

Resultados

Clonacion de ADNc parcial de BMP-3c de reno

La secuencia de nucleotidos obtenida a partir de las reacciones de ABI Prism, se analizo con ordenador y se comparo con secuencias de BMP ya conocidas. Debido a las busquedas de homologfa, el ADNc recien clonado pareda ser mas homologo con BMp-3b de reno (homolog^a de nucleotidos 96% y homologfa de aminoacidos 95%) y con BMP-3b humana (homolog^a de aminoacidos 93%), Tabla 1. Las homologfas de la protema BMP-3c con las otras protemas BMP-3 de mairnfero fueron las mas elevadas para BMP-3 humana (homologfa de aminoacidos 91%), Tabla 2.

Expresion de la parte madura de BMP-3c de reno

En primer lugar, se insertaron dos partes maduras diferentes de BMP-3c de reno en el vector pTrcHis2A, y las celulas TOP 10 de E coli se transformaron mediante los vectores pTrcrd3c/138 y pTrcrd3c/110 resultantes. La expresion de protema recombinante se indujo por IPTG. La produccion de protemas recombinantes se comprobo mediante SDS-PAGE, pero no se observo induccion con ambos vectores. Se esperaba que esto fuera causado por varios codones en rdBMP-3c que eran raros para el empleo del codon E coli. Tambien podna ser posible que fuese causado por un contenido de GC ligeramente alto en el comienzo de la secuencia de codificacion de ambas protemas rdBMP-3c (mediante BMP-3c/138 los primeros 10 codones tienen un contenido de GC de 53%, y mediante BMP-3c/110 de 63%).

Debido a estos hechos, se decidio probar otro sistema vectorial con diferentes lmeas celulares de E. coli. Se seleccionaron pET22b(+) (Novagen) con His6-marcador y pelB lfder como el nuevo vector de expresion, y se eligieron para la expresion las lmeas Rosetta (DE3) y Origami B (DE3) de E coli. Se clono el ADN de ambas partes maduras de BMP-3c de reno que codifican protemas en pET22b (+), y los nuevos plasmidos se denominaron pETrd3c/138 y pETrd3c/110, y tanto las celulas Rosetta (DE3) como las Origami B (DE3) se transformaron con estos vectores construidos. Cuando se analizo en SDS-PAGE, se observo sobreexpresion de protemas rdBMP-3c (Figura 8). Debido a estudios de expresion, se usaron principalmente celulas Rosetta (DE3) con vectores pETrd3c en la produccion de protemas rdBMP-3c recombinantes.

Purificacion de protemas rdBMP-3c

Las protemas recombinantes rdBMP-3c de reno se sobreexpresaron en E coli. Despues del tratamiento de lavado, precipitacion por punto isoelectrico, y solubilizacion de los cuerpos de inclusion, el contenido de rdBMP-3c recombinante de reno fue del 85%.

La siguiente etapa de purificacion fue la cromatograffa de afinidad por metal inmovilizado (IMAC). Despues de la elucion de la columna con gradiente de pH, la pureza de rdBMP-3c medida a partir del SDS-PAGE fue de hasta 75% (Figura 8). La protema aislada con la parte madura de rdBMP-3c/138 tema un PM de 20.400 Da, y con la parte madura de rdBMP-3c/110, 17.100 Da, como se muestra por la movilidad electroforetica en el SDS-PAGE en condiciones reductoras.

Purificacion de protenas HBSrdBMP-3c

Las protemas HBSrdBMP-3c/138 y HBSrdBMP-3c/110 recombinantes de reno se sobreexpresaron en E coli y se produjeron como cuerpos de inclusion (IBs). Despues del tratamiento de lavado, precipitacion por punto isoelectrico y solubilizacion de los cuerpos de inclusion, el contenido de HBSrdBMP-3c recombinante de reno fue del 50%.

La siguiente etapa de purificacion fue la cromatograffa de afinidad (IMAC y Heparina). Despues de la elucion de las columnas, la pureza de HBSrdBMP-3c medida a partir del SDS-PAGE fue de hasta 90%. Las protemas aisladas con la parte madura de HBSrdBMP-3c/138 teman un PM de 20.300 Da, y HBSrdBMP-3c/110 de 17.000 Da, como se muestra por la movilidad electroforetica en el SDS-PAGE en condiciones reductoras.

Ensayos de replegamiento y de la actividad de rdBMP-3c/138, rdBMP-3c/110, HBSrd3c/138 y HBSrd3c/110

El replegamiento in vitro de las protemas rdBMP-3c desnaturalizadas se cuantifico midiendo mediante densitometna el dfmero replegado de la protema en geles tenidos con Azul de Coomassie. La cantidad de dfmero replegado medida por SdS-PAGE no reductora fue para las protemas rdBMP-3c sin HBS del 50%, y para HBSrdBMP-3c de mas del 70%.

La actividad osteoinductiva inducida por las protemas rdBMP-3c sin HBS aumento de manera dependiente de la dosis, al menos hasta 5 mg (Tabla 3). Cuando se comparo la actividad biologica de BMP-3c/138 a la de BMP- 3c/110, pareda que BMP-3c/110 era un inductor mas potente de la formacion osea. De hecho, el replegado era un 20% mayor para el rdBMP-3c con HBS, que sin HBS, lo hace que el HBSrdBMP-3c sea de gran valor.

Esta invencion se ha descrito con enfasis en algunas de las realizaciones y aplicaciones preferidas. Sin embargo, sera evidente para los expertos en la tecnica, que se pueden preparar y utilizar variaciones en las realizaciones

Claims (18)

1. 5

   10

   15

   20

   25

   30

   35

   40

   REIVINDICACIONES

   1. Una protema morfogenetica osea 3 aislada (BMP-3), caracterizada por que contiene la secuencia de consenso:

   R-K-K-Q-W-D-E-P-R-V/N-C-S/A-R-R-Y-L-K-V-D-F-A-D-I-G-W-N/S-E-W-I-I-S-P-K-S-F-D-A-

   Y-Y-C-S-G-A-C-E/Q-F-P-M-P-K-M-V/L-R/K-P-S-N-H-A-T-I-Q-S-I-V-R-A-V-G-I/V-V-P/S-G-

   I-P-E-P-C-C-V.
2. 2. La protema morfogenetica osea 3 de la reivindicacion 1, caracterizada por que se obtiene mediante la expresion en un huesped bacteriano.
3. 3. La protema morfogenetica osea 3 de la reivindicacion 2, caracterizada por que el huesped bacteriano es Ecoli, tal como una celula TOP10, Origami o Rosetta de E coli.
4. 4. La protema morfogenetica osea 3 de cualquiera de las reivindicaciones 1-3, caracterizada por que contiene los aminoacidos 26-104 de SEQ ID NO: 1.
5. 5. La protema morfogenetica osea 3 de cualquiera de las reivindicaciones 1-3, caracterizada por que contiene los aminoacidos 6-104 de SEQ ID NO: 1.
6. 6. La protema morfogenetica osea 3 de cualquiera de las reivindicaciones 1-3, caracterizada por que contiene los aminoacidos 6-109 de SEQ ID NO: 1.
7. 7. La protema morfogenetica osea 3 de cualquiera de las reivindicaciones 1-3, caracterizada por que contiene la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 1.
8. 8. La protema morfogenetica osea 3 de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizada por que en el amino terminal contiene un sitio de union a heparina que contiene la secuencia de aminoacidos AKHKQRKRGT.
9. 9. Una composition farmaceutica, caracterizada por que contiene la protema morfogenetica osea de cualquiera de las reivindicaciones 1-8.
10. 10. La composicion farmaceutica de la reivindicacion 9, caracterizada por que contiene dicha protema morfogenetica osea como homodimero o como heterodimero junto con otra protema morfogenetica osea.
11. 11. La composicion farmaceutica de la reivindicacion 9 o 10, caracterizada por que contiene ademas otra protema morfogenetica osea, factor de crecimiento epidermico, factor de crecimiento de fibroblastos o factor de crecimiento transformante.
12. 12. El uso de la protema morfogenetica osea de cualquiera de las reivindicaciones 1-8, para la fabrication de un medicamento para tratar trastornos relacionados con el hueso, cartflago, tendon o diente, en donde se desea la regeneration, reparation o crecimiento de los mismos.
13. 13. Un dispositivo osteogenico, caracterizado por que es un implante que contiene la protema morfogenetica osea de cualquiera de las reivindicaciones 1-8.
14. 14. El dispositivo osteogenico de la reivindicacion 13, caracterizado por que contiene dicha protema morfogenetica osea como homodimero o como heterodimero junto con otra protema morfogenetica osea.
15. 15. El dispositivo osteogenico de la reivindicacion 13 o 14, caracterizado por que contiene ademas otra protema morfogenetica osea, factor de crecimiento epidermico, factor de crecimiento de fibroblastos o factor de crecimiento transformante.
16. 16. El dispositivo osteogenico de cualquiera de las reivindicaciones 13-15, caracterizado por que contiene una matriz biocompatible.
17. 17. El dispositivo osteogenico de la reivindicacion 16, caracterizado por que dicha matriz biocompatible contiene fosfato de calcio, carboximetilcelulosa o colageno o combinaciones de los mismos.
18. 18. Un metodo in vitro para inducir la formation de hueso, cartflago, tendon o diente, caracterizado por tratar dicho hueso, cartflago, tendon o diente con la protema morfogenetica osea de cualquiera de las reivindicaciones 1-8.