EA004509B1

EA004509B1 - Днк, кодирующая белок-7 морфогенеза кости человека, содержащая промоторную область гена, кодирующего данный белок, и способ ее получения

Info

Publication number: EA004509B1
Application number: EA200001130A
Authority: EA
Inventors: Синдзи Каваи; Такеюки Сугиура
Original assignee: Хехст Марион Руссель
Priority date: 1998-04-30
Filing date: 1999-04-22
Publication date: 2004-04-29
Also published as: HRP20000736A2; US20030040007A1; JPH11313675A; HUP0102329A3; CN1307643A; AU769124B2; HUP0102329A2; US6534268B1; BG104883A; AP2000001982A0; CA2326957A1; NZ507625A; GEP20033056B; TR200003182T2; AP1329A; PL343817A1; IL139100A0; CN1170941C; NO20005433D0; ZA200006080B

Abstract

Настоящее изобретение относится к ДНК, содержащей нуклеотиды 1-10877 SEQ ID NO:1, приведенной в списке последовательностей, кодирующей белок-7 морфогенеза кости (ВМР-7) человека и содержащей промоторную область гена, кодирующего указанный белок. Настоящее изобретение также относится к способу получения указанной ДНК и к вектору, содержащему указанную ДНК. Низкомолекулярные соединения и их производные обладают морфогенетической активностью и ингибиторной активностью в отношении костной и хрящевой тканей по типу активности ВМР-7 человека, и они эффективны в качестве профилактических или терапевтических средств против заболеваний хрящевой и костной тканей, средств против развития костных метастаз или терапевтических и профилактических средств против избыточного остеогенеза.

Description

Настоящее изобретение относится к 5'расположенному участку ДНК, включающему промотор гена, кодирующего белок морфогенеза костей (здесь и далее обозначаемый как ВМР7). Кроме того, настоящее изобретение относится к способу анализа низкомолекулярного соединения, которое позитивно или негативно регулирует экспрессию гена ВМР-7 человека, с использованием массива клеток животного или дрожжей, в которые вносят рекомбинантный экспрессирующий вектор, включающий 5'расположенный участок ДНК, в составе которого имеется промотор ВМР-7 человека, соединенный с подходящим геном-репортером, с использованием активности гена-репортера в качестве индикаторного признака.

Описание уровня техники

К настоящему времени было установлено, что активность, связанная с морфогенезом костной ткани, свойственна фактору морфогенеза костей - ВМР, относящемуся к надсемейству ТСЕ-β (трансформирующие факторы роста) (8аепсе, 1965, 150, 893-897; 8с1епсе, 1988, 242, 1528-1534). Известными типами ВМР являются белки от ВМР-1 до ВМР-14. Среди них для факторов от ВМР-2 до ВМР-14 было подтверждено наличие активности по контролю морфогенеза (формирования) костей. Белки ВМР, представляемые от ВМР-2 до ВМР-14, считаются эффективными с точки зрения лечения и профилактики различных патологий костей и заболеваний костей, однако в природе они существуют в очень малых количествах. Следовательно, доступность большого количества белков от ВМР-2 до ВМР-14, необходимых для указанного лечения, требует получения рекомбинантного белка. Выработка рекомбинантного белка обычно является весьма высокозатратным процессом по сравнению с получением низкомолекулярных соединений. Более того, существует целый ряд ограничений для лекарственного средства с точки зрения его физических свойств и способов его введения, связанных с характеристиками белка. С учетом этих замечаний низкомолекулярное органическое соединение, реально обладающее активностью, равной такой активности белка ВМР, может быть очень перспективным лекарственным средством. Соединение, получаемое в анализе с применением способа, заявляемого настоящим изобретением, обладает активностью по индукции экспрессии ВМР-7 человека, являющегося фактором остеогенеза, а также характеризуется эффективностью, такой же как у ВМР-7 человека, указывающей на его эффективную применимость. С другой стороны, если ВМР-7 человека связан с гиперплазией костной и хрящевой тканей, то подавление его экспрессии может предотвращать остеогиперплазию. В соответствии с настоящим изобретением можно идентифицировать подавление экс прессии ВМР-7, и настоящее изобретение представляет способ анализа вещества с точки зрения подавления гиперплазии. Кроме того, известно, что ВМР-7 человека обладает активностью по усилению дифференцировки почечных клеток (Ргос. №11. Асаб. 8сг И8А, 1996, 93, 9021-9026). Таким образом, представляемая настоящим изобретением экспериментальная система может быть включена в способ анализа агента, предназначенного для лечения заболевания почек.

С точки зрения такого анализа единственным ранее опубликованным примером является использование промотора гена ВМР-2 (международная патентная заявка АО 97/15308), причем примеров применения промотора гена ВМР-7 не было. Кроме того, поскольку представляемые настоящим изобретением материалы для заявляемого способа происходят от организма человека, то можно ожидать, что обнаруженные соединения проявят эффект при их практическом применении.

Сущность изобретения

Настоящее изобретение относится к ДНК, содержащей нуклеотиды 1-10877 8ЕО ГО N0: 1, приведенной в списке последовательностей, кодирующей белок-7 морфогенеза кости (ВМР7) человека и содержащей промоторную область гена, кодирующего указанный белок. Настоящее изобретение также относится к способу получения указанной ДНК и к вектору, содержащему указанную ДНК. Низкомолекулярные соединения и их производные обладают морфогенетической активностью и ингибиторной активностью в отношении костной и хрящевой тканей по типу активности ВМР-7 человека, и они эффективны в качестве профилактических или терапевтических средств против заболеваний хрящевой и костной тканей, средств против развития костных метастаз или терапевтических и профилактических средств против избыточного остеогенеза.

Краткое описание чертежей

На фиг. 1 показана экзон-интронная структура 5'-расположенного участка гена ВМР-7 человека длиной 10,8 т.п.н. и его рестрикционная карта. Закрашенный участок соответствует экзону, а незакрашенный участок после него интрону.

На фиг. 2 изображен рекомбинантный экспрессирующий вектор (плазмида рМ88115), включающий 5'-сегмент гена ВМР-7 человека. Промоторный сегмент длиной 4400 пар нуклеотидов (нуклеотиды 3813-8222, показанные в 8ЕО ГО N0: 1 списка последовательностей, приведенные от второго ХЬа1-сайта до третьего ХЬа1-сайта 5'-концевой структуры на фиг. 1) был встроен по рестрикционному ΝΜ-αίΐιγ исходной плазмиды рОЬ3.

На фиг. 3 приведены результаты измерений активности промотора гена ВМР-7 человека (при экспрессии непостоянного типа).

Описание предпочтительного осуществления

Настоящее изобретение относится к ДНК, нуклеотидная последовательность которой показана в виде перечня нуклеотидов 1-10877 в ЗЕО ΙΌ N0: 1 списка последовательностей, которая кодирует промоторный участок гена белка-7 морфогенеза, костей человека или его фрагмент. В последовательности ЗЕО ΙΌ N0: 1 списка последовательностей показан 5'расположенный участок гена ВМР-7 человека.

Настоящее изобретение относится к способу получения ДНК, показанной в ЗЕО ΙΌ N0:1 списка последовательностей, путем осуществления следующих стадий:

(1) расщепление геномной ДНК клеток плаценты человека рестриктазой ΗίηάΙΙΙ;

(2) выделение с применением электрофореза в агарозном геле;

(3) клонирование выделенного, расщепленного рестриктазой ΗίηάΙΙΙ фрагмента ДНК в фаговый вектор λΌΆ3Η-ΙΙ, предварительно расщепленный той же рестриктазой;

(4) упаковка упомянутого вектора в зрелую фаговую частицу;

(5) получение геномной клонотеки путем инфицирования клеток ЕксйепсЫа сой полученным фагом;

(6) скрининг с помощью ПЦР; и (7) субклонирование в плазмидный вектор.

Тип используемого здесь плазмидного вектора ничем не ограничен и может быть выбран из тех, которые доступны на коммерческой основе. Предпочтительным примером такого вектора может быть плазмида рИС18.

Настоящее изобретение относится к рекомбинантному экспрессирующему вектору, характеризующемуся встроенной в генрепортер полной или частичной последовательностью ДНК по ЗЕО ΙΌ N0: 1 списка последовательностей. В частности, рекомбинантный экспрессирующий вектор конструируют таким образом, чтобы разместить 5'-участок гена ВМР-7 человека, представленный в ЗЕО ΙΌ N0: 1 списка последовательностей, перед геномрепортером. Ген-репортер, такой как ген люциферазы или ген β-галактозидазы, будет свидетельствовать об экспрессии исходного продукта данного гена. Тип вектора, используемого для получения рекомбинантного экспрессирующего вектора, ничем специально не ограничивается, и может быть использован коммерчески доступный вектор. В качестве предпочтительного примера настоящим изобретением используется вектор на основе плазмиды рСЬ3. На основе рСЬ3 был сформирован вектор рМЗЗ115 (длиной 9200 пар нуклеотидов), являющийся рекомбинантным экспресирующим вектором, включающим промотор гена ВМР-7 человека и люциферазный ген-репортер. В настоящем изобретении он обозначается как рекомбинантный экспрессирующий вектор. Необходимым явля ется внесение этого вектора в клетки млекопитающего, предпочтительно в клетки остеобластного типа человека, такие как клетки За0З-2, с использованием липосом. Клетки животного, трансфицированные рекомбинантным экспрессирующим вектором, отбирают с использованием маркерного гена резистентности.

Настоящее изобретение относится к способу анализа связанного с костной тканью вещества, отличающегося использованием рекомбинантного экспрессирующего вектора, отличающегося соединением полной или частичной ДНК, показанной в ЗЕО ΙΌ N0: 1 списка последовательностей, с геном-репортером. Оно относится к способу анализа связанного с костной тканью вещества, причем таким связанным с костной тканью веществом является вещество, индуцирующее остеогенез, или причем связанным с костной тканью веществом является вещество, подавляющее остеогенез. Низкомолекулярное соединение, которое индуцирует или подавляет экспрессию ВМР-7 человека, может быть получено путем выделения промотора, который контролирует экспрессию гена, соединяя его с подходящим репортерным геном и внося полученную генную структуру в подходящую клетку млекопитающего с целью формирования анализаторной системы. Вещество, которое регулирует экспрессию гена ВМР-7 человека в такой анализаторной системе, воздействует на данный промотор так, что это обусловливает повышение или снижение уровня экспрессии гена-репортера. Таким образом, простое и несложное определение уровня активности репортера делает возможным тестирование анализируемого вещества.

Клетка животного, трансфицированная упомянутым вектором, может быть использована в способе тестирования библиотеки химических соединений путем высокопроизводительного скрининга (№11иге. 1996, 384, щрГ 14-16) и анализа активного компонента вещества естественного происхождения. То вещество, которое обусловливает снижение или усиление активности, обнаруживается при воздействии ее на клетку в течение подходящего периода времени с последующим определением уровня активности репортера. Полученное таким образом вещество может регулировать экспрессию путем прямого воздействия на транскрипционный фактор или косвенно на промотор гена ВМР-7 человека за счет влияния на элементы сигнальных путей. Следовательно, эти соединения будут эффективными в качестве терапевтических средств против заболеваний костной и хрящевой тканей, метастаз костных опухолей или гиперплазии костей.

Кроме того, эти соединения применимы в качестве терапевтических средств в отношении болезней почек.

Вещество, полученное в соответствии с настоящим изобретением, обладает морфогене тической активностью в отношении костной и хрящевой ткани и эффективно в качестве агента для терапии и профилактики в области ортопедической хирургии (переломы, остеоартрит, такой как остеоартроз суставов и остеоартроз тазобедренного сустава, эпифизарный остеомиелит, повреждения хрящей, такие как повреждения мениска, регенерация костной и хрящевой ткани после повреждений и удаления опухоли, костная пластика, такая как создание межпозвонковых анкилозов и расширение позвоночного канала, а также наследственные патологии костей и хряща, такие как дизостеогенез и ахондроплазия) или стоматологии (костная пластика, такая как заделка нёбной расщелины, реконструкция челюстных костей и наращивание остаточных альвеолярных выступов), а также при остеопорозе. Более того, такое вещество по настоящему изобретению может быть использовано при пересадке костной ткани в пластической хирургии. Аналогичные пути применения будут эффективны и в случае ветеринарной хирургии. С другой стороны, настоящим изобретением может представляться вещество, подавляющее развитие костной или хрящевой ткани. В этом случае это вещество применяется в качестве профилактического или терапевтического средства при гиперплазии кости и хряща.

Кроме того, настоящее изобретение может представлять вещество, характеризующееся способностью усиливать дифференциацию почечных клеток, благодаря чему она может быть применена в качестве средства лечения и профилактики заболеваний почек.

Примеры

Настоящее изобретение будет более наглядно объяснено с помощью приводимых далее примеров. При этом во всех отношениях нижеследующие примеры являются иллюстративными, а не ограничивающими.

Пример 1. Выделение 5'-участка гена ВМР-7 человека.

Геномная ДНК клеток плаценты человека (С1оШсс11) обрабатывали рестриктазами различного типа (ВатН1, ВдШ, ЕсоКЕ ΗίηάΙΙΙ, ΡκΐΙ, 8ас1, 8ай, 8та1, 8рЫ и ХЬа1), разделяли методом электрофореза в агарозном геле, переносили на нейлоновую мембрану и подвергали Саузерн-гибридизации с использованием в качестве зонда кДНК гена ВМР-7 (ЕМВО 1., 1990, 9, 2085-2093). В результате, было установлено, что расщепление рестриктазой ΗίηάΙΙΙ среди других использовавшихся рестриктаз позволило получить ДНК-фрагмент длиной примерно 11 тысяч пар нуклеотидов, включающий наиболее крупный участок гена ВМР-7 человека. Затем геномную ДНК клеток плаценты человека обрабатывали рестриктазой ΗίηάΙΙΙ и разделяли методом электрофореза в агарозном геле с последующим выделением из геля фрагмента ДНК длиной примерно 11 тысяч пар нуклеотидов.

Полученный фрагмент ДНК был клонирован в λ-фаговый вектор λΌΑδΗ-ΙΙ (81га1аде1те Ыб.), предварительно обработанный рестриктазой ΗίηάΙΙΙ. Полученный вектор ίη νίΐτο упаковывали с использованием Сфараск ΙΙΙ ХЬ Ех1гас1 (З^а^е^ Ь1б.), инфицировали им клетки ЕксйепсЫа со11 штамма ХЬ-1 В1ие МКА (81га1адеие Ь1б.) с формированием в результате геномной клонотеки. Эту клонотеку разделяли на пулы. Каждый из пулов амплифицировали с помощью ПЦР (Ыис1. Ас1б§ Кек., 1993, 21, 26272631), а именно, применяли метод ПЦР с затравками (8ЕО ГО N0: 2 и 8ЕО ГО N0: 3 списка последовательностей), соответствующими транслируемому сегменту, с целью выделения пула, от которого может быть выделена искомая 5'-последовательность гена ВМР-7 человека. Кроме того, 5'-расположенный фрагмент длиной 10,8 тысяч пар нуклеотидов субклонировали в состав вектора рИС18 (предоставлен Атегкйат Рйагтааа Вю1есй). Этот вектор обозначили как Е.сой рКОТ314. Вектор Е.соБ рКОТ314 внесли в коллекцию Национального института биологии и технологии человека Министерства международной торговли и промышленности Японии (1-3 ШдакЫ 1-скоте, ТкикиЬа-кЫ, !Ьагак1кеη 305-8566) 30 марта 1998 года с получением депозитарного номера ЕЕКМ Р-16737 с последующим внесением 17 февраля 1999 года в международный депозитарий под юрисдикцией Будапештского соглашения (депозитарный № ЕЕКМ ВР-6651).

Пример 2. Определение нуклеотидной последовательности 5'-участка гена ВМР-7 человека.

Нуклеотидная последовательность выделенного 5'-расположенного участка гена ВМР-7 человека была установлена с помощью ДНКсеквенатора АБЕ (Атегкйат Рйагтааа Вю1ес11), работа которого основана на методе Сэйнджера (За^ег е1 а1., 1977, Ргос. №111. Асаб. 8ск И8А, 74, 5463-5467). Определенная в этом анализе нуклеотидная последовательность показана в 8Е0 ГО N0: 1 списка последовательностей. Нуклеотиды 5557-10780 в последовательности 8Е0 ГО N0: 1 ранее уже были опубликованы (ЕМВО I., 1990, 9, 2085-2093). Однако имеется значительное число отличий от последовательности, приводимой настоящим изобретением.

Пример 3. Конструирование рекомбинантного экспрессирующего вектора, включающего промотор гена ВМР-7 человека и люциферазный ген-репортер.

Как показано на фиг. 1, промотор гена ВМР-7 человека расположен выше 1-го экзона. С учетом этого фрагмент длиной 4400 пар нуклеотидов, включающий промотор от второго ХЬаЕсайта до третьего ХЬаТсайта, считая от 5'конца в соответствии с показанным на фиг. 1, вносили по рестрикционному МюЕсайту исходного вектора рСЬ (Рготеда Ь1б.) так, чтобы этот фрагмент располагался выше гена

Ί репортера люциферазы, с целью конструирования рекомбинантного экспрессирующего вектора рМ88115 (9200 пар нуклеотидов). Он показан на фиг. 2.

Пример 4. Измерение активности промотора гена ВМР-7 человека (внесение рекомбинантного экспрессирующего вектора в клетку человека и экспрессия по непостоянному типу).

С целью экспрессии по непостоянному типу рекомбинантного экспрессирующего вектора с промотором ВМР-7 человека упомянутый рекомбинантный экспрессирующий вектор (рМ88115) в равном количестве смешивали с вектором рКЬ-8У40 (Рготеда Иб.). включающим ген люциферазы организма кеа райку, взятый в качестве внутреннего контроля для определения эффективности внесения гена. Затем к смеси, предназначенной для добавления к остеосаркомным клеткам человека линий НО8, МО63 и 8аО8-2, добавляли катионные липосомы - липофектамин (Ыро1еей Ог1еп1а1 Со.). Активность люциферазы огненного муравья 8о1епорк1к ίηνίοΐη и люциферазы кеа рапку измеряли с использованием набора реактивов Р1кка Оепе Эиа1 кй (Тоуо 1пк Со.). Полученные результаты показаны на фиг. 3. Уровень промоторной активности выражали отношением активности люциферазы огненного муравья и активности люциферазы кеа рапку. Исходя из этих результатов, стало ясно, что ДНК по 8ЕЦ ГО N0: 1 списка последовательностей обладает промоторной активностью.

Пример 5. Внесение рекомбинантного экспрессирующего вектора в клетку человека и стабильная экспрессия.

С целью стабильной экспрессии рекомбинантного экспрессирующего вектора, включающего ВМР-7 человека, упомянутый вектор смешивали с вектором, включающим ген резистентности к пуромицину, в соотношении 10:1, а также смешивали с катионными липосомами липофектамином (Ы£е1еей Ог1еп1а1 Со.), которые затем добавляли к остеосаркомным клеткам человека НО8 с целью их трансфицирования. Клетки, в которые попал анализируемый ген, отбирали из культуральной среды, содержащей пуромицин (81§та Пб.).

Пример 6. Скрининг активного низкомолекулярного соединения.

Отобранные клетки вносили в лунки 96луночного планшета, обрабатывали в течение 13 дней веществами, представляющими различные библиотеки химических соединений, обрабатывали цитолитическим агентом (Рготеда Иб.) и измеряли каталитическую активность с использованием набора реактивов для определения люциферазной активности (Рготеда Иб.). С помощью данного подхода был выделен ряд веществ, индуцирующих или подавляющих экспрессию ВМР-7 человека.

Описание списка последовательностей <210> 1 <223> Нуклеотидная последовательность участков, расположенных в 5'-части гена ВМР-7 человека, включающих 1-й экзон.

<210> 2 <223> Прямая ПЦР-затравка для клонирования 5'-последовательности гена ВМР-7 человека, соответствующая участку 1-го экзона.

<210> 3 <223> Обратная ПЦР-затравка для клонирования 5'-последовательности гена ВМР-7 человека, соответствующая участку 1-го экзона.

Список последовательностей <110> НоесИзС МагФоп Еоиззе1 ΙΧά.

<120> Промотор гена ВМР-7 человека и способ анализа с его использованием вещества, связанного с костной тканью

Claims

1. ДНК, содержащая нуклеотиды 1-10877 8Е0 ΙΌ N0: 1, приведенной в списке последовательностей, кодирующая белок-7 морфогенеза кости (ВМР-7) человека и содержащая промоторную область гена, кодирующего указанный белок.

2. Способ получения ДНК, охарактеризованной в п.1, предусматривающий следующие стадии:

(1) расщепление геномной ДНК клеток плаценты человека рестриктазой ΗίηάΙΙΙ, (2) выделение фрагмента ДНК размером приблизительно 11 т.п.н. с помощью электрофореза обработанной ΗίηάΙΙΙ смеси в агарозном геле, (3) клонирование выделенного расщепленного ΗίηάΙΙΙ фрагмента ДНК в λ-фаговый вектор λΌΑδΗΙΙ, обработанный ΗίηάΙΙΙ, (4) упаковка указанного вектора в фаг, (5) получение геномной клонотеки путем инфицирования ЕксйепсШа сой полученным фагом, (6) скрининг по методу ПЦР с использованием ПЦР-праймеров, имеющих нуклеотидные последовательности 8Е0 ΙΌ N0:2 и 3, приведенные в списке последовательностей, соответствующих области экзона 1 гена ВМР-7, и (7) субклонирование генного фрагмента размером 10,8 т.п.н., расположенного в 5'концевой области гена ВМР-7 человека, в плазмидный вектор с получением ДНК, охарактеризованной в п.1.

3. Рекомбинантный экспрессирующий вектор, полученный встраиванием ДНК по п.1 в участок, расположенный выше репортерного гена.