UA72212C2 - Human bmp-7 promoter and method for exploring bone-related substance by using the same - Google Patents
Human bmp-7 promoter and method for exploring bone-related substance by using the same Download PDFInfo
- Publication number
- UA72212C2 UA72212C2 UA2000116830A UA2000116830A UA72212C2 UA 72212 C2 UA72212 C2 UA 72212C2 UA 2000116830 A UA2000116830 A UA 2000116830A UA 2000116830 A UA2000116830 A UA 2000116830A UA 72212 C2 UA72212 C2 UA 72212C2
- Authority
- UA
- Ukraine
- Prior art keywords
- vector
- bone
- gene
- human bmp
- activity
- Prior art date
Links
- 210000000988 bone and bone Anatomy 0.000 title claims abstract description 25
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 18
- 239000000126 substance Substances 0.000 title claims description 23
- 101100165560 Mus musculus Bmp7 gene Proteins 0.000 title 1
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims abstract description 39
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims abstract description 23
- 108700008625 Reporter Genes Proteins 0.000 claims abstract description 16
- 208000017169 kidney disease Diseases 0.000 claims abstract description 6
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 24
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 19
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 19
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 14
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 claims description 13
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 claims description 11
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 10
- 238000010367 cloning Methods 0.000 claims description 6
- 230000034127 bone morphogenesis Effects 0.000 claims description 5
- 230000011164 ossification Effects 0.000 claims description 5
- 244000068988 Glycine max Species 0.000 claims description 4
- 235000010469 Glycine max Nutrition 0.000 claims description 4
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 claims description 4
- 210000002826 placenta Anatomy 0.000 claims description 4
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 claims description 3
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 claims description 3
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 claims description 3
- 238000002955 isolation Methods 0.000 claims description 3
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 claims description 3
- 230000007017 scission Effects 0.000 claims description 3
- 238000012216 screening Methods 0.000 claims description 3
- 108700039691 Genetic Promoter Regions Proteins 0.000 claims description 2
- 101710151715 Protein 7 Proteins 0.000 claims description 2
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 claims 4
- 238000003780 insertion Methods 0.000 claims 2
- 230000037431 insertion Effects 0.000 claims 2
- 201000006370 kidney failure Diseases 0.000 claims 1
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 abstract description 17
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 abstract description 15
- 101000899361 Homo sapiens Bone morphogenetic protein 7 Proteins 0.000 abstract description 13
- 210000000845 cartilage Anatomy 0.000 abstract description 11
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 8
- 150000003384 small molecules Chemical class 0.000 abstract description 8
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 abstract description 7
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 abstract description 5
- 230000003449 preventive effect Effects 0.000 abstract description 4
- 230000001002 morphogenetic effect Effects 0.000 abstract description 3
- 208000020084 Bone disease Diseases 0.000 abstract description 2
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 abstract description 2
- 208000015100 cartilage disease Diseases 0.000 abstract 1
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 abstract 1
- 101100165559 Homo sapiens BMP7 gene Proteins 0.000 description 26
- 108060001084 Luciferase Proteins 0.000 description 10
- 239000005089 Luciferase Substances 0.000 description 8
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 7
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 5
- 206010020718 hyperplasia Diseases 0.000 description 4
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 4
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 4
- RXWNCPJZOCPEPQ-NVWDDTSBSA-N puromycin Chemical compound C1=CC(OC)=CC=C1C[C@H](N)C(=O)N[C@H]1[C@@H](O)[C@H](N2C3=NC=NC(=C3N=C2)N(C)C)O[C@@H]1CO RXWNCPJZOCPEPQ-NVWDDTSBSA-N 0.000 description 4
- 108010049931 Bone Morphogenetic Protein 2 Proteins 0.000 description 3
- 108010049870 Bone Morphogenetic Protein 7 Proteins 0.000 description 3
- 102100024506 Bone morphogenetic protein 2 Human genes 0.000 description 3
- 102100035379 Growth/differentiation factor 5 Human genes 0.000 description 3
- 101710204282 Growth/differentiation factor 5 Proteins 0.000 description 3
- 230000030279 gene silencing Effects 0.000 description 3
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 3
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 3
- 240000002791 Brassica napus Species 0.000 description 2
- 235000004977 Brassica sinapistrum Nutrition 0.000 description 2
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 2
- CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L Sodium Carbonate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]C([O-])=O CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 241000517830 Solenopsis geminata Species 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 125000002091 cationic group Chemical group 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 2
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 2
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 2
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 2
- 210000003292 kidney cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 2
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- 201000008482 osteoarthritis Diseases 0.000 description 2
- 201000008968 osteosarcoma Diseases 0.000 description 2
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 2
- 230000007170 pathology Effects 0.000 description 2
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 2
- 229950010131 puromycin Drugs 0.000 description 2
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 description 2
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 2
- 235000015067 sauces Nutrition 0.000 description 2
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 2
- 208000008822 Ankylosis Diseases 0.000 description 1
- 102100028728 Bone morphogenetic protein 1 Human genes 0.000 description 1
- 108090000654 Bone morphogenetic protein 1 Proteins 0.000 description 1
- 102100022544 Bone morphogenetic protein 7 Human genes 0.000 description 1
- 208000018084 Bone neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 206010007710 Cartilage injury Diseases 0.000 description 1
- 241000283153 Cetacea Species 0.000 description 1
- 206010008723 Chondrodystrophy Diseases 0.000 description 1
- 206010009269 Cleft palate Diseases 0.000 description 1
- 241000282326 Felis catus Species 0.000 description 1
- 208000007353 Hip Osteoarthritis Diseases 0.000 description 1
- 206010023198 Joint ankylosis Diseases 0.000 description 1
- 206010027476 Metastases Diseases 0.000 description 1
- 206010027452 Metastases to bone Diseases 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- 239000004677 Nylon Substances 0.000 description 1
- 206010031252 Osteomyelitis Diseases 0.000 description 1
- 208000001132 Osteoporosis Diseases 0.000 description 1
- 238000002105 Southern blotting Methods 0.000 description 1
- 108091023040 Transcription factor Proteins 0.000 description 1
- 102000040945 Transcription factor Human genes 0.000 description 1
- 102000009618 Transforming Growth Factors Human genes 0.000 description 1
- 108010009583 Transforming Growth Factors Proteins 0.000 description 1
- 208000008919 achondroplasia Diseases 0.000 description 1
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 210000001909 alveolar process Anatomy 0.000 description 1
- 230000019552 anatomical structure morphogenesis Effects 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 230000003416 augmentation Effects 0.000 description 1
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 238000002316 cosmetic surgery Methods 0.000 description 1
- 230000001461 cytolytic effect Effects 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 238000013537 high throughput screening Methods 0.000 description 1
- 210000004394 hip joint Anatomy 0.000 description 1
- 210000001847 jaw Anatomy 0.000 description 1
- 210000001503 joint Anatomy 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 229940126601 medicinal product Drugs 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 230000005499 meniscus Effects 0.000 description 1
- 229920001778 nylon Polymers 0.000 description 1
- 150000002894 organic compounds Chemical class 0.000 description 1
- 230000000399 orthopedic effect Effects 0.000 description 1
- 210000000963 osteoblast Anatomy 0.000 description 1
- 238000004806 packaging method and process Methods 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 235000011837 pasties Nutrition 0.000 description 1
- 230000000704 physical effect Effects 0.000 description 1
- 230000000069 prophylactic effect Effects 0.000 description 1
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 1
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 1
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 230000019491 signal transduction Effects 0.000 description 1
- 230000010473 stable expression Effects 0.000 description 1
- 230000002123 temporal effect Effects 0.000 description 1
- 238000010998 test method Methods 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 1
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 description 1
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/475—Growth factors; Growth regulators
- C07K14/51—Bone morphogenetic factor; Osteogenins; Osteogenic factor; Bone-inducing factor
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
- A61P13/02—Drugs for disorders of the urinary system of urine or of the urinary tract, e.g. urine acidifiers
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P15/00—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Physical Education & Sports Medicine (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- Reproductive Health (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
Description
Даний винахід відноситься до 5'-розташованої ділянки ДНК, яка включає промотор гена, що кодує білок морфогенезу кісток (тут і надалі позначається як ВМР-7). Крім того, даний винахід відноситься до способу аналізу низькомолекулярної сполуки, яка позитивно або негативно регулює експресію гена ВМР-7 людини, з використанням масиву клітин тварини або дріжджів, у які вносять рекомбінантний експресуючий вектор, який включає 5'--розташовану ділянку ДНК, у складі якої є промотор ВМР-7 людини, з'єднаний з відповідним геном- репортером з використанням активності гена-репортера як індикаторної ознаки.
Дотепер було встановлено, що активність, пов'язана з морфогенезом кісткової тканини, властива фактору морфогенезу кісток - ВМР, що відноситься до суперсімейства ТОБ-Р (трансформуючі фактори росту) (Зсіепсе, 1965, 150, 893-897; Зсієепсе, 1988, 242, 1528-1534). Відомими типами ВМР є білки від ВМР-1 до ВМР-14. Серед них для факторів від ВМР-2 до ВМР-14 була підтверджена наявність активності по контролю морфогенезу (формування) кісток. Білюи ВМР від ВМР-2 до ВМР-14 вважаються ефективними з точки зору лікування і профілактики різних патологій кісток та захворювань кісток, однак в природі вони існують у надзвичайно малих кількостях. Отже, доступність великої кількості білків від ВМР-2 до ВМР-14, необхідних для зазначеного лікування, вимагає отримання рекомбінантного білка. Вироблення рекомбінантного білка звичайно є вельми високовитратним процесом у порівнянні з отриманням низькомолекулярних сполук. До того ж, існує цілий ряд обмежень для лікарського засобу з точки зору його фізичних властивостей та способів його введення, пов'язаних з характеристиками білка. З урахуванням цих зауважень низькомолекулярна органічна сполука, яка реально має активність, рівну такій активності білка ВМР, може бути дуже перспективним лікарським засобом.
Сполука, яка одержується при аналізі із застосуванням способу, що заявляється даним винаходом, має активність по індукції експресії ВМР-7 людини, що є фактором остеогенезу, а також характеризується ефективністю, такою ж як у ВМР-7 людини, що вказує на його ефективну застосовність. З іншого боку, якщо
ВМР-7 людини пов'язаний з гіперплазією кісткової і хрящової тканин, то приглушення його експресії може запобігати остеогіперплазії. Відповідно до даного винаходу можна ідентифікувати приглушення експресії ВМР - 7, І даний винахід представляє спосіб аналізу речовини з точки зору приглушення гіперплазії. Крім того, відомо, що ВМР-7 людини має активність по посиленню диференціровки ниркових клітин (Ргос. Маї!. Асад. 5бві.
БА, 1996, 93, 9021-9026). Таким чином, представлену даним винаходом експериментальну систему можна включити до способу аналізу агента, призначеного для лікування захворювання нирок.
З точки зору такого аналізу єдиним раніше опублікованим прикладом є використання промотору гена
ВМР-2 (міжнародна патентна заявка МО 97/15308), причому прикладів застосування промотору гена ВМР-7 не було. Крім того, оскільки матеріали, які представляються даним винаходом для способу, що заявляється, походять від організму людини, то можна чекати, що виявлені сполуки проявлять ефект при їх практичному застосуванні.
Даний винахід представляє 5'-розташовану ДНК, яка включає промотор гена ВМР-7 людини. З використанням промотору, розташованого у 5'-частині гена ВМР-7 людини, з'єднаного з відповідним геном- репортером, і клітини тварини, до якої внесено рекомбінантний експресуючий вектор, низькомолекулярні сполуки, які позитивно або негативно регулюють експресію гена ВМР-7 людини, можуть бути проаналізовані по активності репортера. Низькомолекулярні сполуки та їх похідні мають морфогенетичну активність та інгібіторну активність по відношенню до кісткової і хрящової тканин за типами активності ВМР-7 людини, і вони є ефективними як профілактичні або терапевтичні засоби проти захворювань хрящової і кісткової тканин, засоби проти розвитку кісткових метастазів або терапевтичні та профілактичні засоби проти надмірного остеогенезу. До того ж, ці низькомолекулярні сполуки та їх похідні можна застосовувати як профілактичні або терапевтичні агенти по відношенню до хвороб нирок.
На Фігурі 1 показана екзон-інтронна структура 5'-розташованої ділянки гена ВМР-7 людини довжиною 10,8 тисяч пар нуклеотидів та його рестрикційна карта. Зафарбована ділянка відповідає екзону і незафарбована після нього ділянка - інтрону.
На фігурі 2 зображений рекомбінантний експресуючий вектор (плазміда рМ55115), який включає 5'- сегмент гена ВМР-7 людини. Промоторний сегмент довжиною 4400 пар нуклеотидів (нуклеотиди 3813-8222, показані у ЗЕО ІО МО:1 списку послідовностей, наведені від другого ХраІ-сайта до третього ХраїЇ-сайта 5'- кінцевої структури на Фіг.1) був вбудований по рестрикційному Мпе!-сайту вихідної плазміди розі 3.
На Фігурі З показані результати вимірювань активності промотору гена ВМР-7 людини (при експресії непостійного типу).
Даний винахід відноситься до ДНК, нуклеотидна послідовність якої показана у вигляді переліку нуклеотидів від 1 до 10877 у БЕО ІО МО:1 списку послідовностей, яка кодує промоторну ділянку гена білка-7 морфогенезу кісток людини або його фрагмент. У послідовності ЗЕО ІЮ МО:1 списку послідовностей показана
Б5'-розташована ділянка гена ВМР-7 людини.
Даний винахід відноситься до способу одержання ДНК, показаної у ЗЕО ІО МО:1 списку послідовностей, шляхом здійснення таких стадій: (1) розщеплення геномної ДНК клітин плаценти людини рестриктазою НіпаїЇІЇ; (2) виділення із застосуванням електрофорезу у агарозному гелі; (3) клонування виділеного, розщепленого рестриктазою Ніпай! фрагмента ДНК у фаговий вектор ХЮАЗН-Ї 1, попередньо розщеплений тією ж рестриктазою; (4) упаковка згаданого вектора у зрілу фагову частинку; (5) одержання геномної клонотеки шляхом інфікування клітин Е5спегіспіа соїї одержаним фагом; (б) скринінг за допомогою ПЛР; і (7) субклонування у плазмідний вектор.
Тип плазмідного вектора, який використовується тут, ні чим не обмежений і може бути вибраний з тих, що доступні на комерційній основі. Найкращім прикладом такого вектора може бути плазміда рис18.
Даний винахід відноситься до рекомбінантного експресуючого вектора, який характеризується вбудованою до гена-репортера повною або частковою послідовністю ДНК по 5ЕО ОО МО:1 списку послідовностей. Зокрема, рекомбінантний експресуючий вектор конструюють таким чином, щоб розмістити 5'-
ділянку гена ВМР-7 людини, подану у ЗЕО ІЮ МО:1 списку послідовностей, перед геном-репортером. Ген- репортер, такий як ген люциферази або ген р-галактозидази, буде свідчити про експресію вихідного продукту даного гена. Тип вектора, який використовується для одержання рекомбінантного експресуючого вектора, ні чим спеціально не обмежується, і може бути використаний комерційно доступний вектор. Як найкращій приклад даним винаходом використовується вектор на основі плазміди роі/3. На основі ро 3 був сформований вектор рМ55115 (довжиною 9200 пар нуклеотидів), який є рекомбінантним експресуючим вектором, що включає промотор гена ВМР-7 людини та люциферазний ген-репортер. У даному винаході він визначається як рекомбінантний експресуючий вектор. Необхідним є внесення цього вектора до клітини ссавця, переважно до клітин остеобластного типу людини, таких як клітини 5аОб5-2, з використанням ліпосом.
Клітини тварини, трансфіковані рекомбінантним експресуючим вектором, відбирають з використанням маркерного гена резистентності.
Даний винахід відноситься до способу аналізу пов'язаної з кістковою тканиною речовини, який відрізняється використанням рекомбінантного експресуючого вектора, що відрізняється поєднанням повної або часткової ДНК, показаної у ЗЕО ІО МО:1 списку послідовностей, з геном-репортером. Він відноситься до способу аналізу пов'язаної з кістковою тканиною речовини, причому такою пов'язаною з кістковою тканиною речовиною є речовина, що індукує остеогенез, або такою пов'язаною з кістковою тканиною речовиною є речовина, яка приглушує остеогенез. Низькомолекулярна сполука, яка індукує або приглушує експресію ВМР- 7 людини, може бути одержана шляхом виділення промотору, який контролює експресію гена, з'єднуючи його з відповідним репортерським геном і вносячи одержану генну структуру у відповідну клітину ссавця з метою формування аналізаторної системи. Речовина, яка регулює експресію гена ВМР-7 людини у такій аналізаторній системі, впливає на даний промотор так, що це стає причиною підвищення або зниження рівня експресії гена-репортера. Таким чином, просте та нескладне визначення рівня активності репортера уможливлює тестування аналізованої речовини.
Клітина тварини, яка трансфікована згаданим вектором, може бути використана у способі тестування бібліотеки хімічних сполук шляхом високопродуктивного скринінгу (Маїиге, 1996, 384, з,иррі., 14-16) та аналізу активного компонента речовини природного походження. Та речовина, яка спричиняє зниження або посилення активності, виявляється під час дії її на клітину протягом відповідного періоду часу з подальшим визначенням рівня активності репортера. Одержана таким чином речовина може регулювати експресію шляхом прямого впливу на транскрипційний фактор або непрямо на промотор гена ВМР-7 людини через вплив на елементи сигнальних шляхів. Отже, ці сполуки будуть ефективними як терапевтичні засоби проти захворювань кісткової і хрящової тканин, метастазах кісткових пухлин або гіперплазії кісток.
Крім того, ці сполуки можуть бути застосовані як терапевтичні засоби по відношенню до хвороб нирок.
Речовина, одержана відповідно до даного винаходу, має морфогенетичну активність по відношенню до кісткової і хрящової тканини та ефективна як агент для терапії і профілактики у області ортопедичної хірургії (переломи, остеоартрит, такий як остеоартроз суглобів і остеоартроз тазостегнового суглоба, епіфізарний остеомієліт, пошкодження хрящів, такі як пошкодження меніска, регенерація кісткової і хрящової тканини після пошкоджень і видалення пухлини, кісткова пластика, така як створення міжхребцевий анкілозів і розширення хребетного каналу, а також спадкові патології кісток і хряща, такі як дизостеогенез і ахондроплазія) або стоматології (кісткова пластика, така як закладення піднебінної щілини, реконструкція щелепних кісток та нарощування залишкових альвеолярних виступів), а також при остеопорозі. До того ж, таку речовину за даним винаходом можна використовувати при пересаджуванні кісткової тканини у пластичній хірургії. Аналогічні шляхи застосування будуть ефективні і у разі ветеринарної хірургії. З іншого боку, даний винахід може представляти речовину, яка приглушує розвиток кісткової або хрящової тканини. У цьому випадку ця речовина застосовується як профілактичний або терапевтичний засіб при гіперплазії кістки і хряща.
Крім того, даний винахід може представляти речовину, що характеризується здатністю посилювати диференціацію ниркових клітин, завдяки чому вона може бути застосована як засіб лікування та профілактики захворювань нирок.
ПРИКЛАДИ
Даний винахід буде більш детально пояснено за допомогою прикладів, що наводяться далі. При цьому нижченаведені приклади є ілюстративними, а не обмежувальними.
Приклад 1
Виділення 5'-ділянки гена ВМР-7 людини
Геномну ДНК клітин плаценти людини (Сіопіесп) обробляли рестриктазами різного типу (Ватні, Во,
ЕсокіІ, Ніпаї, Р, зай, заї, Зтаї, 5рп! і Храї), розділяли методом електрофорезу у агарозному гелі, переносили на нейлонову мембрану та піддавали Саузерн-гібридизації з використанням КДНК гена ВМР-7 (ЕМВО 9., 1990, 9, 2085-2093) як зонду. У результаті було встановлено, що розщеплення рестриктазою Ніпаг ії посеред інших рестриктаз, які використовувалися, дозволило одержати ДНК-фрагмент довжиною приблизно 11 тисяч пар нуклеотидів, який включає найбільшу ділянку гена ВМР-7 людини. Потім геномну ДНК клітин плаценти людини обробляли рестриктазою Ніпаїїї та розділяли методом електрофорезу у агарозному гелі з подальшим виділенням з гелю фрагмента ДНК довжиною приблизно 11 тисяч пар нуклеотидів. Одержаний фрагмент ДНК був клонован у Х-фаговий вектор ХОАБН-ЇЇ (Зігаїадепе Ца.), попередньо оброблений рестриктазою Ніпай. Одержаний вектор іп міго упаковували з використанням Сідараск ПІ Хі Ехігасі (5Зігазтадепе Ца.), інфікували їм клітини Езспегіспіа соїї штаму ХІ-1 Віпе МЕА (5ігаїадепе ЦЯ.) з формуванням у результаті геномної клонотеки. Цю клонотеку розділяли на пули. Кожний з пулів ампліфікували з допомогою
ПЛР (Мисі. Асіаз Кев5., 1993, 21, 2627-2631), а саме застосовували метод ПЛР з затравками (ЗЕО ІО МО:2 та
ЗЕО ІЮО МО:З3 списку послідовностей), відповідними до сегменту, що транслюється, з метою виділення пулу, з якого може бути виділена шукана 5'- послідовність гена ВМР-7 людини. Крім того, 5'-розташований фрагмент довжиною 10,8 тисяч пар нуклеотидів субклонували до складу вектора рисіІ8 (наданий Атегзпат РПпагтасіа
Віоїесі). Цей вектор позначили як Е.соїї РКОТ314. Вектор Е.соїї рКОТ314 внесли до колекції Національного інституту біології та технології людини Міністерства міжнародної торгівлі та промисловості Японії (1-3 Нідавзпі
1-споте, Тзикиба-впПі, Ібагакі-кеп 305-8566) 30 березня 1998 року з отриманням депозитарного номера РЕКМ
Р-16737 з подальшим внесенням 17 лютого 1999 року до міжнародного депозитарію під юрисдикцією
Будапештської угоди (депозитарний М"РЕКМ ВР-6651).
Приклад 2
Визначення нуклеотидної послідовності 5'-ділянки гена ВМР-7 людини Нуклеотидна послідовність виділеної 5'--розташованої ділянки гена ВМР-7 людини була встановлена за допомогою ДНК-секвенатора АГ ЕЕ (Атег5пат РІагтасіа Віоїтесі), дія якого заснована на методі Сейнджера (Заподег еї а!., 1977, Ргос. Май). Асай. сі. ОБА, 74, 5463-5467). Визначена під час цього аналізу нуклеотидна послідовність показана у БЕО ІЮ МО: 1 списку послідовностей. Нуклеотиди 5557-10780 у послідовності ФЕО ІЮ МО:1 раніше вже були опубліковані (ЕМВО 1, 1990, 9, 2085-2093). Однак, існує-значне число - відмінностей від послідовності, яка наводиться даним винаходом.
Приклад З
Конструювання рекомбінантного експресуючого вектора, який включає промотор гена ВМР-7 людини та люциферазний ген-репортер
Як показано на Ффіг.1, промотор гена ВМР-7 людини розташований вище 1-го екзону. З урахуванням цього фрагмент довжиною 4400 пар нуклеотидів, який включає промотор від другого Хра!-сайта до третього Хвраї- сайта, рахуючи від 5'-кінця відповідно до показаного на фіг. 1, вносили по рестрикційному Мпе!-сайту вихідного вектора рої (Рготеда ЦЯ.) так, щоб цей фрагмент розташовувався вище гена-репортера люциферази, з метою конструювання рекомбінантного експресуючого вектора рм55115 (9200 пар нуклеотидів). Він показаний на Фіг.2.
Приклад 4
Вимірювання активності промотору гена ВМР-7 людини (внесення рекомбінантного експресуючого вектора до клітини людини та експресія за непостійним типом) З метою експресії за непостійним типом рекомбінантного експресуючого вектора з промотором ВМР-7 людини згаданий рекомбінантний експресуючий вектор (6М55115) у рівних кількостях змішували з вектором ркІ-5М40 (Рготеда Ца.), який включає ген люциферази організму 5еа рапзу, узятий як внутрішній контроль для визначення ефективності внесення гена.
Потім до суміші, призначеної для додавання до остеосаркомних клітин людини ліній НО5, МО63 та зао5-2, додавали катіонні ліпосоми - ліпофектамін (Гіроїтесп Огіепіа! Со.). Активність люциферази вогненної мурашки
БоІепорзів іпміста та люциферази 5еа рапзу вимірювали з використанням набору реактивів Рікка сепе Опаї кії (Тоуо Іпк Со.). Одержані результати показані на Фіг.3. Рівень промоторної активності визначали відношенням активності люциферази вогненної мурашки та активності люциферази з5еа рапзу. Виходячи з цих результатів зрозуміло, що ДНК по 5ЕО ІО МО:1 списку послідовностей має промоторну активність.
Приклад 5
Внесення рекомбінантного експресуючого вектора до клітини людини та стабільна експресія
З метою стабільної експресії рекомбінантного експресуючого вектора, який включає ВМР-7 людини, згаданий вектор змішували з вектором, який включає ген резистентності до пуроміцину, у співвідношенні 101, а також змішували з катіонними ліпосомами - ліпофектаміном (іїегесп Огіепіа! Со.), які потім додавали до остеосаркомних клітин людини НОБЗ з метою їх трансфікування. Клітини, до яких попав аналізований ген, відбирали з культурального середовища, яке містить пуроміцин (Зідта (їа.).
Приклад 6
Скринінг активної низькомолекулярної сполуки
Відібрані клітини вносили до лунки 96-луночного планшета, обробляли протягом 1-3 днів речовинами, які представляють різні бібліотеки хімічних сполук, обробляли цитолітичним агентом (Рготеда Ца.) та вимірювали каталітичну активність з використанням набору реактивів для визначення люпиферазної активності (Рготеда Ша.) За допомогою даного підходу був виділений ряд речовин, які індукують або приглушають експресію ВМР-7 людини.
Опис списку послідовностей «21051 «223» Нуклеотидна послідовність ділянок, розташованих у 5'-частині гена ВМР-7 людини, які включають 1- й екзон. «21052 «223» Пряма ПЛР-затравка для клонування 5'- послідовності гена ВМР-7 людини, яка відповідна до ділянки 1-го екзону. «21053 «223» Зворотна ПЛР-затравка для клонування 5'- послідовності гена ВМР-7 людини, яка відповідна до ділянки 1-го екзону.
СПИСОК ПОСЛІДОВНОСТЕЙ
«110» Ноеспзі Мапоп Ноизгзеї! ЦИ. «120» Промотор гена ВМР-7 людини і спосіб аналізу з його використанням речовини, пов'язаної з кістковою тканиною «130» УНУВКО04 РСТ БЕОШОЄЕМСЕЗ5 ІМ ЕМОГІЗН -140» «1415 -1505 10-120174 «151» 30 квітня 1998р. -16053 «170» Раїепііп, мегв. 2.1 «21051 «2115 10877 «212» ДНК
«213» людина «РоО0» «221» властивість «222 (1)... (10877) «223» Нуклеотидна послідовність ділянок, розташованих у 5'-частині гена ВМР-7 людини, які включають 1- й зкзон «4005 1
ЗАпепІзо; зхсЗ3хіЗУс суспіІСЬстЄ ЗПпОЕБааут ТЗ Зсхп сІЩІЗЕсатя Й «пеіжЗ5ЖІтО ФІпохахіху ПІЛОяТоМІй спайдодхі сусхсопому ХЗХІМІухоМ 122 азспурсікі зстіхзазса зспетійвс; зсуви; 23ахвазозі завасустея І1Й
ЧіІхоашунаа зЗзатаптя І5Ілоз3ї4з пуговаасяс повара лодасяцокУ чаззазааша хохоячапр пплсохтихо дапеспузує соц озої ксопосувиї БО стопа пожсостьзу стажсстої всотсастідта гозсубезт стохеиант 350 хпіиМмлхвне хауса ш хсосабсстся возсозауя ветіІЗассяу оссустшизи ЗО саспухоусу цоЗІлузМ соковсілуз зсуви Мр такса Ззохусотузи М тихі о Ст ї зфпКрМмІ хи демМмигс ГУхИмчоаул ЗІ у їх підЕКУХ Ці ШПізхаугиу ЩоуусМІсІ фраз уує зуф ми саме «аа тукоа лоз ЗиВІа спиМходасс ІЩдИМММлИ яд пед БО здсмиайоує деп меха цусйзохур пуахОВІіле СПРеМЦІМ ісхураЗМІЗ 7ХО ссісузиско роза сах помлузиех пусуфоуєце сети уї бпммомос ТЕ ясіпІЩЗАхЬ ІпОд3ІхОУ ФІ хдИглО ХопуЗАОяІА схДІсТОУУХ сФулодагм ВЕ дент іхопаднсшхо засхцлцдно ЗІпІЛМА ФетасАцЕУ ПТДЖИММг ЗО лолтмиситт ІпісУМмО фін ЗІЦаніІцІй струм кішок ММІ: ЗКО пУпликкс суха пусу зас омх спот хзех хіопоноояі бемихма ХУХИ
У окдіся схо: сиву суугіуь перуку замісу 2335 химотіхат попотуїхас зооцдоцсттуа здох усусом хопмеміІЙйИиО Фомізузиа ЗИ сесіщрах спіпісустаа 32325353 ехахукЗаху ЗакзсхажуЗ захікуУХЄУщи ЗДО зазітолузх цохозчасас сгузутисз8 «уопускаше усисиЕхОцуЗ ШХУслІсуЗ МО запоміах цехах сузіаусуах вза уору ТТ кс: сеузмвучу 530 чеуфх Мох хІхЗжтахтх сусУу3иїх старі зіспзкмкхся Зхтахловмац 135 заусхзауту поцехІото4у хІЗІІкЗіх сЗЕБіхуУсст Ззацой3аоІї зжузхаиіль Б кжоихохасу сЕулиихіуду тТіхіліцодх тідЗахІсца Зсузцасати схіхусусмі 1 к«хісрахоху усудужатлх Улотліулулс сСтоулитУсЬх ЩсЗхутаЗах ахусутувиух 1250 соусі сі соусудауиЬ УЗтЗІІояа ЗІ слуїтас паза ІХ сим уех І схехузуано усе уєзіст тІстсзасіцо сакужуєти вусики бхдлуситма 1955 зуусІЗІАХс сс суЗої ІПУудлІОов дЗсаасаЧах хосхусУЄтТІ са УТУФУХ АТО зсзсзхоамм лолсхассхо зудхиіІЖТо дос колс Каси тіоу ЗВІТИ: АВС хатозцдит зукомцпі» схеми щиа: зпфимІСЯХ ХіпОУМлоЄ ЗОхУбмиМи АБО самоти апот сЗататки усу: Майї часової гКдлбхж ГО тхвадмитх фіз; мотусівца: «ущцопусут ІБузйимя сюіІЦУНУ ЗВУ тихусиїсЗах сетахіалау цусісасУсо хазусоо ЗУ ситах са ТОНИ тов саху Зсупутусх статево оз5ІЩфаВій лЕУдКетіІнт дуулусус ліЖа дллсУтТОо МИ ПІХІлЛО: опехумохи Зрумххол хупхахатгі гелем: ліИ пасти ру; масі; ботан: суемаахтпу деІвшлпопІї «хх ціпіх ЛІДУ хохомхомі; сірасівщтс сума ссят сЗахІсЗахУ тедлтуіиїл дизолуслат: ЛУКИ зпозоузусу спла пт піно Зп укх плоту ао яЕшлУспУВ ЩЕ сасихдєхаху сиспієМауа ФМ зквлмзоМіх изпиФЕМІН: Пейтамяда ТАТО ктецехускй сузгусіх8 кіп іІЖтІ ВпіІсцаКіЗ Філутогкга файзововій З55У паста тіа діЗІпсдоли подУцІсТХтЇ хастіпусту дизІхіІлащя дпілІспаІ ЗМ пахесузоак сгкакілулт пдаіцові хспопсУ ЗКФІФЦх садеотіхшпю СІВБИ ташілудавт сіла сх хату спам; умо зпотзифттІ ЩО бепсхууМ пфмжІХНПОХ ЧМаМІКОхщШи сбохщфисохУ вЗМиНійща ФдлрІйУУЄИ БІЙ псепоазася пусуепатсоя досопсимм: сіІбасхшаух здав ссця ФпіптЧаеца МИ пЧіІлпохумм ІДС НІіІЯ дпдмхедосг поаосятата ЗЖУупубЧалІ дп цеУ ЗМ підцітлаоои тсосозшзотс вузртапсто симисяпея йпаопібсист спаполістя УЗ захцтостту сетстдотот покщпазтіст сезЗсіЧах ЖОЗоКЗмай сспаттово ПІЛЙ зпхітіПІтЯ ссІЗпеоцуті ІП стІдІ пЗІсСЯттаВ УТОВОтОоЗКт пІліІломІсП ВІВ
ФизінсовтІха зпдпссЕЗце сеикулиусхоп псепеистпі сзотцецщаа св3353ав МИ дЕзяцасосі стожхсоваус зподвхоЗІ5 падзаценао зпстзазАцо соусткохя 530 сашттподУї пада ссутУє проте КУ ІКУ 555 сВо5 сПІОІІ5О 536 телтзпопох позах сугпіІсхсаЗ ЗаЗопута бот хУ ст поцомі Х5ІВ
ЗксспІХди Піп у похвелосеоцє спуйкессяз поз пУМп тілу: ЗЗА3 сіівшіцет пайізілтаг ппінр)твфуце спохідпазс золотої попсляузрос 2555 здкЕЗМтТИтІ мецейцксж цекщохолоє Зло стО садІпсхув: схов уеттю ТЛО зтудаЕхлоту БдЕУусЕ ІІ усЕЗЕВіЦІш сома о точопопенх Кдстодооцо СТВ схшоттутусі Зтілвецехт сттоссхет ІЩЕ Чоі осзіхококу сецетасіхо 5825
Щиспахдха сусцехЗИх йшов цспкй хІЇКХІХВІха емІйнпецехо зеззтзасту 550 спбеЕмІйстт пБОХУТсапі сиВопторІв МОМ ПІПИс іХосзаопе зсусузуеот БО зичспспезІ Фохусиове сдазпстуЗи БІХРТДХІСІ ОПО щОВО Фокохолазт БО0О купетоуспо ссоБсосугуд тост тусп п«епуєвахст схелтнстук «хід чтх БОБВ апласіхоуз Кроштсулви стсттсозоЗ БІСІсШерІЯ бІОЖсЮтТттт ЗхежшсусУх АТО спутукуаує «пепепсосо сусттуанзуєо піцтнзєвіх біупозотуд азу удусся Й стстусутат сусузивитх спЗІЗІтщах суду сцас утри оїс ТсуфпЗнис БМ пссвуссєто пілот дт кЕлосоцетї дФесепокуди шолісжожс: ттлютотттй З3ИЙ хутвудуєтт сдтосіустст состав Вх їпапсоЗох пахву оВіх сзохзовтст 3 пстпетзиуї сацістсудв втсттЕтсте ЗТ МІтс МІХФсусШе: сусисубсву Хо пефцехсміх потусесусу помадосоуз хост почу цепайустю сссузстзує ЛО хіимносиі; шердхсоат Хопосктвта зуахсстох сао усваа стадія 73 сосазузусу зсусиухісо сауустесус зувзсгсасві 35325 сепетінат 50 зепскззЗ) Уодзстстта зоЗ5сІЗУ5п пулотидтат хи ЧІ соудпє БЕ ститкустот Фтїсосувтуа опосудиутс сСетусттотс стосцазуа зуекотчехі ВТ28 дІВІлоаОау соліст Зоо Узтопоссдт сІЗЕдлопої стопалео 1 схдсшттугя соусі пех пахиїчтІйо ЗбопапОйи піцезтетсец спицехохіо 4835 постхаапет пев уду зіжхусхсжцт спрехузиеко тсустдлсеву сспетудсти «ЗЕ «аистВІптя шоІсотгЯто КпдІсассІх сіссахавує поссолудог дІассопецету ЗЕ чсталуєшп свевопапіт суфстспа)ае зехолоїхдя лрзлпФяївУ ПІПІБЦІМ ТОДО зпсопсвпсІ піІСсТудВап ПОТЕФОПІйО ЗАФІДрУТШ Зоо дади кпетопсясв ЗОЇ поети шчодттоттВ ОКУ сЖусиут сустуаціти Мистзаату СІПТ2ІЗоЗп 3 хІсшвитосто усалокзих спзупазтс хату што тї беомпопбУ ТЕ сепругзстт; слІЄФТОУї ШОВК рТо ссттіхуиус сласвтсурт Зоя с ХВО еп уссо кер ФК поріл пасом сліІдцемсову ПопіІсетуїв ТК депатуазот сода соуадя сасопцензс ЗКЖжиМоосіа ЗУ дини хусясеуа 13 «сплочая свзакцауухх сповоессво сузсудцико сролусуясі досастаоца ТЯ зу Іцу дехЗпелиа; пузпуміп: НКИ СІел ціптиюКМмЯ педмнерощи ЗМ тсоїзаякра сеудутосстх ЗОВ ЧЗБУКІаЦО Зсросссуац стожовотя 15 фіжсясійат Ядапуєаасо запозкуясх дося ЗІЦато ЗуІссктош ТБ плсзкооса: мм запам сопа: адолцабофп спУпоемис сепопумлу ЗБ тт іх ресудудево схзорсаІх хУзхазеви Зумиймсо земозпакї ТІ6І
Фпсловазоо БесобЗІкуї всі цеїаоз ЗзасвазоЗУ Зої сгугі воусувптна ТЯ зпзассстку сттудІВсУХ сУсоувоуст сту сзх5сеуиЗ КсІдЗсузИи ТЯ сдизиуицотя плтсчівтТ; Воно ес пас шсецалУшух ТВУЯ знало ба попосту попа оа гпатлЧівсо тоапохтряхля дуєпаполої ТОБ кдасхону схаписпумс пекло миміслоз дахами хішТсменеи ЗОМ мззусистут змі усусха пщЩІКІдНсиОУо осад МАО Мич УХсмізусисот ЛВ сссптлучтсе ФпФлсецахст пепдасіє дкФфецоміео Фмхцепіхи пехісссоєох 21сО песусвіхсех сусутсційо суха пім їхзпопссм Фі ніту; зомошвсвех ВХ хсксозауои ссізовузуг зпузктзах мпосузатея «вусцзузує оту ВІВ) пеоаоузогт соту соц у пааЦУдити «рах іписосесто5 ВН штотпутисс сустаовудут сосзтощиуєв стасусци дипілогуаці соуси сулу ВКМ
Хопустусиом;: поеускскуу діди п поету сиспьшиїхі соуоцемиеа ВЕ ціхбузаозу шусуїистус соусу ссооа Зудпецайо пуохукуа сиугвосзяу ЗІ засос узи псптспиє ЗИ ХеХ Бдогісоссиу ПУудХФОуоКо пт оцоміох ВЕБ туепосуусу пусто бост сровсосугу подуємусцуУ пасусцетує Ккоту«одот ЗІ усу: росахдетсс состУзсЗох сзиусезску усу а Зшсосевуюх ВТО сацезстуку тата пу от супу ут ЗЗусусше соту бутси ЗБ соусу сзсассохо стлуісузса оБосеснос цасузустуц асооспулся ВХ
Зстдеттсоу опассстуву суду Іух сплузхдссоу дадхкозаЗо Вузосоіхая С58О досотопутух Іпеасорм стпостдичя пото одОоди сфоасоцоть супу сів ВІЙ соски б Ми цс нми сіро й пе рмкецз сохсземиц ЗИ сУупхслецей ліІспаму: ЗПФІПІЛОЗИ КОП ДИи поту Федр ВОНИ дих ріхудузиія висмиуммам пепизишеци холутиомо) сводпомаояє ЗО тофзизстгов удтссосалЕ сулутсщізс звотссетеу сопогуапое ЗиоуІсзи5 ЗАВ сптафлунх визотуєтсо сійсвосопох зхфдосцпх ілодфпопохх Задослопок ЗДАВ дім пМмм сцевопесва сиЗіліІци ямцОелІМОЮ аПОлОвОсхІ ЧМмлілии БА запо вусхастуа ЗТ суми оту стспогуата Фетопесаст БІЛО ттт2суаЗсу паоосядлтів сусоЗсосху сопулараду ттхозптота спусудзАВІ ЗІ тзтиптссйі Фімуецуть пІЛСОЖОО сасопитаеа зла юМм: буцім о Ж пиххеихо диоишсуу м ПИХпІпудеє ФПоАЗИУХ злі ЦФЧенЧ пОмозВі пс 34 сесуахувссм стооостіко соссоутудс пфоніпілех ффесувау свяудоесвх 550 тозевуедєец ЗНпІКОдто Зк оодост соту: Зсуедстсю супаноміпф ВС гкдезазуЗИ лості сстоу сум тУпо Жтпшлуотт брохугутоє сФттешеаосе 3100 їчепІМмнис позоятсовоЗ досотоЩоВт Форопіясит Копстдіцен фосспішсні: З?ЖО тоспоксупа чіцсодоопал сусжатсуєзт «умі ве ЧаптммЕЗу птусутикуто 9545 саздсгупсо Чехопопев Встпіпіт45 пІЯЦаЗООу; ЗовачАкОот Фр потіх: ЗО хвЕаАукттпЕВ ЕтІсКІсУуєт Пелідрктуах ХІІІ Усе усЕх Іст спкттух 3353
ЖІБКпвтйтс ІЛтбгІтІЕ ТІК сода осяс спсхусозо скусстщв: 13020
Бспозуєцев спажстоіце шрмхпелодс сепізготст пебздітсвоз стзпісінойх 10580 дсшотодост сроузотяус КИдоУкузре Фокс севОрсгац піжаУчусуву АЙ зпуілтххаса д3залоддує прохопасцк сЗуссауЗос ор стогвас Жсасакото ЗОЛОВ зро аЕЦещ спепепстцец Оопохсахео СЯДЕ КІуд ЯХІВсАФІОЯ Ібадисвсто 15250 сусостдоро сожобссіІсу хіхіхазяуєх БАТХЗиаЦх пегпеомерНе сиусзовато 2932 тзсуктсозут втусзсопесу сох5бу0сзс зазссзс2азу сІСтоусоВи супу ссеци ІВ даозпстсот всідоспуєто дОЧоФсоусь попі попу постповаот Здаухоюох МОНО сехепсмуди песуоцанюм цем зознотиу ягреехсос петссвсату ЗОБА шпКоровпасх МІСуЄсОЗИОи ЕФороповат хапспсогу спусуслоюс дпеустудседец 12352 енітакцає: ЗакхЗусУуо Хукрсцацах яасзсхстто оБІЖусусту сстпомю 10523 трупи шІБУсуЧУух язсусусуз; сеазасссую зсовайтлае увсатзяхо 15528 кпассствох досопісовт сзвтясодях зхазбцатас тоезаспоя попри Ц340 сусло паста Успохецеву сопел пеотісолисй япеуопохдо ЦО сувЕвхоціх спІуЧаЗІпІ спол ЗБІдОтодуо стузковаїв Зстахзбспь 11842 яттоцІвнох слацейу тет «21052 «2115 30 «2122 ДНК «213» людина «РоО0» «221» властивість «222» (1)...(30) «223» Пряма ПЛР-затравка для клонування 5'-послідовності гена ВМР-7 людини, яка відповідає ділянці 1- го екзону «40052 . садодсацся чудоссуєст дсвосавасе о «2105 З
-2115» 30
«212» ДНК
«213» людина
«220»
«221» властивість
«222» комплемент (1).......(30)
«223» Зворотна ПЛР-затравка для клонування 5'-послідовності гена ВМР-7 людини, яка відповідає ділянці 1-го екзону
«400» З зчазчаассвс зседессосаве боссусодеє 30
Claims (7)
1. Молекула ДНК, нуклеотидна послідовність якої представлена нуклеотидами 1- 10877, наведеними у 5ЕО ІО МО: 1, яка кодує промоторну ділянку гена білка-7 морфогенезу кісток людини.
2. Спосіб одержання молекули ДНК, що відповідає послідовності, наведеній у 52Е0 ІЮ МО: 1, який передбачає наступні стадії: (1) розщеплення геномної ДНК клітин плаценти людини рестриктазою НіпанІЇ, (2) виділення відщепленого рестриктазою із Ніпапй фрагмента молекули ДНК за допомогою електрофорезу у агарозному гелі, (3) клонування виділеного розщепленого рестриктазою Ніпан фрагмента молекули ДНК до Х -фагового вектора ЛОАБЗНА-Ї, обробленого тією ж рестриктазою, (4) інсерція вказаного вектора у фаг, (5) одержання бібліотеки геномної ДНК шляхом інфікування клітин ЕвсПегіснпіа соїї одержаним фагом, (6) скринінг за допомогою ПЦР, і (7) субклонування у плазмідний вектор.
З. Рекомбінантний експресуючий вектор, одержаний шляхом інсерції до гена- репортера ДНК, що відповідає послідовності 5ЕО ІЮ МО: І.
4. Спосіб пошуку зв'язаної з кістковою тканиною сполуки, який передбачає введення рекомбінантного експресуючого вектора за п.З в клітину ссавця і вимір активності гена-репортера.
5. Спосіб за п. 4, який відрізняється тим, що вказана зв'язана з кістковою тканиною сполука є сполукою, яка індукує остеогенез.
б. Спосіб за п. 4, який відрізняється тим, що вказана зв'язана з кістковою тканиною сполука є сполукою, яка приглушує остеогенез.
7. Спосіб пошуку речовини, ефективної у лікуванні ниркового порушення, який передбачає введення рекомбінантного експресуючого вектора, який охарактеризовано у п.3, в клітину ссавця і вимір активності репортерного гену з метою визначення наявності або відсутності речовини.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP10120174A JPH11313675A (ja) | 1998-04-30 | 1998-04-30 | ヒトｂｍｐ−７プロモーターおよびこれを用いた骨関連物質の探索法 |
| PCT/IB1999/000733 WO1999057293A1 (en) | 1998-04-30 | 1999-04-22 | Human bmp-7 promoter and method for exploring bone-related substance by using the same |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| UA72212C2 true UA72212C2 (en) | 2005-02-15 |
Family
ID=14779761
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| UA2000116830A UA72212C2 (en) | 1998-04-30 | 1999-04-22 | Human bmp-7 promoter and method for exploring bone-related substance by using the same |
Country Status (26)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US6534268B1 (uk) |
| EP (1) | EP1076713A1 (uk) |
| JP (1) | JPH11313675A (uk) |
| KR (1) | KR20010071193A (uk) |
| CN (1) | CN1170941C (uk) |
| AP (1) | AP1329A (uk) |
| AU (1) | AU769124B2 (uk) |
| BG (1) | BG64780B1 (uk) |
| BR (1) | BR9910585A (uk) |
| CA (1) | CA2326957A1 (uk) |
| EA (1) | EA004509B1 (uk) |
| EE (1) | EE200000627A (uk) |
| GE (1) | GEP20033056B (uk) |
| HR (1) | HRP20000736A2 (uk) |
| HU (1) | HUP0102329A3 (uk) |
| ID (1) | ID26704A (uk) |
| IL (1) | IL139100A0 (uk) |
| NO (1) | NO20005433L (uk) |
| NZ (1) | NZ507625A (uk) |
| PL (1) | PL343817A1 (uk) |
| SK (1) | SK16082000A3 (uk) |
| TR (1) | TR200003182T2 (uk) |
| UA (1) | UA72212C2 (uk) |
| WO (1) | WO1999057293A1 (uk) |
| YU (1) | YU64900A (uk) |
| ZA (1) | ZA200006080B (uk) |
Families Citing this family (16)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20040225077A1 (en) | 2002-12-30 | 2004-11-11 | Angiotech International Ag | Drug delivery from rapid gelling polymer composition |
| US20070015701A1 (en) * | 2005-06-01 | 2007-01-18 | Samuel Zalipsky | Macromolecular conjugates of bone morphogenetic protein-7 |
| PL2078073T3 (pl) * | 2006-10-12 | 2013-12-31 | Ethicon Inc | Komórki pochodzące z nerki oraz sposoby ich zastosowania w leczeniu i regeneracji tkanki |
| CA2681317C (en) * | 2008-05-16 | 2013-04-02 | Industry Foundation Of Chonnam National University | A synthetic peptide containing bone forming peptide 1(bfp 1) for stimulating osteoblast differentiation, and pharmaceutical composition comprising the synthetic peptide |
| WO2011156590A2 (en) | 2010-06-09 | 2011-12-15 | Semprus Biosciences Corp. | Non-fouling, anti-microbial, anti-thrombogenic graft compositions |
| EP2579907A4 (en) | 2010-06-09 | 2016-03-23 | Arrow Int Inc | ARTICLES HAVING NON-FORMING SURFACES AND PREPARATION METHODS COMPRISING THE PRIMARY LAYER APPLICATION |
| JP6083071B2 (ja) | 2010-06-09 | 2017-02-22 | アロー インターナショナル インコーポレイテッド | 非汚染性、抗菌性、抗血栓性グラフトフロム組成物 |
| CA2808655C (en) | 2010-08-18 | 2019-11-26 | Emory University | Compounds and compositions for ossification and methods related thereto |
| WO2012116137A2 (en) | 2011-02-24 | 2012-08-30 | Emory University | Jab1 blocking compositions for ossification and methods related thereto |
| CA2827392A1 (en) | 2011-02-24 | 2012-08-30 | Emory University | Noggin blocking compositions for ossification and methods related thereto |
| AU2012351980B2 (en) | 2011-12-14 | 2015-09-17 | Arrow International, Inc. | Silicone hydrogel contact lens modified using Lanthanide or Transition metal oxidants |
| MX2014007204A (es) | 2011-12-14 | 2015-04-14 | Semprus Biosciences Corp | Proceso de uv de multietapas para crear lentes de contacto modificadas en la superficie. |
| CA2858730C (en) | 2011-12-14 | 2017-07-18 | Semprus Biosciences Corp. | Surface modified contact lenses |
| AU2012368232B2 (en) | 2011-12-14 | 2016-01-07 | Arrow International, Inc. | Imbibing process for contact lens surface modification |
| JP2015507761A (ja) | 2011-12-14 | 2015-03-12 | センプラス・バイオサイエンシーズ・コーポレイションＳｅｍｐｒｕｓ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｃｏｒｐ． | コンタクトレンズ改質のためのレドックス法 |
| WO2019005563A1 (en) * | 2017-06-27 | 2019-01-03 | St. Jude Children's Research Hospital | METHODS ASSOCIATED WITH THE ACTIVATION OF THE SIGNALING PATHWAY OF BONE MORPHOGENETIC PROTEINS |
Family Cites Families (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1990011366A1 (en) * | 1989-03-28 | 1990-10-04 | Genetics Institute, Inc. | Osteoinductive compositions |
| US5266683A (en) | 1988-04-08 | 1993-11-30 | Stryker Corporation | Osteogenic proteins |
| US5650276A (en) * | 1991-03-11 | 1997-07-22 | Creative Biomolecules, Inc. | Morphogenic protein screening method |
| AU2407192A (en) * | 1991-08-01 | 1993-03-02 | Pharmaceutical Discovery Corporation | Characterization of specific drug receptors with fluorescent ligands |
| EP0804573A1 (en) | 1994-06-07 | 1997-11-05 | Creative Biomolecules, Inc. | Methods and compositions for modulating morphogenic protein expression |
| US6083690A (en) * | 1995-06-02 | 2000-07-04 | Osteoscreen, Inc. | Methods and compositions for identifying osteogenic agents |
| JP2001509010A (ja) | 1996-11-22 | 2001-07-10 | アクゾ・ノベル・エヌ・ベー | Ｂｍｐ―４プロモーターならびに骨粗鬆症の予防および／または治療用の治療剤のスクリーニングにおけるその用途 |
| US5863790A (en) | 1997-05-14 | 1999-01-26 | Minnesota Mining And Manfacturing Company | Biological sterility indicator |
| WO1998054344A2 (en) * | 1997-05-29 | 1998-12-03 | Creative Biomolecules, Inc. | Modulators of morphogen expression and methods of identifying the same |
-
1998
- 1998-04-30 JP JP10120174A patent/JPH11313675A/ja active Pending
-
1999
- 1999-04-22 CA CA002326957A patent/CA2326957A1/en not_active Abandoned
- 1999-04-22 AU AU31634/99A patent/AU769124B2/en not_active Ceased
- 1999-04-22 EA EA200001130A patent/EA004509B1/ru not_active IP Right Cessation
- 1999-04-22 SK SK1608-2000A patent/SK16082000A3/sk unknown
- 1999-04-22 NZ NZ507625A patent/NZ507625A/en unknown
- 1999-04-22 IL IL13910099A patent/IL139100A0/xx unknown
- 1999-04-22 EE EEP200000627A patent/EE200000627A/xx unknown
- 1999-04-22 TR TR2000/03182T patent/TR200003182T2/xx unknown
- 1999-04-22 GE GEAP19995635A patent/GEP20033056B/en unknown
- 1999-04-22 WO PCT/IB1999/000733 patent/WO1999057293A1/en not_active Application Discontinuation
- 1999-04-22 CN CNB998079553A patent/CN1170941C/zh not_active Expired - Fee Related
- 1999-04-22 HU HU0102329A patent/HUP0102329A3/hu unknown
- 1999-04-22 AP APAP/P/2000/001982A patent/AP1329A/en active
- 1999-04-22 BR BR9910585-3A patent/BR9910585A/pt not_active IP Right Cessation
- 1999-04-22 ID IDW20002196A patent/ID26704A/id unknown
- 1999-04-22 KR KR1020007012054A patent/KR20010071193A/ko not_active Application Discontinuation
- 1999-04-22 UA UA2000116830A patent/UA72212C2/uk unknown
- 1999-04-22 PL PL99343817A patent/PL343817A1/xx not_active Application Discontinuation
- 1999-04-22 YU YU64900A patent/YU64900A/sh unknown
- 1999-04-22 EP EP99913528A patent/EP1076713A1/en not_active Withdrawn
- 1999-04-22 US US09/674,311 patent/US6534268B1/en not_active Expired - Fee Related
-
2000
- 2000-10-24 BG BG104883A patent/BG64780B1/bg unknown
- 2000-10-27 NO NO20005433A patent/NO20005433L/no not_active Application Discontinuation
- 2000-10-27 ZA ZA200006080A patent/ZA200006080B/xx unknown
- 2000-10-30 HR HR20000736A patent/HRP20000736A2/hr not_active Application Discontinuation
-
2002
- 2002-10-03 US US10/263,788 patent/US20030040007A1/en not_active Abandoned
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| HRP20000736A2 (en) | 2001-10-31 |
| US20030040007A1 (en) | 2003-02-27 |
| JPH11313675A (ja) | 1999-11-16 |
| HUP0102329A3 (en) | 2006-03-28 |
| CN1307643A (zh) | 2001-08-08 |
| AU769124B2 (en) | 2004-01-15 |
| HUP0102329A2 (hu) | 2001-10-28 |
| US6534268B1 (en) | 2003-03-18 |
| BG104883A (en) | 2001-05-31 |
| AP2000001982A0 (en) | 2000-12-31 |
| CA2326957A1 (en) | 1999-11-11 |
| NZ507625A (en) | 2003-12-19 |
| GEP20033056B (en) | 2003-08-25 |
| TR200003182T2 (tr) | 2001-02-21 |
| AP1329A (en) | 2004-11-22 |
| PL343817A1 (en) | 2001-09-10 |
| EA004509B1 (ru) | 2004-04-29 |
| IL139100A0 (en) | 2001-11-25 |
| CN1170941C (zh) | 2004-10-13 |
| NO20005433D0 (no) | 2000-10-27 |
| ZA200006080B (en) | 2001-10-29 |
| WO1999057293A1 (en) | 1999-11-11 |
| NO20005433L (no) | 2000-10-27 |
| SK16082000A3 (sk) | 2001-05-10 |
| YU64900A (sh) | 2003-10-31 |
| ID26704A (id) | 2001-02-01 |
| EA200001130A1 (ru) | 2001-04-23 |
| EE200000627A (et) | 2002-02-15 |
| AU3163499A (en) | 1999-11-23 |
| EP1076713A1 (en) | 2001-02-21 |
| BR9910585A (pt) | 2001-01-09 |
| BG64780B1 (bg) | 2006-03-31 |
| KR20010071193A (ko) | 2001-07-28 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| UA72212C2 (en) | Human bmp-7 promoter and method for exploring bone-related substance by using the same | |
| Winslow et al. | Cloning of AL-1, a ligand for an Eph-related tyrosine kinase receptor involved in axon bundle formation | |
| KR100406299B1 (ko) | Tgf수용체족및/또는bmp수용체족에속하는액티빈수용체유사키나제(alk) | |
| Claesson-Welsh et al. | cDNA cloning and expression of a human platelet-derived growth factor (PDGF) receptor specific for B-chain-containing PDGF molecules | |
| LORD et al. | Type 5 acid phosphatase: Sequence, expression and chromosomal localization of a differentiation‐associated protein of the human macrophage | |
| US20060252724A1 (en) | Method and composition for modulating bone growth | |
| CN103920139A (zh) | 活化素-actriia拮抗剂及在治疗或预防乳腺癌中的用途 | |
| CN109072255A (zh) | 用于治疗皮肤的伤口、病症和疾病的组合物和方法 | |
| EP1071775A2 (de) | Menschliche nukleinsäuresequenzen aus endometriumtumorgewebe | |
| EP1370287A2 (en) | Method and composition for modulating bone growth | |
| Buiting et al. | A putative gene family in 15q11-13 and 16p11. 2: possible implications for Prader-Willi and Angelman syndromes. | |
| EP1181056B1 (en) | Lim mineralization protein splice variants | |
| CN101772351A (zh) | 新的骨量增加药 | |
| CA2017466A1 (en) | Bone calcification factor | |
| Narducci et al. | The murine Tcl1 oncogene: embryonic and lymphoid cell expression | |
| ES2338210T3 (es) | Metaloproteasa novedosa que tiene actividad agrecanasa. | |
| CA2095729A1 (en) | Soluble mannose receptor peptides | |
| Grötzinger et al. | A highly amplified mouse gene is homologous to the human interferon-responsive Sp100 gene encoding an autoantigen associated with nuclear dots | |
| US6475735B1 (en) | Human BMP-2 promoter and method for exploring bone-related substance by using the same | |
| WO1998040487A1 (en) | Angiogenin receptor, compositions and methods related thereto | |
| CN105087821A (zh) | 一种诊治骨质疏松症的分子标志物 | |
| CN111139299B (zh) | Josd2蛋白在制备治疗恶性肿瘤药物中的应用 | |
| KR101404247B1 (ko) | Ｈｖｅｍ억제제를 유효성분으로 포함하는 골분화 또는 골생성 증진용 조성물 | |
| AU6519299A (en) | Bone morphogenic protein-induced genes and polypeptides, and their use in diagnostic and therapeutic methods | |
| EP4334347A1 (en) | Treatment of moderate-to-severe osteogenesis imperfecta |