KR20010071193A - 인간 ｂｍｐ-7 프로모터 및 이를 이용한 뼈 관련 물질의탐색 방법 - Google Patents

인간 ｂｍｐ-7 프로모터 및 이를 이용한 뼈 관련 물질의탐색 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 인간 BMP-7를 함유하는 5′상부 영역 유전자 및 적당한 리포터 유전자에 연결된 재조합 발현 벡터가 도입된 동물 세포를 사용하여 리포터 활성을 참고로 하여 인간 BMP-7의 발현을 양성적 또는 음성적으로 조절하는 저분자량 화합물을 탐색하는 방법을 제공한다. 본 발명의 방법으로 얻어진 저분자량 화합물 및 그의 유도체는 인간 BMP-7의 발현을 통해 뼈 및 연골에 대해 형태 발생 활성 및 억제 활성을 가져서, 연골 및 뼈 질환의 예방 또는 치료용 약제로서 유용하다.

Description

인간 ＢＭＰ-7 프로모터 및 이를 이용한 뼈 관련 물질의 탐색 방법 {Human BMP-7 Promoter and Method for Exploring Bone-Related Substance by Using the Same}
본 발명은 인간 뼈 형태 발생 단백질(BMP, 이하 BMP-7라고 칭함)의 프로모터를 함유하는 5′상부 영역 DNA에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 인간 BMP-7 프로모터를 함유하는 5′상부 영역 DNA 및 적당한 리포터 유전자에 결합된 재조합 발현 벡터가 도입된 다수의 동물 또는 효모 세포를 사용하고 리포터 활성을 표지로 사용하여 인간 BMP-7의 발현을 조절하는 저분자량 화합물을 양성적 또는 음성적으로 탐색하는 방법에 관한 것이다.
현재, 뼈 형태 발생 활성은 TGF(형질 전환 성장 인자)-β 수퍼패밀리에 속하는 뼈 형태 발생 인자 BMP에 대해서 보고되어 있다(Science 150, 893-897, 1965; Science 242; 1528-1534, 1988). 알려진 BMP종은 BMP-1 내지 BMP-14이다. 이 중, BMP-2 내지 BMP-14는 뼈 형태 발생 활성을 나타내는 것으로 알려져 있다. BMP-2 내지 BMP-14의 BMP는 여러가지 뼈 기능 장애 및 뼈 질환의 치료적 및 예방적 처치에 효과적인 것으로 여겨지고 있지만, 이들은 자연계에 극소량으로 존재한다. 따라서, 이러한 처치에 이용되는 BMP-2 내지 BMP-14를 입수가능하게 다량으로 얻는 데는 재조합 단백질의 제조를 필요로 한다. 재조합 단백질의 제조는 일반적으로저분자량 화합물에 비해 비용이 많이 소요된다. 다른 한편, 그의 단백질적 특성 때문에 물성 및 투여의 면에서 의약으로서는 많은 제약이 있다. 이러한 점들을 고려할 때, 상기 BMP 단백질과 동일한 활성을 갖는 저분자량 유기 화합물이 만일 존재한다면, 그것은 매우 유망한 의약이 될 것이다. 본 발명에 의해 제공되는 탐색 방법에 의해 얻어지는 물질은 인간 BMP-7 (골형성 인자)의 발현을 유발시키는 활성을 가지고, 또한 인간 BMP-7와 동일한 효능을 가져서 매우 높은 유용성을 나타낸다. 이와 반대로, 인간 BMP-7가 뼈 및 연골 과형성과 관련된 경우, 인간 BMP-7의 발현을 억제하는 것이 골과형성을 방지할 수 있다. 본 발명은 인간 BMP-7 발현의 억제를 탐지할 수 있고, 이러한 과형성을 방지하는 물질을 탐색하는 방법을 제공할 수 있다. 또한, 인간 BMP-7은 신장 세포의 분화를 상승시킬 수 있다는 것이 공지되어 있다(Pro. Natnl. Acad. Sci., U.S.A., Vol. 93, p9021-9026, 1996). 따라서, 본 발명이 제공하는 실험 시스템은 신장 질환 치료용 물질을 탐색하는 방법에 적용될 수 있다.
이러한 탐색 방법에 대해서는, 이제까지 쥐 BMP-2 프로모터를 이용하는 일례가 유일하게 보고되어 있고 (WO 97/15308), 인간 BMP-7 프로모터를 이용하는 예는 없다. 본 발명에 의해 제공되는 탐색 방법을 위한 물질들은 모두 인간으로부터 유래되는 것이어서, 그 탐색에 의해 얻어지는 물질은 임상 응용에 효과를 보일 것이라고 기대하고 있다.
<발명의 요약>
본 발명은 인간 BMP-7의 프로모터를 함유하는 5′상부 영역 유전자를 제공한다. 인간 BMP-7 프로모터를 함유하는 5′상부 영역 유전자, 및 적당한 리포터 유전자에 연결된 재조합 발현 벡터가 도입된 동물 세포를 이용하여, 인간 BMP-7의 발현을 양성적 또는 음성적으로 조절하는 저분자량 화합물을 리포터 활성을 참고로 하여 탐색할 수 있다. 저분자량 화합물 및 그의 유도체는 인간 BMP-7 발현을 통해 뼈 및 연골에 대한 형태 발생 활성 및 억제 활성을 가져서, 연골 및 뼈 질환의 예방 또는 치료제, 골전이의 치료제, 또는 과도한 골형성의 치료 및 예방제로서 유용하다. 또한, 이들 저분자량 화합물 및 그의 유도체는 신장 질환의 치료 및 예방제로서 유용하다.
도면의 간단한 설명
도 1은 인간 BMP-7 유전자의 10.8 kb 5′상부 영역의 엑손-인트론 구조 및 제한효소 지도이다. 그물 모양 부분은 엑손 부위를 나타내고 빈 사각형은 인트론을 나타낸다.
도 2는 인간 BMP-7 유전자의 5′상부 영역을 함유하는 재조합 발현 벡터(pMSS115)이다. 프로모터 영역(4.4 kb)(서열 목록의 SEQ. ID NO. 1에 나타낸 염기 번호 3813 내지 8222, 도 1의 5′말단에서 두번째XbaI에서부터 세번째XbaI까지)은 pGL3-basic의NheI 제한효소 부위에 삽입되어 있다.
도 3은 인간 BMP-7 프로모터 활성을 측정한 결과이다(임시 발현).
바람직한 실시태양에 대한 설명
본 발명은 인간 뼈 형태 발생 단백질-7 프로모터 영역 또는 그의 단편을 코딩하는 서열 목록의 SEQ ID NO. 1의 염기 서열 번호 1 내지 10877로 나타내어지는뉴클레오티드 서열을 갖는 DNA에 관한 것이다. 서열 목록의 SEQ ID NO. 1은 인간 BMP-7 유전자의 5 ′상부 영역 서열을 나타낸다.
본 발명은
(1) 인간 태반 게놈 DNA를HindIII 제한효소로 절단하는 단계,
(2) 아가로스 겔 전기영동법에 의해 단리하는 단계,
(3)HindIII로 절단되어 단리된 DNA 단편을 동일 효소로 처리된 람다 파지 벡터 λDASH II 내로 클로닝하는 단계,
(4) 상기 벡터를 파지 내로 패키지하는 단계,
(5) 에쉐리키아 콜라이(Escherichia coli)를 파지로 감염시켜 게놈 DNA 라이브러리를 확립하는 단계,
(6) PCR에 의해 스크리닝하는 단계 및
(7) 플라스미드 벡터 내로 서브클로닝하는 단계
를 수행하는 것을 포함하는, 서열 목록의 SEQ ID NO. 1에 나타낸 DNA의 제조 방법에 관한 것이다.
여기에서 사용되는 플라스미드 벡터는 한정되지 않으며, 시판되는 것들 중에서 사용될 수 있다. pUC18 벡터가 바람직한 예일 수 있다.
본 발명은 서열 목록의 SEQ ID NO. 1에 나타낸 DNA 전장 또는 일부를 리포터 유전자 내에 결합시킨 것을 특징으로 하는 재조합 발현 벡터에 관한 것이다. 상세히 말하자면, 재조합 발현 벡터는 서열 목록의 SEQ. ID. NO. 1에 의해 나타내어지는 인간 BMP-7 유전자의 5′상부 영역의 적당한 영역을 리포터 유전자의 앞에 위치시킴으로써 제작된다. 루시페라제 또는 β-갈락토시다제 유전자와 같은 리포터 유전자는 원물(原物; original product)을 대신하여 발현 상태를 보여준다. 재조합 발현 벡터를 위한 원물로서의 벡터는 구체적으로 한정되지 않고, 시판되고 있는 플라스미드 벡터를 사용할 수 있다. 본 발명은 바람직한 예로서 pGL3-basic를 사용한다. pGL3-basic를 사용하여 인간 BMP-7 프로모터 및 루시페라제 리포터 유전자를 함유하는 재조합 발현 벡터인 pMSS115(9.2kb)를 만든다. 본 발명은 그것들을 재조합 발현 벡터로 지정한다. 재조합 발현 벡터를 리포솜과 함께 포유동물 세포, 바람직하게는 SaOS-2 세포와 같은 인간 골아세포류 세포에 도입시키는 것이 필요하다. 재조합 발현 벡터로 안정적으로 형질감염된 동물세포는 내성 마커를 사용하여 선별한다.
본 발명은 서열 목록의 SEQ ID NO.1에 나타낸 DNA의 전장 또는 일부를 리포터 유전자 내로 결합시킨 것을 특징으로 하는 재조합 발현 벡터를 사용하는 것을 특징으로 하는 뼈 관련 물질의 탐색 방법에 관한 것이다. 본 발명은 뼈 관련 물질이 골형성 유발 물질이거나 또는 뼈 관련 물질이 골형성 억제 물질인 뼈 관련 물질의 탐색 방법에 관한 것이다. 인간 BMP-7의 발현을 유발 또는 억제하는 저분자량 화합물은 그 유전자의 발현을 조절하는 프로모터를 단리시키고, 그것을 적당한 리포터 유전자에 연결시키고, 그 유전자 구조물을 적당한 포유동물 세포에 도입시켜 탐색 시스템을 제조함으로써 얻을 수 있다. 탐색 시스템에서 인간 BMP-7의 발현을 조절하는 물질은 프로모터에 작용하여 리포터 유전자의 발현 수준을 증가 또는 감소시킨다. 따라서, 리포터 활성을 간단하고 손쉽게 측정함으로써 목적 물질의 탐색이 가능하다.
상기 벡터로 형질감염된 동물 세포는 고처리용량 스크리닝법(Nature, Vol. 384, Suppl., p.14-16, 1996)에 의해 화합물 라이브러리를 스크리닝하고, 천연 물질로부터 활성 물질을 탐색하는 방법에 사용될 수 있다. 활성을 증가 또는 감소시키는 물질은 세포를 적당한 기간 동안 어떤 물질로 처리하고, 이어서 리포터 활성을 측정함으로써 조사된다. 이렇게 하여 얻어진 물질은 시그날 형질도입 시스템 조절을 통해 전사 인자에 직접 작용하거나 또는 인간 BMP-7 프로모터에 간접 작용함으로써 발현을 조절할 수 있다. 따라서, 이 화합물들은 골연골 질환, 뼈로의 암 전이 또는 골과형성증의 치료제로서 유용하다.
또한, 이들 화합물은 신장 질환의 치료제로서 효과적이다.
본 발명에 의해 얻어지는 물질은 뼈 또는 연골 형태 발생 활성을 가지고, 정형외과수술 분야(골절, 관절 골관절염 및 고관절 골관절염과 같은 골관절염, 관절골염, 반월 손상과 같은 연골 손상, 부상 또는 종양 절개로 인한 뼈 및 연골 결손의 재생, 척수 융합 및 척주관 확장과 같은 뼈 복구, 및 이골발생 및 태성연골이영양과 같은 선천성 연골 및 뼈 질환) 또는 치과 분야 (구개열, 하악 복구, 및 잔유 융선 구성과 같은 뼈 복구) 및 골다공증의 치료 및 예방적 처치를 위한 약제로서 효과적이다. 게다가, 본 발명의 물질은 성형 수술에서 뼈 이식에 이용될 수 있다. 이러한 치료적 처치는 수의 수술 분야에서의 치료에도 효과적이다. 다른 한편, 본 발명은 뼈 또는 연골 형태 발생을 억제하는 물질을 제공할 수 있다. 이 경우, 그 물질은 뼈 및 연골 과형성의 예방 및 치료를 위한 약제로서 이용된다.
또한, 본 발명은 신장 세포의 분화를 증가시키는 물질을 제공할 수 있고, 이 물질은 신장 질환의 치료 및 예방을 위한 물질로서 이용될 수 있다.
본 발명을 다음 실시예를 통해 더 예시적으로 설명할 것이다. 다음 실시예는 모든 면에서 예시적인 것이지 한정적인 것이 아닌 것으로 여겨야 한다.
실시예 1 인간 BMP-7 유전자의 5′상부 영역의 단리
여러 종류의 제한 효소 (BamHI,BglII,HindIII,HindIII,PstI,SacI,SalISmaI,SphI 및XbaI)를 이용하여 인간 태반 게놈 DNA (CloneTech 제품)를 절단하고, 아가로스 겔 전기영동법으로 분리시키고, 나일론막으로 옮기고, BMP-7 cDNA (EMBO J. 9: 2085-2093, 1990)를 프로브로서 사용하여 표준 조건 하에서 서던 혼성화하였다. 그 결과, 사용된 제한효소들 중에서 제한효소HindIII 로 절단되었을 때가 최장의 인간 BMP-7 유전자를 함유하는 약 11 kb의 DNA 단편이 얻어진다는 것을 발견하였다. 이어서, 인간 태반 게놈 DNA를 제한효소HindIII로 절단하고, 아가로스 겔 전기영동법으로 분리하여 아가로스 겔로부터 약 11 kb의 DNA 단편을 추출하였다. 얻어진 DNA 단편을 제한효소HindIII로 절단 람다 파지 벡터 λDASH II(Stratagene Ltd. 제품)에 클로닝시켰다. 그 벡터를 기가팩 III XL 추출물 (Gigapack III XL Extract; Stratagene Ltd. 제품)로 시험관 내에서 패키지하고, 에쉐리키아 콜라이 XL1-블루 MRA (Escherichia coliXL1-Blue MRA; Stratagene Ltd. 제품)로 감염시켜서 게놈 DNA 라이브러리를 제작하였다. 그 라이브러리를 여러 개의 풀(pool)로 나누었다. 각각의 풀을 PCR, 즉 번역 부위에 대응하는 PCR 프라이머(서열 목록의 SEQ ID NO. 2 및 SEQ ID NO. 3)를 이용하여 목적 풀을 선택하는 PCR법에 의해 스크리닝(Nucleic Acids Research 21: 2627-2631, 1993)하여 증폭시켜서 최종적으로 인간 BMP-7 유전자의 5′상부 영역(10.8 kb)을 제조하였다. 또한, 5′상부 10.8 kb 단편을 pUC18 벡터(Amersham Pharmacia Biotech 제품)로 서브클로닝하였다. 그 벡터를E. colipKOT 314라 명명하였다.E. colipKOT 314는 일본 305-8566 이바라끼껭 쭈꾸바시 히가시 1-쪼메 1-3에 소재하는 국제무역산업부 (Ministry of International Trade and Industry)의 산업과학기술국 (Agency of Industrial Science and Technology)의 국립생물과학인체공학 연구소(National Institute of Bioscience and Human-Technology)에 1998년 3월 30일자로 기탁 번호 FERM P-16737으로 기탁하였고, 부다페스트 조약 하의 국제기탁기구에 1999년 2월 17일자로 기탁번호 FERM BP-6651로 기탁하였다.
실시예 2 인간 BMP-7 유전자의 5′상부 영역의 DNA 서열의 결정
얻어진 인간 BMP-7 유전자의 5′상부 영역의 서열을 생거(Sanger) 등의 방법(Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74: 5463-5467, 1977)에 따라 ALF DNA 시퀀서 (Amersham Pharmacia Biotech 제품)를 이용하여 결정하였다. 이와 같이 하여 분석된 서열을 서열 목록의 SEQ ID NO. 1에 기재하였다. SEQ ID NO. 1의 서열 번호 5557 내지 10780은 이미 보고되었다(EMBO J. 9: 2085-2093, 1990). 그러나, 본 발명의 서열과 많은 차이가 있다.
실시예 3 인간 BMP-7 프로모터 및 루시페라제 리포터 유전자를 함유하는 재조합 발현 벡터의 제작
도 1에 도시한 바와 같이, 인간 BMP-7의 프로모터는 엑손 1의 상부에 존재한다. 이어서, 도 1에서 5' 말단으로부터 두번째 위치의XbaI부터 세번째 위치의XbaI까지의 프로모터를 포함하는 4.4 kb 영역이 리포터 유전자의 상류에 배열되어 루시페라제 리포터 벡터 pGL3-basic(Pro Mega Ltd.의 제품)의 제한효소 부위NheI 부위에 삽입되어 재조합 발현 벡터 pMSS115(9.2 kb)를 제작하였다. 이것은 도 2에 나타내져 있다.
실시예 4 인간 BMP-7 프로모터의 활성 측정 (인간 세포에 재조합 발현 벡터 도입 및 임시 발현)
인간 BMP-7 재조합 발현 벡터를 임시 발현시키기 위해, 상기 재조합 발현 벡터 (pMSS115)를 유전자 도입 효율을 측정하기 위한 내부 대조물로서 바다 팬지 루시페라제 유전자를 함유하는 벡터 pRL-SV40 (Pro Mega Co. 제품)과 동량으로 혼합하였다. 이어서, 양이온성 리포솜 리포펙타민(Lifetech Oriental Co. 제품)을 상기 DNA 용액과 혼합하여 형질감염을 위해 인간 골육종 세포 HOS, MG63 및 SaOS-2에 첨가하였다. 개똥벌레 루시페라제 활성 및 바다 팬지 루시페라제 활성을 피카 젠 듀얼 키트(Pikka Gene Dual Kit ; Toko Ink Co. 제품)로 측정하였다. 그 결과를 도 3에 나타내었다. 프로모터 활성은 바다 팬지 루시페라제 활성에 대한 개똥벌레 루시페라제 활성의 비로 나타내었다. 그 결과로부터 서열 목록의 SEQ.ID. NO. 1의 DNA가 프로모터 활성을 갖는다는 것을 알아냈다.
실시예 5 인간 세포로의 인간 BMP-7 재조합 발현 벡터의 도입 및 안정화된 발현
인간 BMP-7 재조합 발현 벡터를 안정하게 발현하기 위해, 상기 벡터들을 퓨로마이신 내성 유전자를 함유하는 벡터 pPUR (CloneTech Ltd. 제품)와 10 : 1의 비율로 혼합하고, 또한 양이온성 리포솜 리포펙타민 (Lifetech Oriental Co. 제품)과 혼합하여 형질감염을 위해 인간 골육종 세포 HOS에 첨가하였다. 퓨로마이신을 함유하는 배지(Sigma Ltd. 제품)로부터 목적하는 유전자가 도입된 세포를 선별하였다.
실시예 6 활성 저분자량 화합물의 스크리닝
선정된 세포들을 96-웰 플레이트에 접종하고, 여러 개의 화합물 라이브러리의 물질로 1 내지 3일 동안 처리하고, 세포용해제(Pro Mega Ltd. 제품)로 용해시키고, 루시페라제 분석 키트(Pro Mega Ltd. 제품)를 이용하여 효소 활성을 측정하였다. 이 과정을 통해, 인간 BMP-7의 발현을 유발 또는 억제하는 다양한 물질을 탐색할 수 있었다.
서열 목록 설명
〈210〉1
〈223〉엑손 1 영역에 포함하는 인간 BMP-7 5′상부 유전자 서열
〈210〉2
〈223〉엑손 1 영역에 대응하는 5′상부 인간 BMP-7 유전자 서열을 클로닝하기 위한 센스 PCR 프라이머
〈210〉3
〈223〉엑손 1 영역에 대응하는 5′상부 인간 BMP-7 유전자 서열을 클로닝하기 위한 역 PCR 프라이머

Claims (7)

  1. 인간 뼈 형태 발생 단백질-7 프로모터 영역을 코딩하는 서열 목록의 SEQ ID NO. 1의 염기 서열 번호 1 내지 10877로 표시된 뉴클레오티드 서열을 갖는 DNA 또는 그의 단편.
  2. (1) 인간 태반 게놈 DNA를HindIII 제한효소로 절단하는 단계,
    (2) 아가로스 겔 전기영동법에 의해 단리하는 단계,
    (3)HindIII로 절단되어 단리된 DNA 단편을 동일 효소로 처리된 람다 파지 벡터 λDASH II 내로 클로닝하는 단계,
    (4) 상기 벡터를 파지 내로 패키지하는 단계,
    (5) 에쉐리키아 콜라이(Escherichia coli)를 파지로 감염시켜 게놈 DNA 라이브러리를 확립하는 단계,
    (6) PCR에 의해 스크리닝하는 단계 및
    (7) 플라스미드 벡터 내로 서브클로닝하는 단계
    를 포함하는, 서열 목록의 SEQ ID NO. 1에 나타낸 DNA의 제조 방법.
  3. 서열 목록의 SEQ ID NO. 1에 나타낸 DNA의 전장 또는 일부를 리포터 유전자에 결합시킨 것을 특징으로 하는 재조합 발현 벡터.
  4. 제3항 기재의 재조합 발현 벡터를 사용하는 것을 특징으로 하는 뼈 관련 물질의 탐색 방법.
  5. 제4항에 있어서, 상기 뼈 관련 물질이 골형성 유발 물질인 뼈 관련 물질의 탐색 방법.
  6. 제4항에 있어서, 뼈 관련 물질이 골형성 억제 물질인 뼈 관련 물질의 탐색 방법.
  7. 제3항 기재의 재조합 발현 벡터를 사용한 신장 질환 치료에 효과적인 물질의 탐색 방법.
KR1020007012054A 1998-04-30 1999-04-22 인간 ｂｍｐ-7 프로모터 및 이를 이용한 뼈 관련 물질의탐색 방법 KR20010071193A (ko)

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