CN1170941C - 人bmp-7启动子以及用其探测骨相关物质的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供根据报道活性、使用含人BMP-7启动子的5′上游区基因和导入与适当报道基因连接的载体的动物细胞，探测正向或负向调节人BMP-7表达的低分子量化合物的方法。用本方法获得的低分子量化合物及其衍生物通过表达人BMP-7对骨和软骨具有形态发生活性或抑制活性的，并可用作软骨和骨疾病的预防或治疗药物。而且该低分子量化合物及其衍生物可用作肾脏疾病的治疗药物。

Description

人BMP-7启动子以及用其探测骨相关物质的方法

发明背景

(1)发明领域

本发明涉及含人骨形成蛋白(此后称为BMP-7)启动子的5’上游区DNA。而且本发明涉及探测正向或负向调节人BMP-7表达的低分子量化合物的方法，该方法使用导入含人BMP-7启动子的5’上游区DNA、整合入适当报道基因的重组表达载体的大量动物或酵母菌细胞，并使用报道活性作为指示物。

(2)相关技术的描述

目前，已有关于属于TGF(转化生长因子)-β超家族的骨形成因子BMP的骨形成活性作了报告(Science 150，893-897，1965；Science242，1528-1534，1988)。已知的BMP种类有BMP-1至BMP-14。其中已知BMP-2至BMP-14的BMP具有骨形成活性。认为BMP-2至BMP-14的BMP对各种骨机能障碍和骨疾病的治疗和预防性治疗是有效的，然而其天然存在量很少。因此为了提供这些治疗使用的大量BMP-2至BMP-14，需要生产重组蛋白。与低分子量化合物相比，重组蛋白的生产通常非常昂贵。而且由于其蛋白质特性，重组蛋白作为药物在物理性质和给药方面存在许多限制。考虑到这些情况，如果有与所述BMP蛋白具有同等活性的小分子量有机化合物，它将成为非常有前景的药物。用本发明所提供的探测方法获得的物质具有诱导人骨形成因子BMP-7表达的活性，而且也具有与人BMP-7同样的活性。相反，如果BMP-7涉及骨和软骨增生，则抑制其表达可防止骨增生。本发明能够检测人BMP-7表达的抑制并提供探测防止增生的物质的方法。此外已知人BMP-7能促进肾细胞的分化(Proc.Natnl.Acad.Sci.，U.S.A.，第93卷，第9021-9026页，1996)。因此本发明所提供的实验系统可用于探测治疗肾脏疾病药物的方法。

对于这样的一种探测方法，至今仅有的报告是一个使用鼠BMP-2启动子实例(WO 97/15308)，没有使用人BMP-7启动子的实例。此外，因为本发明所提供的探测方法中的材料均来源于人，所以可以预期所发现的物质在临床实际应用中具有效果。

发明概述

本发明提供含人BMP-7启动子的5’上游区DNA。通过使用含人BMP-7启动子的5’上游区基因和已导入与适当报道基因连接的重组表达载体的动物细胞，根据报道活性可探测正向或负向调节人BMP-7表达的低分子量化合物。该低分子量化合物及其衍生物通过表达人BMP-7对骨和软骨具有形态发生活性和抑制活性，且可用作软骨和骨疾病的有效预防或治疗药物、骨转移有效药物或过量骨形成的治疗和预防有效药物。此外，这些低分子量化合物及其衍生物可用作肾脏疾病的预防或治疗药物。

附图简述

图1是人BMP-7基因10.8kb 5’上游区外显子-内含子结构及限制性酶图，网状表示外显子区，而空方框表示内含子区。

图2是含有人BMP-7基因5’上游区的重组表达载体(pMSS115)。启动子区(4.4kb)(序列表SEQ ID NO.1所示的第3813-8222号碱基，是指在图1中从5’末端第2个XbaI到第3个XbaI)插入到pGL3-基本型的Nhe I限制性酶位点。

图3是测量人BMP-7启动子活性(瞬时表达)的结果

优选实施方案的描述

本发明涉及一种DNA，其核苷酸序列为序列表SEQ ID NO.1所示第1-10877号碱基序列，它编码人骨形成蛋白-7启动子区或其片段。序列表的SEQ ID NO.1表示人BMP-7基因5’上游区序列。

本发明涉及通过进行以下步骤制备序列表SEQ ID NO.1所示DNA的方法：

(1)用HindIII限制性酶消化人胎盘基因组DNA，

(2)通过琼脂糖凝胶电泳分离，

(3)将用HindIII消化的分离DNA片段克隆到用相同的酶处理

   的λ噬菌体载体λDASHII中，

(4)将所述载体包装入噬菌体中，

(5)用噬菌体感染大肠杆菌建立基因组DNA文库，

(6)用PCR筛选，和

(7)亚克隆至质粒载体中。

这里所用的质粒载体是不受限制的，且可使用商品化质粒。pUC18载体可是优选实例。

本发明涉及一种重组表达载体，其特征为序列表SEQ ID NO.1中所示全长或部分DNA整合入报道基因中。详细地讲，重组表达载体构建是将序列表SEQ ID NO.1所示的人BMP-7基因5’上游适当区置于报道基因之前。报道基因如荧光素酶或β-半乳糖苷酶基因指示原始产物的表达状态。对于重组表达载体的原始载体不受特别限制，允许用商业化的质粒载体。本发明用pGL3-基本型作为最佳实例。使用pGL3-基本型获得的pMSS116(8.2kb)、pMSS118(7.1kb)和pMSS119(10.5kb)是含人BMP-7启动子和荧光素酶报道基因的重组表达载体。本发明将其指定为重组表达载体。必要的是用脂质体将所述重组表达载体导入哺乳动物细胞、优选人成骨细胞样细胞如SaOS-2细胞。用抗性标记选择稳定转染重组表达载体的动物细胞。

本发明涉及探测骨相关物质的方法，该方法的特征为使用序列表SEQ ID NO.1所示全长或部分DNA整合至报道基因为特点的重组表达载体。本发明涉及探测其中骨相关物质是骨形成诱导物质的骨相关物质的方法，或探测其中骨相关物质为骨形成抑制物质的骨相关物质的方法。诱导或抑制人BMP-7表达的低分子量化合物可通过以下方法获得：分离调节所述基因表达的启动子，将其与适当报道基因连接以及将所述基因结构物导入适当哺乳动物细胞以制成探测系统。在该探测系统中调节人BMP-7表达的物质作用于所述启动子以增加或降低所述报道基因的表达水平。因此简单且容易地测量所述报道活性使对所述目标物质的探测成为可能。

用所述载体转染的动物细胞可用于通过高产率筛选(Nature，第384卷(增补)，第14-16页，1996)筛选化合物文库以及从天然物质中探测活性物质的方法。通过用一种物质处理所述细胞适当时间，然后测量报道活性，从而探查增加或降低活性的物质。这样获得的物质可通过调节信号转导系统直接作用于转录因子或间接作用于所述人BMP-7启动子而调节所述表达。因此这些化合物作为骨软骨病、癌性骨转移或骨质增生的治疗药物是有效的。

而且这些化合物可用作肾脏疾病的治疗药物。

本发明获得的物质具有骨或软骨形成活性，且在整形外科领域(骨折，骨关节炎如关节骨关节炎和髋关节骨关节炎，关节骨炎，软骨损伤如半月板损伤，创伤和肿瘤切除引起的骨以及软骨缺损的再生，骨再建如脊骨接合和椎管扩大，以及先天性软骨和骨疾病如骨发育障碍和软骨发育不全)或牙科领域(骨再建如腭裂、下颌骨再建和牙槽残嵴构建)和骨质疏松的治疗和预防性治疗的有效药物。而且本发明的物质可用于美容外科中的骨移植。这些治疗性治疗对在兽医外科领域中的治疗是有效的。另一方面，本发明可提供抑制骨或软骨形成的物质。在这种情况下，该物质用作骨或软骨增生的预防和治疗的药物。

另外，本发明能提供可促进肾细胞分化的物质，并可将其用作治疗和预防肾脏疾病的药物。

实施例

通过以下的实施例将对本发明作更直观的解释。以下实施例在各方面都均考虑为是说明性的，不能认是为限制性的。

实施例1 人BMP-7基因5’上游区的分离

通过使用各种限制性酶(BamHI、BglII、EcoRI、HindIII、PstI、SacI、SalI、SmaI、SphI和XbaI)消化人胎盘基因组DNA(CloneTech产品)，通过琼脂糖凝胶电泳分离，转移至尼龙膜，并用BMP-7cDNA(EMBO J.9：2085-2093，1990)作探针进行DNA杂交。结果发现在所用的限制性酶中限制性酶HindIII消化产生含最长的人BMP-7基因的约11kb DNA片段。然后用限制性酶HindIII消化并用琼脂糖凝胶电泳分离人胎盘基因组DNA，从琼脂糖凝胶中提取约11kb DNA片段。将所获得的DNA片段克隆至用限制性酶HindIII消化的λ噬菌体载体λDASHII(Stratagene公司制造)。将该载体在体外用GigapackIII XL Extract(Stratagene公司制造)包装，感染至大肠肝菌XL1-Blue MRA(Stratagene公司制造)中以建立基因组DNA文库。将该DNA库划分成池(pool)。每个池用PCR筛选(Nucleic Acid Res.21：2627-2631，1993)扩增；即使用对应于翻译区的PCR引物(序列表SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3)的PCR方法选择目标池，最后获得人BMP-7基因5’上游区(10.8kb)。另外将5’上游10.8kb片段亚克隆至pUC 18载体(Amersham Pharmacia Biotech产品)。该载体命名为大肠杆菌pKOT 314。该大肠杆菌pKOT 314于1998年3月30日保藏在日本国立生命科学和人体技术研究所(National Institute ofBioscience and Human-Technology，Agency of Industrial Science andTechnology，Ministry of International Trade and Industry 1-3，Higash 1-chome，Tsukuba-shi Ibaraki-ken 305-8566，日本)，保藏号为FERM P-16737，并于1999年2月17日转至布达佩斯条约微生物国际保藏单位，保藏号为FERM BP-6651。

实施例2 人BMP-7基因5’上游区DNA序列的测定

根据Sanger等的方法(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 74：5463-5467，1977)，用Amersham Pharmacia Biotech’s ALF DNA测序仪测定所获得的人BMP-7基因5’上游区序列。这样分析的序列描述在序列表SEQID NO.1中。已报告SEQ ID NO.1的5557-10780号碱基序列(EMBOJ.9：2085-2093，1990)。然而与本发明序列存在许多差异。

实施例3 构建含人BMP-7启动子和荧光素酶报道基因的重组表达载体。

如图1所示，人BMP-7启动子存在于外显子1上游。那么，含图1启动子(5’末端第二个XbaI至第三个XbaI)的4.4kb区域，排列在报道基因上游，将其插入荧光素酶报道载体pGL3-基本型(ProMega公司产品)的限制性酶位点NheI，从而构建重组表达载体pMSS115(9.2kb)。见图2。

实施例4 人BMP-7启动子活性的测量(将重组表达载体导入人细胞并瞬时表达)

为了瞬时表达人BMP-7重组表达载体，将所述重组表达载体(pMSS115)与含海洋三色紫罗兰荧光素酶基因的作为内对照的载体pRL-SV40(Pro Mega公司产品)混合，以测量等量基因导入的效率。然后将阳离子脂质体脂质转染胺(Lifetech Oriental公司产品)加入到所述混合溶液中，并加到人骨肉瘤细胞HOS、MG63和SaOS-2中以转染。通过Pikka Gene Dual试剂盒(Toyo Ink公司产品)测量荧火虫荧光素酶活性和海洋三色紫罗兰荧光素酶活性。结果见图3。启动子活性以荧火虫荧光素酶活性与海洋三色紫罗兰荧光素酶活性比值表示。从该结果可知序列表的SEQ ID NO.1的DNA具有启动子活性。

实施例5   将重组表达载体导入人细胞并稳定表达

为了稳定表达人BMP-7重组表达载体，将所述载体与含嘌呤霉素抗性基因的pPUR载体(CloneTech公司产品)以10∶1的比例混合，并且也与阳离子脂质体脂质体转染胺(Lifetech Oriental公司产品)混合，并加入人骨肉瘤细胞HOS中以转染。从含嘌呤霉素的培养基(Sigma公司产品)中选择导入目标基因的细胞。

实施例6 活性低分子量化合物的筛选

将所选定的建立细胞接种在96孔板中，用各种化合物文库物质处理1-3天，用细胞溶解剂(Pro Mega公司产品)溶解，并用荧光素酶分析试剂盒(Pro Mega公司产品)测量酶活性。通过这样的方法可获得诱导或抑制人BMP-7表达的各种物质。

                       序列表独立文本

<210>1

<223>包括外显子1区的人BMP-75，上游基因序列

<210>2

<223>克隆5’上游人BMP-7基因序列的对应于外显子1区的正向

     PCR引物

<210>3

<223>克隆5’上游人BMP-7基因序列的对应于外显子1区的反向

     PCR引物

                    序列表

<110>Hoechst Marion Roussel Ltd

<120>人BMP-7启动子以及用其探测骨相关物质的方法。

<130>英文JH98K005 PCT SEQUENCES

<140>

<141>

<150>10-120173

<151>1998-04-30

<160>3

<170>Patentln Ver.2.1

<210>1

<211>10877

<212>DNA

<213>人

<220>

<221>misc-特征

<222>(1)..(10877)

<223>包括外显子1区的人BMP-75’上游基因序列。

<400>1

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ggcagggggt actttgttca taggtgattc agaaccacat atggtgacct cagagtagga 6600

aaccaagtgt ggggccctta agagctgggg ggccctgtac gactgtccag gttgcaggcc 6660

ccacagctcg cctcctgata tcctgtgctc catgcttgtc tgttgaagga aggagtgaat 6720

ggatgaagag caggtggtgg gggtggtttg agggccttgc tggtgggtgg gtagaggccc 6780

ctccctggca tggggctcaa gacctgttcc atcccacagc ctggggcctg tgtgtaaatg 6840

gccaggacct gcaggctggc atttttctgc tccttgcctg cctctggcct cccctttctc 6900

cacccatgtg gcccctcagg ttgccatcta gtccaaaagt ccccaaggga gacccagagg 6960

gccacttggc caaactactt ctgctccaga aaactgtaga agaccataat tctcttcccc 7020

agctctcctg ctccaggaag gacagcccca aagtgaggct tagccagagc ccctcccaga 7080

caagcgcccc cgcttcccca acctcagccc ttcccagctc atcccaaagg ccctctgggg 7140

acccactctc tcacccagcc ccaggagggg aaggagacag gatgaacttt taccccgctg 7200

ccctcactgc cactctgggt gcagtaattc ccttgagatc ccacaccggc agagggaccg 7260

gtgggttctg agtggtctgg ggactccctg tgacagcgtg catggctcgg tattgattga  7320

gggatgaatg gatgaggaga gacaggagag gaggccgatg gggaggtctc aggcacagac  7380

ccttggaggg gaagaggatg tgaagaccag cggctggctc cccaggcact gccacgagga  7440

gggctgatgg gaagccctag tggtggggct ggggtgtctg gtctcaggct gaggggtggc  7500

tggaaagata cagggccccg aagaggagga ggtgggaaga acccccccag ctcacacgca  7560

gttcacttat tcactcaaca aatcgtgact gcgcacgtac agtggctacc aggcgctggg  7620

ttcaaggcac tgcgggtacc agaggtgcgg agaagatcgc tgatccgggc cccagtgctc  7680

tgggtgtcta gcgggggtaa gaaggcaata aagaaggcac ggagtaactc aaacagcaat  7740

tccagacagc aagagaaact acaggaaaga aaacaaacgt gcgaggggcg aggcgaggaa  7800

acaacctcag cttggcaggt cttggaggtc tctgggagga gaaagcagcg tctgatgggg  7860

gcgggaggtg gtgagtgggg agaggtccag gcggagggaa tggcgagcgc agagacaggc  7920

tggcaacggc ttcagggagg cgcggagggg tcagcgtggc tggcttaaaa ggatacatgg  7980

gactgagggg caagaccggc tcaagggtca ccgcttccag gaagccttct atttccgcgc  8040

caacctcggc gctcccccaa cttttcccac cgcggtccgc agcccacccg tcctgctcgg  8100

gccgccttcc tggtccggac cgcgagtgcc gagagggcag ggccggctcc gattcctcca  8160

gccgcatccc cgcgacgtcc cgccaggctc taggcacccc gtgggcaccc agtaaacatt  8220

tgtcgagcgc tctagaggga atgaatgaac ccactgggca cagctggggg gagggcgggg  8280

ccgagggcag gtgggaggcc gccggcgcgg gaggggcccc tcgaagcccg tcctcctcct  8340

cctcctcctc cgcccaggcc ccagcgcgta ccactctggc gctcccgagg cggcctcttg  8400

tgcgatccag ggcgcacaag gctgggagag cgccccgggg cccctgctat ccgcgccgga  8460

gttggaagag ggtgggttgc cgccgcccga gggcgagagc gccagaggag cgggaagaag  8520

gagcgctcgc ccgcccgcct gcctcctcgc tgcctccccg gcgttggctc tctggactcc  8580

taggcttgct ggctgctcct cccacccgcg cccgcctcct cactcgcctt ttcgttcgcc  8640

ggggctgctt tccaagccct gcggtgcgcc cgggcgagtg cggggcgagg ggcccggggc  8700

cagcaccgag cagggggcgg gggtccgggc agagcgcggc cggccgggga ggggccatgt  8760

ctggcgcggg cgcagcgggg cccgtctgca gcaagtgacc gacggccggg acggccgcct  8820

gccccctctg ccacctgggg cggtgcgggc ccggagcccg gagcccgggt agcgcgtaga  8880

gccggcgcga tgcacgtgcg ctcactgcga gctgcggcgc cgcacagctt cgtggcgctc  8940

tgggcacccc tgttcctgct gcgctccgcc ctggccgact tcagcctgga caacgaggtg  9000

cactcgagct tcatccaccg gcgcctccgc agccaggagc ggcgggagat gcagcgcgag  9060

atcctctcca ttttgggctt gccccaccgc ccgcgcccgc acctccaggg caagcacaac  9120

tcggcaccca tgttcatgct ggacctgtac aacgccatgg cggtggagga gggcggcggg  9180

cccggcggcc agggcttctc ctacccctac aaggccgtct tcagtaccca gggcccccct  9240

ctggccagcc tgcaagatag ccatttcctc accgacgccg acatggtcat gagcttcgtc  9300

aacctcggtg agtaagggca ggcgagggta cgcgtctcct ttcgggggca ctttgagact  9360

gggagggagg gagccgcttc ttctatgcag cccgcccagc tttccgctcc tggctgaaat  9420

cgcagtgcct gcccgagggt ctcccaccca cagccctatg actcccaagc tgtgtgcgcc  9480

cccaggtcgg gcgcgctggg ttcggtgagc ctgtaggggt tactgggaag gagggatcct  9540

ccgaagtccc ctccatgtta cgccgccggc cgcatctctg gggctggagg caagggccgt 9600

tcaaagcgcg gggctcggtc atgtgagctg tcccgggccg gcgcggctcg cgtaacctgg 9660

atgtaaaggg cccttcccgg cgaggctgcc ttgccgccct tcctgggccc ctctcagccc 9720

tgcctggccc tggcatcgcg gccgtcgcac ccccttaccc tccctgtcaa gccctacctg 9780

tcccctcgtg gtgcgcccgc cttagcgtac cgcgcgctcc gagcgcttgg ggcccctctc 9840

cgggccgccg gatgccccat tctctcttgg ctggagctgg ggaagaaacg gtgccattgc 9900

taattttctt tgttttcttt ctttgtttat tttttttctt ttttcttttt ttttcttttc 9960

ttttcttttc tttttttttt ttttttgaga cggagttcac tcttgtcgcc cagtctggag 10020

tgcaatggcg cgatctctgc tcaccgcaac ctctgcctcc cgggttcaag cgattctcgt 10080

gcctcagcct cccgagtagc tgggattaca gcatgcgcca ccatgcctgg ctaattttgt 10140

atttttagta gagacagggt ttctccatgt taggcaggct ggtctcgaac tcccgatctc 10200

aggtgatcct cccgcctcag cctcccaaag tggtgctggg attacaggcg tgagccactg 10260

tgccctgccg ctagtcttct attttaagta tttagtggta ggtcccgggc cggcagaatc 10320

tattttcagc atttaccacg tgtggcgcgc aaaccacagg ttttggcgat tgggttgcgc 10380

gggatctcag actgacgcgc gggggcggct gggggtcccg gtttccgact ggagccgcga 10440

cgaccccggc gacgcgagcc tggggctgca gcgagggccg gggagctccc cctccatatg 10500

tgcgcgcaca ttctccagac ttgctcaaac taaccccccg cggcgccagc gcgctgcggg 105 60

actgatgatc aaatatttgg tttccgagat aacacacccc gatagcgctg tttcctgagc 10620

cgctttcatt ctacttgtgt aacttgctgc gaaaacccga accaagtcaa gacagcaaac 10680

tcaccccacg ggcgctgtgt caacatggaa ataatgatac tgaagcccca cgctgggcac 10740

ctggggcgtg gactgggggc gcgggggaag cgcagatccg ccttcatgct tcccccctcc 10800

tgataaggtc cctggagttc ccgggaggcc attgtctgta cttaataata actaaatcca 10860

actagtgaac caagctt                                                10877

<210>2

<211>30

<212>DNA

<213>人

<220>

<221>misc-特征

<222>(1)..(30)

<223>克隆5’上游人BMP-7基因序列的对应于外显子1区的正向PCR引物.

<400>2

gggcgcagcg gggcccgtct gcagcaagtg                                  30

<210>3

<211>30

<212>DNA

<213>人

<220>

<221>misc-特征

<222>互补物(Complement)((1)..(30))

<223>克隆5’上游人BMP-7基因序列的对应于外显子1区的反向PCR引物.

<400>3

agaggatctc gcgctgcatc tcccgccgct                    30

Claims (7)

1.一种DNA，其核苷酸序列为序列表SEQ ID NO.1所示的第1-10877号碱基序列，它编码人骨形成蛋白-7启动子区。

2.一种制备序列表的SEQ ID NO.1所示DNA的方法，该方法包括以下步骤：

(1)用HindIII限制性酶消化人胎盘基因组DNA，

(2)通过琼脂糖凝胶电泳进行分离，

(3)将用HindIII消化的分离的DNA片段克隆到用同样的酶处理的λ噬菌体载体λDASH II中，

(4)将所述载体包装入所述噬菌体中

(5)用所述噬菌体感染大肠杆菌建立基因组DNA文库，

(6)用PCR进行筛选，以及

(7)亚克隆至质粒载体中。

3.一种重组表达载体，其特征为序列表的SEQ ID NO.1所示DNA的全长整合至报道基因中。

4.探测骨相关物质的方法，包括将权利要求3的重组表达载体导入哺乳动物细胞和检测报道基因活性。

5.按照权利要求4的探测骨相关物质的方法，其中所述骨相关物质是骨形成诱导物质。

6.按照权利要求4的探测骨相关物质的方法，其中所述骨相关物质是骨形成抑制物质。

7.一种探测治疗肾脏疾病的有效物质的方法，包括将按照权利要求3的重组表达载体导入哺乳动物细胞并测量报道基因活性以确定所述化合物是否存在。

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