ES2139889T5 - Metodos y composiciones para estimular las celulas oseas. - Google Patents

Metodos y composiciones para estimular las celulas oseas.

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Abstract

SE REVELAN METODOS, COMPOSICIONES, MATERIALES NECESARIOS Y DISPOSITIVOS PARA SU USO EN LA TRANSFERENCIA DE ACIDOS NUCLEICOS EN CELULAS OSEAS IN SITU Y/O PARA ESTIMULAR LAS CELULAS PROGENITORAS OSEAS. EL COLAGENO TIPO II Y, PARTICULARMENTE GENES OSTEOTROPICOS, SON MOSTRADOS PARA ESTIMULAR LAS CELULAS PROGENITORAS OSEAS Y PROMOVER EL CRECIMIENTO OSEO, REPARACION Y REGENERACION IN VIVO. SE REVELAN LOS PROTOCOLOS DE TRANSFERENCIA DE GENES PARA SU USO EN LA TRANSFERENCIA DE VARIOS MATERIALES DE ACIDO NUCLEICO EN HUESOS, CUANDO PUEDEN SER USADOS EN EL TRATAMIENTO DE VARIAS ENFERMADADES RELACIONADAS CON LOS HUESOS Y DEFECTOS INCLUYENDO FRACTURAS, OSTEOPOROSIS, OSTEOGENESIS, IMPERFECTA Y CON RESPECTO A IMPLANTES OSEOS.

Description

Métodos y composiciones para estimular las células óseas.
La presente solicitud es una continuación - en parte - de la solicitud U.S. con Número de Serie 08/316.650, presentada el 30 de septiembre de 1994; la cual es una continuación - en parte - de la solicitud U.S. con Número de Serie 08/199.780, presentada el 18 de febrero de 1994; cuyo texto completo y figuras se incorporan específicamente en la presente memoria como referencia sin rectificación. El Gobierno de los Estados Unidos tiene ciertos derechos en la presente invención de conformidad con la concesión HL-41926 del Instituto Nacional de la Salud.
1. Campo de la invención
La presente invención se refiere de modo general al campo de las células y tejidos óseos. Más particularmente, algunas formas de realización se refieren a la transferencia de material genético al hueso y otras formas de realización se refieren al colágeno de tipo II. En algunos ejemplos, la invención se refiere a la utilización del colágeno de tipo II y a los ácidos nucleicos para estimular el crecimiento óseo, su reparación y su regeneración. Se proporcionan procedimientos, composiciones, kits y dispositivos para transferir un gen osteotrópico a células óseas progenitoras, el cual se ha demostrado que estimula a éstas y promueve el incremento de la formación in vivo del hueso.
2. Descripción de la técnica anterior
Defectos en el procedimiento de reparación y regeneración ósea están relacionados con el desarrollo de varias enfermedades y alteraciones humanas, por ejemplo, la osteoporosis y la osteogénesis imperfecta. El fallo del mecanismo de reparación ósea, está por supuesto asociado también con complicaciones significativas en la práctica ortopética clínica, por ejemplo, la falta de unión fibrosa tras una fractura ósea, los fallos interfásicos del injerto y los fallos de los grandes aloinjertos. Las vidas de muchas personas podrían ser mejoradas mediante el desarrollo de nuevas terapias diseñadas para estimular y reforzar los procedimientos de reparación de las fracturas.
Naturalmente, cualquier nueva técnica para estimular la reparación ósea constituiría una valiosa herramienta para tratar las fracturas óseas. Una parte significativa de los huesos fracturados se tratan todavía con escayola, dejando que los mecanismos naturales realicen la reparación de la herida. Aunque han habido avances en el tratamiento de las fracturas en años recientes, incluyendo dispositivos mejorados, el desarrollo de nuevos procedimientos para estimular o complementar los mecanismos de reparación de las heridas representarían progresos significativos en este campo.
Una población muy significativa de pacientes que se beneficiaría de nuevas terapias diseñadas para promover la reparación de las fracturas, o incluso prevernirlas o reducirlas, son aquéllos pacientes que padecen osteoporosis. El término osteoporosis se refiere a un grupo heterogéneo de alteraciones caracterizado por una masa ósea disminuida y fracturas. Clínicamente, la osteoporosis se divide en tipo I y tipo II. El tipo I se presenta predominantemente en mujeres de edad media y se asocia con la pérdida de estrógenos en la menopausia, mientras que la osteoporosis de tipo II se asocia con la edad avanzada.
Se estima que 20-25 millones de personas sufren un riesgo aumentado de fracturas, a causa de la pérdida ósea en lugares específicos. El coste de tratar la osteoporosis en los Estados Unidos se calcula habitualmente que es del orden de 10.000 millones de dólares por año. Las tendencias demográficas, por ejemplo, la edad gradualmente creciente de la población US, sugieren que estos costes pueden aumentar de 2 a 3 veces en el año 2020 si no se encuentra un tratamiento seguro y efectivo.
El foco importante de las terapias habituales para la osteoporosis es la prevención de las fracturas, no su reparación. Esto constituye una consideración importante, pues se sabe que una significativa morbilidad y mortalidad se asocian con una estancia prolongada en cama de las personas mayores, especialmente de aquéllas que han sufrido fractura de la cadera. Son claramente necesarios nuevos métodos para estimular la reparación de las fracturas, restaurando de este modo la movilidad en estos pacientes antes de que lleguen las complicaciones.
La osteogénesis imperfecta (OI) se refiere a un grupo de enfermedades heredadas del tejido conjuntivo caracterizadas por fragilidad de los huesos y del tejido conjuntivo blando (Byers y Steiner, 1912; Prockop, 1990). Los hombres y mujeres se ven igualmente afectados, y la incidencia total se estima habitualmente que es de 1 entre 5.000-14.000 nacimientos vivos. Pérdida de la audición, formación imperfecta de los dientes, insuficiencia respiratoria, escoliosis severa y enfisema son justamente algunas de las condiciones que se asocian con uno o más tipos de OI. Mientras que están no disponibles estimaciones precisas de los costes de los cuidados sanitarios, la morbilidad y mortalidad asociadas con OI provienen ciertamente de la propensión extrema a las fracturas (tipos I-IV de OI) y a la deformación de los huesos anormales tras la reparación de las fracturas (tipos II-IV de OI) (Bonadio y Goldstein, 1993). La consecuencia más importante del tratamiento de la OI es desarrollar nuevos métodos mediante los cuales mejore la reparación de las fracturas y por tanto mejore la calidad de vida de estos pacientes.
Las técnicas de reconstrucción ósea, tales como las que se utilizan para reconstruir defectos que se producen como resultado de traumas, cirugía del cáncer o errores en el desarrollo, mejorarían también con nuevos métodos para promover la reparación ósea. Los métodos de reconstrucción habitualmente utilizados, tales como utilizar injertos óseos autólogos, o injertos óseos con tejidos blandos y vasos sanguíneos unidos, se asocian con inconvenientes significativos de coste y dificultad. Por ejemplo, la recogida de una cantidad útil de hueso autólogo no se alcanza fácilmente, y aún los injertos autólogos se infectan a menudo o sufren resorción.
El procedimiento de reparación y regeneración ósea se parece al de cicatrización de las heridas en otros tejidos. Una secuencia típica de sucesos, incluye: hemorragia; formación del coágulo; disolución de éste con renovación concomitante de los tejidos dañados; crecimiento interno del tejido de granulación; formación de cartílago; crecimiento interno de capilares y recambio del cartílago; formación rápida del hueso (tejido calloso); y, finalmente, remodelación del callo en hueso cortical y trabecular. Por tanto, la reparación ósea es un procedimiento complicado que implica muchos tipos celulares y moléculas reguladoras. Las diversas poblaciones celulares implicadas en la reparación de las fracturas incluyen células de sostén, macrófagos, fibroblastos, células vasculares, osteoblastos, condroblastos, y osteoclastos.
Los factores reguladores implicados en la reparación ósea se conocen por incluir hormonas sistémicas, citoquinas, factores de crecimiento, y otras moléculas que regulan el crecimiento y diferenciación. Se han purificado diversos agentes inductores óseos, mostrándose que son moléculas polipeptídicas como factores de crecimiento. Estos factores estimuladores se refieren a proteínas morfogenéticas óseas ó proteínas morfogénicas (BMPs) y se han denominado también proteínas inductoras osteogénicas óseas ó proteínas osteogénicas (OPs). Se han clonado ahora varios genes BMP (ó OP), siendo las denominaciones habituales BMP-1 a BMP-8. Se están descubriendo nuevos BMPs. Aunque la terminología BMP se utiliza ampliamente, puede darse el caso de que exista un término réplica de OP para cada BMP individual (Alper, 1994).
Se piensa que los BMPs 2-8 son generalmente osteogénicos, aunque BMP-1 es un morfógeno más generalizado (Shimell et al., 1991). BMP-3 se denomina también ósteogenina (Luyten et al., 1989) y BMP-7 se denomina también OP-1 (Ozkaynak et al., 1990). Los BMPs se relacionan con, o con parte, de la superfamilia del factor \beta transformante del crecimiento (TGF-\beta) y ambos, TGF-\beta_{1} y TGF-\beta_{2} regulan también la función osteoblástica (Seitz et al., 1992). Varias secuencias nucleotídicas BMP (ó OP) y polipéptidos se han descrito en los documentos de Patente U.S. por ejemplo, en 4.795,804; 4.877.864; 4.968.590; 5.108.753; que incluyen específicamente, BMP-1 que se da a conocer en el documento de Patente U.S. 5.108.922; BMP-2A (al que se hace referencia habitualmente como BMP-2) en los documentos de Patente U.S. 5.166.058 y 5.013.649; BMP-2B (al que se hace referencia habitual como BMP-4) que se da a conocer en la Patente U.S. 5.013.649; BMP-3 en el documento 5.116.738; BMP-5 en el documento 5.106.748; BMP-6 en el documento 5.187.076; BMP-7 en el documento 5.108.753 y 5.141.905; y OP-1, COP-5 y COP-7 en el documento 5.011.691.
Otros factores de crecimiento ú hormonas, de las que se ha informado que tienen la capacidad de estimular la nueva formación de tejido óseo, incluyen el factor de crecimiento acídico de los fibroblastos (Jingushi et al., 1990); estrógenos (Boden et al., 1989); factor estimulante de la colonia de macrófagos (Horowitz et al., 1989); y agentes reguladores del calcio tales como la hormona paratiroidea (PTH) (Raisz y Kream, 1983).
Varios grupos han investigado la posibilidad de utilizar proteínas y polipéptidos estimulantes del hueso, particularmente el BMPs recombinante, para influenciar la reparación ósea in vivo. Por ejemplo, el BMP-2 recombinante se ha utilizado para reparar los defectos creados quirúrgicamente en la mandíbula de perros adultos (Touriumi et al., 1991) y se ha demostrado que altas dosis de esta molécula reparan funcionalmente defectos segmentales en los fémures de las ratas (Yasko et al., 1992). Chen y colegas demostraron que una aplicación simple de 25-100 mg del TGF-\beta_{1} recombinante adyacente al cartílago, inducía la formación ósea endocondral en las heridas dérmicas de grosor total de la oreja del conejo (Chen et al., 1991). También se ha informado de que una aplicación de TGF-\beta_{1} en un gel de metilcelulosa al 3% fue capaz de reparar grandes defectos craneales inducidos quirúrgicamente que de otro modo cicatrizan mediante tejido conjuntivo fibroso y nunca forman hueso (Beck et al., 1991). El documento WO 88/00205 da a conocer la utilización de una proteína recombinante para la reparación ósea.
La técnica anterior (documento WO 94/01139) describe un procedimiento para transfectar una célula en una estructura de articulación, en la que un vector de ADN que contiene un cassette de ácido nucleico que codifica una proteína deseada, por ejemplo, un agente de ablación celular o un agente terapéutico, se inyecta directamente en la articulación. Las células que son transfectadas con el gen son por ejemplo, células sinoviales. El documento EP nº 0 248 531 da a conocer una microcápsula para a la liberación controlada de ácido nucleico.
Sin embargo, existen muchos inconvenientes asociados con este tipo de protocolos de tratamiento, especialmente la cara y larga purificación de las proteínas recombinantes a partir de sus células huésped. También, los polipéptidos, una vez administrados a un animal son más inestables de lo que es generalmente deseable para un agente terapéutico, y son susceptibles al ataque proteolítico. Además, la administración de proteínas recombinantes puede iniciar varias respuestas inmunes inhibitorias o dañinas de alguna otra manera. Está claro, por tanto, que un procedimiento nuevo capaz de promover la reparación y regeneración ósea in vivo representaría un avance médico y científico significativo con beneficios inmediatos para un gran número de pacientes. Un método adaptable fácilmente para su utilización con diversas matrices y genes óseo-estimuladores sería particularmente ventajoso.
Sumario de la invención
La presente invención supera uno o más de estos y otros inconvenientes inherentes a la técnica anterior, proporcionando nuevos procedimientos, composiciones y dispositivos para utilizarlos en la transferencia de ácidos nucleicos a las células y tejidos óseos, y para promover la reparación y regeneración de los huesos. Algunas formas de realización de la presente invención se basan, generalmente, en el hallazgo sorprendente de los inventores de que los ácidos nucleicos puede transferirse efectivamente a las células progenitoras óseas in vivo y que, en algunas de esas formas de realización, la transferencia de un gen osteotrópico estimula la reparación ósea en un animal.
Tal como se utiliza en la presente memoria, "segmento aislado de ácido nucleico se refiere a un ácido nucleico" tal como se define en la reivindicación 1.
Tal como se utiliza en la presente memoria, la expresión "matriz" se refiere a una matriz según la reivindicación 1.
La presente invención, en términos generales, se refiere por lo tanto a procedimientos, composiciones y dispositivos para transferir un segmento de ácido nucleico a las células progenitoras ó tejidos óseos. Los procedimientos de la presente invención comprenden generalmente contactar de forma efectiva las células progenitoras óseas con una composición que comprende un segmento de ácido nucleico, para transferir éste a las células. Las células pueden ser células cultivadas ó células recombinantes que se mantienen in vitro, cuando todo lo que se necesita es añadir la composición del ácido nucleico a las células, por ejemplo, añadiéndolo al medio de cultivo.
Alternativamente, las células progenitoras pueden estar localizadas en el interior de un sitio hístico progenitor del hueso de un animal, cuando la composición del ácido nucleico se aplique a ese lugar con objeto de afectar, o promover la transferencia in vivo del ácido nucleico a las células del progenitor óseo. En la transferencia de ácidos nucleicos a células óseas en el interior de un animal, un procedimiento preferido implica primero añadir el material genético a una matriz ósea compatible y utilizar entonces la matriz resultante para contactar un sitio hístico apropiado en el interior del animal. A la matriz "resultante" se puede, en algunas formas de realización, aludir como a una matriz impregnada con material genético, o puede tomar la forma de una mezcla ácido nucleico-matriz, o también de un conjugado.
A las células progenitoras óseas o tejidos, utilizando las composiciones y procedimientos de la presente invención, puede transferirse una variedad extremadamente amplia de material genético tal como se reivindica en la reivindicación 1. Por ejemplo, el segmento de ácido nucleico puede ser ADN (mono ó bicatenario) ó ARN. Los segmentos de ácido nucleicos pueden por tanto ser secuencias genómicas, que incluyen exones o intrones sólo, o exones e intrones, o regiones cADN codificantes, o de hecho cualquier construcción que se desee transferir a una célula progenitora o tejido óseo. Segmentos de ácidos nucleicos apropiados pueden estar en cualquier forma virtualmente, tal como ADN o ARN desnudos, que incluyen moléculas lineales de ácidos nucleicos y plásmidos; inserciones funcionales en el interior de genomas de varios virus recombinantes, incluyendo virus con genomas de ADN y retrovirus; y cualquier forma de segmento de ácido nucleico, plásmido o virus asociado con un liposoma o una partícula de oro, pudiéndose emplear esta última en relación con la tecnología del cañón génico.
La invención puede utilizarse para promover la expresión de un gen deseado en las células ó tejidos óseos y comunicar a éstas un fenotipo particular deseado. Esta expresión podría constituir la expresión aumentada de un gen que se expresa normalmente, o podría (esto es, "sobre-expresión") utilizarse para expresar un gen que no se asocia normalmente con las células progenitoras del hueso en su entorno natural. Alternativamente, la invención puede utilizarse para suprimir la expresión de un gen que se expresa naturalmente en dichas células y tejidos, y otra vez, para cambiar o alterar el fenotipo. La supresión génica puede constituir una manera de expresar un gen que codifica una proteína que ejerce una función reguladora a la baja.
1. Células y tejidos progenitores óseos
En algunas formas de realización, la presente invención proporciona procedimientos ventajosos para utilizar genes que estimulen las células progenitoras óseas. Tal como se utiliza en la presente memoria, el término "células progenitoras óseas" se refiere a cualquiera o a la totalidad de aquellas células que tienen la capacidad de formar últimamente, o contribuir a la formación de nuevos tejidos óseos. Esto incluye varias células en distintas fases de diferenciación, tal como por ejemplo, células de sostén, macrófagos, fibroblastos, células vasculares, osteoblastos, condroblastos, osteoclastos y análogos. Las células progenitoras óseas incluyen también células que se han aislado y manipulado in vitro, por ejemplo, se han sometido a estimulación con agentes tales como citoquinas o factores de crecimiento o incluso células sometidas a ingeniería genética. El tipo particular o tipos de células progenitoras óseas que son estimuladas utilizando los procedimientos y composiciones de la invención no son importantes, siempre que las células se estimulen de tal forma que se activen y, en el contexto de las formas de realización in vivo, produzcan finalmente nuevo tejido óseo.
El término "célula progenitora ósea" se utiliza para referirse particularmente a aquellas células que se localizan en el interior, están en contacto con, o emigran hacia (es decir, "hacia casa") el tejido progenitor óseo y cuyas células estimulan directa o indirectamente la formación de hueso maduro. Como tales, las células progenitoras pueden ser células que se diferencian finalmente ellas mismas en células óseas maduras esto es, células que forman "directamente" nuevo tejido óseo. Las células que, tras estimulación, atraen ulteriormente células progenitoras o promueven que las células cercanas se diferencien en células formadoras óseas (por ejemplo, en osteoblastos, osteocitos y/o osteoclastos) se consideran también como células progenitoras en el contexto de esta exposición - ya que su estimulación conduce "indirectamente" a la reparación o regeneración ósea. Las células que afectan a la formación ósea pueden llevar a cabo esto indirectamente mediante la elaboración de diversos factores de crecimiento o citoquinas, o mediante su interacción física con otros tipos celulares. Aunque de interés científico, los mecanismos directos o indirectos mediante los cuales las células progenitoras estimulan la reparación ósea o de las heridas, no constituye una consideración para la práctica de esta invención.
Las células progenitoras óseas y los tejidos progenitores óseos pueden ser células y tejidos que, en su entorno natural, lleguen a un área de crecimiento óseo activo, reparación o regeneración (a la que también se alude como un sitio de reparación de una herida). En términos de células progenitoras óseas, estas pueden también ser células que son atraídas o reclutadas a dicha área. Estas pueden ser células que estén presentes en el interior de un sitio osteotómico creado artificialmente en un modelo animal, tal como las que se exponen en la presente memoria. Las células progenitoras óseas pueden también aislarse de los tejidos animales o humanos y conservarse en un entorno in vitro. Las áreas apropiadas del organismo a partir de las cuales obtener células progenitoras óseas son áreas tales como el tejido óseo y fluido que rodea una fractura u otro defecto del esqueleto (de todos modos este es un sitio creado artificialmente) o, verdaderamente, a partir de la médula ósea. Las células aisladas pueden estimularse utilizando los procedimientos y composiciones que se dan a conocer en la presente memoria, y, si se desea, devolverlas a un sitio apropiado en un animal en el que la reparación ósea tenga que estimularse. En tales casos, las células que contienen el ácido nucleico serían ellas mismas una forma de agente terapéutico. Dichos protocolos ex vivo son bien conocidos por los expertos en la materia.
En formas de realización importantes de la invención, las células progenitoras óseas y tejidos serán aquellas células y tejidos que lleguen al área de fractura ósea o dañada que se quiera tratar. De acuerdo con esto, en formas de realización del tratamiento, no existe dificultad asociada con la identificación de células progenitoras diana apropiadas a las cuales deban aplicarse las presentes composiciones terapéuticas. Todo lo que se necesita en dichos casos es obtener una composición estimuladora apropiada, como se ha expuesto, y poner en contacto el sitio de la fractura ósea o defecto con la composición. La naturaleza de este entorno biológico es tal que las células apropiadas se activarán en ausencia de cualquier determinación ulterior de la diana o identificación celular por el médico.
Algunos métodos de la presente invención implican, generalmente, poner en contacto las células progenitoras óseas con una composición que comprende uno o más genes osteotrópicos (con o sin genes adicionales, proteínas u otras biomoléculas), de forma que se promueva la expresión de dicho gen en dichas células. Tal como se expresó anteriormente, las células pueden ponerse en contacto in vitro o in vivo. Esto se consigue, de la forma más directa, obteniendo simplemente una construcción funcional génica osteotrópica y aplicando ésta a las células. Los inventores encontraron sorprendentemente que no existen modificaciones biológicas moleculares particulares que necesiten llevarse a cabo con objeto de promover la expresión efectiva del gen en las células progenitoras. Poniendo en contacto las células con ADN, por ejemplo, una molécula de ADN lineal, o ADN en forma de un plásmido u otro vector recombinante, que contiene el gen de interés bajo el control de un promotor junto con las señales de finalización apropiadas, es suficiente para que se obtenga la captación y expresión del ADN, no siendo necesarias etapas ulteriores.
En formas de realización preferidas, el procedimiento de poner en contacto las células progenitoras con la composición de genes osteotrópicos se lleva a cabo in vivo. Otra vez, una consecuencia directa de este procedimiento es que las células captan y expresan el gen y que, sin etapas adicionales, funcionan para estimular el crecimiento, reparación ó regeneración del tejido óseo.
Un ensayo de un gen ósteoinductor puede llevarse a cabo utilizando el ensayo de inducción ósea de Sampath y Reddi (1981; que se incorpora a la presente memoria como referencia). Este es un ensayo de formación ósea en la rata que se utiliza rutinariamente para evaluar la actividad osteogénica de los factores inductores óseos. Sin embargo, para analizar los efectos de los genes osteotrópicos sobre el crecimiento óseo, se dirige generalmente a la utilización del nuevo modelo de osteotomía que aquí se da a conocer.
2. Genes osteotrópicos
Tal como se utiliza en la presente memoria, los términos "osteotrópico" y "gen osteogénico" se utilizan para referirse a un gen o región codificante del ADN que codifica una proteína, polipéptido o péptido que es capaz de promover, o ayudar en la promoción de la formación ósea, o una que aumente la tasa de crecimiento óseo primario o de cicatrización del tejido conjuntivo esquelético (o también un gen que aumente la tasa de crecimiento o cicatrización del tejido conjuntivo esquelético). Los términos "promover", "inducir", y "estimular" se utilizan de modo intercambiable a través de este texto para referirse directa o indirectamente a procedimientos que dan lugar finalmente a la formación de nuevo tejido óseo o a una tasa aumentada de reparación ósea. Así, un gen osteotrópico es un gen que, cuando se expresa, provoca que el fenotipo de una célula cambie de modo que la célula se diferencia, estimule a otras células a diferenciarse, atraiga a las células formadoras de hueso, o funcione de otra manera de forma que dé lugar finalmente a nuevo tejido óseo.
Al utilizar el nuevo modelo de osteotomía de la presente invención, un gen osteotrópico es un gen caracterizado como uno que es capaz de estimular el crecimiento óseo adecuado en el espacio de osteotomía hasta cualquier grado superior al observado en los estudios de control, por ejemplo, estudios paralelos que emplean un gen marcador irrelevante tal como la \beta-galactosidasa. Esta estimulación del "crecimiento óseo adecuado" incluye tanto el tipo de crecimiento tisular como la tasa de formación ósea. Al utilizar el modelo con un espacio osteotómico de 5 mm, un gen osteotrópico se caracteriza generalmente como un gen que es capaz de promover o inducir nueva formación ósea, más bien que la reparación anormal de una fractura ósea, es decir, la no- unión fibrosa. Al utilizar el espacio osteotómico de 2 mm, se pueden caracterizar los genes osteotrópicos como genes que aumentan la tasa de cicatrización ósea primaria cuando se compara con los controles, y más preferentemente, genes capaces de estimular la reparación del defecto osteotómico en un tiempo menor que 9 semanas.
En términos generales, un gen osteotrópico puede también caracterizarse como un gen capaz de estimular el crecimiento o regeneración de los tejidos conjuntivos del esqueleto tal como, por ejemplo, tendones, cartílagos y ligamentos. Así, en algunas formas de realización, los procedimientos y composiciones de la invención pueden utilizarse para estimular el crecimiento o reparación tanto del tejido óseo en si mismo como también de los tejidos conjuntivos del esqueleto.
Se conocen ahora diversos genes osteotrópicos, todos los cuales son apropiados para utilizar en relación con la presente invención. Los genes osteotrópicos y las proteínas que codifican incluyen, por ejemplo, hormonas sistémicas, tales como la hormona paratiroidea (PTH) y estrógenos; muchos distintos factores de crecimiento y citoquinas; péptidos o polipéptidos quimiotácticos o adhesivos; moléculas tales como la activina (Patente USA 5.208.219, que se incorpora a la presente memoria como referencia); proteínas morfogenéticas óseas específicas (BMPs); y también genes receptores de factores de crecimiento.
Ejemplos de factores de crecimiento osteotrópicos apropiados incluyen la familia génica de los factores transformantes de crecimiento (TGF) que incluyen TGFs 1-3 y particularmente TGF-\beta_{1}, TGF-\beta_{2} y TGF-\beta_{3} (documentos de Patente USA 4.886.747 y 4.742.003, que se incorporan a la presente memoria como referencia) con TGF-\alpha (Patente US 5.168.051, que se incorpora a la presente memoria como referencia) siendo también de utilización posible; y también factores de crecimiento fibroblástico (FGF), a los que previamente se ha hecho referencia como FGF acídicos y básicos y a los que ahora se alude como FGF1-9; factor estimulante colonial granulocito/macrófago (GMCSF); factor de crecimiento epidérmico (EGF); factor de crecimiento derivado de las plaquetas (PDGF); factores de crecimiento análogos a la insulina (IGF), que incluyen IGF-I e IGF-II; y factor inhibitorio leucémico (LIF), también conocido cono HILDA y DIA. Cualquiera de los genes anteriores u otros relacionados, o segmentos de ADN que codifican las porciones activas de dichas proteínas, pueden utilizarse en los nuevos procedimientos y composiciones de la invención.
Algunos genes osteotrópicos preferidos y segmentos de ADN son los de la superfamilia TGF, tales como TGF\beta_{1}, TGF-\beta_{2}, TGF-\beta_{3} y miembros de la familia BMP de genes. Por ejemplo, se han clonado varios genes BMP que constituyen candidatos ideales para su empleo en la transferencia de ácidos nucleicos o en los protocolos de entrega de la invención. Los gentes BMP apropiados son los que se denominan BMP-2 a BMP-12. BMP-1 no se considera como particularmente útil en esta fase.
Existe una variación considerable en la terminología habitualmente utilizada en la literatura al referirse a estos genes y polipéptidos. Se entenderá por los expertos en la técnica que todos los genes BMP que codifican una proteína osteogénica activa se consideran útiles en la presente invención, a pesar de la terminología distinta que pueda emplearse. Por ejemplo, BMP-3 se denomina también osteogenina y BMP-7 se llama también OP-1 (proteína osteogénica-1). Es probable que la familia de factores denominada OP(s) sea tan amplia como la denominada BMP(s), y que estos términos, de hecho, describen el mismo conjunto de moléculas (Alper, 1994).
Las secuencias de ADN para varios genes BMP (ó OP) se han descrito tanto en artículos científicos como en documentos de Patente U.S. tales como 4.877.864; 4.968.590; 5.108.753. Específicamente, las secuencias BMP-1 se exponen en el documento de Patente U.S. 5.108.922; BMP-2A (a la que se alude habitualmente como BMP-2), en el documento de Patente 5.166.058 y 5.013.649; BMP-2B (a la que se alude habitualmente como BMP-4) se expone en el documento de Patente U.S 5.013.649; BMP-3 en el documento 5.116.738; BMP-5 en 5.106.748; BMP-6 en 5.187.076; y BMP-7 en 5.108.753 y 5.141.905; todos se incorporan a la presente memoria como referencia). El artículo de Wozney et al., (1988; que se incorpora a la presente memoria como referencia) se considera particularmente útil para la descripción de los clones moleculares de BMP y sus actividades. Las secuencias que codifican las proteínas osteogénicas denominadas OP-1, COP-5 y COP-7 se dan a conocer también en el documento de Patente U.S. 5.011.691.
Todos los documentos de Patente U.S. anteriormente publicados se incorporan a la presente memoria como referencia y tienen la intención de utilizarse con objeto de suplementar las presentes enseñanzas respecto a la preparación de los genes BMP y OP y de los segmentos de ADN que expresan los polipéptidos osteotrópicos. Tal como se da a conocer en las patentes anteriores, y como es conocido por los expertos en la materia, la fuente original de un gen recombinante o de un segmento de ADN que va a utilizarse en un régimen terapéutico no necesita ser de idéntica especie que el animal que va a tratarse. A este respecto, se contempla que puede utilizarse cualquier gen recombinante PTH, TGF ó BMP para promover la reparación o regeneración ósea en un individuo humano o un animal; por ejemplo, un caballo. Genes particularmente preferidos son los de orígenes humano, murino y bovino, debido a que dichos genes y segmentos de ADN están fácilmente disponibles, siendo las formas murinas y humanas del gen las más preferidas para utilizar en los regímenes de tratamiento en el hombre. A las proteínas y polipéptidos recombinantes codificados por segmentos aislados de ADN y genes se hace referencia a menudo con el prefijo "r" para recombinante, y "rh" para humano recombinante''. Como tales, los segmentos de ADN que codifican rBMPs, tales como rhBMP-2 ó rhBMP-4, se contemplan como particularmente útiles en relación con la presente invención.
La definición de un "gen BMP" tal como se utiliza en la presente memoria, es un gen que hibridiza, bajo condiciones de hibridación relativamente estrictas (véase, por ejemplo, Maniatis et al., 1982) a secuencias de ADN que se sabe actualmente incluyen secuencias génicas BMP.
Para preparar un segmento génico osteotrópico ó cADN, se pueden seguir las enseñanzas que se dan a conocer a la presente memoria y también las de cualquiera de las patentes o documentos científicos a los que se hace específicamente referencia. Varias secuencias nucleótidas que codifican BMPs activos se dan a conocer en los documentos de patente U.S. 5.166.058, 5.013.649, 5.116.738. 5.106.748, 5.187.076, 5.108.753 y 5.011.691, cada uno de los cuales se incorpora a la presente memoria como referencia. Sólo como ejemplo, el documento de Patente U.S. 5.166.058, enseña que hBMP-2 está codificado por una secuencia nucleótida que abarca desde el nucleótido #356 al nucleótido #1543 de la secuencia que se muestra en la Tabla II de la patente. Se puede obtener de este modo un segmento hBMP-2 ADN utilizando técnicas de biología molecular, tales como la reacción en cadena de la polimerasa (PCR™) o investigando un cADN o una biblioteca genómica, utilizando cebadores o sondas con secuencias basadas en la secuencia nucleótida anterior. La práctica de dichas técnicas es un asunto rutinario para los expertos en la materia, como se enseña en diversos artículos científicos tales como en Sambrook et al., (1989), que se incorpora a la presente memoria como referencia. Ciertos documentos describen particularmente además vectores apropiados de expresión de mamíferos, por ejemplo, el documento de Patente 5.168.050, que se incorpora a la presente memoria como referencia.
Los genes osteotrópicos y los segmentos de ADN que se prefieren particularmente para su utilización en ciertos aspectos de las presentes composiciones y procedimientos son los genes TGF, PTH y BMP. Los genes TFG se describen en los documentos de Patente U.S: 5.618.051; 4.886.747 y 4.742.003, cada uno de los cuales se incorporará a la presente memoria como referencia. TGF-\alpha puede no ser tan ampliamente aplicable como TGF\beta, pero se propone para utilizar particularmente en aplicaciones que implican los tejidos blandos del esqueleto. El gen PTH o un segmento de ADN que codifica su fragmento activo, tal como un segmento de ADN que codifique un polipéptido que incluya los aminoácidos 1-34 (hPTH 1-34; Hendy et al., 1981; que se incorpora a la presente memoria como referencia) es otro gen preferido; como lo son los genes BMP denominados BMP-4 y BMP-2, tal como el gen o el cADN que codifica el BMP-4 que se da a conocer en la presente memoria.
Se contempla también que se pueden clonar posteriormente genes ó cADNs que codifiquen una proteína o polipéptido osteotrópico. Las técnicas para clonar moléculas de ADN, esto es, obtener una secuencia codificante específica a partir de una biblioteca genómica que es distinta de otras porciones del ADN, se conocen bien en la técnica. Esto puede obtenerse a partir de, por ejemplo, la búsqueda de una biblioteca apropiada de ADN tal como se da a conocer aquí en el Ejemplo XV, que se refiere a la clonación de un gen de cicatrización de heridas. El procedimiento de búsqueda puede estar basado en la hibridación de sondas oligonucleótidas, diseñadas a partir de la consideración de partes de la secuencia aminoácida de secuencias conocidas de ADN que codifiquen las proteínas osteogénicas relacionadas. La realización de dichos protocolos de búsqueda es bien conocida para los expertos en la materia y están descritos detalladamente en la literatura científica, por ejemplo, en Sambrook et al., (1989), que se incorpora a la presente memoria como referencia.
Los genes osteotrópicos con secuencias que varían de las descritas en la literatura son también abarcados por la invención, siempre que el gen alterado o modificado codifique todavía una proteína que actúe para estimular a las células progenitoras óseas de cualquier manera directa o indirecta. Estas secuencias incluyen las causadas por mutaciones puntuales, las debidas a las degeneraciones del código genético ó de sus variantes alélicas que tienen lugar naturalmente, o a las modificaciones posteriores que se han introducido mediante ingeniería genética, esto es, por el hombre.
Las técnicas para introducir cambios en las secuencias nucleótidas que son diseñadas para alterar las propiedades funcionales de las proteínas o polipéptidos codificados, se conocen bien en la técnica, por ejemplo, el documento de Patente U.S. 4.518.584 que se incorpora a la presente memoria como referencia, las cuales técnicas se describen en la presente memoria más detalladamente. Dichas modificaciones incluyen la deleción, inserción o sustitución de bases, y por tanto, cambios en la secuencia aminoácida. Los cambios pueden hacerse para aumentar la actividad osteogénica de una proteína, para aumentar su estabilidad biológica o vida media, para cambiar su patrón de glicosilación, y análogos. La totalidad de dichas modificaciones para las secuencias nucleótidas son abarcadas por la presente invención.
Se entenderá, sin embargo, por supuesto, que uno o más de un gen osteotrópico puede(n) utilizarse en los procedimientos y composiciones de la invención. Los métodos de suministro del ácido nucleico pueden por esto ocasionar la administración de uno, dos, tres o más genes osteotrópicos. El número máximo de genes que pueden aplicarse está limitado sólo por consideraciones prácticas, tales como el esfuerzo implicado en preparar simultáneamente un gran número de construcciones génicas o incluso, la posibilidad de provocar un efecto citotóxico adverso significativo. La combinación particular de genes puede ser de dos o más genes BMP distintos; o puede ser tal que un gen de un factor de crecimiento se combine con un gen de una hormona, por ejemplo, un gen BMP y un gen PTH; un gen de una hormona o de un factor de crecimiento puede incluso combinarse con un gen que codifique un receptor de la superficie celular capaz de interactuar con el producto polipeptídico del primer gen.
Al utilizar genes múltiples, pueden combinarse en una construcción génica única bajo el control de uno o más promotores, o pueden prepararse como construcciones separadas de tipo idéntico o diferente. Así, puede utilizarse una combinación casi sin fin de genes distintos y construcciones genéticas. Ciertas combinaciones génicas pueden ser diseñadas para, o su utilización puede dar lugar de otro modo a, alcanzar efectos sinérgicos sobre la estimulación celular y el desarrollo óseo, teniendo la intención cualquiera y la totalidad de tales combinaciones de incluirse dentro del ámbito de la presente invención. Verdaderamente, se han descrito muchos efectos sinérgicos en la literatura científica, de modo que un experto en la materia podría identificar probables combinaciones génicas sinérgicas, o incluso, combinaciones gen-proteína.
Se entenderá también que, si se desea, el segmento de ácido nucleico o gen podría administrarse en combinación con otros agentes, como por ejemplo, proteínas o polipéptidos o varios agentes farmacéuticamente activos. Siempre que el material genético forme parte de la composición, no existe virtualmente límite para otros componentes que pueden también incluirse, dado que los agentes adicionales no causan un efecto adverso significativo en el contacto con las células o tejidos diana. Los ácidos nucleicos pueden de este modo administrarse junto con otros varios agentes, por ejemplo, en ciertas formas de realización se puede desear administrar un factor angiogénico y/o un inhibidor de la resorción ósea, tal como se da a conocer en los documentos de patente U.S. 5.270.300 y 5.118.667, respectivamente, cada uno de los cuales se incorpora a la presente memoria como referencia.
3. Construcciones génicas y segmentos de ADN
Tal como se utiliza en la presente memoria, el término "gen" y "segmento de ADN" se utilizan ambos para referirse a una molécula de ADN que se ha aislado libre de ADN genómico total de una especie particular. Por tanto, un gen o segmento de ADN que codifique un gen osteotrópico se refiere a un segmento de ADN que contiene secuencias que codifican una proteína osteotrópica, pero se aísla fuera ó se purifica libre del ADN genómico total de la especie de la cual se obtiene el ADN. Incluido en el término "segmento de ADN", se encuentran segmentos de ADN y fragmentos más pequeños de dichos segmentos, y también vectores recombinantes, que incluyen, por ejemplo, plásmidos, cósmidos, fagos, retrovirus, adenovirus, y análogos.
El término "gen" se utiliza por simplicidad para referirse a una unidad codificante peptídica o de una proteína funcional. Como se entenderá por los expertos en la materia, este término funcional incluye tanto secuencias genómicas como secuencias cADN. "Aislado sustancialmente fuera de otras secuencias codificantes" significa que el gen de interés, en este caso un gen osteotrópico, forma la parte significativa de la región codificante del segmento de ADN, y que el segmento de ADN no contiene partes grandes de ADN codificante que se encuentra naturalmente, tales como fragmentos cromosómicos grandes u otros genes funcionales o regiones codificantes cADN. Por supuesto que esto se refiere al segmento de ADN tal como se aisló originalmente, y no excluye genes o regiones codificantes, tales como secuencias que codifican péptidos conductores o secuencias diana, añadidas más tarde al segmento por el hombre.
La presente invención proporciona nuevas maneras de utilizar varios segmentos osteotrópicos conocidos de ADN y vectores recombinantes. Tal como se ha descrito anteriormente, muchos de dichos vectores están fácilmente disponibles, describiéndose en el documento de patente U.S. 5.168.050, que se incorpora a la presente memoria como referencia, un ejemplo detallado particular de un vector apropiado para la expresión en las células de un mamífero. Sin embargo, no es necesario que se utilice un vector muy purificado, siempre que el segmento codificante que se utilice codifique una proteína osteotrópica y no incluya secuencias codificantes o reguladoras que tengan un efecto adverso significativo sobre las células progenitoras óseas. Por tanto, se entenderá también que las secuencias ácido nucleicas útiles pueden incluir residuos adicionales, tales como secuencias no codificantes adicionales que flanqueen las porciones 5' ó 3' de la región codificante o pueden incluir varias secuencias internas, es decir., intrones, que se sabe se encuentran en el interior de los genes.
Después de identificar un gen osteotrópico o molécula de ADN apropiados, puede insertarse en cualquiera de los muchos vectores que se conocen habitualmente en la técnica, de forma que dirija la expresión y producción de la proteína osteotrópica cuando se incorpore a una célula progenitora ósea. En un vector recombinante de expresión, la porción codificante del segmento de ADN se sitúa por debajo del control de un promotor. Este puede estar en forma del promotor que se asocia naturalmente con un gen osteotrópico, como puede obtenerse aislando las secuencias no codificadoras del extremo 5' que se localizan por encima del segmento codificante o exón, por ejemplo, utilizando clonación recombinante y/o tecnología PCR™, en conexión con las composiciones que se dan aquí a conocer.
En otras formas de realización, se contempla que se obtendrán ciertas ventajas situando el segmento codificante de ADN bajo el control de un promotor recombinante u heterólogo. Tal como se utiliza en la presente memoria, un promotor recombinante o heterólogo tiene el propósito de referirse a un promotor que no se asocia normalmente con un gen osteotrópico en su entorno natural. Dichos promotores pueden incluir los asociados normalmente con otros genes osteotrópicos, y/o promotores aislados de otras células bacterianas, virales, eucariotas o de mamífero. Naturalmente, será importante utilizar un promotor que dirija efectivamente la expresión del segmento de ADN en las células progenitoras óseas.
La utilización de promotores recombinantes para obtener la expresión proteica es generalmente conocida por los expertos en biología molecular, véase por ejemplo Sambrook et al., (1989). Los promotores utilizados pueden ser constitutivos o inducibles, y pueden utilizarse bajo las condiciones apropiadas para dirigir un alto nivel de expresión, o la expresión regulada del segmento de ADN introducido. Los promotores habitualmente empleados son aquellos tales como CMV, RSV LTR, el promotor SV40 solo, y el promotor SV40 en combinación con diversos elementos de potenciación.
Los genes osteotrópicos y los segmentos de ADN pueden también estar en forma de una inserción de ADN que se localiza en el interior del genoma de un virus recombinante, tal como por ejemplo un adenovirus recombinante, virus adeno-asociado (AAV) o retrovirus. En dichas formas de realización, para poner el gen en contacto con una célula progenitora ósea, se prepararán las partículas víricas recombinantes, cuyo genoma incluye la inserción del gen osteotrópico, poniendo simplemente en contacto las células progenitoras o tejidos con el virus, por lo que el virus infecta las células y transfiere el material genético.
En ciertas formas de realización preferidas, se impregnaría una matriz o material de implante con virus por inmersión del material en una solución madre de virus recombinante, por ejemplo, durante 1 a 2 horas, y después se pondrían en contacto las células o tejidos progenitores óseos con la matriz impregnada resultante. A continuación las células penetran, o entran, en la matriz, poniéndose de este modo en contacto con el virus y permitiendo la infección viral, lo cual da lugar a que las células absorban el gen o cADN deseado y que expresan la proteína codificada.
En otras formas preferidas de realización, se formaría una mezcla matriz-ácido nucleico, utilizando ADN desnudo ó un plásmido o un vector vírico, y se pondrían en contacto las células o tejidos progenitores óseos con la matriz mezclada resultante. La matriz puede entonces introducir al ácido nucleico en las células tras disociación en la superficie celular, o en el entorno celular inmediato. Igualmente, la mezcla de la matriz ella misma, especialmente una partícula o mezcla fibra-ADN, puede entonces ser absorbida por las células para proporcionar la subsiguiente liberación intracelular del material genético. La matriz puede entonces expulsarse de la célula, catabolizarse por ésta, o incluso, almacenarse dentro de ella. El mecanismo molecular por el cual una matriz óseo-compatible alcanza la transferencia del ADN a una célula es indiferente para la práctica de la presente invención.
4. Matrices óseo-compatibles
En ciertas formas preferidas de realización, los procedimientos de la invención se aplicaron a la preparación de una composición en la que el gen osteotrópico, genes, segmentos de ADN o células que ya incorporan dichos genes o segmentos, se asocia con, se impregna en el interior de, o incluso se acopla a, una matriz óseo compatible según la reivindicación 1, para formar una "composición matriz-gen", poniendo ésta entonces en contacto con las células o tejido progenitor óseo. La matriz puede entonces impregnarse con un segmento de ADN génico simplemente mediante inmersión de la matriz en una solución que contiene el ADN, tal como una solución plasmídica, durante un corto período de tiempo desde 5 minutos aproximadamente, hasta dos semanas.
Las composiciones matriz-gen son todas aquéllas en las que el material genético se adsorbe, absorbe, impregna, se conjuga con, o se mantiene en contacto generalmente de otro modo con la matriz. "Se mantiene en contacto con la matriz" significa que una cantidad efectiva de la composición del ácido nucleico debe permanecer funcionalmente asociada con la matriz hasta su transferencia a la célula progenitora ósea ó su liberación en el sitio del tejido óseo.
El tipo de matriz que puede utilizarse en las composiciones, dispositivos y procedimientos de la invención es una "matriz óseo-compatible". Esto significa que la matriz posee todas las características que se asocian habitualmente con ser "biocompatible", en que está en una forma que no produce una reacción significativa alérgica o adversa, u otra reacción inconveniente cuando se administra a un animal, y que es también apropiada para ponerla en contacto con el tejido óseo. Un efecto adverso "significativo" es uno que sobrepasa los efectos secundarios que son aceptados normalmente con cualquier terapia dada.
La expresión "óseo-compatible", tal como se utiliza en la presente memoria, significa que la matriz (y el gen) no produce una reacción adversa o inconveniente significativa cuando se pone en contacto con el hueso. En ciertas formas de realización, cuando se elige utilizar una particular matriz óseo-compatible, se pueden, opcionalmente, tomar en consideración varios otros factores, por ejemplo, la capacidad de la matriz de proporcionar una estructura para el hueso que se está desarrollando, la capacidad para su resorción en el organismo después de que el hueso se haya reparado, y factores de esta índole. Sin embargo, estas propiedades no son necesarias para poner en práctica la invención y constituyen solamente ejemplos de los factores que pueden considerarse.
En otras formas de realización, se puede considerar también la posibilidad de que la matriz sea transportada al interior de la célula, por ejemplo, mediante transporte membranario activo ó pasivo. Cuando se contempla tal transporte y la subsiguiente liberación del ácido nucleico, pueden evaluarse otras propiedades de la matriz y del gen para optimizar la formulación matriz-gen. Por ejemplo, los vectores de adenovirus pueden proporcionar una liberación ventajosa del ADN en dichas formas de realización. En éstas, se preferirían también probablemente las matrices que se metabolizan fácilmente en el citoplasma. Las matrices que se liberan más tarde a partir de la célula, y preferentemente, se eliminan también a partir del área de tejido circundante, serían otra forma preferida de matriz para utilizar en dichas formas de realización.
La selección de material de la matriz diferirá según las circunstancias particulares y el sitio del hueso que se va a tratar. Pueden emplearse matrices tales como las que se describen en el documento de Patente U.S. 5.270.300 (que se incorpora a la presente memoria como referencia). Las características físicas y químicas, tales como, por ejemplo, biocompatibilidad, biodegradabilidad, intensidad, rigidez, propiedades interfásicas, incluso la apariencia cosmética, pueden considerarse al escoger una matriz, como es bien conocido para los expertos en la materia. Las matrices apropiadas liberarán la composición génica y en ciertas circunstancias, pueden incorporarse al interior de una célula, o pueden proporcionar una superficie para un nuevo desarrollo óseo, es decir, pueden actuar como un andamio in situ a través del cual pueden emigrar las células progenitoras.
Un aspecto particularmente importante de la presente invención es su utilización en conexión con injertos ortopédicos e interfases y articulaciones artificiales, que incluyen los injertos mismos y las partes funcionales de un injerto, tal como por ejemplo, tornillos quirúrgicos, clavos y análogos. En formas de organización preferidas, se contempla que la superficie o superficies metálicas de un injerto o una de sus partes, tal como una superficie de titanio, se tapizará con una material que posee afinidad para los ácidos nucleicos, más preferentemente, con hidroxilapatito y entonces el metal revestido se tapizará ulteriormente con el gen o el ácido nucleico que se desea transferir. Los grupos químicos disponibles del material de absorción, tal como el hidroxilapatito, pueden ser manipulados fácilmente para controlar su afinidad para los ácidos nucleicos, como es conocido por los expertos en la materia.
En ciertas formas de realización, pueden utilizarse matrices no biodegradables, tales como hidroxilapatito sinterizado, aluminatos, otros materiales biocerámicos y materiales metálicos, tales como titanio. Un sistema cerámico apropiado es el que se describe en el documento de patente U.S 4.596.574, que se incorpora a la presente memoria como referencia. Pueden utilizarse también matrices poliméricas, que incluyen polímeros de éster acrílico, polímeros de ácido láctico, y copolímeros en bloque de ácido poliláctico poliglicólico (PLGA), que se han descrito (documentos de Patente U.S. 4.526.909, 4.563.489, Simons et al., 1992, y Langer y Folkman, 1976, respectivamente, que se incorporan cada uno de ellos a la presente memoria como referencia).
En ciertas formas de realización, se contempla que una matriz biodegradable será probablemente la más útil. Una matriz biodegradable se define generalmente como una que es capaz de experimentar resorción en el organismo. Matrices potenciales biodegradables para utilizarlas en conexión con las composiciones, dispositivos y procedimientos de la presente invención incluyen, por ejemplo, sulfato cálcico biodegradable y químicamente definido, tricalciofosfato, hidroxilapatito, copolímeros en bloque de PLGA, polianhídridos, matrices de proteínas purificadas, y composiciones matriciales extracelulares semipurificadas.
Un grupo preferido de matrices son matrices colagenosas, que incluyen las obtenidas a partir del colágeno tendinoso o dérmico, por ejemplo, el colágeno de tipo I, que se prepara generalmente a partir de la dermis; las obtenidas a partir de cartílago, tales como el colágeno de tipo II; y otros varios tipos de colágeno. Los colágenos pueden obtenerse a partir de diversas fuentes comerciales; por ejemplo, Sigma que proporciona el colágeno de tipo II obtenido de las tráqueas bovinas; y la Collagen Corporation. Las matrices de colágeno pueden también prepararse tal como se describe en los documentos de Patente U.S. 4.394.370 y 4.975.527, cada una de las cuales se incorpora a la presente memoria como referencia.
Los diversos materiales de colágeno pueden también estar en forma de colágeno mineralizado. Un material colágeno mineralizado preferido es el denominado UltraFiber™, obtenible de Norian Corp (Mountain View, CA). El documento de Patente U.S: 5.231.169, que se incorpora a la presente memoria como referencia, describe la preparación de colágeno mineralizado a través de la formación de mineral de fosfato cálcico bajo agitación suave in situ en presencia de fibrillas de colágeno dispersadas. Dicha formulación puede utilizarse en el contexto de la liberación de un segmento de ácido nucleico en un sitio del tejido óseo.
Algunos otros materiales colágenos preferidos son los que se basan en el colágeno de tipo II. Se ha descubierto que las preparaciones de colágeno de tipo II tienen la sorprendente y ventajosa propiedad de estimular las células progenitoras óseas en ausencia de cualquier gen osteotrópico. Anteriormente a la presente invención, se pensaba que el colágeno de tipo II tenía sólo un papel estructural en la matriz extracelular cartilaginosa y el presente hallazgo de que el colágeno de tipo II es actualmente un material osteoconductor/osteoinductor, es inesperado. La presente invención contempla así la utilización de una variedad de las preparaciones de colágeno de tipo II como matrices de transferencia génica o estimulantes celulares óseos, con o sin segmentos de ADN, que incluyen el colágeno original de tipo II, preparado a partir del cartílago, y el colágeno de tipo II recombinante.
Los copolímeros en bloque de PLGA pueden también utilizarse como matrices de transferencia génica. Se ha demostrado que dichos polímeros incorporan ADN fácilmente, están disponibles comercialmente, no son tóxicos, e hidrolizan en proporciones definidas (esto es, facilitan la liberación sostenida de agentes farmacéuticos). Los copolímeros en bloque PLGA poseen dos propiedades particulares ventajosas: en primer lugar, presentan gelificación térmica reversible, y en segundo lugar, pueden combinarse con otros agentes para permitir la visualización radiográfica.
5. Formas de realización de la transferencia de ácidos nucleicos
Una vez que se ha preparado u obtenido una composición matriz-gen apropiada, todo lo que se requiere para liberar el gen osteotrópico en las células progenitoras óseas en el interior de un animal, es poner la composición matriz-gen en contacto con el sitio en el organismo en el cual se desea promover al crecimiento óseo. Esto puede alcanzarse situando físicamente la composición matriz-gen en contacto con el sitio del organismo, o aplicando una forma farmacéutica inyectable de la composición matriz-gen en el área apropiada.
La composición matriz-gen puede aplicarse en el lugar de una fractura sencilla del hueso que se desee reparar, un área de hueso débil, tal como en un paciente con osteoporosis, o en una cavidad ósea que se desee rellenar con nuevo tejido óseo. Las cavidades óseas pueden producirse como resultado de una alteración heredada, defecto de nacimiento, o pueden provenir de cirugía dental o periodontal o después de la eliminación de un ósteosarcoma.
La utilización como matrices de compuestos PLGA y análogos permite que la composición matriz-ADN sea susceptible de aplicarse mediante jeringuilla, lo cual se alcanza, generalmente, mezclando la composición matriz-gen con un agente plurónico. La composición resultante matriz-gen/agente plurónico puede conservarse en el interior de una jeringuilla con camisa térmica, mantenida a una temperatura de alrededor de 4ºC, inmediatamente antes de administrarla
al organismo. A esta temperatura y con este entorno, la composición será líquida. Después de la inserción en el organismo, la composición se equilibrará respecto a la temperatura corporal, y al hacerlo, formará una matriz gelatinosa.
El fenómeno anterior se denomina "gelificación térmica reversible" y permite que se alcance una proporción controlada de gelificación. La manera de utilizar agentes plurónicos en este contexto se conocerá por los expertos en la materia a la luz de la presente exposición. Las composiciones matriz-gen/agente plurónico pueden también mezclarse, o asociarse generalmente con un agente de formación de imágenes, de forma que la presente tecnología de transferencia génica pueda utilizarse en distintas modalidades de formación de imágenes. En estos casos, el médico o veterinario asistente, deberán ser capaces de controlar la liberación y posicionado de la composición matriz-gen. Están disponibles muchos agentes seguros y efectivos de formación de imágenes, tales como el compuesto radiográfico fosfato cálcico, que pueden utilizarse a la vez que la fluoroscopía, o incluso con la tomografía, para formar la imagen del organismo o del lugar tisular mientras la composición se está liberando.
Allí donde debe proporcionarse una imagen del sitio tisular, se deseará utilizar un agente formador de imagen detectable, tal como un agente radiográfico, o también, un agente paramagnético o radioactivo. Muchos agentes de diagnóstico radiográfico se conocen en la técnica por ser útiles para la formación de imágenes, incluyendo, por ejemplo, al fosfato cálcico.
En el caso de iones paramagnéticos, los ejemplos incluyen el cromo (III), manganeso (II), hierro (III), hierro (II), cobalto (II), níquel (II), cobre (II), neodimio (III), samario (III), iterbio (III), gadolinio (III), vanadio (II), terbio (III), disprosio (III), holmio (III) y erbio (III), siendo generalmente preferido el gadolinio. Iones útiles en otros contextos, tales como la formación de imágenes mediante los rayos X, incluyen pero no se limitan a lantano (III), oro (III), plomo (II) y especialmente, el bismuto (III).
Aunque no son generalmente preferidos, no se excluyen los isótopos radioactivos y pueden utilizarse para la formación de imágenes, si se desea. Iones apropiados incluyen el yodo^{131}, yodo^{123}, tecnecio^{99m}, indio^{111}, renio^{188}, renio^{186}, galio^{67}, cobre^{67}, itrio^{90}, yodo^{125} y astato^{211}.
La cantidad de construcción génica que se aplica a la matriz y la cantidad de material matriz-gen que se aplica al tejido óseo se determinará por el médico o veterinario asistente considerando varios factores médicos y biológicos. Por ejemplo, se desearía considerar el gen osteotrópico particular y la matriz, la cantidad de peso óseo que se desee formar, el sitio del daño óseo, el estado del hueso dañado, la edad, sexo y dieta del paciente o del animal, la gravedad de cualquier infección, el tiempo de administración y cualquier factor clínico posterior que pueda afectar al crecimiento del hueso, tal como los niveles séricos de varios factores y hormonas. El régimen de dosificación apropiado será por tanto fácilmente determinable por cualquier experto en la materia a la luz de la presente exposición, teniendo en cuenta las circunstancias individuales.
Al tratar a los animales y al hombre, puede controlarse el progreso mediante evaluación periódica del crecimiento y/o reparación ósea, por ejemplo, utilizando rayos X. Los procedimientos terapéuticos y composiciones de la invención se contemplan para utilizarlos en aplicaciones médicas y veterinarias, debido a la falta de especificidad de la especie en los factores inductores óseos. En particular, se contempla que los animales domésticos, de granja y del zoológico, así como los caballos de pura raza, serían tratables utilizando los protocolos de transferencia de ácidos nucleicos que se dan a conocer aquí.
Los procedimientos y composiciones actuales pueden tener también utilizaciones profilácticas en la reducción de fracturas abiertas y cerradas y también en la fijación mejorada de articulaciones artificiales. La invención se aplica para estimular la reparación ósea en defectos craneofaciales congénitos, inducidos por traumas o por resección oncológica, y también es útil en el tratamiento de enfermedades periodontales y en otros procedimientos de reparación dentaria y también en cirugía plástica cosmética. Las composiciones matriz-gen y dispositivos de la presente invención pueden utilizarse también en la cicatrización de las heridas y en la reparación de tejidos relacionados, que incluye, pero no se limita a, la cicatrización de quemaduras, incisiones y úlceras.
La presente invención abarca también composiciones basadas en el ADN para utilización en la transferencia celular con objeto de tratar defectos y alteraciones óseas. Las composiciones de la presente invención comprenden generalmente un gen osteotrópico asociado con una matriz óseo-compatible, tal como el colágeno de tipo II, en el que la composición es capaz de estimular el crecimiento óseo, la reparación o regeneración después de la administración a, o el injerto en, un sitio del tejido progenitor óseo de un animal. El gen o genes osteotrópicos puede ser cualquiera de los descritos anteriormente, siendo generalmente preferidos los genes TGF-\alpha (para tejidos esqueléticos blandos), TGF-\beta_{1}, TGF-\beta_{2}, TGF-\beta_{3}, PTH, BMP-2 y BMP-4. Del mismo modo, sin tener en cuenta la selección del gen, la matriz óseo-compatible puede ser cualquiera de las descritas anteriormente, con matrices biodegradables tal como el colágeno, y más particularmente, siendo preferido el colágeno de tipo II.
En todavía otras formas de realización ulteriores, la presente invención se refiere a dispositivos osteotrópicos, los cuales pueden considerarse generalmente como composiciones moldeadas o diseñadas por la matriz-gen. Los dispositivos de la presente invención comprenden naturalmente una matriz óseo-compatible en la cual un gen osteotrópico se asocia con la matriz. La combinación de genes y componentes de la matriz es tal que el dispositivo es capaz de estimular el crecimiento óseo o la cicatrización cuando se injerta en un animal. Los dispositivos pueden ser de virtualmente cualquier tamaño o forma, de modo que sus dimensiones se adapten para encajar en una fractura ósea o en el sitio de una cavidad ósea en el animal que va a tratarse, permitiendo que la articulación de la fractura y/o el recrecimiento óseo sean más uniformes. Otros dispositivos que se contemplan particularmente son los que se diseñan para actuar como una articulación artificial. Los dispositivos de titanio y los de titanio revestidos con hidroxilapatito se preferirán en ciertas formas de realización. Partes de dispositivos en combinación con un segmento de ácido nucleico osteotrópico, tal como un tornillo revestido con ADN para una articulación artificial, y análogos, quedan también dentro del alcance de la presente invención.
Kits terapéuticos que comprenden, en medios contenedores apropiados, una matriz óseo-compatible, tal como el colágeno de tipo II ó un copolímero en bloque PLGA, y un gen osteotrópico, constituyen otro aspecto de la invención. Dichos kits contendrán generalmente una formulación farmacéuticamente aceptable de la matriz y una formulación farmacéuticamente aceptable de un gen osteotrópico, tal como PTH, BMP, TGF-\beta, FGF, GMCSF, EGF, PDGF, IGF o un gen LIF. Los genes que se prefieren habitualmente incluyen PTH, TGF-\beta1, TGF-\beta2, TGF-\beta3, y BMP-4.
Los kits pueden comprenden un medio contenedor único que contiene tanto la matriz biocompatible como el gen osteotrópico. El medio contenedor puede, si se desea, contener una matriz inyectable estéril farmacéuticamente aceptable, teniendo asociada a ella la composición del gen osteotrópico, y, opcionalmente, un marcador detectable o agente formador de imágenes. La formulación matriz-ADN inyectable puede estar en forma de una composición gelatinosa, por ejemplo, una composición de colágeno de tipo II-ADN, o bien puede estar en una forma más fluida que da lugar sin embargo a una composición de tipo gel después de administración al organismo. En estos casos, el medio contenedor puede él mismo ser una jeringuilla, pipeta, u otro aparato similar, a partir del cual el material matriz-ADN puede aplicarse a un sitio del tejido óseo o del área herida. Sin embargo, el medio del contenedor único puede contener una mezcla seca o liofilizada, y de una composición de matriz y gen osteotrópico, la cual puede o no necesitar una prehumidificación antes de utilizarla.
Alternativamente, los kits de la invención pueden comprender distintos medios contenedores para cada componente. En dichos casos, un contenedor contendrá el gen osteotrópico, bien como una solución estéril de ADN o en forma liofilizada, y el otro contenedor incluirá la matriz, la cual puede o no a su vez estar prehumedecida con una solución estéril, o estar en forma gelatinosa, líquida u otra de tipo inyectable.
Los kits pueden también comprender un segundo o tercer medio contenedor para contener un tampón estéril farmacéuticamente aceptable, diluyente o solvente. Dicha solución puede requerirse para formular bien el componente de ADN, el componente de la matriz, ambos componentes separadamente, o una combinación premezclada de los componentes, en una forma más apropiada para aplicarla al organismo, por ejemplo, una forma más gelatinosa. Debe tenerse en cuenta, sin embargo, que todos los componentes de un kit deben ser suministrados en una forma seca (liofilizados), lo cual permitirá "humedecerlos" después de ponerlos en contacto con los fluidos corporales. Así, la presencia de cualquier tipo de tampón farmacéuticamente aceptable o solvente no es una necesidad para los kits de la invención. Los kits pueden también comprender un segundo o tercer medio contenedor para contener una composición o agente formador de imágenes detectable farmacéuticamente aceptable.
Los medios del contenedor serán generalmente un contenedor tal como un vial, tubo de ensayo, matraz, botella, jeringa u otros medios contenedores, en los que los componentes del kit pueden disponerse. La matriz y los componentes génicos pueden también distribuirse alícuotamente en contenedores más pequeños, si esto se desea. Los kits de la presente invención pueden también incluir un medio para contener los contenedores individuales en un acondicionamiento cerrado para la venta comercial, como por ejemplo, los contenedores de plástico moldeados por inyección o por soplado en los que los viales o jeringuillas deseados son retenidos.
Sin tener en cuenta el número de contenedores, los kits de la invención pueden también comprender, o estar empaquetados con, un instrumento para ayudar en la aplicación de la composición matriz-gen definida en el interior del organismo de un animal. Dicho instrumento puede ser una jeringuilla, pipeta, fórceps, o cualquier vehículo médico de liberación adecuado.
6. Colágeno de tipo II como un material ósteoconductor/inductor
La presente invención proporciona también procedimientos para estimular las células progenitoras óseas, pues puede aplicarse, en ciertas circunstancias, para promover la formación de hueso nuevo, o para estimular la cicatrización de las heridas. Como tal, las células progenitoras óseas que son las dianas de la invención, pueden también ser denominadas "células progenitoras óseas de cicatrización de heridas". Aunque la función de la cicatrización de las heridas en si misma puede no siempre requerirse para poner en práctica todos los aspectos de la invención, y aunque no se requiere un conocimiento mecánico para llevar a cabo la invención, se piensa generalmente que el procedimiento de cicatrización de heridas opera durante la ejecución de la presente invención.
Para estimular una célula progenitora ósea según estos aspectos de la invención, se pondrá en contacto generalmente una célula progenitora ósea con una composición que comprende una cantidad biológicamente efectiva del colágeno de tipo II. Aunque las preparaciones de hueso triturado y de colágeno mineralizado se han demostrado ósteoconductoras, esta propiedad no se había adscrito previamente al colágeno de tipo II. Los inventores han encontrado que el colágeno de tipo II solo es sorprendentemente efectivo para promover la formación de hueso nuevo, siendo capaz de unir un espacio de osteotomía de 5 mm en sólo ocho semanas en todos los animales ensayados (Fig. 5A, Fig. 5B, Fig. 6A, Fig. 6B, Fig. 6C, Fig. 6D, Fig. 7A, Fig. 7B, Fig. 8A, Fig. 8B, y Fig. 8C).
Las formas de colágeno de tipo II que pueden utilizarse en la presente invención son virtualmente ilimitadas. Por ejemplo, el colágeno de tipo II puede purificarse a partir del cartílago hialino de la tráquea bovina, o aislarse a partir de las articulaciones diartrósicas o de las placas de crecimiento. El colágeno de tipo II purificado está disponible comercialmente y puede obtenerse de, por ejemplo, Sigma Chemical Company, St. Louis, MO. Cualquier forma de colágeno de tipo II recombinante puede también utilizarse, pues puede obtenerse a partir de una célula huésped recombinante que exprese el colágeno de tipo II, incluyendo las células bacterianas, las levaduras, las células de mamífero, y de insectos. Un ejemplo particular de un sistema de expresión del colágeno recombinante de tipo II es una célula de levadura que incluye un vector de expresión que codifica el colágeno de tipo II, tal como se da conocer aquí en el Ejemplo VI.
El colágeno de tipo II utilizado en la presente invención, puede, si se desea, suplementarse con minerales adicionales, tales como calcio, por ejemplo, en forma de fosfato de calcio. Ambos, el colágeno de tipo II original y el recombinante pueden suplementarse con la mezcla de, la adsorción de, o la asociación con minerales adicionales de esta forma. Dichas preparaciones de colágeno de tipo II se distinguen claramente de los tipos de "colágeno mineralizado" que se han descrito previamente, por ejemplo, en el documento de Patente U.S: 5.231.169 que describe la preparación de fibrillas de colágeno total mineralizado.
Un objetivo de este aspecto de la presente invención es proporcionar una fuente de material osteoconductor matriz que pueda ser reproduciblemente preparado de forma sencilla y rentable y que pueda ser empleado, con un segmento génico osteotrópico, para estimular las células progenitores óseas. Se encontró sorprendentemente que el colágeno recombinante de tipo II cumplía estos criterios. La presente invención abarca también, aunque no es necesaria claramente para obtener resultados efectivos, la combinación de colágeno original o recombinante de tipo II con suplementos minerales, como el calcio.
Una cantidad biológicamente efectiva del colágeno de tipo II es una cantidad de colágeno de tipo II que funciona para estimular una célula progenitora ósea, tal como se ha descrito en la presente memoria. Como ejemplo, una medición de una cantidad biológicamente efectiva es una cantidad efectiva para estimular las células progenitoras óseas hasta que se evidencia la formación de nuevo hueso. A este respecto, los inventores han demostrado que 10 mg de colágeno liofilizado funcionan efectivamente para cerrar un espacio de osteotomía de 5 mm en tres semanas. Esta información puede utilizarse por los expertos en la materia para optimizar la cantidad de colágeno de tipo II que se necesita para cualquier situación dada.
Dependiendo de los casos individuales, el experto será capaz, a la luz de esta exposición, de calcular fácilmente una cantidad apropiada, o dosis, del colágeno de tipo II para estimular las células óseas y promover el crecimiento óseo. En términos de pequeños animales o de individuos humanos, cantidades efectivas apropiadas de colágeno incluyen entre aproximadamente 1 mg y aproximadamente 500 mg, y preferentemente, entre 1 mg y 100 mg aproximadamente, de colágeno liofilizado de tipo II por lugar de tejido óseo. Por supuesto que es probable que existirán variaciones debidas a, por ejemplo, respuestas individuales, condiciones particulares del tejido, y la velocidad con la cual se requiera la formación ósea. Mientras que 10 mg demostraron ser útiles en el ejemplo ilustrativo, los inventores contemplan que 1,5,10,15, 20, 30, 40, 50, 75, 100, 125, 150, 200, 300 mg y análogos, pueden ser utilizados útilmente para los pacientes humanos y los animales pequeños. Por supuesto, cualquiera de los valores de entre los contemplados puede ser útil en cualquier caso particular.
Naturalmente, una de las principales variables que se ha de considerar es la cantidad de nuevo hueso que necesita ser generado en un área particular o cavidad ósea. Esto puede ser en gran parte una función del tamaño del animal que va a ser tratado, por ejemplo, un gato o un caballo. Por tanto, no existe habitualmente un límite superior en la cantidad de colágeno de tipo II ó verdaderamente en la cantidad de cualquier composición de matriz-gen que puede ser empleada en los métodos de la presente invención, dándose una supervisión cuidadosa por el médico.
Al poner en contacto o aplicar el colágeno de tipo II, con un segmento de ADN, a células progenitoras óseas localizadas en el interior de un sitio hístico progenitor óseo de un animal, el crecimiento del hueso será estimulado. Así, los sitios de la cavidad ósea y las fracturas óseas pueden ser rellenados y reparados.
Se prefiere la utilización del colágeno de tipo II en combinación con un segmento de ácido nucleico que codifica un polipéptido o proteína que estimula las células progenitoras óseas cuando se expresa en dichas células, tal como se ha descrito anteriormente. Los segmentos de ácido nucleico que comprenden un gen PTH aislado, un gen BMP, un gen del factor de crecimiento, un gen receptor del factor de crecimiento, un gen citoquínico o un gen del factor quimiotáctico, son los preferidos, siendo los genes PTH, TGF-\beta y BMP los más preferidos. Los genes funcionan subsiguientemente a su transferencia a, y a su expresión en, las células progenitoras del animal tratado, promoviendo de este modo el crecimiento óseo.
Aunque el colágeno de tipo II es efectivo solo, su utilización combinada con un segmento génico osteotrópico puede probar que posee efectos sinérgicos y particularmente ventajosos. El colágeno de tipo II, original o recombinante, puede así también formularse en un kit terapéutico con un segmento génico osteotrópico, de acuerdo con los kits descritos anteriormente en la presente memoria. Esto incluye la utilización de medios contenedores múltiples o sencillos, y la combinación con cualquier vehículo de liberación aprobado médicamente, que incluye, pero no se limita a jeringuillas, pipetas, fórceps, diluyentes adicionales y análogos.
Breve descripción de los dibujos
Los dibujos forman parte de la presente memoria y se incluyen para demostrar ulteriormente ciertos aspectos de la presente invención. La presente invención puede comprenderse mejor refiriéndola a uno o más de estos dibujos en combinación con la descripción detallada de formas de realización específicas que aquí se presentan.
La Fig. 1. representa un modelo de terapia de ADN para la reparación ósea.
La Fig. 2A. representa un modelo esquemático de las bases celular y molecular del mecanismo directo de transferencia de ADN a células osteogénicas in vivo. Se representa el procedimiento de crear osteotomía y de situar la matriz activada génicamente in situ.
La Fig. 2B. representa un modelo esquemático de las bases celular y molecular del mecanismo directo de transferencia de ADN a células osteogénicas in vivo. Se representa el procedimiento de fractura de las células de reparación allí donde los vasos sanguíneos crecen en la matriz activada génicamente (Fig. 2A).
La Fig. 2C. representa un modelo esquemático de las bases celular y molecular del mecanismo directo de transferencia de ADN a células osteogénicas in vivo. Se muestran células fracturadas que incorporan ADN como un elemento episómico, es decir, transferencia directa del gen in vivo.
La Fig. 2D. representa un modelo esquemático de las bases celular y molecular del mecanismo directo de transferencia de ADN a células osteogénicas in vivo. Se representan células de reparación fracturadas que sintetizan y secretan proteínas recombinantes codificadas por el ADN episómico.
La Fig. 2E. representa un modelo esquemático de las bases celular y molecular del mecanismo directo de transferencia de ADN a células osteogénicas in vivo. Se representa la formación del nuevo hueso resultante.
La Fig. 3A. representa la transferencia génica del tendón de Aquiles se representa como visión general del curso del tiempo a las 3 semanas postquirúrgicas.
La Fig. 3B. representa la transferencia génica del tendón de Aquiles se representa como visión general del curso del tiempo a las 9 semanas postquirúrgicas.
La Fig. 3C. representa la transferencia génica del tendón de Aquiles se representa como visión general del curso del tiempo a las 12 semanas postquirúrgicas.
La Fig. 3D. representa la transferencia génica del tendón de Aquiles se representa como un estudio inmunohistoquímico en el curso del tiempo. Se representa la microscopía del tejido del tendón que recibió el injerto SIS impregnado con el ADN plasmídico de expresión. Nótese la tinción citoplásmica positiva de las células fibroblásticas 9 semanas después de cirugía.
La Fig. 3E. representa la transferencia génica del tendón de Aquiles se representa como un estudio inmunohistoquímico en el curso del tiempo. Se representa la microscopía del tejido del tendón que recibió el injerto SIS solo, sin ADN. Nótese la ausencia relativa de tinción citoplásmica.
La Fig. 4. Representa el control de la transferencia génica del ligamento cruzado utilizando un ensayo de utilización del substrato. Tres semanas después de la implantación del SIS empapado en una solución del plasmido de expresión pSV40\beta-gal, se recogió el tejido del tendón, se fijó brevemente en glutaraldehído al 0,5%, y se incubó entonces con X-gal según los métodos publicados. Los tejidos se embebieron entonces en parafina y se seccionaron y tiñeron con H y E. Nótese la tinción positiva (flechas) en el citoplasma de los fibroblastos de los tejidos de granulación.
La Fig. 5A. representa Transferencia directa del ADN al hueso que se está regenerando: actividad \beta-gal. La figura compara la actividad de la \beta-galactosidasa en homogenados del tejido de la hendidura osteotómica de dos ratas Sprague-Dawley. En el animal #1, el material de injerto UltraFiber™ se embebió en una solución de pSV4o\beta-gal ADN (Promega) que codifica la \beta-galactosidasa bacteriana. En el animal #2, el material del injerto se embebió en una solución pura de Vector ADN- Promotor pGL2 (Promega) que codifica la luciferasa de los insectos. La actividad enzimática se determinó utilizando kits de ensayo de substrato (\beta-galactosidase and Luciferase Assay Systems, Promega). Nótese que la actividad significativa de la \beta-galactosidasa se encontró sólo en el homogenado preparado del animal #1.
La Fig. 5B. representa la transferencia directa del ADN en el hueso que se está regenerando:actividad de la luciferasa. La figura compara la actividad de la luciferasa en partes alícuotas de los homogenados que se describen en la Fig. 5A. La actividad de la luciferasa se determinó utilizando los reactivos comerciales y protocolos (Promega) descritos en la Fig. 5A. Nótese que la actividad significativa de luciferasa se encuentra sólo en el homogenado preparado a partir del animal #2.
La Fig. 6A. representa la transferencia génica osteotómica controlada por estudios PTH. En este estudio, un plásmido de expresión que codifica un fragmento peptídido funcional de 34 aminoácidos de la hormona paratiroidea humana (PTH1-34) se transfirió y se expresó in vivo utilizando la tecnología GAM. El progreso de la nueva formación ósea en la hendidura se controló radiográficamente durante tres semanas y los animales se sacrificaron. Se representa una radiografía de la hendidura osteotómica del animal que recibió la construcción con sentido hPTH1-34 GAM. Nótese la presencia de tejido radiodenso en la hendidura (flecha).
La Fig. 6B. representa la transferencia génica osteotómica (Fig. 6A) controlada por estudios PTH. Se representa una radiografía de la hendidura osteotómica del animal de control que recibió un constructo antisentido hPTH1-34 GAM. No existió evidencia de tejido radiodenso en la hendidura.
La Fig. 6C. representa la transferencia génica osteotómica (Fig. 6A) controlada por estudios PTH. Se representa una sección histológica del tejido de reparación osteotómico de idéntico animal control que en la Fig. 6 B. La sección se caracteriza por la presencia de fibroblastos de tejido de granulación y capilares.
La Fig. 6D. representa la transferencia génica osteotómica (Fig. 6A) controlada por estudios PTH. Se representa una sección histológica del tejido de reparación osteotómico del mismo animal que recibió la construcción con sentido hPTH1-34 GAM (como en la Fig. 6A). La sección se caracteriza por la presencia de placas óseas trabeculares que se extienden en la hendidura a partir del margen quirúrgico.
La Fig. 7A. representa unos estudios de transferencia génica osteotómica con BMP-4. Se representa la evidencia inmunohistoquímica de la expresión transgénica de BMP-4 por fibroblastos del tejido de granulación cercanos al centro de una hendidura de osteotomía tres semanas después de la cirugía. Nótese la tinción positiva (flechas) de las células axiales. El transgen BMP-4 incluía un epítopo tag (epitopo HA, Pharmacia) que facilitó la identificación de las moléculas transgénicas BMP-4. La tinción tisular se realizó utilizando anticuerpos anti-HA policlonales disponibles comercialmente y procedimientos estándar. La inmunotinción se localizó sólo en los tejidos de la hendidura. Las secciones de control incluían secciones seriadas teñidas con suero preinmune de conejo y secciones hísticas de 13 hendiduras de osteotomía de control. En ambos casos, todos los controles fueron negativos para la tinción por peroxidasa de los fibroblastos hísticos de granulación.
La Fig. 7B. representa los estudios de transferencia génica osteotómica con BMP-4. Se representa la histología del hueso nuevamente formado tan pronto como tres semanas después de la transferencia génica (Fig. 7A).
La Fig. 8A. representa la evidencia radiográfica de la formación de un nuevo empalme óseo (flechas) como consecuencia de la transferencia del gen BMP-4 y expresión a las seis semanas después de la cirugía. 9 y 16 semanas después de cirugía, se presentan en la Fig. 8B y Fig. 8C, respectivamente, para demostrar el crecimiento anterior del hueso nuevo in situ a lo largo del tiempo. Este animal, que se ha mantenido durante 23 semanas, se ha estado desplazando normalmente sin un fijador externo durante las 7 últimas semanas. Se han obtenido resultados similares en un segundo animal a largo plazo (de dos) que se encuentra ahora en la 17ª semana después de la operación.
La Fig. 8B. representa la evidencia radiográfica de la formación de un nuevo empalme óseo (flechas) como consecuencia de la transferencia del gen BMP-4 y de su expresión, nueve semanas después de la cirugía (véase la Fig. 8A).
La Fig. 8C. representa la evidencia radiográfica de la formación de un nuevo empalme óseo (flechas) como consecuencia de la transferencia del gen BMP-4 y de su expresión, a la 16ª semana después de la cirugía (véase la Fig. 8A).
La Fig. 9A. representa el animal que se muestra representa el grupo de control que recibió una osteotomía más una esponja de colágeno sin ADN de ningún tipo. El animal se mantuvo durante 9 semanas después de la cirugía y entonces se sacrificó. Se controló radiográfica e histológicamente el progreso de la formación del nuevo hueso en la hendidura. Se representa una radiografía de la hendidura osteotómica a las 9 semanas. Nótese la ausencia de tejido radiodenso en la hendidura.
La Fig. 9B. representa un corte histológico del tejido de la hendidura osteotómica del animal de control utilizado en la Fig. 9A. El corte se caracteriza por la presencia de fibroblastos y capilares del tejido de granulación.
La Fig. 10. Representa una construcción PLJ-HPTH1-34 de expresión. Un fragmento de cADN que codifica un péptido prepro-hPTH1-34 se generó mediante PCR™ (Hendy et al., 1981) ligándose entonces en un sitio de clonación BamHI (Wilson et al., 1992). Se aislaron y caracterizaron varios clones independientes con la inserción en la orientación de codificación.
La Fig. 11. representa el análisis Southern de integración retrovírica en el clon YZ-15. 10 mg de ADN genómico YZ-15 se digirieron con KpnI (para el cual existe un sitio único en el vector LTR) y se analizaron mediante transferencia Southern. Un fragmento de cADN que codificaba prepro-hPTH1-34 se utilizó como sonda. El control positivo para las condiciones de hibridación Southern fue un digesto KpnI del ADN genómico de células Rata -1 infectadas y seleccionadas con el retrovirus recombinante PLJ-hPTH1-84 incompleto en réplica (Wilson et al., 1992). Los digestos KpnI de ADN se prepararon también a partir de dos controles negativos: células Rata-1 originales y células Rata-1 infectadas y seleccionadas con BAG ("células BAG"), (Wilson et al., 1992), un retrovirus recombinante incompleto en réplica que codifica la \beta-galactosidasa, el cual es un gen marcador irrelevante en estos estudios. Las asignaciones de carril fueron como sigue: 1, células PLJ-hPTH1-84; 2, células BAG; 3, YZ-15; 4, células originales Rata-1. Los tamaños del ADN (kb) se representan a la izquierda de la figura. Tal como se esperaba, un fragmento del tamaño predicho (por ejemplo., 4,3 kb) se ve sólo en el carril 1 (control positivo) y en el carril 3 (YZ-15 ADN).
La Fig. 12. representa el análisis de transferencia Northern de un clon Rata-1 transducido. Se preparó poly-A (^{+})ARN a partir del clon YZ-15 y se analizó mediante transferencia Northern tal como se describe (Chen et al., 1993). La Fig. 12 contiene dos cuadros en una hoja única. Poly-A (^{+})ARN preparado a partir de células PLJ-hPTH1-84, células BAG, y células Rata-1 originales se utilizaron como controles positivo y negativo. Se aplicaron cuatro sondas a un borrón único siguiendo la secuencia: hPTH1-34, \beta-gal, Neo, y \beta-actina. Las asignaciones de carriles fueron como sigue: células PLJ-hPTH1-84; 2, células BAG; 3, células YZ-15; 4, células originales Rata-1. Tal como se esperaba, el transcrito hPTH1-34 se ve solamente en el carril 1 (control positivo) y en los carriles 3-4; un transcrito Neo se ve sólo en los carriles 1-3; un transcrito \beta-gal se ve solamente en el carril 2; y los transcritos \beta-actina se ven en carriles 1-4.
La Fig. 13. representa el análisis Northern de poly-A(^{+}) ARN que demuestra la expresión del receptor PTH/PTHrP en el tejido de reparación osteotómico.
La Fig. 14. Representa los Clones cADN murinos que se solapan y que representan la secuencia tipo LTBP (LTBP-3). Se muestra una representación parcial de los sitios de restricción. N, NcoI; P, PvuII; R, RsaII; B, BamHI; H, HindIII. El sistema de numeración en el fondo asume que la "A" del codon de iniciación Met es nt #1.
La Fig. 15A. es un esquema que representa la estructura del producto del gen murino fibrilina-1. Los dominios estructurales se representan debajo del diagrama. Los símbolos que designan varios elementos estructurales se definen en la leyenda de la Fig. 15B.
La Fig. 15B. es un esquema que representa la estructura de la molécula tipo LTBP (LTBP-3). Los dominios #1-5 se indican debajo del diagrama. Los símbolos designan los siguientes elementos estructurales: repeticiones EGF-CB: rectángulos abiertos; repeticiones de pares de bases TGF: óvalos abiertos; motivo Fib: círculo abierto; repeticiones tipo de pares de bases TGF: dibujo oval; secuencias ricas en cisteína: dibujo en rectángulos; región rica en prolina/glicina: línea curva gruesa, dominio #2; región rica en prolina, línea curva gruesa, dominio #3. Nótese que los símbolos que designan el péptido señal se han borrado en aras de la sencillez. Adicionalmente, el esquema asume que las repeticiones tipo EGF y EGF-CB pueden extenderse por varios aminoácidos por detrás de la posición C_{6}.
La Fig. 15C. es un esquema que representa la estructura de la LTBP-1 humana. Los dominios #1-5 se anotan debajo del diagrama. Los símbolos que designan los elementos estructurales se definen en la leyenda de la Fig. 15B.
La Fig. 16. es una vista general de la expresión del nuevo gen de tipo LTBP (LTBP-3) durante el desarrollo murino, determinada mediante la hibridación tisular in situ. La Fig. 16 está compuesta por autorradiogramas realizados mediante la exposición directa de cortes hísticos a la película fotográfica, después de hibridación con sondas marcadas radioactivamente. El día 8,5-9,0 los cortes contenían embriones rodeados por membranas intactas, tejidos uterinos, y el disco placentario, cortado en planos al azar. Los días 13,5 y 16,5 los cortes contenían embriones enteros aislados, seccionados en el plano sagital cercana o próximamente al eje mediano. Se mantuvieron condiciones idénticas durante la autorradiografía y la fotografía, permitiendo de este modo una comparación de la intensidad global de la hibridación en todos los cortes hísticos. El transcrito se expresa en el tejido conjuntivo, mesénquima, hígado, corazón y
CNS.
Las Fig. 17A. son unas vistas microscópicas seleccionadas de la expresión del gen LTBP-3 del ratón en los tejidos en desarrollo de éste el día 8,5-9,0. Todas las fotografías en las Figs. 17A-17D se tomaron a partir de idénticos portaobjetos utilizados para preparar los cortes enteros montados (después de sumergir los portaobjetos en la emulsión radiográfica). Se representa el tubo neural, imagen en campo claro 1 cm = 20 mm.
Las Fig. 17B. son unas vistas microscópicas seleccionadas de la expresión del gen LTBP-3 del ratón en los tejidos en desarrollo de éste el día 8,5-9,0. Se representa el tubo neural, imagen en campo oscuro. Nótese la expresión por las células neuroepiteliales y por el mesénquima circundante. 1 cm = 20 mm.
Las Fig. 17C. son unas vistas microscópicas seleccionadas de la expresión del gen LTBP-3 del ratón en los tejidos en desarrollo de éste el día 8,5-9,0. Se representa el corazón, imagen en campo claro. La figura demuestra la expresión por las células mío y endocárdicas (flechas). 1 cm = 20 mm.
Las Fig. 17D. son una vistas microscópicas seleccionadas de la expresión del gen LTBP-3 del ratón en los tejidos en desarrollo de éste el día 8,5-9,0. Se muestra el corazón, imagen en campo oscuro. La figura demuestra la expresión por las células mío y endocárdicas (flechas). Se tomaron fotomicrografías en campo oscuro después de exposición de los tejidos a la emulsión fotográfica durante 2 semanas. En esta imagen y en la que se representa en la Fig. 17B, los hematíes y otras membranas plasmáticas dieron lugar a una señal blanco pálida que contribuye a los antecedentes del experimento. 1 cm = 20 mm.
La Fig. 18A. es una microscopía de la expresión del gen LTBP-3 del ratón en los tejidos en desarrollo de éste en el día 13,5 y en el día 16. Todas las fotografías en las Figs. 18A-18P se tomaron a partir de idénticos portaobjetos utilizados para preparar los cortes enteros montados (después de sumergir los portaobjetos en la emulsión radiográfica). Se representa el modelo de cartílago del hueso largo que se desarrolla a partir de la extremidad inferior, imagen en campo claro. La expresión por los condrocitos y por las células pericondriales se ve en la Fig 18B. 1 cm = 20 mm.
La Fig. 18B. es una microscopía de la expresión del gen LTBP-3 del ratón en los tejidos en desarrollo de éste en el día 13,5 y en el 16. Se representa el modelo de cartílago del hueso largo que se desarrolla a partir de la extremidad inferior, imagen en campo oscuro. Nótese la expresión por los condrocitos y por las células pericondriales. En todas las vistas en campo oscuro de la Fig. 18, los hematíes y otras membranas plasmáticas dieron lugar a una señal blanco pálida que contribuye a los antecedentes del experimento. Nótese la ausencia de una señal de hibridación espúrea en áreas del portaobjetos en las que faltan elementos celulares. 1cm = 20 mm.
La Fig. 18C. es una microscopía de la expresión del gen LTBP-3 del ratón en los tejidos en desarrollo de éste en el día 13,5 y en el 16. Se representan los pulmones, imagen en campo claro. 1cm = 20 mm.
La Fig. 18D. es una microscopía de la expresión del gen LTBP-3 del ratón en los tejidos en desarrollo de éste el día 13,5 y en el 16. Se representan el corazón, imagen en campo claro. 1 cm = 20 mm.
La Fig. 18E. es una microscopía de la expresión del gen LTBP-3 del ratón en los tejidos en desarrollo de éste el día 13,5 y el día 16. Se representan los pulmones, imagen en campo oscuro. Nótese la expresión por las células epiteliales de la vía respiratoria en desarrollo y por las células parenquimáticas que la rodean. 1 cm = 20 mm.
La Fig. 18F. es una microscopía de la expresión del gen LTBP-3 del ratón en los tejidos en desarrollo de éste el día 13,5 y el día 16. Se representa el corazón, imagen en campo oscuro. Nótese la expresión continuada por las células miocárdicas. 1 cm = 20 mm.
La Fig. 18G. Es una microscopía de la expresión del gen LTBP-3 del ratón en los tejidos en desarrollo de éste el día 13,5 y el día 16. Se representa el páncreas, imagen en campo claro. 1 cm = 20 mm.
La Fig. 18H. Es una microscopía de la expresión del gen LTBP-3 del ratón en los tejidos en desarrollo de éste el día 13,5 y el día 16. Se representa el intestino, imagen en campo claro. 1 cm = 20 mm.
La Fig. 18I. Es una microscopía de la expresión del gen LTBP-3 el ratón en los tejidos en desarrollo de éste el día 13,5 y el 16. Se representa el páncreas, imagen en campo oscuro. Nótese la expresión por las células epiteliales acinares, 1 cm = 20 mm.
La Fig. 18J. Es una microscopía de la expresión del gen LTBP-3 del ratón en los tejidos en desarrollo de éste el día 13,5 y el 16. Se representa el intestino, imagen en campo oscuro. Nótese la expresión en las células epiteliales y subepiteliales. 1 cm = 20 mm.
La Fig. 18K. Es una microscopía de la expresión del gen LTBP-3 del ratón en los tejidos en desarrollo de éste el día 13,5 y el 16. Se representa el riñón, imagen en campo claro. 1 cm = 20 mm.
La Fig. 18L. Es una microscopía de la expresión del gen LTBP-3 del ratón en los tejidos en desarrollo de éste el día 13,5 y el 16. Se representa la piel, imagen en campo claro. 1 cm = 20 mm.
La Fig. 18M. Es una microscopía de la expresión del gen LTBP-3 del ratón en los tejidos en desarrollo de éste el día 13,5 y el 16. Se representa el riñón, imagen en campo oscuro. Nótese la expresión por las células blastémicas por debajo de la cápsula renal, por las células epiteliales de los nefrones y túbulos que se están desarrollando, y por el mesénquima intersticial. 1 cm = 20 mm.
La Fig. 18N. Es una microscopía de la expresión del gen LTBP-3 del ratón en los tejidos en desarrollo de éste el día 13,5 y el día 16. Se representa la piel, imagen en campo oscuro. Nótese la expresión por las células epidérmicas, anexas y dérmicas de la piel en desarrollo. 1 cm = 20 mm.
La Fig. 18O. Es una microscopía de la expresión del gen LTBP-3 del ratón en los tejidos en desarrollo de éste el día 13,5 y el día 16. Se representa la retina, imagen en campo claro. 1 cm = 20 mm.
La Fig. 18P. Es una microscopía de la expresión del gen LTBP-3 en los tejidos en desarrollo en el día 13,5 y en el 16. Se representa la retina, imagen en campo oscuro. Nótese la expresión por las células epiteliales retinales y por las células adyacentes del tejido conjuntivo. 1 cm = 20 mm.
La Fig. 19. Representa la expresión dependiente del tiempo del gen LTBP-3 por las células MC3T3-E1. La preparación del ARNm y la transferencia Northern se llevaron a cabo tal como se describe en el Ejemplo XIV. Se cargaron en cada carril del gel Northern alícuotas iguales del ARN total determinado por espectroscopía UV. Tal como se demostró mediante tinción por azul de metileno (Sambrook et al., 1989), se transfirieron a la membrana de nylon cantidades iguales de ARN. Los resultados demuestran un preciso e intenso pico en la expresión génica LTBP-3 después de 14 días en cultivo. Señales más débiles que ponían de manifiesto la expresión del gen LTBP-3 también pueden observarse después de 5 y 28 días en cultivo.
La Fig. 20. Representa el antisuero #274 que se une específicamente a los epítopos LTBP-3. La transfección de las células 293T con un plásmido de expresión LTBP-3 de ratón en toda su longitud, seguido por marcaje radioactivo, preparación de la muestra del medio, inmunoprecipitación, y SDS-PAGE de gradiente 4-18%, se realizaron tal como se describe en el Ejemplo XIV. La figura representa un autorradiograma SDS-PAGE de muestras del medio que sigue a una exposición a la película fotográfica de 2 días. Las asignaciones a los carriles son como sigue: carril 1, medio 293 T marcado radioactivamente (anterior a la transfección) inmunoprecipitado con suero preinmune; carril 2: medio 293T marcado radioactivamente (anterior a la transfección) inmunoprecipitado con anticuerpo #274; carril 3, medio 393T marcado radioactivamente (después de transfección y preincubación con 10 \mug del cóctel peptídico sintético LTBP)inmunoprecipitado con anticuerpo #274; y carril 4, medio 293T marcado radioactivamente (después de transfección) inmunoprecipitado con anticuerpo #274. Tal como se indica por la barra, la molécula de LTBP-3 de longitud completa emigró a 180-190 kDa.
La Fig. 21. Representa la co-inmunoprecipitación de LTBP-3 y TG-\beta_{1} producida por las células MC3T3-E1. Alícuotas (\sim10^{6} de CMP incorporado) de medio marcado radioactivamente producido por las células MC3T3-E1 después de 7 días en cultivo se inmunoprecipitaron tal como se describe en el Ejemplo XIV. Las barras indican la posición de estándares de peso molecular frío utilizados para estimar el peso molecular (mezcla Rainbow, Amersham). Los inmunoprecipitados se separaron utilizando SDS-PAGE con un gradiente de 4-18% y condiciones reductoras. La figura muestra un carril 1 de control negativo que consiste en medio MC3T3-E1 inmunoprecipitado con anticuerpo #274 anti-LTBP-3. Se llevó a cabo transferencia Western utilizando la parte inferior del gel gradiente y un anticuerpo para TGF-\beta disponible comercialmente (Santa Cruz Biotechnology, Inc.). La tinción del anticuerpo se detectó utilizando reactivos y protocolos disponibles comercialmente (ECL Western Blotting Reagent, Amersham). El medio MC3T3-E1 se inmunoprecipitó con anticuerpo #274 anti-LTBP-3.
La Fig. 22A. Representa el análisis radiográfico de la hendidura osteotómica de colágeno del tipo II tres semanas después de cirugía.
La Fig. 22B. Representa el análisis radiográfico de la hendidura osteotómica de colágeno de tipo I tres semanas después de cirugía.
La Fig. 22C. Representa el análisis histológico de la osteotomía de colágeno de tipo II que se representa en la Fig. 22A.
La Fig. 23A. Representa la transferencia génica mediada por adenovirus en células de reparación/regeneración ósea in vivo. En las células de reparación de la fractura se observa tinción citoplásmica \beta-gal (flechas) positiva.
La Fig. 23B. Representa la transferencia génica mediada por adenovirus en células de reparación/regeneración ósea in vivo. Control negativo de cortes seriados teñidos con el vehículo del anticuerpo \beta-gal más un cóctel de anticuerpos no específicos IgG de conejo.
La Fig. 23C. Representa la transferencia génica mediada por adenovirus en células de reparación/regeneración in vivo. El sitio de osteotomía se rellenó con un material de injerto de colágeno fibroso embebido en una solución del adenovirus recombinante incompleto en la réplica AdRSV\beta-gal (\approx10^{11} unidades/ml formadoras de placa). Nótese la tinción nuclear \beta-gal (flecha) positiva de los condrocitos en el interior del sitio osteotómico, tal como se demuestra mediante inmunohistoquímica utilizando un anticuerpo específico anti-\beta-gal.
La Fig. 24. Es la secuencia aminoácida murina BMP-4, SEC ID Nº:1. El epítopo HA se representa en letra negrita en el extremo carboxi terminal de la secuencia.
La Fig. 25. Es la secuencia de ADN del gen murino LTBP-3 (SEC ID Nº:2).
La Fig. 26. Es la secuencia aminoácida del producto del gen LTBP-3 murino (SEC ID Nº:3).
La Fig. 27. Es la secuencia de ADN del gen murino LTBP-2 (SEC ID Nº:17)
La Fig. 28. Es la secuencia aminoácida del producto del gen murino LTBP-2 (SEC ID Nº: 18).
Descripción de la forma de realización preferida 1. Aplicaciones de la tecnología de la reparación ósea al tratamiento humano
Lo que sigue es una breve consideración de cuatro situaciones humanas para ejemplificar la variedad de enfermedades y alteraciones que se beneficiarán del desarrollo de la nueva tecnología para mejorar la reparación ósea y los procedimientos de cicatrización. Además de lo siguiente, otras varias condiciones, por ejemplo, la deficiencia de vitamina D; la cicatrización de heridas en general; la reparación de tejidos esqueléticos blandos; y la reparación y regeneración de tendones, pueden también beneficiarse de la tecnología que se refiere a la estimulación de células progenitoras óseas.
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El primer ejemplo es el individuo por lo demás sano que sufre una fractura. A menudo, la fractura ósea clínica se trata escayolando para aliviar el dolor y permitir que los mecanismos naturales de reparación actúen sobre la herida. Aunque recientemente se han realizado progresos en el tratamiento de las fracturas, y aunque no se consideren las complicaciones diversas que pueden surgir al tratar huesos fracturados, cualquier nuevo procedimiento que aumente la cicatrización ósea en circunstancias normales, representaría un gran avance.
Un segundo ejemplo que puede beneficiarse de los nuevos métodos de tratamiento es la osteogénesis imperfecta (OI). La OI abarca diversas enfermedades heredadas del tejido conjuntivo que implican una fragilidad ósea y del tejido conjuntivo blando en el hombre (Byers y Steiner, 1992; Prockop, 1990). La OI, afecta aproximadamente un niño de cada 5.000-20.000 niños nacidos y la enfermedad se asocia con morbilidad significativa durante la vida. También ocurren cierto número de muertes, que resultan en parte de la alta propensión a las fracturas óseas y a la deformación de los huesos anormales después de la reparación de la fractura (tipos II-IV de OI; Bonadio y Goldstein, 1993). La consecuencia importante aquí es la calidad de vida; claramente, las vidas de los individuos afectados mejorarían por el desarrollo de nuevas terapias diseñadas para estimular y reforzar los procesos de reparación de las fracturas.
El tipo I de OI es una alteración benigna que se caracteriza por fracturas óseas sin deformidades, escleróticas azules, estatura normal o casi normal, y herencia dominante autosómica (Bonadio y Goldstein, 1993). La osteopenia se asocia con una proporción incrementada de fracturas óseas aisladas en la deambulación (la frecuencia de las fracturas disminuye de forma importante en la pubertad y durante la vida de los adultos jóvenes, pero aumenta otra vez en la tercera edad). La pérdida de la audición, que empieza a menudo en la segunda o tercera década, es una característica de esta enfermedad en aproximadamente la mitad de las familias y puede progresar a pesar de la disminución general en la frecuencia de las fracturas. La génesis dentaria imperfecta se observa en un subconjunto de individuos.
En contraste, los tipos II-VI de OI representan un espectro de alteraciones más graves asociadas con una vida más corta. El tipo II de OI, la forma letal perinatal, se caracteriza por estatura baja, bóveda craneana blanda, escleróticas azules, piel frágil, pecho pequeño, extremidades inferiores que aparecen colgantes (debido a la rotación externa y abducción de los fémures), tendones y ligamentos frágiles, fracturas óseas con deformidades importantes, y muerte en el período perinatal debido a insuficiencia respiratoria. Los signos radiográficos de la debilidad ósea incluyen compresión de los fémures, tibias arqueadas, costillas anchas y compuestas de pequeñas porciones, y adelgazamiento de la bóveda craneana.
El tipo III de OI se caracteriza por estatura baja, facies triangular, escoliosis severa, y fracturas óseas con deformidad moderada. La escoliosis puede conducir a enfisema y a una vida acortada debido a insuficiencia respiratoria. El tipo IV de OI se caracteriza por escleróticas normales, fracturas óseas con deformidades de medias a moderadas, defectos dentarios, y una historia natural que es esencialmente intermedia entre el tipo II y el tipo I de OI.
Se han caracterizado desde 1989 más de 200 mutaciones de OI (revisado en Byers y Steiner, 1992; Prockop, 1990). La mayor parte tiene lugar en los genes COL1A1 y COL1A2 del tipo de colágeno I. La mayoría de los casos del tipo I de OI parecen el resultado de mutaciones heterocigóticas en el gen COL1A1 que disminuyen la producción de colágeno pero no alteran la estructura primaria, esto es, mutaciones nulas heterocigóticas afectan la expresión de COL1A1. La mayoría de los casos de los tipos II-IV de OI resultan de mutaciones heterocigóticas en los genes COL1A1 y COL1A2 que alteran la estructura del colágeno.
Un tercer ejemplo importante es la osteoporosis. El término "osteoporosis" se refiere a un grupo heterogéneo de alteraciones caracterizado por una masa ósea disminuida y fracturas. Existe una cantidad estimada de 20-25 millones de personas que sufren un riesgo aumentado de fracturas a causa de la pérdida ósea en sitios específicos. Los factores de riesgo para la osteopororis incluyen el incremento de edad, el género (más mujeres), masa ósea escasa, menopausia temprana, raza (caucasianos), ingesta baja en calcio, actividad física reducida, factores genéticos, factores medio ambientales (que incluyen fumar cigarrillos y el abuso de alcohol o de cafeína), y deficiencias en el control neuromuscular que crean una propensión a las caídas.
Más de un millón de fracturas en los USA cada año pueden atribuirse a la osteoporosis, y en 1986 solo el coste de su tratamiento se estimó en 70.000-100.000 millones de dólares. Las tendencias demográficas (esto es, el gradual incremento de la edad de la población USA) sugieren que estos costos pueden aumentar 2-3 veces en el año 2020 si no se encuentra un tratamiento efectivo y seguro. Claramente, la osteoporosis constituye un problema significativo del cuidado de la salud.
Clínicamente, la osteoporosis se divide en de tipo I y tipo II. El tipo I se presenta predominantemente en las mujeres de mediana edad y se asocia con la pérdida de estrógenos en la menopausia, mientras que la osteoporosis de tipo II se asocia con la edad avanzada. Una gran parte de la morbilidad y mortalidad asociada con la osteoporosis proviene de la inmovilización de los pacientes de edad avanzada después de las fracturas.
Las terapias habituales para los pacientes de osteoporosis ponen el acento en la prevención de las fracturas, no en la reparación de éstas. Esto sigue siendo una consideración importante, a causa de la literatura, que establece claramente que la morbilidad y mortalidad significativa se asocian con el descanso prolongado en cama en las personas mayores, particularmente de aquéllas que han sufrido fracturas de la cadera. Las complicaciones de la estancia en la cama incluyen coágulos sanguíneos y neumonía. Estas complicaciones están reconocidas y se toman habitualmente medidas para evitarlas, pero estas medidas apenas representan la mejor aproximación a la terapia. Así, la población de pacientes osteoporóticos se beneficiará de las nuevas terapias diseñadas para reforzar los huesos y la velocidad de los procesos de reparación de las fracturas, haciendo que estas personas por tanto se mantengan de pie antes de que vengan las complicaciones.
Un cuarto ejemplo se refiere a la reconstrucción ósea, y, específicamente, a la capacidad para reconstruir defectos en el tejido óseo que provienen de daños traumáticos; cáncer o cirugía de éste; defectos de nacimiento; un error en el desarrollo ó una alteración heredada; o por la edad. Existe una necesidad ortopédica significativa para injertos de articulaciones totales más estables, y los huesos craneales y faciales constituyen una diana particular para este tipo de necesidad reconstructiva. La disponibilidad de nuevos materiales de injerto, por ejemplo, titanio, ha permitido la reparación de defectos relativamente grandes. Los injertos de titanio proporcionan una estabilidad temporal excelente de los defectos óseos. Sin embargo, la experiencia ha mostrado que una falta de unión ósea viable puede hacer que el defecto conduzca a la exposición del dispositivo, infección, inestabilidad estructural y, finalmente, fallo en la reparación del defecto.
Los injertos óseos autólogos constituyen otra modalidad reconstructora posible, pero presentan diversas desventajas demostradas porque deben tomarse a partir de un sitio del donante tal como la cresta ilíaca o las costillas, por lo que proporcionan habitualmente una cantidad insuficiente de hueso para rellenar completamente el defecto, y el hueso que forma es a veces propenso a la infección y resorción. Las preparaciones xenogénicas parcialmente purificadas no son prácticas para la utilización clínica a causa de que cantidades de microgramos son purificadas a partir de kilogramos de hueso bovino, haciendo que la producción comercial a gran escala sea costosa y poco práctica. Los aloinjertos y las preparaciones óseas desmineralizadas son por tanto empleadas a menudo.
Las transferencias microquirúrgicas de injertos óseos libres con tejido blando enganchado y vasos sanguíneos pueden cerrar defectos óseos con una fuente inmediata de suministro sanguíneo al injerto. Sin embargo, estas técnicas tardan tiempo, han demostrado que producen una gran morbilidad, y sólo pueden utilizarse por individuos especialmente entrenados. Además, el injerto óseo está a menudo limitado en cantidad y no se perfila fácilmente. En la mandíbula, por ejemplo, la mayoría de los pacientes no pueden llevar dispositivos dentales utilizando las técnicas aceptadas actualmente (aún cuando se establezca después una continuidad), y de esta forma mejoran poco en la capacidad para masticar. Toriumi et al., han escrito que, ``los cirujanos reconstructores tendrán a su disposición un sustituto óseo que será seguro, biocompatible, fácil de usar, y que permanecerá mucho tiempo y restaurará la continuidad mandibular con una escasa morbilidad asociada.
En relación con la reconstrucción ósea, las áreas problema específicas para una mejoría son las que se refieren al tratamiento de defectos grandes, tales como las creadas por traumatismos, defectos de nacimiento, o particularmente, después de resecciones tumorales. El éxito de los injertos ortopédicos, interfases y articulaciones artificiales se mejoraría imaginablemente si la superficie del injerto, o una parte funcional de él, estuviera revestida con uno o más materiales apropiados, con objeto de promover una interacción más efectiva con el sitio biológico que rodea al injerto, e, idealmente, para promover la reparación tisular.
2. Reparación ósea
Se sabe que el tejido óseo posee capacidad de reparación y regeneración y existe un cierto conocimiento de las bases moleculares y celulares de estos procesos. La iniciación de nueva formación ósea implica el compromiso, la expansión clonal y la diferenciación de las células progenitoras. Una vez iniciada, la formación ósea se promueve por diversos factores polipeptídicos de crecimiento. El hueso nuevamente formado se mantiene entonces mediante una serie de factores de diferenciación y crecimiento sistémicos y locales.
El concepto de agentes específicos que promueven el crecimiento óseo se deriva del trabajo de Huggins y Urist. Huggins et al., 1936. demostró que el injerto autólogo de los dientes incisivos caninos al músculo esquelético dio lugar a la formación local de hueso nuevo (Huggins et al., 1936). Urist y colaboradores informaron de que segmentos de hueso liofilizados y desmineralizados indujeron la formación ósea (Urist, 1965; Urist et al., 1983), un proceso que implicó la quimiotaxis macrofágica; el reclutamiento de células progenitoras; la formación de tejido de granulación, cartílago, y hueso; la remodelación del hueso; y la diferenciación del tuétano. La iniciación de la formación del cartílago y del hueso en un sitio extraesquelético, un proceso al que se alude como osteinducción, ha permitido la identificación inequívoca de iniciadores de la morfogénesis ósea (Urist, 1965; Urist et al., 1983; Sampath et al., 1984; Wang et al., 1990; Cunningham et al., 1992).
Se ha realizado un progreso significativo en la caracterización de agentes biológicos elaborados por el tejido óseo activo durante el crecimiento y la cicatrización ósea natural. La matriz ósea desmineralizada es muy insoluble; Sampath y Reddi (1981) demostraron que sólo pueden extraerse el 3% de las proteínas utilizando combinaciones fuertes de desnaturalizantes y detergentes. Demostraron también que el extracto óseo desmineralizado no fraccionado iniciará la morfogénesis ósea, una observación crítica que condujo a la purificación de moléculas "osteoinductoras". Ahora se han purificado y caracterizado familias de factores osteoinductores proteináceos. En la literatura, se ha hecho alusión a ellos de forma variada como proteínas morfogénicas o morfogenéticas (BMPs), proteínas inductoras óseas osteogénicas o proteínas osteogénicas (OPs).
3. Reparación ósea y proteínas morfogenéticas óseas (BMPs)
Después de su purificación inicial, se han clonado ahora varios genes de proteínas morfogenéticas óseas utilizando técnicas moleculares (Wozney et al., 1988; Rosen et al., 1989; resumidas en Alper, 1994). Este trabajo ha establecido a las BMPs como miembros de la superfamilia del factor-\beta transformante de crecimiento (TGF-\beta) basándose en homologías secuenciales del ADN. Se ha demostrado también que otras moléculas TGF participan en la formación de nuevo hueso, y el TGF-\beta se considera como un regulador multifuncional complejo de la función osteoblástica (Centrell et al., 1988; Carrington et al., 1988; Seitz et al., 1992). Verdaderamente, la familia de los factores transformantes de crecimiento (TGF-\beta1, TGF-\beta2, y TGF-\beta3) se ha propuesto como útil potencialmente en el tratamiento de las enfermedades óseas (documento de Patente U.S. 5.125.978, que se incorpora a la presente memoria como referencia).
La clonación de distintos genes BMP ha conducido a la designación de genes y proteínas individuales BMP como BMP-1 a BMP-8. Las BMP 2-8 son las que se piensa que son generalmente osteogénicas (BMP-1 puede ser un morfógeno más generalizado; Shimell et al., 1991). BMP-3 se denomina también ósteogenina (Luyten et al., 1989)
y
BMP-7 se denomina también OP-1 (Ozkaynak et al., 1990). Cada una de las TGFs y BMPs actúa sobre las células mediante interacciones histoespecíficas complejas con las familias de los receptores superficiales celulares (Roberts y Sporn, 1989; Paralkar et al., 1991).
En la literatura de patentes, se han descrito varias secuencias nucleótidas de BMP (o OP) y vectores, células huéspedes cultivadas y polipéptidos. Por ejemplo, los documentos de Patente U.S. 4.877.864, 4.968.590 y 5.108,753 se refieren todos a factores osteogénicos. Más específicamente, BMP-1 se da a conocer en la Patente U.S. 5.108.922; el tipo BMP-2, que incluye BMP-2A y BMP-2B, se dan a conocer en las Patentes U.S. 5.166.058, 5.013.649, y 5.013.649; BMP-3 en 5.116.738; BMP-5 en 5.106.748; BMP-6 en 5.187.076; y BMP-7 en 5.108.753 y 5.141.905; todos los cuales se incorporan a la presente memoria como referencia. Varios clones de BMP y sus actividades han sido descritos particularmente por Wozney et al., 1988; (que se incorporan a la presente memoria como referencia). Las secuencias de ADN que codifican las proteínas osteogénicas denominadas OP-1, COP-5 y COP-7 se dan a conocer también en el documento de Patente U.S 5.011.691. Aunque la terminología de BMP se utiliza ampliamente, puede darse el caso de que exista un término "contraparte" de OP para cada BMP individual (Alper, 1994).
4. Reparación ósea y factores de crecimiento y citoquinas
Los factores transformantes de crecimiento (TGFs) tienen un papel central en la regulación de la cicatrización hística por su efecto sobre la proliferación celular, la expresión génica, y la síntesis de las proteínas matriciales (Roberts y Sporn, 1989). Aunque no ejerzan necesariamente un efecto directo, Bolander y colaboradores han proporcionado evidencia de que TGF-\beta1 y TGF-\beta2 pueden iniciar tanto la condrogénesis como la osteogénesis (Joyce et al., 1990; Izumi et al., 1992; Jingushi et al., 1992). En estos estudios apareció que la formación ósea y la de cartílago era dependiente de la dosis (es decir, dependiente de la concentración local del factor de crecimiento). Los datos sugirieron también que TGF-\beta1 y TGF-\beta2 estimulaban la diferenciación celular mediante un mecanismo similar, aún cuando difirieron en términos de la cantidad final de nuevo cartílago y hueso que se formó.
Otros factores de crecimiento/hormonas además de TGF y BMP pueden influenciar la formación de nuevo hueso después de la fractura. Bolander y colaboradores inyectaron factor recombinante acídico fibroblástico de crecimiento en un sitio de una fractura de rata (Jingushi et al., 1990). El efecto mayor de múltiples dosis altas (1,0 mg/50 ml) fue un aumento significativo en el tejido del cartílago en la hendidura de la fractura, mientras que dosis bajas no tuvieron efecto. Estos investigadores utilizaron también la técnica de la reacción en cadena de la transcriptasa inversa-polimerasa (PCR™) para demostrar la expresión de los transcritos de los receptores estrogénicos en el tejido del callo (Boden et al., 1989). Estos resultados sugirieron un papel de los estrógenos en la reparación normal de las fracturas.
Horowitz y colaboradores han demostrado que los osteoblastos sintetizan citoquinas, factores estimulantes de colonias de macrófagos (Horowitz et al., 1989). Los agentes osteotrópicos utilizados en este estudio incluyeron lipopolisacáridos, PTH1-84, PTH1-34, vitamina D y ácido al-trans retinoico. Esta observación ha conducido a la sugerencia de que la activación de los osteoblastos después de la fractura pueden llevar a la producción de citoquinas que regulan tanto la hematopoyesis como la formación de nuevo hueso. Varias otras proteínas y polipéptidos que se ha encontrado que se expresan a niveles altos en las células osteogénicas, tales como, por ejemplo, el polipéptido denominado Vgr-1 (Lyons et al., 1989), tienen también potencial para su utilización en relación con la presente invención.
5. Reparación ósea y hormonas que regulan el calcio
Las hormonas reguladoras de calcio tal como la hormona paratiroidea (PTH) participan en la formación de nuevo hueso y en la remodelación de éste (Raisz y Kream, 1983). La PTH es una hormona de 84 aminoácidos que regula el calcio cuya función principal es elevar la concentración de Ca^{2+} en el plasma y en el líquido extracelular. Estudios con la hormona original y con péptidos sintéticos han demostrado que el amino terminal de la molécula (aa 1-34) contiene los requerimientos estructurales para la actividad biológica (Tregear et al., 1973; Hermann-Erlee et al., 1976; Riond, 1993). La PTH funciona uniéndose a un receptor superficial celular específico que pertenece a la superfamilia de los receptores acoplados con la proteína G (Silve et al., 1982; Rizzoli et al., 1983; Juppner et al., 1991).
Utilizando una estrategia retrovírica, se ha introducido una construcción génica PTH humana en toda su longitud en fibroblastos de rata cultivados para crear células recombinantes que secreten PTH. Estas células se trasplantaban entonces a receptores murinos singénicos que se observó que desarrollaban hipercalcemia mediada por las concentraciones séricas aumentadas de PTH (Wilson et al., 1992). El objetivo de estos estudios fue crear un modelo animal de hiperparatiroidismo primario.
La PTH tiene un efecto dual sobre la formación del nuevo hueso, un aspecto algo desconcertante de función hormonal, a pesar de una intensa investigación. Se ha demostrado que la PTH es una potente inhibidora directa de la producción de colágeno de tipo I por los osteoblastos (Kream et al., 1993). Hace 30 años, se demostró también que la PTH intacta estimulaba la resorción ósea en cultivo de órganos, y se sabe que la hormona aumenta el número y actividad de los osteoclastos. Estudios recientes por Gay y colaboradores han demostrado la unión de (I^{125})PTH (1-94) a osteoclastos en cortes histológicos y que los osteoclastos se unen a la PTH intacta de una forma que es a la vez saturable y dependiente del tiempo y de la temperatura (Agarwala y Gay, 1992). Aunque estas propiedades están de acuerdo con la presencia de receptores PTH/PTHrP sobre la superficie celular osteoclástica, esta hipótesis se considera todavía controvertida. Un punto de vista más aceptado, quizás, es que la activación de los osteoclastos tiene lugar mediante un mecanismo de señalización osteoblástica.
Por otra parte, la osteoesclerosis puede ocurrir en los pacientes humanos con hiperparatiroidismo primario (Seyle, 1932). Es bien conocido que los individuos con hiperparatiroidismo no pierden masa ósea inexorablemente, pero alcanzan eventualmente un nuevo estado de equilibrio de remodelación del hueso nuevo después de un período inicial de pérdida ósea neta. La administración crónica a dosis bajas del fragmento aminoterminal de PTH (aa 1-34) puede también inducir nueva formación ósea según un esquema dosis-tiempo dependiente (Seyle, 1932; Parsons y Reit, 1974).
Se ha mostrado recientemente que la PTH 1-34 humana estimula la síntesis del ADN en osteoblastos y condrocitos de pollos en cultivo (Van der Plas, 1985; Schluter et al., 1989; Somjen et al., 1990); aumenta el número de células óseas in vivo (Malluche et al., 1986) potencia el crecimiento in vitro del cartílago y hueso de embriones de pollo (Kawashima, 1980; Burch y Lebovitz, 1983; Lewinson y Silbermann, 1986; Endo et al., 1980; Kleind-Nulend et al., 1990); potencia la formación de hueso superficial (ambos, tanto el trabecular como el cortical) en animales normales y osteogénicos y en el hombre con osteoporosis (Reeve et al., 1976; Reeve et al., 1980; Tam et al., 1982; Hefti et al., 1982; Podbesek et al., 1983; Stevenson y Parsons, 1983; Slovik et al., 1986; Gunness-Hey y Hock, 1984; Tada et al., 1988; Spencer et al., 1989; Hock y Fonseca, 1990; Liu y Kalu, 1990; Hock y Gera, 1992; Mitlak et al., 1992; Ejersted et al., 1993); y retrasa e invierte los efectos catabólicos de la deprivación de estrógenos sobre la masa ósea (Hock et al., 1988; Hori et al., 1988; Gunness-Hey y Hock, 1989; Liu et al., 1991). Se han presentado evidencias de interacciones sinérgicas entre hPTH-1-34 y otras moléculas anabólicas, que incluyen el factor de crecimiento tipo insulina, BMP-2, hormona del crecimiento, vitamina D, y TGF-\beta (Slovik et al., 1986; Spencer et al., 1989; Mitlak et al., 1992; Canalis et al., 1989; Linkhart y Mohan, 1989; Seitz et al., 1992; Vukicevic et al., 1989).
La observación anecdótica ha demostrado que los niveles séricos de PTH pueden elevarse después de la fractura ósea (Meller et al., 1984; Johnston et al., 1985; Compston et al., 1989; Hardy et al., 1993), pero el significado de esta observación no se entiende. No existen aparentemente informes en la literatura relacionados con intentos para localizar PTH ó el receptor PTH/PTHrP in situ en los sitios de fractura humanos o en modelos experimentales. Además, no se ha realizado ningún intento para aumentar la reparación mediante la adición exógena de péptidos PTH. Aunque hPTH1-34 se conoce por funcionar como un agente anabólico para el hueso anteriormente a la presente invención, mucho queda por aprender acerca del papel (si tiene alguno) de la PTH durante la regeneración y reparación ósea.
6. Administración proteica y reparación ósea
Se han llevado a cabo varios estudios en los que preparaciones de factores proteicos de crecimiento, incluyendo BMPs, se administraron a animales en un esfuerzo para estimular el crecimiento óseo. Los resultados de cuatro de dichos estudios ejemplares se describen seguidamente.
Toriumi et al., estudiaron el efecto del BMP-2 recombinante sobre la reparación de defectos creados quirúrgicamente en la mandíbula de perros adultos (Toriumi et al., 1991). 26 perros adultos se dispusieron en tres grupos después de la creación de un defecto mandibular de un grosor total de 3 cm: 12 animales recibieron injertos de prueba compuestos de transportadores inactivos de matrices óseas de perro y BMP-2 humano, 10 animales recibieron injertos de control compuestos por transportadores sin BMP-2, y los animales BMP-4 no recibieron injerto. Se sacrificaron los perros a los 2,5-6 meses, y los segmentos reconstruidos se analizaron mediante radiografía, histología, histomorfometría, y ensayos biomecánicos. Los animales que recibieron injertos de prueba se sacrificaron después de 2,5 meses, a causa de la presencia de huesos bien mineralizados que empalman el defecto. El nuevo hueso permitió a estos animales masticar una dieta sólida, y el promedio de la fuerza de curvatura de las mandíbulas reconstruidas era un 27% de lo normal ("normal" en este caso representa la hemimandíbula no operada y contralateral). En contraste, los injertos en los otros dos grupos no fueron funcionales aún hasta después de 6 meses y mostraron una formación ósea mínima.
Yasko et al., publicaron un estudio relacionado en el que se examinó el efecto de BMP-2 sobre la reparación de defectos segmentales en el fémur de la rata (Yasko et al., 1992). El diseño del estudio incluía un grupo que recibía una dosis de 1,4 mg de BMP-2, otro grupo que recibió una dosis de 11,0 mg de BMP-2, y un grupo de control que recibió sólo la matriz transportadora. Se observó la formación de hueso endocondral en los dos grupos de animales que recibieron BMP-2. Tal como se ha demostrado por radiografía, histología, y ensayos de integridad mecánica de huesos enteros (torsión), la dosis más grande que dio lugar a la reparación funcional de los defectos de 5 mm empezando 4,5 semanas después de la cirugía. La dosis más baja dio lugar a la evidencia radiográfica e histológica de la formación de hueso nuevo, pero la unión funcional no se observó hasta después de 9 semanas de la cirugía. Tampoco hubo evidencia de la formación ósea en los animales de control en este momento.
Chen et al., demostraron que una aplicación única de 25-100 mg de TGF-\beta1 recombinante adyacente al cartílago, indujo la formación de hueso endocondral en las heridas dérmicas de grosor completo de las orejas del conejo (Chen et al., 1991). La formación ósea empezó 21 días después de la creación de la herida y alcanzó un máximo en el día 42, tal como se demostró mediante métodos morfológicos. Se observó una remodelación ósea activa después de este momento.
En un estudio relacionado, Beck et al., demostraron que una aplicación única de TGF-\beta1 en un gel de metilcelulosa al 3% fue capaz de reparar grandes defectos craneales inducidos quirúrgicamente que de otro modo cicatrizan mediante tejido conjuntivo fibroso y nunca forman hueso (Beck et al., 1991). El cierre óseo se consiguió en un plazo de 28 días a partir de la aplicación de 200 mg de TGF-\beta1 y la proporción de cicatrización se mostró que era dosis dependiente.
Estudios tales como los descritos anteriormente han establecido, pues, que los factores exógenos de crecimiento pueden utilizarse para estimular la formación/reparación/regeneración in vivo de hueso nuevo. Ciertos documentos de Patente U.S. se refieren también a métodos para tratar defectos óseos o inducir la formación ósea. Por ejemplo, la Patente U.S. 4.877.864 se refiere a la administración de una composición terapéutica de proteínas inductoras del hueso para tratar defectos del cartílago y/o del hueso; la Patente U.S 5.108.753 se refiere a la utilización de un dispositivo que contiene una proteína pura osteogénica para inducir la formación ósea endocondral y para utilización en los procedimientos reconstructivos periodontal, dental o cráneofacial.
Sin embargo, en ninguna parte en esta extensa literatura aparece alguna sugerencia de que los mismos genes osteogénicos pueden aplicarse a un animal con objeto de promover la reparación o regeneración ósea. Verdaderamente, incluso a través de la literatura de patentes que ser refiere a los genes que codifican diversos factores estimuladores óseos y su expresión in vitro en las células huéspedes para producir proteínas recombinantes, no parece mencionarse la posibilidad de utilizar la transferencia de ácidos nucleicos en un esfuerzo para expresar un gen osteogénico en células progenitoras óseas in vivo o promover la formación de hueso nuevo en un animal o en un individuo humano.
7. Matrices biocompatibles para utilización en la reparación ósea
Existen una cantidad considerable de trabajos que se han dirigido al desarrollo de matrices biocompatibles para utilización en injertos médicos, incluyendo las específicas para el trabajo de implante óseo. En el contexto de la presente invención, una matriz puede utilizarse en asociación con el gen o la región codificante del ADN que codifica el polipéptido osteotrópico, con objeto de liberar fácilmente el gen en el sitio de daño óseo. Dichas matrices pueden formarse a partir de varios materiales que se utilizan en la actualidad para los dispositivos médicos injertados.
En ciertos casos, la matriz puede también actuar como un "biorrelleno" para proporcionar una estructura para el hueso y cartílago en desarrollo. Sin embargo, la formación de dicha estructura de andamiaje no constituye una necesidad primaria, porque, más bien, los principales requerimientos de la matriz son ser biocompatibles y ser capaces de liberar un segmento de ácido nucleico a una célula ósea o sitio tisular óseo.
Las matrices que pueden utilizarse en ciertas formas de realización incluyen matrices no-biodegradables y químicamente definidas, tal como el hidroxilapatito sinterizado, biovidrio, aluminatos y otras cerámicas. Las biocerámicas pueden alterarse en su composición, tal como en calcio-aluminato-fosfato; y pueden ser procesadas para modificar características físicas y químicas particulares, tales como el tamaño de poro, tamaño de partícula, forma de partícula, y biodegradabilidad. Ciertas matrices poliméricas pueden también utilizarse si se desea, incluyendo los polímeros de ésteres acrílicos y los polímeros de ácidos lácticos, tal como se da a conocer en los documentos de Patente U.S. 4.526.909, y 4.563.489, respectivamente, incorporada cada una a la presente memoria como referencia. Ejemplos particulares de polímeros útiles son los de ortoésteres, anhídridos, propilen-cofumaratos, o un polímero de uno o más de los monómeros del ácido \alpha-hidroxicarboxílico, por ejemplo., el ácido \alpha-hidroxiacético (ácido glicólico) y/o el ácido \alpha-hidroxipropiónico (ácido láctico).
Algunas de las matrices preferidas para utilizarlas con los propósitos actuales, son aquellas que son capaces de ser reabsorbidas en el organismo. Matrices biodegradables potenciales para utilizarlas en la transferencia génica ósea, incluyen, por ejemplo, copolímeros en bloque PLGA, sulfato cálcico definido químicamente y biodegradable, fosfato tricálcico, hidroxiapatito y polianhídridos. Además, pueden utilizarse biomatrices compuestas por proteínas puras y/o componentes matriciales extracelulares.
Los inventores han mostrado la utilización de materiales de colágeno dérmicos u óseos como matrices, pues pueden prepararse a partir de diversas preparaciones de colágeno liofilizadas disponibles comercialmente, tales como las de la piel de rata o de bovinos, así como de copolímeros en bloque PLGA. Las matrices de colágeno pueden también formularse tal como se describe en el documento de Patente U.S. 4.394.370, que se incorpora a la presente memoria como referencia, el cual se refiere a la utilización de matrices de colágeno como vehículos de liberación de la proteína osteogénica.
UltraFiber™, que puede obtenerse de Norian Corp (Mountain View, CA), es una matriz preferida. Las matrices preferidas son las que se formulan con el colágeno de tipo II, y más preferentemente, con el colágeno recombinante de tipo II y el colágeno mineralizado de tipo II.
Pueden prepararse posteriormente matrices apropiadas a partir de combinaciones de materiales, tales como copolímeros en bloque PLGA, que permiten una liberación sostenida; hidroxiapatito; o colágeno y fosfato tricalcico. Aunque la suficiente retención y subsiguiente liberación de un gen osteotrópico de ningún modo constituye un límite para la presente invención, sería deseable que al sitio tisular óseo se pudiera administrar una matriz porosa y una combinación génica en combinación con un coágulo sanguíneo autólogo. La base para esto es que los coágulos sanguíneos se hayan utilizado previamente para aumentar el secuestro de proteínas osteogénicas para utilizarlas en el tratamiento óseo (documento de Patente U.S 5.171.579, que se incorpora a la presente memoria como referencia), no excluyéndose de ninguna manera su utilización en conexión con la presente invención (pueden incluso atraer factores de crecimiento o citoquinas).
8. Colágeno
Aunque no se propuso previamente para utilizarlo con una molécula de ácido nucleico, se ha descrito la utilización del colágeno como un vehículo farmacéutico de liberación. La biocompatibilidad de las matrices de colágeno es bien conocida en la técnica. Los documentos de Patente U.S. 5.206.028, 5,128.136. 5.081.106, 4.585.797. 4.390.519, y 5.197.977 (todas incorporadas a la presente memoria como referencia) describen la biocompatibilidad de matrices que contienen colágeno en el tratamiento de las lesiones dérmicas, utilización como un vendaje para heridas, y como un medio de controlar las hemorragias. A la luz de estos documentos, por tanto, no ofrece la menor duda respecto a lo apropiado de aplicar una preparación de colágeno a un sitio óseo de un animal.
El documento de Patente U.S. 5.197.977 describe la preparación de un injerto vascular impregnado de colágeno que incluye materiales medicinales complejados con el colágeno para ser liberados lentamente a partir del injerto, después del implante. El documento de Patente U.S. 4.538.603 se refiere a un vendaje oclusivo útil para tratar las lesiones dérmicas y a un material granular capaz de interactuar con el exudado de la herida. El documento de Patente U.S. 5.162.430 describe una composición no inmunogénica farmacéuticamente aceptable que comprende un colágeno telopéptido conjugado químicamente con un polímero hidrofílico sintético.
Documentos ulteriores, que un experto en la materia puede encontrar fácilmente, incluyen las Patentes U.S. 4.837.285, 4.703.108, 4.409.332 y 4.347.234, incorporándose a la presente memoria cada una de ellas como referencia. Estas referencias describen las utilizaciones del colágeno como un agente de unión no inmunogénico, biodegradable y capaz de biorresorción.
Los inventores consideran que el colágeno de muchas fuentes será útil en la presente invención. Particularmente útiles son las secuencias aminoácidas del colágeno de tipo II. Ejemplos del colágeno de tipo II se conocen bien en la técnica. Por ejemplo, las secuencias aminoácidas del hombre (Lee et al., 1989), rata (Michaelson et al., 1994), y del ratón (Ortman et al., 1994) se han determinado (SEC ID Nº:10, SEC ID Nº:12, SEC ID Nº:14), respectivamente).
Aunque no se conoció previamente como capaz de estimular las células progenitoras óseas por sí mismo, se muestra aquí sorprendentemente que el colágeno de tipo II posee esta propiedad, lo cual da lugar, de este modo, a nuevas posibilidades para utilizaciones clínicas.
9. Liberación de ácidos nucleicos
La transferencia de ácidos nucleicos a células de mamífero ha brindado un método para tratar ciertas enfermedades o alteraciones. A la transferencia o liberación de ácidos nucleicos se alude a menudo como "terapia génica". Esfuerzos iniciales hacia una terapia génica postnatal (somática) dependieron de medios indirectos de introducción de los genes en los tejidos, por ejemplo, se obtuvieron del organismo células diana, se infectaron con vectores víricos que transportaban genes recombinantes, y se implantaron otra vez en aquél. A este tipo de técnicas se hace referencia generalmente como protocolos de tratamiento ex vivo. La transferencia génica in vivo se ha alcanzado recientemente con formulaciones de ADN atrapado en liposomas (Ledley et al., 1987); o en proteoliposomas que contienen proteínas receptoras de la envoltura vírica (Nicolau et al., 1983); ADN coprecipitado con fosfato cálcico (Benvenisty y Reshef, 1986); y ADN acoplado a un complejo transportador de glicoproteína-polilisina (Wu y Wu, 1988). Se ha descrito también la utilización de vectores recombinantes víricos incompletos en la réplica para infectar células diana in vivo (por ejemplo, Seeger et al., 1984).
Recientemente, Wolff et al., demostraron que la inyección directa de preparaciones purificadas de ADN y ARN en el músculo esquelético murino dio lugar a la expresión significativa de un gen informador (Wolff et al., 1990). Esto constituyó un hallazgo inesperado, y el mecanismo de la transferencia genética no pudo definirse. Los autores especularon que las células musculares pueden estar particularmente dotadas para captar y expresar polinucleótidos in vivo o que el daño asociado con la inyección de ADN puede permitir que tenga lugar la transfección.
Wolff et al., sugirieron varias aplicaciones potenciales del método de la inyección directa, incluyendo (a) el tratamiento de alteraciones heredables del músculo. (b) la modificación de las alteraciones no musculares mediante la expresión tisular muscular de transgenes terapéuticos, (c) desarrollo vacunal, y (d) un tipo reversible de transferencia genética, en el cual se administra el ADN como un tratamiento farmacéutico convencional. En un elegante estudio, Liu y colaboradores demostraron recientemente que el método de inyección directa puede aplicarse satisfactoriamente al problema del desarrollo de una vacuna de la gripe (Ulmer et al., 1993).
También se ha considerado la utilización de la transferencia génica a los sinoviocitos como un medio para tratar la artritis, (Bandara et al., 1992; Roessler et al., 1993). Los protocolos que se consideran han incluido ambos el tratamiento ex vivo de los sinoviocitos aislados y su reintroducción en el animal y también transferencia génica directa en la cual vectores apropiados se inyectan en la articulación. La transferencia de genes marcadores a los sinoviocitos ya se ha demostrado utilizando tecnología retrovírica y adenovírica (Bandara et al., 1992 Roessler et al., 1993).
A pesar del énfasis exclusivo en el tratamiento proteico por los que trabajan en el campo del nuevo crecimiento óseo, los inventores vieron que había un gran potencial para utilizar los mismos ácidos nucleicos para promover la regeneración/reparación ósea in vivo. Esto proporciona un tipo más sofisticado de liberación farmacéutica. Además de la facilidad y coste de preparar ADN, se razonó también que utilizando la transferencia del ADN antes que la de los péptidos, se proporcionarían muchas ventajas ulteriores. Por ejemplo, la transferencia de ADN permite la expresión o sobreexpresión de receptores de membrana integrales sobre la superficie de las células de reparación/regeneración del hueso, mientras que esto no puede realizarse utilizando la transferencia peptídica a causa de que la última (a priori) es una manipulación extracelular. De forma importante, la transferencia de ADN permite también la expresión de polipéptidos modificados de una forma dirigida a un sitio, con la cantidad mínima de trabajo adicional (esto es., una clara manipulación biológica molecular sin purificación de proteínas), así como una liberación sostenida de las terapias administradas mediante una vía inyectable.
Las ventajas de la utilización de ADN son también numerosas considerando el desarrollo de productos farmacéuticos y medios efectivos de suministro. Aquí, las ventajas importantes incluyen la capacidad para preparar formulaciones inyectables, especialmente aquellas composiciones que presentan gelificación térmica reversible, y la oportunidad para combinar dichos inyectable con la tecnologías de la formación de imagen durante el suministro. "Liberación sostenida" es también una ventaja importante de utilizar ADN, porque el ADN añadido exógenamente continua dirigiendo la producción de un producto proteico después de la incorporación a una célula. La utilización de ciertas composiciones matriz-ADN permite también un fenómeno más típico de "liberación sostenida" porque la liberación operativa del ADN a partir de la mezcla de la matriz puede también manipularse.
Los inventores consideraron que ambos ADN, el desnudo y el mediado víricamente, podrían utilizarse en un esfuerzo para transferir genes a células progenitoras óseas. Al empezar a estudiar esto, tenía que emplearse el modelo animal más apropiado, esto es, uno en el cual las posibilidades de utilizar ácidos nucleicos para promover la reparación ósea pudieran ser adecuadamente ensayadas en estudios controlados.
10. Modelo de osteotomía
Antes de la presente invención, estaban disponibles para el estudio en esta área tres sistemas modelo, que incluían el ratón Mov13, un modelo animal de OI. Desafortunadamente, cada uno de los modelos adolece de inconvenientes significativos. Con el ratón Mov13, en primer lugar, estos ratones mueren típicamente en la mayoría de edad temprana, debido a leucemia inducida por retrovirus (Schnieke et al., 1983); en segundo lugar, los estudios de transferencia genética en el ratón Mov13 llevados a cabo entre las semanas postnatales 8-16 (esto es., antes del desarrollo de la leucemia) pueden complicarse por una adaptación natural en la cual una cantidad significativa de hueso nuevo se deposita en la superficie perióstica (Bonadio et al., 1993); y en tercer lugar, un gen osteotrópico transferido a un sitio de osteotomía puede sinergizarse con el retrovirus activo y hacerlo aún más virulento.
Otro sistema es el modelo de fractura ósea in vivo creada por Einhorn y colaboradores (Bonnarens y Einhorn, 1984). Sin embargo, este modelo es un sistema cerrado que no permitiría fácilmente estudios iniciales de transferencia génica in vivo. El modelo de cultivo de órganos desarrollado por Bolander y colaboradores (Joyce et al., 1990) también estaba disponible, pero otra vez, este modelo no es apropiado para estudiar la transferencia génica in vivo. Debido a que los modelos anteriormente citados no son apropiados para estudiar los efectos de la transferencia génica sobre la repara-
ción y regeneración ósea, los inventores utilizaron un sistema osteotómico murino, tal como se describe seguidamente.
Las características importantes del modelo osteotómico murino son las siguientes: bajo anestesia general, se atornillan cuatro clavos de un diámetro de 1,2 mm en la diáfisis femoral de ratas normales adultas Sprague Dawley. Una plantilla quirúrgica asegura el emplazamiento paralelo de los clavos. Se asegura entonces un fijador sobre éstos, y se crea un defecto segmental (incisión) de 2 mm ó de 5 mm en la diáfisis central, con una sierra Hall 100 microoscilante. Un material de injerto biodegradable, embebido en una solución del ADN plasmídico, o en otra construcción genética o en una preparación de virus recombinante, se sitúa entonces en el canal intramedular y el defecto se cierra (Fig. 5A, Fig. 5B, Fig. 6A, Fig. 6B, Fig. 6C, Fig. 6D, Fig. 7A, Fig. 7B, Fig. 8A, Fig. 8B, Fig. 8C).
Puede detectarse la formación del nuevo hueso tan pronto como tres semanas más tarde en la incisión de 2 mm, aunque se deja generalmente que tenga lugar la formación del nuevo hueso hasta las 9 semanas. El fijador proporcionó la estabilidad necesaria, y no hubo limitaciones en el movimiento de los animales. Hasta la fecha, el protocolo quirúrgico se ha realizado satisfactoriamente en 21/21 animales. Ninguno de ellos ha muerto. Tras el sacrificio, se llevan a cabo ensayos de la formación del hueso nuevo, excepto la radiografía completa, que se realiza semanalmente entre la fecha en que se realizó la cirugía y el sacrificio.
Estudios previos en ratas Sprague Dawley han demostrado que la incisión osteotómica de 5 mm se cicatrizará como una no unión fibrosa, mientras que una incisión de menos de 3 mm, (tal como la de 2 mm utilizada rutinariamente en los estudios descritos en la presente memoria) cicatrizará mediante la formación ósea primaria. Estudios utilizando la incisión de 5 mm permiten pues una determinación de si la expresión transgénica puede estimular la formación de hueso nuevo cuando se espera normalmente la cicatrización por el tejido fibroso. Por otra parte, estudios con la incisión de 2 mm permiten una determinación de si la expresión transgénica puede acelerar la cicatrización ósea primaria natural. Los controles se llevaron también a cabo en los cuales los animales no recibieron ADN (Fig. 9A y Fig. 9B).
11. La transferencia genética promueve la reparación ósea in vivo
Los inventores encontraron sorprendentemente que la transferencia genética a células progenitoras óseas in vivo (esto es, células en el tejido de regeneración de la hendidura osteotómica) podía alcanzarse fácilmente. Habitualmente, los métodos preferidos para alcanzar la transferencia genética implican la utilización de un material de injerto de colágeno fibroso embebido en una solución de ADN poco antes de ser emplazado en el sitio en el cual se desea promover el crecimiento óseo. Como los estudios presentados muestran, el material injertado facilita la captación de las construcciones plasmídicas exógenas por las células (en la hendidura osteotómica) que participan claramente en la regeneración/reparación ósea. Los transgenes, después de la captación celular, dirigen la expresión de polipéptidos recombinantes, tal como se evidencia mediante la expresión in vivo de productos génicos marcadores funcionales.
Se presentan aquí estudios ulteriores que demuestran que la transferencia de un gen osteotrópico da lugar a la expresión celular de una molécula osteotrópica recombinante, cuya expresión se asocia directamente con la estimulación de la formación del hueso nuevo. Después de considerar un número relativamente grande de genes candidatos, un vector génico de transferencia que codifica un fragmento de la hormona paratiroidea humana (hPTH1-34), se seleccionó para los estudios iniciales de los inventores. Se consideraron varios factores al hacer esta selección: (a), los péptidos recombinantes hPTH1-34 pueden discriminarse de cualquier hormona endógena de la rata presente en los tejidos osteotómicos; (b), los péptidos hPTH1-34 estimularán la formación de hueso nuevo en las ratas Sprague Dawley, indicando que el péptido humano puede unirse eficientemente al receptor PTH/PTHrP en la superficie celular osteoblástica de la rata; y (c), existe sólo un receptor PTH/PTHrP, cuyo gen se ha clonado, y están disponibles sondas cADN para el receptor.
Así, en términos de entender el mecanismo de acción del transgen sobre la nueva formación ósea in vivo, los inventores resolvieron que lo más claro era correlacionar la expresión del péptido recombinante hPTH1-34 y su receptor con la formación del hueso nuevo en el modelo osteotómico de la rata. Por supuesto que, siguiendo estos estudios iniciales, se considera que puede utilizarse cualquiera de una amplia variedad de genes en relación con las formas de realización de la transferencia génica ósea de la presente invención.
Estudios previos han indicado que hPTH1-34 es un agente anabólico más potente cuando se administra intermitentemente que cuando se da continuamente. A pesar del hecho de que se espera todavía que un efecto anabólico se produzca con dosificación continua, tal como se ha documentado por los estudios de Parsons y colaboradores (Tam et al., 1982; Spencer et al., 1989), existió la inquietud de que el transgen PLJ-hPTH1-34 puede no funcionar de forma muy efectiva tal como se espera que las células transfectadas expresaran las moléculas recombinantes hPTH1-34 de forma constitutiva. El hallazgo de que la transfección y la expresión del transgen LPH-hPTH1-34 estimuló efectivamente la formación ósea en el modelo osteotómico de la rata, constituyó por tanto un resultado importante.
Como el sitio osteotómico en este modelo está muy vascularizado, una posible complicación de los estudios con el transgen PLJ-hPTH1-34 es la secreción de PTH humano recombinante a partir del sitio osteotómico con hipercalcemia consiguiente y (potencialmente) muerte del animal. Cuando se utilice este transgen, deberán determinarse semanalmente por tanto los niveles cálcicos séricos. El hecho de que no se haya encontrado en este trabajo evidencia de niveles cálcicos séricos alterados, es por tanto un hallazgo ulteriormente alentador.
Estos estudios complementan otros realizados por los inventores en los que se utilizó la transferencia génica directa para introducir genes en el tendón de Aquiles y en el ligamento cruzado, tal como se describe en el Ejemplo XI.
Después de estos hallazgos sorprendentes, resultaron claras para los inventores varias aplicaciones inmediatas para utilizar la liberación de ácidos nucleicos en relación con alteraciones óseas. La transferencia directa de un gen osteotrópico para promover la reparación de fracturas en la práctica ortopédica clínica, constituye justamente una utilización. Otros aspectos importantes de esta tecnología incluyen la utilización de transferencia génica para tratar pacientes con "huesos frágiles", tales como en enfermedades como la osteoporosis; para mejorar la escasa cicatrización que puede producirse por razones desconocidas, por ejemplo, la no unión fibrosa; para promover la integración del injerto y la función de las articulaciones artificiales; para estimular la cicatrización de otros tejidos del esqueleto, tales como el tendón de Aquiles; y como un adyuvante para reparar grandes defectos. En todas estas formas de realización el ADN se utiliza como un agente farmacéutico directo.
12. Equivalentes funcionales biológicos
Tal como se mencionó anteriormente, pueden realizarse modificaciones y cambios en la estructura de un gen osteotrópico y obtener todavía una molécula funcional que codifique una proteína o polipéptido con características deseables. Lo que sigue es una consideración basada en el cambio de aminoácidos de una proteína para crear una equivalente, o incluso una molécula de segunda generación mejorada Los cambios en los aminoácidos pueden alcanzarse cambiando los codones de la secuencia de ADN, según la siguiente tabla de codones:
TABLA 1
Aminoácidos Codones
Alanina Ala A GCA GCC GCG GCU
Cisteína Cys C UGC UGU
Acido aspártico Asp D GAC GAU
Acido glutámico Glu E GAA GAG
Fenilalanina Phe F UUC UUU
Glicina Gly G GGA GGC GGG GGU
Histidina His H CAC CAU
Isoleucina Ile I AUA AUC AUU
Lisina Lys K AAA AAG
Leucina Leu L UUA UUG CUA CUC CUG CUU
Metionina Met M AUG
Asparagina Asn N AAC AAU
Prolina Pro P CCA CCC CCG CCU
Glutamina Gln Q CAA CAG
Arginina Arg R AGA AGG CGA CGC CGG CGU
Serina Ser S AGC AGU UCA UCC UCG UCU
Treonina Thr T ACA ACC ACG ACU
Valina Val V GUA GUC GUG GUU
Triptófano Trp W UGG
Tirosina Tyr Y UAC UAU
Por ejemplo, ciertos aminoácidos pueden sustituirse por otros en una estructura proteica sin pérdida pareciable de capacidad de unión interactiva con estructuras tales como, por ejemplo, regiones de unión a antígenos de anticuerpos o sitios de unión sobre moléculas del substrato. Dado que la capacidad interactiva y la naturaleza de una proteína definen su actividad funcional biológica, ciertas sustituciones secuenciales de aminoácidos pueden realizarse en una secuencia proteica, y, por supuesto, en su secuencia subyacente de ADN codificante, y obtener sin embargo una proteína con propiedades parecidas. Se considera de este modo entonces por los inventores que pueden realizarse varios cambios en las secuencias de genes osteotrópicos sin pérdida apreciable de su utilidad o actividad bioló-
gica.
Al llevar a cabo dichos cambios, puede considerarse el índice hidropático de los aminoácidos. La importancia del índice hidropático aminoácido para conferir función biológica interactiva a una proteína se entiende generalmente en la técnica (Kyte y Doolittle, 1982, que se incorpora a la presente memoria como referencia). Se acepta que el carácter hidropático relativo del aminoácido contribuye a la estructura secundaria de la proteína resultante, la cual a su vez define su interacción con otras moléculas, por ejemplo, enzimas, substratos, receptores, ADN, anticuerpos, antígenos, y análogos.
Se ha asignado un índice hidropático a cada aminoácido sobre la base de su hidrofobicidad y características de carga (Kyte y Doolittle, 1982), que son: Isoleucina (+4,5); valina (+4,2); leucina (+3,8); fenilalanina (+2,8); cisteína/cistina (+2,5); metionina (+1,9); alanina (+ 1,8); glicina (-0,4); treonina (-0,7); serina (-0,8); triptófano (-0,9); tirosina (-1,3); prolina (-1,6); histidina (-3,2); glutamato (-3,5); glutamina (-3,5); aspartato (-3,5); asparagina (-3,5); lisina (-3,9); y arginina (-4,5).
Se sabe en la técnica que ciertos aminoácidos pueden sustituirse por otros que tengan un índice hidropático o evaluación similar y dan lugar todavía a una proteína con una actividad biológica similar, es decir., obtienen todavía una proteína equivalente funcionalmente biológica. Al realizar dichos cambios, es preferible la sustitución de aminoácidos cuyos índices hidropáticos se encuentran dentro de \pm 2, es particularmente preferida la sustitución de los que se encuentran dentro de \pm 1, y aún más preferida es la sustitución de los que se encuentran dentro de \pm 0,5.
Se comprende también en la técnica que la sustitución de aminoácidos parecidos puede realizarse efectivamente basándose en la hidrofilicidad. El documento de Patente U.S: 4.554.101 que se incorpora a la presente memoria como referencia, da a conocer que la hidrofilicidad promedio local mayor de una proteína, gobernada por la hidrofilicidad de sus aminoácidos adyacentes, se correlaciona con una propiedad biológica de la proteína.
Tal como se detalla en el documento de Patente U.S. 4.554.101, los siguientes valores de hidrofilicidad se han asignado a los residuos aminoácidos: arginina, (+3,0); lisina (+3,0); aspartato (+3,0 \pm 1); glutamato (+3,0 \pm 1); serina (+0,3); asparagina (+0,2); glutamina (+0,2); glicina (0); treonina (-0,4); prolina (-0,5 \pm 1); alanina (-0,5); histidina
(-0,5); cisteína (-1,0); metionina (-1,3); valina (-1,5); leucina (-1,8); isoleucina (-1,8); tirosina (-2,3); fenilalanina
(-2,5); triptófano (-3,4).
Se comprende que un aminoácido puede sustituirse por otro que tenga un valor similar de hidrofilicidad y obtener todavía uno biológicamente equivalente, y en particular, una proteína inmunológicamente equivalente. En dichos cambios, se prefiere la sustitución de los aminoácidos cuyos valores de hidrofilicidad están dentro de \pm 2, se prefieren en particular los que están dentro de \pm 1, y los que presentan valores dentro de \pm 0,5 se prefieren aún más particularmente.
Tal como se esbozó anteriormente, las sustituciones de aminoácidos se basan generalmente por tanto en la similitud relativa de los sustituyentes de la cadena lateral aminoácida, por ejemplo, su hidrofobicidad, hidrofilicidad, carga, tamaño, y análogos. Sustituciones ejemplares que consideran varias de las anteriores características son bien conocidas para los expertos en la materia e incluyen: arginina y lisina; glutamato y aspartato; serina y treonina; glutamina y asparagina; y valina, leucina e isoleucina.
13. Mutagénesis específica de un sitio
La mutagénesis específica de un sitio es una técnica útil en la preparación de péptidos individuales, o proteínas ó péptidos equivalentes biológicamente funcionales, mediante mutagénesis específica del ADN subyacente. La técnica proporciona además una capacidad dispuesta para preparar y ensayar variantes secuenciales, por ejemplo, incorporando una o varias de las consideraciones anteriormente mencionadas, introduciendo uno o más cambios de la secuencia nucleótida en el ADN. La mutagénesis específica de un sitio permite la producción de mutantes mediante la utilización de secuencias oligonucleótidas específicas que codifican la secuencia de ADN de la mutación deseada, así como un número suficiente de nucleótidos adyacentes, para proporcionar una secuencia iniciadora de suficiente tamaño y complejidad para formar un duplex estable a ambos lados del empalme de deleción que está siendo atravesado. Típicamente, se prefiere un iniciador de 17 a 25 nucleótidos de longitud, con aproximadamente de 5 a 10 residuos a ambos lados del empalme de la secuencia que está siendo alterada.
En general, la técnica de la mutagénesis específica de un sitio se conoce bien en la técnica, tal como se ejemplifica por varias publicaciones. Como se apreciará, la técnica utiliza típicamente un vector fágico que existe en forma tanto mono como bicatenaria. Los vectores típicos útiles en la mutagénesis dirigida a un sitio incluyen vectores tales como el fago M13. Estos fagos están fácilmente disponibles comercialmente y su utilización es bien conocida generalmente por los expertos en la materia. Los plásmidos bicatenarios se utilizan también rutinariamente en la mutagénesis específica de un sitio que elimina la etapa de transferencia del gen de interés desde un plásmido al fago.
En general, la mutagénesis dirigida a un sitio de acuerdo con las consideraciones adjuntas, se lleva a cabo en primer lugar obteniendo un vector monocatenario o fusionando aparte dos filamentos de un vector bicatenario que incluye en el interior de su secuencia una de ADN que codifica la proteína osteotrópica deseada. Se prepara, generalmente de modo sintético, un iniciador oligonucleótido que lleva la secuencia mutada deseada. Este iniciador se hibridiza entonces con el vector monocatenario, y se somete a enzimas polimerizantes del ADN tal como el fragmento Klenow de la polimerasa I de E.coli, con objeto de completar la síntesis del filamento que transporta la mutación. De este modo, se forma un heteroduplex en el que un filamento codifica la secuencia original no mutada y el segundo filamento transporta la mutación deseada. El vector heteroduplex se utiliza entonces para transformar las células apropiadas, tales como las de E. coli, y se seleccionan clones que incluyen vectores recombinantes que transportan la disposición de secuencia mutada.
Se proporciona la preparación de las variantes secuenciales del gen osteotrópico seleccionado utilizando la mutagénesis dirigida a un sitio como medio de producir tipos potencialmente útiles y no significa que sea limitante, como lo son otras maneras por las cuales pueden obtenerse variantes secuenciales de los genes osteotrópicos. Por ejemplo, vectores recombinantes que codifican el gen osteotrópico deseado, pueden ser tratados con agentes mutagénicos tales como al hidroxilamina, para obtener variantes secuenciales.
14. Generación de anticuerpos monoclonales
Los medios para preparar y caracterizar anticuerpos son bien conocidos en la técnica (Véase, por ejemplo, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988; que se incorpora a la presente memoria como referencia).
Los métodos para generar anticuerpos monoclonales (MAbs) empiezan generalmente según idénticas directrices que los que preparan anticuerpos policlonales. Brevemente, se prepara un anticuerpo policlonal inmunizando un animal con una composición inmunogénica según la presente invención y recuperando los antisueros de aquel animal inmunizado. Pueden utilizarse una amplia variedad de especies animales para la producción de antisueros. Típicamente el animal utilizado para la producción de los antisueros es un conejo, un ratón, una rata, un hámster, un cobaya o una cabra. A causa del volumen sanguíneo relativamente grande de los conejos, un conejo constituye la selección preferida para la producción de anticuerpos policlonales.
Como se conoce bien en la técnica, una composición dada puede variar en su inmunogenicidad. Es a menudo necesario, por tanto, revacunar el sistema inmune del huésped, como puede lograrse uniendo un inmunógeno péptido o polipéptido a un vehículo. Vehículos preferidos y ejemplares son la hemocianina de lapa (KLH) y la albúmina sérica bovina (BSA). Otras albúminas, tales como la ovoalbúmina, albúmina sérica del ratón o albúmina sérica del conejo pueden también utilizarse como vehículos. Los medios para unir un polipéptido a una proteína vehículo se conocen bien en la técnica e incluyen glutaraldehído, éster m-maleimidobenzoil-N-hidroxisuccinimida, carbodiimida y bencidina bis-binitrogenada.
Como también se conoce bien en la técnica, la inmunogenicidad de una composición inmunógena particular puede estimularse mediante la utilización de estimuladores no específicos de la respuesta inmune, conocidos como adyuvantes. Adyuvantes preferidos y ejemplares incluyen el adyuvante completo de Freund (un estimulador no específico de la respuesta inmune que contiene Mycobacterium tuberculosis muerto), adyuvantes incompletos de Freund y adyuvante de hidróxido de aluminio.
La cantidad de composición inmunógena utilizada en la producción de anticuerpos policlonales, varía según la naturaleza del inmunógeno así como según el animal utilizado para la inmunización. Pueden utilizarse para administrar el inmunógeno distintas vías (subcutánea, intramuscular, intradérmica, intravenosa e intraperitoneal). La producción de anticuerpos policlonales puede controlarse mediante el muestreo de sangre del animal inmunizado en varios puntos después de la inmunización. Se puede administrar también una segunda inyección de recuerdo. El procedimiento de revacunación y titulación se repite hasta que se alcanza un título apropiado. Cuando se obtiene un nivel deseado de inmunogenicidad, el animal inmunizado puede sangrarse y el suero aislado y almacenado, y/o puede utilizarse el animal para generar MAbs.
Los MAbs pueden prepararse fácilmente utilizando técnicas bien conocidas, tales como las que se ejemplifican en el documento de Patente 4.196.265 que se incorpora a la presente memoria como referencia. Típicamente, esta técnica implica la inmunización de un animal apropiado con una composición inmunógena seleccionada, por ejemplo, una proteína LTBP-3 purificada o parcialmente purificada, polipéptido o péptido. La composición de inmunización se administra de forma efectiva para estimular las células productoras de anticuerpos. Los roedores tales como ratones y ratas son animales preferidos, pero sin embargo, la utilización de las células del conejo, oveja y rana es también posible. La utilización de ratas puede proporcionar ciertas ventajas (Goding, 1986, pp. 60-61), pero se prefieren los ratones, siendo los ratones BALB/c los más preferidos, pues son los que se utilizan más rutinariamente y dan lugar a porcentajes más altos de fusiones estables.
Después de la inmunización, las células somáticas con potencial para producir anticuerpos, específicamente los linfocitos B (células B), se seleccionaron para utilizarlas en el protocolo de generación de MAb. Estas células pueden obtenerse a partir de bazos biopsiados, amígdalas o nódulos linfáticos, o a partir de una muestra de sangre periférica. Se prefieren las células del bazo y las células sanguíneas, las primeras porque constituyen una rica fuente de células que producen anticuerpos las cuales están en la fase hemocitoblástica de división, y las otras porque la sangre periférica es fácilmente accesible. A menudo, se inmunizará un conjunto de animales y el bazo del animal con el título de anticuerpos más alto será extraído y se obtendrán los linfocitos de este órgano mediante su homogenización con una jeringa. Típicamente, un bazo de un ratón inmunizado contiene aproximadamente 5 x 10^{7} a 2 x 10^{8} linfocitos.
Los linfocitos B productores de anticuerpos del animal inmunizado se fusionan entonces con células de una progenie celular inmortal de mieloma, generalmente una del mismo tipo que el animal que fue inmunizado. Las progenies celulares de mieloma que son adecuadas para su utilización en los procedimientos de fusión productores de hibridomas, no producen anticuerpos preferentemente, poseen una alta eficiencia de fusión, y deficiencias enzimáticas que hacen que sean incapaces de crecer en ciertos medios selectivos que soportan el crecimiento de sólo las células fusionadas que se desea (hibridomas).
Puede utilizarse cualquiera de varias células de mieloma como saben los expertos en la materia (Goding, pp. 65-66, 1986; Campbell, pp. 75-83, 1984). por ejemplo, cuando el animal inmunizado es un ratón, se pueden utilizar P3-X63/Ag8, X63-Ag8.653,NS1/1.Ag 4 1, Sp210-Ag14, FO, NSO/U, MPC-11, MPC11-X45-GTG 1.7 y S194/5XX0 Bul; para ratas, se pueden utilizar R210.RCY3, Y3-Ag 1.2.3, IR983F y 4B210; y U-266, GM1500-GRG2, LICR-LON-HMy2 y UC729-6 siendo todas útiles en relación con las fusiones celulares humanas.
Una célula preferida de mieloma murino es la progenie celular de mieloma NS-1 (también denominada P3-NS-1-Ag4-1), que está fácilmente disponible en el NIGMS Human Genetic Mutant Cell Repository solicitando el número de depósito GM3573 de la progenie celular. Otra progenie celular de mieloma de ratón que puede utilizarse es la progenie celular SP2/0 de mieloma murino no productora de resistencia a la 8-azaguanina.
Los métodos para generar híbridos de células de nódulos linfáticos o de bazo que producen anticuerpos y de células de mieloma comprenden habitualmente la mezcla de células somáticas con células de mieloma en una proporción de 2:1, aunque ésta puede variar entre aproximadamente 20:1 a 1:1, respectivamente, en presencia de un agente o agentes (químicos o eléctricos) que promueven la fusión de las membranas celulares. Los métodos de fusión utilizando el virus de Sendai se han descrito por Kohler y Milstein (1975; 1976) y los que utilizan polietilenglicol (PEG), tal como PEG al 37% (v/v), por Gefter et al., (1977). El empleo de métodos de fusión inducidos eléctricamente es también apropiado (Goding, pp. 71-74, 1986).
Los procedimientos de fusión producen habitualmente híbridos viables a frecuencias bajas, alrededor de 1 x 10^{-6} a 1 x 10^{-8}. Sin embargo, esto no constituye un problema, pues los híbridos fusionados viables se diferencian de las células no fusionadas parentales (particularmente de las células de mieloma no fusionadas que continuarán normalmente dividiéndose indefinidamente) cultivándolas en un medio selectivo. El medio selectivo es generalmente uno que contiene un agente que bloquea la síntesis de novo de nucleótidos en el medio de cultivo tisular. Agentes ejemplares y preferidos son la aminopterina, el metotrexato y la azaserina. La aminopterina y el metotrexato bloquean la síntesis de novo de ambas, purinas y pirimidinas, mientras que la azaserina bloquea sólo la síntesis purínica. Cuando se utilizan la aminopterina o el metotrexato, el medio se suplementa con hipoxantina y timidina como fuente de nucleótidos (medio HAT). Cuando se utiliza la azaserina, el medio se suplementa con hipoxantina.
El medio de selección preferido es HAT. Sólo las células capaces de realizar vías de salvamento de nucleótidos son capaces de sobrevivir en el medio HAT. A las células de mieloma les faltan enzimas clave de las vías de salvamento, por ejemplo., la hipoxantina fosforribosil transferasa (HPRT), y no pueden sobrevivir. Las células B pueden realizar esta vía, pero tienen una vida limitada en el cultivo y mueren generalmente en el plazo de aproximadamente dos semanas. Por tanto, las únicas células que pueden sobrevivir en el medio selectivo son los híbridos formados a partir del mieloma y de las células B.
Este cultivo proporciona una población de hibridomas a partir de los cuales se seleccionan hibridomas específicos. Típicamente, la selección de hibridomas se lleva a cabo cultivando las células mediante dilución de clones únicos en placas de microtitulación, seguido por ensayo de los sobrenadantes clonales individuales (después de dos a tres semanas) en cuanto a la deseada reactividad. El ensayo debería ser sensible, simple y rápido, tal como radioinmunoensayo, inmunoensayo enzimático, ensayo de citotoxicidad, ensayos de calvas, ensayos de inmunounión a mancha, y análogos.
Los hibridomas seleccionados se diluirán entonces seriadamente y se clonarán en progenies celulares individuales productoras de anticuerpos, los cuales clones pueden entonces propagarse indefinidamente para proporcionar MAbs. Las progenies celulares pueden explotarse para la producción de MAb de dos formas básicas. Una muestra del hibridoma puede inyectarse (a menudo en el interior de la cavidad peritoneal) en un animal histocompatible del tipo que se utilizó para proporcionar las células somáticas y de mieloma para la fusión original. El animal inyectado desarrolla tumores que secretan el anticuerpo monoclonal específico producido por el híbrido celular fusionado. Los líquidos corporales del animal, tales como suero o líquido ascítico, pueden entonces drenarse para proporcionar MAbs a altas concentraciones. Las progenies celulares individuales podrían también cultivarse in vitro, donde los MAbs se secretan naturalmente al medio de cultivo a partir del cual pueden obtenerse fácilmente a concentraciones altas. Los MAbs producidos mediante cualquiera de los medios, pueden ser purificados ulteriormente, si se desea, utilizando filtración, centrifugación y varios métodos cromatográficos tales como HPLC o cromatografía de afinidad.
15. LTBP-3
Otros aspectos de la presente invención se refieren a segmentos aislados de ADN y a vectores recombinantes que codifican LTBP-3, y a la creación y utilización de células huéspedes recombinantes a través de la aplicación de la tecnología del ADN, que expresan productos del gen LTBP-3. Como tal, la presente invención se refiere a un segmento de ADN que comprende un gen aislado que codifica una proteína o péptido que incluye una secuencia aminoácida tal como se expone esencialmente por una secuencia contigua de SEC ID Nº:3. Estos segmentos de ADN están representados por los que incluyen una secuencia ácido nucleico tal como se expone esencialmente por una secuencia contigua de SEC ID Nº:2 (Fig. 25). La invención abarca también composiciones que incluyen una proteína purificada que posee una secuencia aminoácida, tal como se expone esencialmente por la secuencia aminoácida de SEC ID Nº:3 (Fig. 26).
Los TGF-\betas representan una familia de moléculas relacionadas estructuralmente con efectos diversos sobre la forma de las células de los mamíferos, crecimiento, y diferenciación (Roberts y Sporn, 1990). Sintetizados inicialmente como un precursor que está formado por una propéptido amino-terminal seguido por TGF-\beta maduro, dos cadenas de pro-TGF-\beta naciente, se asocian en la mayoría de los tejidos para formar un dímero inactivo unido a disulfuro de un Mr de 106.000 aproximadamente. Los homodímeros son más habituales, pero los héterodímeros se han descrito también (Cheifetz et al., 1987; Ogava et al., 1992). Durante la biosíntesis el dímero maduro TGF-\beta es fragmentado a partir del dímero propéptido. El estado latente de TGF-\beta proviene en parte de la asociación no covalente del propéptido y de los dímeros maduros TGF-\beta (Pircher et al., 1984, 1986; Wakefield et al., 1987; Millan et al., 1992; Miyazono y Heldin, 1989). Consecuentemente, al dímero propéptido se hace referencia a menudo como la proteína asociada al estado latente (LAP), y LAP más el dímero de TGF-\beta unido a disulfuro se conoce también como el pequeño complejo del estado latente. En el espacio extracelular los pequeños complejos del estado latente deben disociarse para activar los TGF-\beta maduros. Se cree que el mecanismo de activación del complejo del estado latente es una de las etapas más importantes que gobiernan los efectos de TGF-\beta (Lyons et al., 1988; Antonelli-Orlidge et al., 1989; Twardzik et al., 1990; Sato et al., 1993).
En ciertas progenies de células cultivadas los pequeños complejos de estado latente de los factores de crecimiento pueden contener proteínas adicionales de alto peso molecular. La mejor caracterizada de estas proteínas de alto peso molecular es la proteína latente de unión TGF-\beta ó LTPB (Miyazono et al., 1988; Kanzaki et al., 1990; Tsuji et al., 1990; Olofsson et al., 1992; Taketazu et al., 1994). LTBP producida por distintos tipos celulares es de tamaño heterogéneo, quizás a causa del empalme alternativo o a causa del procesado, proteolítico tisular específico (Miyazono et al., 1988; Wakefield et al., 1988; Kanzaki et al., 1990; Tsuji et al., 1990). Los complejos de estado latente TGF-\beta que contienen LTBP se conocen como complejos grandes de estado latente. LTPB no tiene enlace covalente al TGF-\beta maduro, pero está unido por un enlace disulfuro a LAP.
En cuanto a la nueva proteína LTBP-3, la presente invención se refiere a segmentos de ADN, que pueden aislarse a partir virtualmente de cualquier origen mamífero, que son libres del ADN genómico total y que codifican proteínas que tienen actividad de tipo LTBP-3. Los segmentos de ADN que codifican tipos de tipo LTBP-3 pueden probar a codificar proteínas, polipéptidos, subunidades, dominios funcionales, y análogos.
Tal como se utiliza en la presente memoria, el término "segmento de ADN" se refiere a una molécula de ADN que se ha aislado libre del ADN genómico total de una especie particular. Por tanto, un segmento de ADN que codifica LTBP-3 se refiere a una segmento de ADN que contiene secuencias que codifican LTBP-3 que se aísla lejos del, o se purifica libre del, ADN genómico total de la especie de la cual el segmento de ADN se obtiene. Incluidos dentro del término "segmento de ADN" están segmentos de ADN y fragmentos de dichos segmentos más pequeños, y también vectores recombinantes, que incluyen, por ejemplo, plásmidos, cósmidos, fagémidos, fagos, virus, y análogos.
De modo similar, un segmento de ADN que comprende un gen LTBP-3 aislado o purificado se refiere a un segmento de ADN que incluye secuencias codificantes LTBP-3 y, en ciertos aspectos, secuencias reguladoras, aisladas sustancialmente lejos de otros genes que se encuentran naturalmente o de secuencias que codifican proteínas. A este respecto, el término "gen" se utiliza por simplicidad para referirse a una unidad que codifica una proteína funcional, polipéptido o péptido. Como se entenderá por los expertos en la materia, este término funcional incluye tanto secuencias genómicas, como secuencias cADN y segmentos génicos más pequeños obtenidos mediante ingeniería genética que expresan, o pueden adaptarse para expresar, proteínas, polipéptidos o péptidos.
"Aislado sustancialmente lejos de otras secuencias codificantes" significa que el gen de interés, en este caso, un gen que codifica LTBP-3, constituye la parte significativa de la región codificante del segmento de ADN, y que el segmento de ADN no contiene porciones grandes de ADN codificante que se encuentre naturalmente, tales como fragmentos cromosómicos grandes u otros genes funcionales o regiones codificantes cADN. Por supuesto, esto se refiere al segmento de ADN originalmente aislado, y no excluye genes o regiones codificantes que se han añadido después al segmento por el hombre.
En formas de realización particulares, la invención se refiere a segmentos aislados de ADN y a vectores recombinantes que incorporan secuencias de ADN que codifican un tipo de LTBP-3 que incluye en el interior de su secuencia aminoácida una secuencia aminoácida, tal como se expone esencialmente en la SEC ID Nº:3. En otras formas de realización particulares, la invención se refiere a segmentos aislados de ADN y vectores recombinantes que incorporan secuencias de ADN que incluyen en su interior una secuencia nucleótida tal como se expone esencialmente en la SEC ID Nº:2.
El término "una secuencia tal como se expone esencialmente en la SEC ID Nº:3" significa que la secuencia corresponde sustancialmente a una parte de la SEC ID Nº:3 y posee relativamente pocos aminoácidos que no sean idénticos a, o equivalentes biológicamente funcionales de los aminoácidos de la SEC ID Nº:3. El término "equivalente biológicamente funcional" se entiende bien en la técnica y se define ulteriormente aquí de modo detallado (por ejemplo, véase la sección 7, formas de realización preferidas). De acuerdo con esto, las secuencias que tienen entre alrededor del 70% y alrededor del 80%; o más preferentemente, entre alrededor del 81% y alrededor del 90%; o aún más preferentemente, entre alrededor del 91% y alrededor del 99%; de los aminoácidos que son idénticos o funcionalmente equivalentes a los aminoácidos de la SEC ID Nº:3, serán secuencias que son "tal como se exponen esencialmente en la SEC ID Nº:3".
En algunas otras formas de realización, la presente invención se refiere a segmentos aislados de ADN y vectores recombinantes que incluyen en su secuencias una secuencia de ácido nucleico tal como se expone esencialmente en la SEC ID Nº:2. El término ``tal como se expone esencialmente en la SEC ID Nº:2 se utiliza en idéntico sentido que el descrito anteriormente y significa que la secuencia de ácido nucleico corresponde sustancialmente a una parte de la SEC ID Nº:2 y posee relativamente pocos codones que no son idénticos, o funcionalmente equivalentes, a los codones de SEC ID Nº:2. Otra vez, los segmentos de ADN que codifican proteínas que presentan actividad de tipo LTBP-3 serán los más preferidos.
Se entenderá también que las secuencias aminoácido y ácido nucleico pueden incluir residuos adicionales, tales como aminoácidos N ó C terminales ó secuencias del extremo 5' o del extremo 3', y será todavía tal como se expone esencialmente en una de las secuencias que aquí se dan a conocer, siempre que la secuencia cumpla con los criterios anteriormente expuestos, incluyendo el mantenimiento de la actividad biológica de la proteína en lo que se refiere a la expresión proteica. La adición de secuencias terminales afecta particularmente a secuencias de ácido nucleico que pueden, por ejemplo, incluir varias secuencias no codificantes que flanquean alguna de las porciones del extremo 5' o del 3' de la región codificante o pueden incluir varias secuencias internas, es decir, intrones, que se sabe que están en el interior de los genes.
Naturalmente, la presente invención abarca también segmentos de ADN que son complementarios, o esencialmente complementarios, para la secuencia que se expone en SEC ID Nº:2. Las secuencias de ácido nucleico que son "complementarias" son aquéllas que son capaces de aparearse según las reglas estándar de complementariedad de Watson-Crick. Tal como se utiliza en la presente memoria, el término "secuencias complementarias" significa secuencias de ácido nucleico que son sustancialmente complementarias, como puede comprobarse por la misma comparación nucleótida que anteriormente se expone, o que se define como siendo capaz de hibridizarse con el segmento de ácido nucleico de la SEC ID Nº:2, bajo condiciones relativamente estrictas tales como las que aquí se describen.
Los segmentos de ácido nucleico de la presente invención, a pesar de la longitud de la misma secuencia codificante, pueden combinarse con otras secuencias de ADN, tales como promotores, señales de poliadenilación, sitios enzimáticos adicionales de restricción, sitios múltiples de clonación, otros segmentos codificantes, y análogos, de forma que su longitud total puede variar considerablemente. Se contempla por tanto que pueda utilizarse un fragmento de ácido nucleico de casi cualquier longitud, estando limitada la totalidad de ésta, preferentemente, por la facilidad de preparación y utilización en el protocolo de ADN recombinante que se tiene la intención de llevar a cabo. Por ejemplo, pueden prepararse fragmentos de ácido nucleico que incluyen un trozo corto continuo idéntico a o complementario de la SEC ID Nº:2, tal como de aproximadamente 14 nucleótidos, y que tienen una longitud de hasta 10.000 pares de bases aproximadamente ó alrededor de 5.000 pares de bases, prefiriéndose en algunos casos segmentos de 3.000 aproximadamente. Los segmentos de ADN con longitudes totales de aproximadamente 1.000, 500, 200, 100 y 50 pares de bases de longitud son contemplados también como útiles.
Se entenderá fácilmente que "longitudes intermedias" en estos contextos, significa cualquier longitud entre los intervalos entrecomillados, tales como 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, etc; 21, 22, 23, etc; 30, 31, 32, etc; 50, 51, 52, 53, etc; 100, 101, 102, 103, etc; 150, 151, 152, 153, etc; incluyendo todos los enteros dentro de los intervalos 200-500; 500-1.000; 1.000-2.000; 2.000-3.000; 3.000-5.000; 5.000-10.000, hasta e incluyendo secuencias de alrededor de 12.001, 12.002, 13.001, 13.002 y análogos.
También se comprenderá que la presente invención no se limita a las secuencias de aminoácidos y de ácido nucleico particulares de SEC ID Nº:2 y SEC ID Nº:3. Vectores recombinantes y segmentos aislados de ADN pueden por tanto incluir de modo variado las regiones codificantes LTBP-3 ellas mismas, las regiones codificantes que muestran alteraciones o modificaciones seleccionadas en la región codificante básica, o pueden codificar polipéptidos más grandes que, sin embargo, incluyen las regiones codificantes LTBP-3 o pueden codificar proteínas o péptidos equivalentes biológicamente funcionales que poseen secuencias de aminoácidos variables.
Los segmentos de ADN de la presente invención abarcan proteínas LTBP-3 y péptidos equivalentes biológicamente funcionales. Dichas secuencias pueden producirse como consecuencia de redundancia de codones y equivalencia funcional que se sabe se producen de forma natural en el interior de secuencias de ácidos nucleicos y de las proteínas así codificadas. Alternativamente, pueden crearse proteínas o péptidos funcionalmente equivalentes mediante la aplicación de la tecnología del ADN recombinante, en los cuales pueden provocarse tecnológicamente cambios en la estructura proteica, basados en consideraciones de las propiedades de los aminoácidos que se están cambiando. Los cambios diseñados por el hombre pueden introducirse mediante la aplicación de técnicas de mutagénesis de un sitio, por ejemplo., para introducir mejoras en la antigenicidad de la proteína o ensayar mutantes con objeto de examinar la actividad a nivel molecular.
Si se desea, se pueden preparar también proteínas de fusión y péptidos, por ejemplo., donde las regiones codificantes LTBP-3 se alinean en el interior de la misma unidad de expresión con otras proteínas o péptidos que tienen funciones deseadas, con propósitos de purificación o de inmunodetección (por ejemplo., proteínas que pueden purificarse mediante cromatografía de afinidad y regiones que codifican marcadores enzimáticos, respectivamente).
Los vectores recombinantes constituyen aspectos ulteriores de la presente invención. Se consideran como vectores particularmente útiles aquellos en los que la porción codificante del segmento de ADN, si codifica una proteína entera o un péptido más pequeño, se sitúa bajo el control de un promotor. El promotor puede estar en forma del que se asocia de forma natural con un gen LTBP-3, pues puede obtenerse aislando las secuencias no codificantes del extremo 5' localizadas por encima del segmento codificante o exón, por ejemplo, utilizando clonación recombinante y/o tecnología PCR™, en relación con las composiciones que se dan aquí a conocer.
En otras formas de realización, se considera que se obtendrán ciertas ventajas situando el segmento de ADN codificante bajo el control de un promotor recombinante o heterólogo. Tal como se utiliza aquí, un promotor recombinante o heterólogo tiene la intención de referirse a un promotor que no se asocia normalmente con un gen LTBP-3 en su entorno natural. Dichos promotores pueden incluir promotores LTBP-3 que se asocian normalmente con otros genes, y/o promotores aislados a partir de cualquier célula bacteriana, viral, eucarióta ó de mamífero. Naturalmente, será importante utilizar un promotor que dirija efectivamente la expresión del segmento de ADN en el tipo celular, organismo, o incluso animal, que se seleccione para la expresión. La utilización del promotor y las combinaciones del tipo celular para la expresión proteica es conocido por los expertos en la materia de biología molecular, por ejemplo, véase Sambrook et al., 1989. Los promotores empleados pueden ser constitutivos, o inducibles, y pueden utilizarse bajo condiciones apropiadas para dirigir la expresión de alto nivel del segmento de ADN introducido, tal como es ventajoso en la producción a gran escala de proteínas recombinantes o péptidos. Sistemas de promotores apropiados que se consideran para utilización en la expresión de alto nivel incluyen, pero no se limitan a, el sistema vector de expresión de Pichia (Pharmacia LKB Biotechnology) (véase aquí Ejemplo XVI).
En relación con las formas de realización de la expresión para preparar las proteínas LTBP-3 recombinantes y los péptidos, se considera que se utilizarán más a menudo los segmentos de ADN más largos, siendo los más preferidos los segmentos de ADN que codifican la proteína LTBP-3 entera o sus dominios funcionales, subunidades, etc. Sin embargo, se apreciará que la utilización de segmentos de ADN más cortos para dirigir la expresión de los péptidos LTBP-3 ó de las regiones nucleares epitópicas, tal como puede utilizarse para generar anticuerpos anti-LTBP-3, queda también dentro del alcance de la presente invención. Los segmentos de ADN que codifican antígenos peptídicos de 15 a 50 aminoácidos de largo aproximadamente, o más preferentemente, desde aproximadamente 15 a aproximadamente 30 aminoácidos de longitud, se considera que son particularmente útiles.
El gen LTBP-3 y los segmentos de ADN pueden también utilizarse en relación con la expresión somática en un animal o en la creación de un animal transgénico. Otra vez, en dichas formas de realización, se considera particularmente la utilización de un vector recombinante que dirige la expresión de la proteína LTBP-3 entera o activa.
Además de su empleo para dirigir la expresión de la proteína LTBP-3, las secuencias de ácido nucleico que aquí se dan a conocer presentan también diversas otras utilizaciones. Por ejemplo, también son útiles como sondas o iniciadores en formas de realización de hibridación de ácidos nucleicos. Como tal, se considera que los segmentos de ácido nucleico que comprenden una región secuencial que está formada por lo menos por una secuencia continua con una longitud de 14 nucleótidos que presenta idéntica secuencia que, o es complementaria de, una secuencia continua con una longitud de 14 nucleótidos de SEC ID Nº:2, encontrarán una utilidad particular. Secuencias complementarias o idénticas contiguas más largas por ejemplo., son las de alrededor de 20, 30, 40, 50, 100, 200, 500, 1000 (que incluyen todas las longitudes intermedias) incluso hasta secuencias completas, serán de utilidad en ciertas formas de realización.
La capacidad de dichas sondas de ácido nucleico para hibridizar específicamente las secuencias que codifican LTBP-3 les permitirá ser útiles para detectar la presencia de secuencias complementarias en una muestra dada. Sin embargo, se imaginan otros usos, incluyendo la utilización de la información secuencial para la preparación de iniciadores de tipo mutante, o iniciadores para utilizar en la preparación de otras construcciones genéticas.
Las moléculas de ácido nucleico que poseen regiones secuenciales formadas por trozos nucleótidos contíguos de 10-14, 15-20, 30, 50 o incluso de 100-200 nucleótidos o así, idénticas o complementarias de la SEC ID Nº:2, se consideran particularmente como sondas de hibridación para utilización en por ejemplo., la transferencia Northern ó Southern. Esto permitiría a los genes estructurales y reguladores de LTBP-3 ser analizados, tanto en diversos tipos celulares, como también en diversas células de mamífero. El tamaño total del fragmento, así como el tamaño del trozo(s) complementario, dependerá en última instancia de la utilización propuesta o de la aplicación del segmento particular de ácido nucleico. Los fragmentos más pequeños tendrán utilidad generalmente en formas de realización de hibridación, en la que la longitud de la región complementaria contigua puede variar, tal como entre alrededor de 10-14 y alrededor de 100 nucleótidos, pero pueden utilizarse trozos contiguos más grandes de complementariedad, según la longitud de las secuencias complementarias que se desean detectar.
La utilización de una sonda de hibridación de alrededor de 10-14 nucleótidos de longitud permite la formación de una molécula duplex que es tanto estable como selectiva. Se prefieren generalmente las moléculas que poseen secuencias complementarias contiguas sobre trozos mayores que 10 bases de longitud, aunque, con objeto de aumentar la estabilidad y la selectividad del híbrido, y mejorar de este modo la calidad y el grado de moléculas híbridas específicas obtenidas. Se preferirá generalmente diseñar moléculas de ácido nucleico que posean trozos complementarios de 15 a 20 nucleótidos contiguos, o aún más largos, si se desea.
Las sondas de hibridación pueden seleccionarse a partir de cualquier parte de cualquiera de las secuencias que aquí se dan a conocer. Todo lo que se necesita es revisar la secuencia que se expone en SEC ID Nº:2 y seleccionar cualquier porción continua de la secuencia, desde alrededor de 10-14 nucleótidos de longitud hasta e incluyendo la secuencia total, que se desea utilizar como una sonda o iniciador. La selección de las secuencias de la sonda y del iniciador puede gobernarse por varios factores, tales como, sólo por ejemplo, que uno puede desear utilizar iniciadores hacia el extremo de la secuencia total.
El procedimiento de seleccionar y preparar un segmento de ácido nucleico que incluye una secuencia contigua del interior de la SEC ID Nº:2 puede describirse alternativamente como preparar un fragmento de ácido nucleico. Por supuesto, pueden obtenerse también fragmentos mediante otras técnicas tales como por ejemplo., cizalladura mecánica o mediante digestión enzimática de restricción. Pueden prepararse fácilmente pequeños segmentos de ácido nucleico o fragmentos, por ejemplo, sintetizando directamente el fragmento mediante medios químicos, como se realiza habitualmente utilizando un sintetizador automatizado de oligonucleótidos. También pueden obtenerse fragmentos mediante aplicación de la tecnología de reproducción de ácidos nucleicos, tal como la PCR™ del documento de Patente 4.603.102 (que se incorpora a la presente memoria como referencia), introduciendo secuencias seleccionadas en vectores recombinantes para producción recombinante, y mediante otras técnicas de ADN recombinante que son generalmente conocidas para los expertos en biología molecular.
De acuerdo con esto, las secuencias de nucleótidos de la presente invención pueden utilizarse por su capacidad para formar selectivamente moléculas duplex con trozos complementarios de fragmentos génicos LTBP-3 ó cADN. Dependiendo de la aplicación que se prevea, se desearán utilizar condiciones variables de hibridación para alcanzar grados variados de selectividad de la sonda respecto a la secuencia diana. Para aplicaciones que requieran una alta selectividad, se deseará típicamente utilizar condiciones relativamente estrictas para formar los híbridos, por ejemplo., se seleccionarán condiciones de soluciones bajas en sales y/o temperaturas altas, tales como las proporcionadas por aproximadamente 0,02 M a 0,15 M de NaCl aproximadamente a temperaturas de 50ºC a 70ºC. Tales condiciones selectivas toleran un mínimo, si alguno, emparejamiento entre la sonda y el molde o el filamento diana, y serán particularmente apropiadas para aislar los genes LTBP-3.
Por supuesto que para algunas aplicaciones, por ejemplo, cuando se desean preparar mutantes utilizando un filamento iniciador mutante hibridizado con un molde subyacente o si se busca aislar las secuencias codificantes LTBP-3 a partir de especies relacionadas, equivalentes funcionales o análogos, se necesitarán típicamente condiciones de hibridación menos estrictas con objeto de permitir la formación de heterodúplex. En estas circunstancias, se puede desear utilizar condiciones tales como sales de aproximadamente 0,15 M a aproximadamente 0,9 M, a temperaturas que oscilan entre 20ºC y 55ºC. Las especies que se hibridizan cruzadamente pueden identificarse rápidamente como señales de hibridación positiva respecto a las hibridaciones de control. En cualquier caso, se aprecia generalmente que las condiciones pueden volverse más estrictas añadiendo cantidades de formamida que van aumentando, lo que sirve para desestabilizar el duplex híbrido de igual forma que la temperatura aumentada. Así, las condiciones de hibridación pueden manipularse fácilmente, y de este modo constituirá generalmente un método de selección dependiendo de los resultados deseados.
En algunas formas de realización, será ventajoso emplear secuencias de ácidos nucleicos de la presente invención en combinación con medios apropiados, tales como un marcador, para determinar la hibridación. Se conocen en la técnica una amplia variedad de medios indicadores apropiados, que incluyen ligandos fluorescentes, radioactivos, enzimáticos u otros, tales como la avidina/biotina, que son capaces de dar lugar a una señal detectable. En formas de realización preferidas, se deseará probablemente emplear un marcador fluorescente o enzimático, tal como ureasa, fosfatasa alcalina o peroxidasa, en vez de reactivos radioactivos u otros indeseables del entorno. En el caso de los marcadores enzimáticos, pueden utilizarse substratos indicadores colorimétricos, que se conocen para proporcionar un medio visible al ojo humano o espectrofotométricamente, para identificar hibridación específica con muestras que contengan ácidos nucleicos complementarios.
En general se prevé que las sondas de hibridación descritas aquí serán útiles tanto como reactivos en la solución de hibridación como en las formas de realización que utilizan una fase sólida. En formas de realización que implican una fase sólida, el ADN de prueba (o ARN) es adsorbido o fijado de otro modo a una matriz o superficie seleccionada. Este ácido nucleico monocatenario fijado, se somete entonces a una hibridación específica con sondas seleccionadas bajo condiciones deseadas. Las condiciones seleccionadas dependerá de las circunstancias particulares que se basan en los criterios particulares que se requieren (dependiendo por ejemplo, del contenido de G+C, tipo de ácido nucleico diana, fuente del ácido nucleico, tamaño de la sonda de hibridación, etc). Después del lavado de la superficie hibridizada de modo que se eliminen las moléculas que no están unidas específicamente, se detecta la hibridación específica, cuantificándose incluso, mediante el marcador.
Los siguientes ejemplos se incluyen para demostrar formas de realización preferidas de la invención. Debe apreciarse por los expertos en la técnica que las técnicas que se dan a conocer en los ejemplos que siguen, representan técnicas descubiertas por los inventores para poder llevar bien a cabo la práctica de la invención, y de este modo, puede considerarse que constituyen modos preferidos para su práctica. Sin embargo, aquellos expertos en la materia deberían, a la luz de la presente exposición, apreciar que pueden realizarse muchos cambios en las formas de realización específicas
que se exponen y obtener todavía un resultado similar o análogo sin apartarse del espíritu y alcance de la invención.
Ejemplo I Modelo animal para evaluar la formación de nuevo hueso
Como diversos modelos animales no eran apropiados para estudiar los efectos de la transferencia de los ácidos nucleicos sobre la formación ósea, los inventores emplearon el siguiente sistema modelo. Las importantes características del modelo osteotómico de la rata, son tal como se describen en el protocolo siguiente (que se completa generalmente en 25-35 minutos).
La osteotomía se realizó sobre un fémur por animal. No hubieron diferencias significativas entre las extremidades derechas o izquierdas, pero dichas diferencias se controlaron en estos estudios, ya que la extremidad que recibe la osteotomía es al azar.
Después de la preparación pre-operatoria (es decir, afeitado y frotado con Betadine®), ratas machos adultos Sprage-Dawley (\sim500 g, machos reproductores retirados) se anestesiaron utilizando una mezcla de 3% de halotano y de 97% de oxígeno (700 ml/min de velocidad de flujo). Sobre una de las extremidades, se llevó a cabo una aproximación lateral al fémur. Utilizando guías quirúrgicas especialmente diseñadas, cuatro clavos de 1,2 mm de diámetro se clavaron en la diáfisis después de una preperforación con una broca de precisión de alta velocidad. Una plantilla quirúrgica aseguraba la disposición paralela y precisa de los clavos. El orden de la disposición de los clavos era siempre la misma: primero próximo externo y entonces distal externo, próximo interior y distal interior (con "externo" e "interno" refiriéndose a la distancia a partir de la articulación de la cadera). La disposición de los clavos en el centro del fémur se aseguró mediante imagen fluoroscópica durante el emplazamiento de aquéllos. El fijador externo se aseguró sobre los clavos y se creó un defecto segmental de 1 ó 2 mm en la diáfisis central mediante una incisión utilizando una sierra oscilante Hall Micro 100 (cuchillas quirúrgicas #5053-60 Hall) bajo irrigación constante. Aparte del tamaño del defecto segmental, no existe diferencia entre los 5 mm y los 2 mm de los protocolos de osteotomía (Fig. 5A, Fig. 5B, Fig. 6A, Fig. 6B, Fig. 6C, Fig. 6D, Fig. 7A, Fig. 7B, Fig. 8A, Fig. 8B, Fig. 8C).
El contenido del sitio de osteotomía se irrigó con solución salina estéril y el material de injerto de colágeno fibroso, previamente embebido en una solución de ADN plasmídico u en otro constructo de ADN si era apropiado, se emplazó in situ. La herida se cerró entonces en capas. Ya que el fijador proporcionaba la estabilidad necesaria, no existieron limitaciones para la deambulación de los animales, y no se necesitaron otros soportes. El protocolo quirúrgico se ha realizado con éxito en 53 animales hasta la fecha, incluyendo 35 controles (Tabla 2 y Fig. 24). Ninguno de estos animales murió y no se han observado efectos secundarios significativos, aparte de las complicaciones que podrían asociarse con la reparación quirúrgica de la fractura. Complicaciones menores de las que se tuvo experiencia fueron un animal que desarrolló una osteomielitis postoperatoria y un animal en el cual 2/4 clavos se aflojaron como consecuencia de la fractura ósea post-operatoria.
Ejemplo II Material de injerto para utilización en la transferencia génica ósea
Pueden utilizarse diversos materiales de injerto para transferir genes al sitio de reparación y/o regeneración ósea in vivo. Estos materiales se embeben en una solución que contiene el ADN o el gen que se va a transferir al sitio de recrecimiento óseo. Alternativamente, el ADN puede incorporarse a la matriz como un método preferido de realización.
Un ejemplo particular de un material apropiado es el colágeno fibroso, el cual puede ser liofilizado después de extracción y purificación parcial de los tejidos y esterilizarse entonces. Un colágeno particularmente preferido es el material de injerto de colágeno fibroso denominado UltraFiber™, tal como puede obtenerse de Norian Corp., (Mountain View, CA). En Gunasekaran et al., (1993a, 1993b; incorporado cada uno a la presente memoria como referencia), se proporcionan descripciones detalladas de la composición y utilización de Ultra Fiber™.
Un colágeno más particularmente preferido es el colágeno de tipo II, siendo el colágeno más particularmente preferido el colágeno recombinante de tipo II o bien el colágeno mineralizado de tipo II. Antes del emplazamiento en los lugares de osteotomía, los materiales de injerto se embeben en soluciones de ADN ( o virus) bajo condiciones estériles. La imbibición puede realizarse durante cualquier período apropiado y conveniente, por ejemplo, de 6 minutos a una noche entera. La solución de ADN (por ejemplo, plásmido) será una solución acuosa estéril, tal como un tampón acuoso estéril o uno aceptable, siendo la concentración generalmente de entre 0,5 y 1,0 mg/ml. Los plásmidos que se prefieren habitualmente son aquellos tales como pGL2 (Promega), pSV40\beta-gal, pAd.CMVlacZ, y
pLJ.
Ejemplo III Construcciones génicas de la hormona paratiroidea
El fragmento activo del gen de la hormona paratiroidea humana (hPTH1-34) se seleccionó como el primero de los genes osteotrópicos a ser incorporado a un vector de expresión para su utilización en la transferencia génica, con el fin de promover la formación de hueso nuevo en el modelo osteotómico de la rata.
Los inventores escogieron construir el transgen hPTH1-34 en el vector de expresión pLJ (Fig. 10), ya que este vector era apropiado para estudios de función transgénica, tanto in vitro como in vivo. En la Fig. 10 se muestra un esquema del transgen PLJ-hPTH1-34. El ADN y las secuencias de aminoácidos del hPTH1-34 son bien conocidas, por ejemplo, véase Hendy et al., 1981 (incorporado a la presente memoria como referencia). Para insertar el transgen en el vector de expresión pJL, se utilizó PCR™ de un clon recombinante PTH de longitud total, seguido por manipulación biológica molecular estándar.
Se generó entonces un almacenado retrovírico después de la transfección mediada por CaPO_{4} de las células Ö con la construcción hPTH1-34, todos según protocolos estándar (Sambrook et al., 1989). Se obtuvieron clones Rat-1 transducidos independientes mediante infección estándar y procedimientos de selección (Sambrook et al., 1989).
Se analizó un clon (YZ-15) mediante análisis Southern, demostrando que el transgen PLJ-hPTH1-34 se había integrado establemente en el genoma Rat-1 (Fig. 11). El próximo análisis que se realizó, un análisis Northern, fue para mostrar que el clon YZ-15 expresaba el transgen PLJ-hPTH1-34, tal como se evidencia por la presencia de transcritos PLJ-hPTH1-34 específicos (Fig. 12).
Ejemplo IV Expresión y actividad de la hormona paratiroidea polipeptídica
Se llevó a cabo un radioinmunoensayo específico y sensible para demostrar que las células YZ-15 expresaban y secretaban una molécula recombinante hPTH1-34 (Tabla 2). El radioinmunoensayo se realizó en un medio de clones Rat-1 transducidos. Para cuantificar la secreción del péptido recombinante hPTH1-34 producido por las células YZ-15, el medio de cultivo de una placa confluente de 100 mm se recogió durante un período de 24 horas y se ensayó con el kit NH_{2}-terminal hPTH RIA (Nichols Institute Diagnostics) según el protocolo del fabricante. Las células PLJ-hPTH1-84 y las células BAG sirvieron respectivamente como controles positivo y negativo.
Las concentraciones proteicas en la Tabla 2 se expresan como el promedio de tres ensayos más la desviación estándar (entre paréntesis). La concentración de los péptidos 1-34 y del de longitud total (1-84) se determinó respecto a una curva estándar generada con reactivos disponibles comercialmente (Nichols Institute Diagnostics).
TABLA 2
Progenies celulares PTH (pg/ml)
YZ-15 247 (\pm 38)
PLJ-hPTH1-84 2616 (\pm 372)
BAG 13 (\pm 3)
Tal como se muestra en la Tabla 2, se detectó la expresión de PTH en ambas células, las YZ-15 y las PLJ-hPTH1-84. Las células BAG no produjeron PTH detectable y sirvieron como una línea de base para el RIA. Estos resultados demuestran que las células YZ-15 expresaron la proteína recombinante hPTH1-34.
La molécula recombinante hPTH1-34 se añadió a células de osteosarcoma de rata y se llevó a cabo un ensayo de respuesta cAMP con objeto de determinar si la molécula secretada tenía actividad biológica. Se recogió medio no concentrado de las células YZ-15, células PLJ-hPTH1-84 y células BAG y se utilizó para tratar células ROS17/2.8 durante 10 minutos, tal como se ha descrito (Majmudar et al., 1991). Se extrajo entonces el cAMP de las células tratadas y se cuantificó mediante RIA (Tabla 3). La cantidad de cAMP que se muestra es el promedio de tres ensayos. La desviación estándar de la media se muestra entre paréntesis.
TABLA 3
Progenies celulares cAMP (pmol)
YZ-15 20,3 (\pm 0,25)
PLJ-hPTH184 88,5 (\pm 4,50)
BAG 7,6 (\pm 0,30)
Se indujo una respuesta cAMP por el PTH recombinante secretado por las células YZ-15 y por las células PLJ-hPTH1-84. Las células BAG no produjeron PTH y sirvieron como línea de base para el ensayo de cAMP. Estos resultados proporcionan evidencia directa in vitro de que el transgen PLJ-hPTH1-34 dirige la expresión y secreción de un agente osteotrópico funcional.
Ejemplo V Construcciones génicas de la proteína morfogenética ósea (BMP)
La proteína-4 morfogenética ósea murina (BMP-4) se seleccionó como el próximo de los genes osteotrópicos a ser incorporados en el vector de expresión para utilizarlo en la promoción de la reparación y regeneración ósea.
Se generó un cADN BMP-4 murino de longitud total mediante búsqueda en una biblioteca cADN de células 3T3 murinas (Stratagene). La secuencia humana para BMP-4 es bien conocida para los expertos en la materia y se ha depositado en Genbank. Se prepararon iniciadores oligonucleótidos degenerados y se utilizaron en una PCR™ estándar para obtener una secuencia cADN murina.
Los extremos del clon cADN se modificaron ulteriormente utilizando la reacción en cadena de la polimerasa de forma que el cADN de longitud total (dirección 5' \rightarrow 3') codifica el codon Met murino natural de iniciación, la secuencia codificadora murina de longitud total, un marcador de 9 aminoácidos (conocido como epítopo HA) y el codon murino natural de finalización. La secuencia aminoácida codificada por el transgen BMP-4 murino se muestra en la Fig. 24; esta secuencia entera, incluyendo el marcador, está representada por SEC ID Nº:1.
El emplazamiento del epítopo HA en el extremo carboxi- terminal no interferirá con la función de la secuencia de la molécula recombinante in vitro o in vivo. La ventaja del epítopo es que se puede utilizar en métodos inmunohistoquímicos para identificar específicamente la molécula BMP-4 murina recombinante en los tejidos osteotómicos in vivo, por ejemplo., el epítopo puede ser identificado utilizando un anticuerpo monoclonal que está disponible comercialmente (Boehringer-Mannheim), tal como aquí se describe.
Los estudios para demostrar que el transgen murino BMP-4 codifica un agente osteotrópico funcional, incluyen, por ejemplo, (a) transfección de células COS e inmunoprecipitación de una banda proteica del tamaño correcto utilizando un anticuerpo monoclonal anti-HA (Boehringer-Mannheim); y (b) un ensayo cuantitativo de inducción ósea in vivo (Sampath y Reddi, 1981) que implica implantar proteínas del medio de las células transfectadas COS por debajo de la piel de ratas macho y valorando la formación del nuevo hueso en el sitio ectópico.
Ejemplo VI Detección del ARNm mediante hibridación tisular in situ
La técnica siguiente describe la detección del ARNm en el tejido obtenido del sitio de la regeneración ósea. Esto puede ser útil para detectar la expresión del transgen ARNm en si mismo, y también para detectar la expresión de la hormona o de los receptores del factor de crecimiento o de otras moléculas. Este método puede utilizarse en lugar del, o además de, los análisis Northern, tal como los que descritos en la Fig. 13.
El ADN de un plásmido que contiene el gen para el cual el ARNm debe detectarse se linealiza, extrae y precipita con etanol. Los transcritos con sentido y antisentido se generan a partir de 1 mg de la matriz con polimerasas T3 y T7, por ejemplo., en presencia de (S)^{35} UTP a > 6 mCi/ml (Amersham Corp., >1200 Ci/mmol) y 1,6 U/ml RNsin (Promega), con los reactivos restantes de transcripción in vitro proporcionados en un kit (SureSite, Novagen Inc). Después de la transcripción a 37ºC durante 1 hora, las matrices de ADN se eliminan mediante una digestión de 15 minutos a 37ºC con 0,5 U/ml de DNasa I libre de RNasa, se extrae, y se precipita con etanol. Las ribosondas se hidrolizan hasta una longitud final promedio de 150 pares de bases mediante incubación en 40 mM de NaHCO_{3}, 60 mM de Na_{2}CO_{3}, 80 mM de DTT a 60ºC, según la fórmula previamente determinada. Se termina la hidrólisis añadiendo acetato de sodio, pH 6,0, y ácido acético glacial a 0,09 M y 0,005% (v/v), respectivamente, y las sondas se precipitan entonces con etanol, se disuelven en 0,1 M de DTT, se cuentan, y se guardan a -20ºC hasta su uso.
Se toman precauciones RNasa en todas las fases de la preparación de los portaobjetos. Los cortes histológicos fijados en líquido de Bouin y embebidos en parafina se calientan hasta 65ºC durante 10 minutos, se desparafinan luego en 3 cambios de xileno durante 5 minutos, y se rehidratan en una serie descendente de etanol, finalizando en una solución tamponada de fosfato (PBS). Los portaobjetos se embeberán en HCl 0,2 N durante 5 minutos, se enjuagarán en PBS, se digerirán con proteinasa K al 0,0002% en PBS durante 30 minutos a 37ºC y se enjuagarán brevemente con agua tratada con DEPC. Después de equilibrado durante 3 minutos en trietanolamina-HCl 0,1 M (TEA-HCl), pH 8,0, los cortes se acetilan en anhídrido acético al 0,25% (vol/vol) en TEA-HCl 0,1 M durante 10 minutos a temperatura ambiente, se enjuagan en PBS, y se deshidratan en una serie ascendente de etanol. Cada corte recibe 100-200 ml de solución de prehibridación (0,5 mg/ml de tARN libre de RNasa, desnaturalizado (Boehringer-Mannheim), 10 mM de DTT, 5 mg/ml de ADN de esperma de salmón sulfurilado y desnaturalizado, formamida al 50%, sulfato de dextrano al 10%, 300 mM NaCl, 1X solución de Denhardt libre de RNasa (preparada con albúmina sérica bovina libre de RNasa, Sigma), 10 mM Tris-HCl, pH 7,4, 1 mM EDTA) y se incuba en un calentador de portaobjetos a 50ºC en un recinto humidificado durante 2 horas. El reactivo de bloqueo ADN de esperma de salmón sulfurilado se utiliza tanto en la solución de prehibridación como en la de hibridación para ayudar a reducir la unión no específica a los tejidos por los grupos SH^{35} en la sonda. Se prepara marcando el ADN de esperma de salmón libre de RNasa (Sigma) con \alpha-tio-dCTP y \alpha-tio-dATP no radioactivo (Amersham) en una reacción estándar de marcaje del ADN iniciada al azar por oligonucleótidos. El exceso de la solución de prehibridación se elimina con un enjuague breve en 4X SSC antes de aplicar la sonda.
Las ribosondas, el tARN fresco y el ADN de esperma de salmón sulfurilado se desnaturalizarán durante 10 minutos a 70ºC, y se enfriarán en hielo. Se aplica la solución de hibridación, idéntica a la solución de prehibridación excepto en que se añadirá a ella una sonda desnaturalizada a 5 x 10^{6} CPM/ml, incubándose los portaobjetos a 50ºC durante una noche en un calentador de portaobjetos situado en una cámara humidificada precintada. Las sondas antisentido y con sentido se aplican a las secciones histológicas seriadas. Los portaobjetos se enjuagan 3 veces en 4X SSC, se lavan con 2X SSC, 1 mM de DTT durante 30 minutos a 50ºC, se digieren con RNasa A (20 mg/ml RNasa A, NaCl 0,5 M, 10 mM Tris, pH 8,0, 1 mM EDTA, pH 8,0) durante 30 minutos, a 37ºC, y se enjuagan brevemente con 2X SSC, 1 mM DTT. Se llevan a cabo tres lavados adicionales, cada uno a 50ºC durante 30 minutos: una vez con 2X SSC, formamida al 50%, 1 mM DTT, y dos veces con 1X SSC, pirofosfato sódico al 0,13% (peso/vol), 1 mM DTT.
Los portaobjetos son deshidratados en una serie etanólica ascendente (suplementando los etanoles diluidos (50% y 70%) con SSC y DTT a 0,1X y 1 mM, respectivamente). Los portaobjetos se exponen a una película de rayos X durante 20-60 horas para visualizar los patrones totales de hibridación, se sumergen en una emulsión autorradiográfica (Kodak NTB-2, diluida hasta 50% con acetato amónico 0,3 M), se seca lentamente durante 2 horas, y se expone (4ºC) durante períodos de oscilan entre 8 días y 8 semanas. Después de revelar la emulsión, los cortes se tiñeron secundariamente con hematoxilina y eosina, se deshidrataron, y se montaron con medio basado en xileno. La señal de hibridación se visualiza bajo microscopía de campo oscuro.
El protocolo de hibridación in situ anteriormente comentado puede utilizarse, por ejemplo, para detectar el patrón espacial y temporal de la expresión del receptor PTH/PTHrP. Una sonda apropiada cADN del receptor PTH/PTHrP de la rata (R15B) es una que está constituida por una región de 1810 pares de bases que codifica el receptor PTH/PTHrP óseo de longitud completa de la rata (Abou-Samra et al., 1992). El fragmento de cADN se subclona en pcADN (Invitrogen Corp., San Diego, CA) y se fragmenta utilizando XbaI y BamHI. Esta sonda ha proporcionado señales positivas para el análisis de transferencia Northern de las progenies celulares de la rata, murina y osteoblástica humana, células craneales primarias de la rata, y tejido óseo murino. El plásmido pcADN I contiene un promotor T7 y SP6 que facilita la generación de sondas cARN para la hibridación in situ. El transcrito de longitud total se ha utilizado para detectar el receptor PTH/PTHrP en cortes óseos (Lee et al., 1994). La sonda PTHrP cADN (Yasuda et al., 1989) es un fragmento de 400 pares de bases subclonado en pBluescript (Stratagene). Esta sonda se ha utilizado para hibridación in situ, generando una sonda cARN antisentido utilizando una fragmentación BamHI y el iniciador T3 y una sonda cARN con sentido utilizando una fragmentación EcoRI y el iniciador T7.
Ejemplo VII Detección proteica in vivo después de expresión transgénica 1. Transgen \beta-galactosidasa
La \beta-galactosidasa bacteriana puede detectarse inmunohistoquímicamente. Las preparaciones hísticas osteotómicas se fijan en líquido de Bouin, se desmineralizan, y se dividen entonces por la mitad a lo largo del plano longitudinal. La mitad de cada preparación se embebe en parafina para identificación inmunohistoquímica subsiguiente de la proteína bacteriana \beta-galactosidasa.
Para inmunohistoquímica, se transfirieron cortes transversales de 2-3 mm de grueso a portaobjetos microcópicos revestidos con poli-L-lisina y se fijaron en acetona a 0ºC durante 20 minutos como mínimo. Se rehidrataron los cortes en PBS. Se reprimió la actividad peroxidásica endógena mediante inmersión de los cortes tisulares en peróxido de hidrógeno al 0,1% ( en metanol al 95%) a temperatura ambiente durante 10 minutos, y se lavaron los cortes 3x en PBS. En algunos casos, los cortes de la bóveda craneana se desmineralizaron mediante inmersión en 4% EDTA, polivinilpirrolidona al 5%, y sacarosa al 7%, pH 7,4, durante 24 horas a 4ºC. Los cortes desmineralizados se lavaron 3x antes de aplicarlos para los anticuerpos. Los anticuerpos primarios se utilizaron sin dilución en forma de hibridoma sobrenadante. Se aplicaron los anticuerpos purificados a los cortes histológicos a una concentración de 5 mg/ml. Se detectaron los anticuerpos primarios con IgG antirratón biotinilada de conejo y con estreptavidina conjugada a peroxidasa (kit Zymed Histostain-SP). Después de la tinción por la peroxidasa, los cortes se tiñeron secundariamente con hematoxilina.
La \beta-gal bacteriana puede también detectarse mediante ensayos de utilización de substrato. Esto se lleva a cabo utilizando kits disponibles comercialmente (por ejemplo, Promega), según las instrucciones del fabricante.
2. Transgen de luciferasa
La luciferasa puede detectarse mediante ensayos de utilización de substrato. Esto se lleva a cabo utilizando kits disponibles comercialmente (por ejemplo, Promega) según las instrucciones del fabricante.
3. Transgenes PTH
La PTH recombinante, tal como el péptido hPTH1-34, se ensaya en homogenados del tejido de la hendidura osteotómica, por ejemplo, utilizando dos kits de radioinmunoensayo disponibles comercialmente según los protocolos del fabricante (Nichols Institute Diagnostics, San Juan Capistrano, CA).
Un kit es el "Kit de Hormona paratiroidea-PTH Intacta 100T". Este radioinmunoensayo utiliza un anticuerpo para el extremo carboxilo de la hormona intacta, y se utiliza de este modo para medir niveles endógenos de hormona en el tejido de la hendidura osteotómica. Este ensayo puede utilizarse para establecer una expresión del valor basal de PTH en el modelo de osteotomía de la rata.
El segundo kit es uno inmunorradiométrico de dos sitios para la medición de la PTH de la rata. Este kit utiliza anticuerpos purificados por afinidad que son específicos para el extremo amino de la hormona intacta de la rata (PTH1-34) y de este modo medirá la producción de PTH endógena, así como la proteína recombinante. Estudios previos han demostrado que estos anticuerpos reaccionan cruzadamente con la PTH humana y son capaces por tanto de reconocer las moléculas recombinantes in vivo.
Los valores obtenidos con el kit #1 (anticuerpos para el extremo carboxilo) se restan de los valores obtenidos con el kit #2 (anticuerpos para el extremo amino) para obtener mediciones sensibles y precisas. El nivel de péptido recombinante se correlaciona así con el grado de la formación del nuevo hueso.
4. Transgen BMP
Preferentemente, las proteínas BMP, tales como el producto peptídico transgénico BMP-4 murino, se detectan inmunohistoquímicamente utilizando un anticuerpo específico que reconoce el epítopo HA (Majmudar et al., 1991), tal como el anticuerpo monoclonal disponible en Boehringer-Mannheim. Pueden también utilizarse anticuerpos para las mismas proteínas BMP. Dichos anticuerpos, junto con diversos métodos de inmunoensayo, se describen en el documento de Patente U.S. 4.857.456, que se incorpora a la presente memoria como referencia.
Las preparaciones hísticas osteotómicas se fijan en líquido de Bouin, se desmineralizan, y se dividen entonces por la mitad a lo largo del plano longitudinal. La mitad de cada preparación se embebe en parafina para identificación inmunohistoquímica subsiguiente de la molécula recombinante murina BMP-4.
Ejemplo VIII Transferencia génica directa al hueso que se regenera in vivo
Para evaluar la viabilidad de la transferencia génica directa al hueso que se regenera in vivo, se utilizó la transferencia de un gen marcador a las células en el modelo osteotómico de la rata. Estos estudios implicaron dos genes marcadores: \beta-galactosidasa bacteriana y luciferasa de los insectos.
Alícuotas de un material de injerto de colágeno fibroso se embebieron en soluciones de ADN génico marcador puro. Los materiales del injerto se aplicaron entonces en el sitio de osteotomía, y se determinó su expresión tal como se ha descrito anteriormente.
Se encontró que ambos genes marcadores se transfirieron con éxito y se expresaron, sin ningún fallo, tal como se demuestra por los ensayos de utilización del substrato (Figs. 5A, 5B, 6A, 6B, 6C Y 6D). Ya que las células de mamíferos no sintetizan tampoco normalmente productos génicos marcadores, esto proporciona evidencia directa de que las células de reparación osteotómicas se transfectaron in vivo y expresaron entonces los transgenes \beta-galactosidasa y luciferasa como enzimas funcionales.
Ejemplo IX Transferencia génica adenovírica al hueso que se esta regenerando in vivo
Uno de los métodos alternativos para obtener la transferencia génica in vivo al hueso que se está regenerando es utilizar una transferencia mediada por un adenovirus. Se ha conseguido con éxito una transferencia génica adenovírica de un constructo génico marcador en células óseas de reparación en el modelo osteotómico de la rata (Figs. 23A, 23B y 23C).
Los inventores utilizaron el vector adenovírico pAd.CMV.lacZ, que es un ejemplo de un vector adenovírico de réplica incompleta que puede replicar en células facultativas (Stratford-Perricaudet et al., 1992). En pAd.CMVlacZ, el potenciador/promotor temprano del citomegalovirus (CMV) se utiliza para gobernar la transcripción de lacZ con una secuencia SV40 de poliadenilación clonada por corriente abajo de este informador (Davidson et al., 1993).
El vector pAd.RSV4 se utiliza también por los inventores. Este vector posee esencialmente idéntica estructura básica que pAd.CMVlacZ, pero sin embargo el promotor CMV y el sitio de clonación única Bg1II se han reemplazado en forma de cassette con el fragmento Bg1II que está formado por un promotor RSV, un sitio múltiple de clonación, y un sitio poly (A^{*}). La flexibilidad mayor de este vector se considera que es de utilidad para subclonar genes osteotrópicos, tales como el fragmento hPTH1-34 cADN, para utilizarlo en estudios ulteriores.
Para generar adenovirus recombinante PTH, se transfecta una placa de 100 mm de 293 células utilizando fosfato cálcico con 20 mg de una construcción plasmídica, por ejemplo., el plásmido que contiene la inserción hPTH1-34 linealizada con NheI, más 2 mg del ADN del adenovirus de tipo salvaje digerido con XbaI y ClaI. El ADN adenovírico se deriva del adenovirus tipo 5, que contiene sólo un único sitio XbaI y ClaI y posee una deleción parcial de la región E3. Aproximadamente 7 días después de la transfección, se recuperaron las células y los medios y se preparó un lisado mediante ciclos repetidos de congelación-descongelación. Este lisado se diluyó y utilizó para infectar placas de 60 mm de 293 células confluyentes durante 1 hora. Las células se cubren entonces con agar al 0,8%/1X MEM/suero de ternera al 2%/ MgCl_{2} 12,5 mM. Diez días después de la infección, se seleccionaron las calvas individuales y se utilizaron para infectar placas de 60 mm de 293 células para extender la cantidad de virus. Se seleccionaron las calvas positivas para purificación ulterior y la generación de almacenados de adenovirus.
Para purificar los adenovirus recombinantes, placas de 150 mm de 293 células que mostraban una confluencia de 75-90%, se infectaron con 2-5 PFU/célula, un título que evita los efectos citotóxicos potenciales de los adenovirus. 30 horas después de la infección, las células se enjugaron, se eliminaron de las placas, se sedimentaron y se volvieron a suspender en 10 mM Tris-HCl, pH 8,1. Se genera un lisado vírico mediante tres ciclos de congelación-descongelación, eliminándose los restos celulares mediante centrifugación durante 10 minutos a 2.000 rpm, y purificándose el adenovirus mediante centrifugación en gradiente de densidad. La banda adenovírica se conserva a -20ºC en glicerol/BSA estéril hasta que se necesite.
La solución de partículas víricas se esterilizó e incubó con el material del injerto (de 6 min a toda la noche), y el material impregnado con el virus se injertó en la hendidura osteotómica, donde tuvo lugar claramente la infección vírica celular. Los resultados obtenidos demostraron claramente la especificidad exquisita del anticuerpo anti-\beta-gal (Sambrook et al., 1989), y demostró conclusivamente la expresión del producto del gen marcador en las células de tipo condrocítico de la hendidura osteotómica. La señal dirigida al núcleo se ha observado también en los preosteo-
blastos.
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Ejemplo X La transferencia de un gen osteotrópico estimula la regeneración/reparación ósea in vivo
Con objeto de que un transgen de la hormona paratiroidea (PTH) funcione como un agente osteotrópico, es probable que sea necesario que el receptor PTH/PTHrP se exprese en el mismo tejido de reparación ósea. Por tanto, los inventores investigaron la expresión del receptor PTH/PTHrP en el modelo osteotómico de la rata.
Se llevó a cabo un análisis Northern del poly-A(+) ARN que demostró que el receptor PTH/PTHrP se expresó en el tejido de reparación osteotómico (Fig. 13).
Los inventores investigaron seguidamente si la transferencia genética podría utilizarse para crear células transfectadas que expresaran constitutivamente el hPTH1-34 in vivo, y si este transgen puede estimular la formación ósea. La proporción de formación del nuevo hueso se analiza de la manera siguiente. En la necropsia, el sitio de osteotomía se disecciona cuidadosamente para realizar un análisis histomorfométrico. Las dimensiones A-P y M-L del tejido del callo se miden utilizando calibradores. Las muestras se fijan entonces en inmersión en líquido de Bouin, se lavan en etanol, y se desmineralizan en ácido fórmico tamponado. Se utiliza el empapado plástico de los materiales descalcificados a causa de la estabilidad dimensional superior del metacrilato durante la preparación y corte de las muestras.
Los bloques hísticos se deshidratan en concentraciones alcohólicas crecientes y se embeben. Se realizan cortes de 5 mm de grueso en el plano coronal utilizando un microtomo Reichert Polycut. Los cortes se preparan desde el centro a través de la anchura de la cavidad medular para protegerse contra la tendencia al muestreo. Los cortes para la microscopía óptica se tiñen utilizando la tinción tricrómica de Goldner modificada, para diferenciar el tejido óseo, osteoide, cartilaginoso y fibroso. Los cortes se cubren utilizando el medio de montaje de Eukitt (Calibrated Instruments, Ardsley, NY). Se llevan a cabo análisis histomorfométricos bajo campo claro utilizando un microscopio de Investigación Nikon Optiphot. Se utilizan las técnicas de estereología estándar de contaje puntual utilizando una cuadrícula ocular reticular de 10 mm x 10 mm.
El área total del callo se mide a un aumento de 125X como un índice de la intensidad total de la reacción de cicatrización. A un aumento de 250 X se miden las fracciones de las áreas de hueso, cartílago y tejido fibroso para examinar la contribución relativa de cada tejido a la formación del callo. Ya que las dimensiones de la hendidura osteotómica reflejan la línea básica (tiempo 0), se utiliza una medición del área ósea a subsecuentes intervalos de tiempo para indicar la velocidad de relleno óseo. Se evalúa la significación estadística utilizando el análisis de variancia, con comparaciones adecuadas ulteriores entre los grupos utilizando el ensayo t student de Tukey.
En el modelo osteotómico de la rata de 5 mm descrito antes, se encontró que la expresión del transgen PTH puede estimular la regeneración/reparación en los animales vivos (Figs. 6A, 6B, 6C y 6D). Este es un hallazgo particularmente importante pues se sabe que hPTH1-34 es un agente anabólico más potente cuando se administra intermitentemente que cuando se compara con la administración continua, y es la liberación de tipo continuo la que tiene como origen los métodos de transferencia génica aquí utilizados.
Aunque los inventores han demostrado ya el éxito de la transferencia génica directa al hueso que se regenera in vivo, se considera también la utilización de los protocolos del tratamiento ex vivo. En dichas formas de realización, las células progenitoras óseas se aislarán a partir de un animal particular o de un hombre, y se mantendrán en un entorno in vitro. Areas apropiadas del organismo a partir de las cuales se puedan obtener células progenitoras óseas son áreas tales como el tejido óseo y el líquido que rodean a una fractura o a otros defectos esqueléticos (ya sea este un sitio creado o no artificialmente) y a partir de la médula ósea. Las células aisladas se pondrán en contacto entonces con la composición de ADN (o vírico recombinante), con, o preferentemente sin, una matriz, cuando las células capten el ADN (o sean infectadas con el virus recombinante). Las células estimuladas se devolverán entonces al sitio en el animal o paciente en el que debe estimularse la reparación ósea.
Ejemplo XI Transferencia de genes al tendón de aquiles y al ligamento cruzado in vivo
Los estudios sobre el hueso en regeneración que se han descrito anteriormente complementan otros de los inventores en los que la transferencia génica se utilizó con éxito para introducir genes en el tendón de Aquiles (Figs. 3A, 3B, 3C, 3D y 3E) y en el ligamento cruzado (Fig. 4).
El tendón de Aquiles está formado por células y matriz extracelular organizados con una característica arquitectura tisular. La herida de los tejidos pueden interrumpir esta arquitectura y estimular una respuesta de cicatrización de la herida. El tendón herido se regenerará, oponiéndose a la cicatriz, si los elementos de su tejido conjuntivo permanecen aproximadamente intactos. La regeneración es ventajosa porque el tejido cicatricial no está diseñado de forma óptima para soportar la función mecánica normal. Los defectos segmentales en el tendón debidos a daño traumático pueden tratarse con injertos biológicos o sintéticos que animan la formación del nuevo tendón. Esta estrategia está limitada, sin embargo, por la disponibilidad de injertos biológicos efectivos (autólogos), la estabilidad y la compatibilidad de las prótesis sintéticas a largo plazo, y el lento ritmo de incorporación observado a menudo con ambos tipos de injertos.
Los inventores sostuvieron la hipótesis de que la efectividad de los injertos biológicos puede potenciarse por la superexpresión de moléculas que regulan la respuesta regenerativa del tejido. Con este fin, desarrollaron un sistema modelo en el cual se crean defectos segmentales en el tendón de Aquiles y se utiliza un nuevo biomaterial como agente de suministro de un injerto de tendón/molecular. En el presente ejemplo, la capacidad para suministrar y expresar construcciones génicas marcadoras en el tejido del tendón en regeneración, está demostrada.
Se prepararon soluciones de almacenado del plásmido (pSV\betagal, Promega) de acuerdo con protocolos estándar (Sambrook et al., 1989). Se preparó material SIS de injerto a partir de un segmento de yeyuno de cerdos adultos (Badylak et al., 1989). En la recolección, se eliminaron los tejidos mesentéricos, se invirtió el segmento y la mucosa y la submucosa superficial se eliminaron mediante una técnica de abrasión mecánica. Después de devolver el segmento a su orientación original, la serosa y las capas musculares se enjuagaron, se esterilizaron mediante tratamiento con ácido peracético diluido y se conservaron a 4ºC hasta utilización.
Se anestesiaron perros mestizos (todos los estudios), se intubaron, se emplazaron en posición recostada dextro lateral sobre una almohadilla caliente, y se mantuvieron con anestesia inhalante. Se utilizó una incisión lateral desde la unión musculotendinosa a la aponeurosis plantar para exponer el tendón de Aquiles. Se envolvió alrededor de una porción central del tendón una hoja gruesa doble de SIS, se suturaron ambos extremos, un segmento de 1,5 cm del tendón se eliminó a través de una abertura lateral en el material del injerto, y éste y el sitio quirúrgico se cerraron. Se inmovilizó la pierna durante 6 semanas y entonces se utilizó libremente durante otras 6 semanas. Los tejidos del injerto se recolectaron en tiempos determinados que se indican debajo, se fijaron en solución Bouin, y se embebieron en parafina. Los cortes histológicos (8 \mum) se cortaron y se emplearon para inmunohistoquímica.
En un estudio inicial, el material SIS solo (injerto sólo de SIS) se injertó y promovió la regeneración del tendón de Aquiles después de la creación de un defecto segmental en perros mestizos en un período de tiempo de 6 meses después de cirugía. El proceso de remodelación implicó la formación rápida de tejido de granulación y eventual degradación del injerto. No se formó tejido cicatricial, y no se observó evidencia de rechazo mediado inmunológicamente.
En un segundo estudio, se embebió el SIS en una solución de ADN plasmídico (SIS+injerto plasmídico) y se injertó a continuación como un injerto del tendón de Aquiles (n= 2 perros) o un injerto del ligamento cruzado (n= 2 perros) en perros mestizos normales. Un plásmido pSV\betagal que utiliza las secuencias reguladoras del virus simiano 40 para gobernar la actividad \beta-galactosidasa (\beta-gal) fue detectable por inmunohistoquímica utilizando un anticuerpo específico en 4/4 de los animales. Como control negativo, la actividad de \beta-gal no se detectó en el tendón de Aquiles no operado y en el ligamento cruzado de estos animales. Pareció, por tanto, que SIS facilitó la captación y subsiguiente expresión del ADN plasmídico por las células de cicatrización de las heridas en ambos, el tendón y el ligamento.
Se diseñó un tercer estudio para evaluar el decurso de la expresión transgénica de \beta-gal. Se implantaron SIS + injertos plasmídicos durante 3, 6, 9 y 12 semanas (n=2 perros, punto pre tiempo) y se ensayó la expresión transgénica mediante inmunohistoquímica y mediante hibridación in situ. Cortes transversales (8 \mum) de tejido fijado en Bouin, embebido en parafina se cortaron y montaron en portaobjetos Probeon Plus (Fisher). Se llevó a cabo la inmunohistoquímica según el protocolo proporcionado con el kit de Histostain-SP (Zymed). Brevemente, se incubaron los portaobjetos con un anticuerpo anti-\beta-galactosidasa bien caracterizado (dilución 1:200, 5' \rightarrow 3'), se lavaron en PBS, se incubaron con un segundo anticuerpo biotinilado, se lavaron, se tiñeron con el conjugado enzimático más una mezcla cromógeno-substrato, y se tiñó por segunda vez con hematoxilina y eosina.
La actividad \beta-gal bacteriana se detectó en los tendones que recibieron el SIS + el injerto plasmídico (8/8 animales). Aunque no rigurosamente cuantitativa, la expresión del transgén apareció en su punto máximo a las 9-12 semanas. La expresión del gen \beta-gal no se detectó en animales que recibieron sólo injertos de SIS (n=2, 3 semanas y 12 semanas). Igual que antes, no se formó el tejido de cicatrización y no se observó evidencia de rechazo mediado inmunológicamente.
Este estudio demostró que el biomaterial SIS de la mucosa puede funcionar como un injerto autólogo que promueve la regeneración de tejidos tales como el tendón de Aquiles y el ligamento cruzado anterior. El SIS puede también utilizarse para liberar una construcción génica marcadora para regenerar el tejido.
Ejemplo XIII Propiedades mecánicas de la formación del nuevo hueso
Las propiedades mecánicas del nuevo hueso formado durante la transferencia génica puede medirse utilizando, por ejemplo., ensayos de torsión ósea total que crean un estado de tensión en el cual las tensiones máximas de extensión tendrán lugar en planos que se sitúan oblicuamente al eje longitudinal del hueso. Dichos ensayos pueden proporcionar deducciones respecto de la anisotropía mecánica del tejido del callo y del grado de integración ósea del nuevo tejido óseo. Estos ensayos son particularmente ventajosos en la evaluación de las muestras de fractura, por ejemplo., la forma irregular del tejido del callo impide típicamente la utilización de ensayos de la unión de 4 puntos del hueso entero, a causa de que es imposible alinear de forma reproducible los puntos de muestra a muestra.
Los fémures se ensayan en una máquina MTS Servohydraulic Testing mientras haya humedad y a temperatura ambiente. Un sensor del momento de torsión y transductores del desplazamiento rotatorio variable proporcionan datos para las curvas de desplazamiento momento de torsión-angular. Dispositivos especialmente diseñados soportan cada hueso cerca de las articulaciones metafisarias-diafisarias, y aplican una carga de 2 puntos a la diáfisis. Los ensayos se llevan a cabo a una velocidad constante de desplazamiento igual a 20 grados/seg. Una célula de carga de 250 pulgadas-onzas mide la fuerza aplicada total. Se ensayan todos los huesos mientras haya humedad y a temperatura ambiente. Los datos del momento de torsión y del desplazamiento angular se obtienen utilizando un convertidor analógico-digital y un ordenador Macintosh y software. A partir de estos datos, se calculan las siguientes variables: a) momento de torsión máximo, b) rigidez torsional, la pendiente de la porción de pre-rendimiento de la curva determinada a partir de una regresión lineal de los datos, c) energía para el fallo, el área bajo la curva de desplazamiento del momento de torsión-angular hasta el punto de fallo, y d) la relación de desplazamiento angular, la relación de desplazamiento en el fallo al desplazamiento en el rendimiento. Se determina la significación estadística mediante análisis de variancia seguido por comparaciones múltiples con correcciones apropiadas (por ejemplo, Bonferroni).
La presente invención proporciona también medios para utilizar la transferencia génica osteotrópica en relación con la cirugía reconstructora y diversos procedimientos de remodelación ósea. Las técnicas que aquí se describen pueden por tanto utilizarse en relación con la tecnología descrita por Yasko et al., 1992; Chen et al., 1991; y Beck et al., 1991, cada una de las cuales se incorpora aquí como referencia.
Ejemplo XIV El colágeno de tipo II promueve el crecimiento de hueso nuevo
Ciertos materiales matriciales son capaces por sí mismos de estimular por lo menos algún nuevo crecimiento, esto es, son "materiales ósteoconductores". Ejemplos potenciales de dichos materiales se conocen bien en el campo de la investigación ortopédica e incluyen preparaciones de hidroxiapatito; preparaciones de huesos triturados y colágeno mineralizado; copolímeros en bloque PLGA y polianhídrido. La capacidad de estos materiales para estimular la formación de nuevo hueso, los distingue de los materiales inertes del injerto, tal como la metilcelulosa, la cual se ha utilizado en el pasado para liberar BMPs en sitios de reparación de fracturas.
Este Ejemplo se refiere a un estudio que utiliza el modelo osteotómico de la rata con injertos hechos de colágeno de tipo I (Sigma), colágeno de tipo II (Sigma), y UltraFiber™ (Norian Corp). Estos materiales se han situado in situ sin ADN de ningún tipo. Cinco animales recibieron una osteotomía con 10 mg de un injerto solo de colágeno de tipo II (10 mg se refiere a la cantidad original de colágeno liofilizado). Cinco de cinco animales de control recibieron una osteotomía con 10 mg de un injerto sólo de colágeno de tipo I. Los animales se albergaron durante tres semanas tras la cirugía y entonces se sacrificaron.
Los resultados de estos estudios fueron que SIS pareció retardar la formación de hueso nuevo; el colágeno de tipo I dio lugar a una respuesta inflamatoria moderadamente intensa; y UltraFiber™ actuó como un agente ósteoconductor. Los estudios de injerto con colágeno de tipo II produjeron resultados sorprendentes porque se encontró que 10 mg de este colágeno promovían la formación de nuevo hueso en el modelo osteotómico de 5 mm (Figs. 22A, 22B, 22C). Se identificó hueso nuevo que empalmaba le hendidura osteotómica tres semanas después de la cirugía en 5/5 animales que recibieron un injerto sólo de colágeno de tipo II (esto es, menos ADN de ningún tipo). En contraste, se obtuvo tejido de granulación fibroso pero no hubo evidencia de formación de nuevo hueso en 5/5 animales que recibieron sólo un injerto de colágeno de tipo I.
El análisis radiográfico demostró conclusivamente que todos los animales que recibieron una osteotomía con un injerto de colágeno de tipo II mostraron sin excepción material radiodenso en la hendidura osteotómica (Fig. 22A). En contraste agudo, el análisis radiográfico de todos los animales que recibieron un injerto de colágeno de tipo I no reveló formación de material radiodenso en la hendidura osteotómica (Fig. 22B). La flecha en la Fig 22A apunta hacia el crecimiento de nuevo hueso formado en la hendidura osteotómica de los animales injertados con colágeno de tipo II. No se observó dicho nuevo crecimiento óseo en los animales que recibieron injertos de colágeno de tipo I (Fig. 22B).
La Fig. 22C demuestra los resultados de la osteotomía con un injerto de colágeno de tipo II. La flecha apunta hacia el área del nuevo hueso formado en la hendidura osteotómica. En contraste, sólo se identificó tejido de granulación fibroso en la hendidura de colágeno de tipo I.
Estudios previos sugirieron que el colágeno de tipo II juega sólo un papel estructural en la matriz extracelular. Los resultados de los estudios de injertos de colágeno de tipo II son interesantes porque demuestran un nuevo y osteoconductor papel para el colágeno de tipo II durante la reparación ósea endocondral. Para optimizar ulteriormente el potencial ósteoconductor del colágeno de tipo II, se utilizará un vector de expresión de levadura que codifica el tipo colágeno II (colágeno \alpha1(II) de longitud total) para producir la proteína recombinante \alpha1 (II) de colágeno.
Ejemplo XV Identificación de genes osteotrópicos ulteriores: aislamiento de un nuevo gen (LTBP-3) de tipo proteína de Unión al TGF-\beta latente
Los TGF-\betas representan una familia de moléculas relacionadas estructuralmente con efectos diversos sobre la forma de las células de los mamíferos, crecimiento, y diferenciación (Roberts y Sporn, 1990). Sintetizados inicialmente como un precursor que está formado por un propéptido amino-terminal seguido por TGF-\beta maduro, dos cadenas de pro-TGF-\beta naciente, se asocian en la mayoría de los tejidos para formar un dímero inactivo unido a disulfuro de un Mr de 106.000 aproximadamente. Los homodímeros son más habituales, pero se han descrito también los heterodímeros (Cheifetz et al., 1987; Ogava et al., 1992). Durante la biosíntesis el dímero maduro TGF-\beta es fragmentado a partir del dímero propéptido. El estado latente de TGF-\beta proviene en parte de la asociación no covalente del propéptido y de los dímeros maduros TGF-\beta (Pircher et al., 1984, 1986; Wakefield et al., 1987; Millan et al., 1992; Miyazono y Heldin, 1989). Consecuentemente, al dímero propéptido se hace referencia a menudo como la proteína asociada al estado latente (LAP), y LAP más el dímero de TGF-\beta unido a disulfuro se conoce también como el pequeño complejo del estado latente. En el espacio extracelular los pequeños complejos del estado latente deben disociarse para activar los TGF-\beta maduros. Se cree que el mecanismo de activación del complejo del estado latente es una de las etapas más importantes que gobiernan los efectos de TGF-\beta (Lyons et al., 1988; Antonelli-Orlidge et al., 1989; Twardzik et al., 1990; Sato et al., 1993).
En ciertas progenies de células cultivadas los pequeños complejos de estado latente de los factores de crecimiento pueden contener proteínas adicionales de alto peso molecular. La mejor caracterizada de estas proteínas de alto peso molecular es la proteína latente de unión TGF-\beta o LTPB (Miyazono et al., 1988; Kanzaki et al., 1990; Tsuji et al., 1990; Olofsson et al., 1992; Taketazu et al., 1994). El LTBP producido por distintos tipos celulares es de tamaño heterogéneo, quizás a causa del empalme alternativo o a causa del procesado proteolítico tisular específico (Miyazono et al., 1988; Wakefield et al., 1988; Kanzaki et al., 1990; Tsuji et al., 1990). Los complejos de estado latente TGF-\beta que contienen LTBP se conocen como complejos grandes de estado latente. El LTPB no tiene enlace covalente conocido con el TGF-\beta maduro, pero está unido por un enlace disulfuro a LAP.
Hasta la fecha, se han aislado dos LTBPs. La secuencia aminoácida deducida LTBP-1 humana comprende un péptido señal, 16 repeticiones del tipo factor de crecimiento epidérmico con el potencial de unir calcio (repeticiones EGF-CB), 2 copias de un motivo único que contiene 8 residuos de cisteína, un motivo de unión a las células RGD, y un motivo de 8 aminoácidos idéntico al dominio de unión celular de la cadena B2 de la laminina (Kanzaki et al., 1990). Existe evidencia de que LTBP-1 se une al calcio, el cual, a su vez, induce un cambio estructural que protege a LTBP del ataque proteolítico (Colosetti et al., 1993). LTBP-2 muestran una identidad secuencial del 41% con LTBP-1 y sus dominios estructurales muestran una organización total similar (Moren et al., 1994).
Mientras que las funciones de LTBP-1 y LTBP-2 son desconocidas actualmente, en la literatura se han propuesto varias ideas. En primer lugar, LTBP puede regular la biosíntesis intracelular de precursores TGF-\beta latentes. Células eritroleucémicas cultivadas se reúnen eficientemente y secretan grandes complejos TGF-\beta latentes, mientras que secretan lentamente pequeños complejos TGF-\beta latentes que contienen enlaces disulfuro anómalos (Miyazono et al., 1991; Miyazono et al., 1992). Por tanto, LTBP puede facilitar la normal reunión y secreción de los complejos TGF-\beta latentes. En segundo lugar, LTBP puede dirigir TGF-\beta latentes a tipos específicos de tejido conjuntivo. Evidencias recientes sugieren que el gran complejo TGF-\beta latente se une covalentemente a la matriz extracelular mediante LTBP (Taipale et al., 1994). Basándose en estas observaciones, a LTBP se ha aludido como un "receptor de la matriz", es decir, una proteína secretada que tiene como diana y almacena a factores de crecimiento latentes tales como TGF-\beta para la matriz extracelular. En tercer lugar, LTBP puede modular la activación de los complejos latentes. Esta idea se basa en parte en la evidencia reciente que sugiere que el TGF-\beta maduro se libera a partir de los sitios de almacenado extracelular mediante proteasas tales como la plasmina y la trombina y que LTBP puede proteger pequeños complejos latentes del ataque proteolítico (Falcone et al., 1993; Benezra et al., 1993; Taipale et al., 1994), es decir, la actividad proteásica puede gobernar el efecto del TGF-\beta en los tejidos, pero LTBP puede modular esta actividad. En cuarto lugar, LTBP puede jugar un papel importante en dirigir el complejo TGF-\beta a la superficie celular, permitiendo que el TGF-\beta latente sea eficientemente activado (Flaumenhaft et al., 1993).
A. Materiales y procedimientos 1. Clonación del cADN
Alícuotas (típicamente 40-50.000 PFU) de partículas fágicas de una biblioteca cADN en el vector ëZAPII® fabricado a partir de ARNm de células NIH 3T3 (Stratagene) y células frescas XL1-Blue™ (desarrolladas en caldo de cultivo Luria suplementado con maltosa al 0,4% en 10 mM de MgSO_{4}) se mezclaron, se incubaron durante 15 min a 37ºC, se mezclaron otra vez con 9 ml de una capa superficial líquida (50ºC) de agarosa (medio de cultivo NZY más agarosa al 0,75%), y se extendieron uniformemente en placas de NZY-agar de 150 mm que se habían preparado recientemente. Se utilizaron procedimientos estándar para la preparación de calvas "elevadas" y filtros para hibridaciones (42ºC, en tampón que contiene formamida al 50%, 5X SSPE, 1X Denhardt's, SDS al 0,1%, 100 mg/ml de ADN de esperma de salmón, 100 mg/ml de heparina). Se lavaron los filtros progresivamente hasta condiciones muy severas (0,1X SSC/SDS al 0,1%, 65ºC). Las sondas cADN se marcaron radioactivamente mediante el procedimiento de desplazamiento de la mella utilizando reactivos y protocolos disponibles comercialmente (Nick Translation Kit, Boehringer Mannheim). Los clones fágicos purificados se convirtieron a clones plasmídicos pBluescript®, los cuales se secuenciaron utilizando Sequenase (v2.0) tal como se ha descrito (Chen et al., 1993; Ying et al., 1995). La alineación de la secuencia y su identidad se determinó utilizando programas de análisis secuenciales del Genetics Computer Group (MacVector).
2. Hibridación tisular in situ
Para preparar sondas normales de sentido y antisentido, un único fragmento de 342 pares de bases procedente de la región no traducida del extremo 3' (+3973 a +4314, contando la "A" del codon de iniciación Met como +1; véase "ish", Figura 1) se subclonó en el plásmido pBSKS+ (Stratagene, Inc). El ADN matriz se linealizó con EcoRI o bien BamHI, se extrajo, y se precipitó con etanol. Se generaron transcritos de sentido y antisentido a partir de 1 mg de la matriz con las polimerasas T3 y T7 en presencia de (S^{35})UTP a >6 mCi/ml (Amersham, >1200 Ci/mmol) y 1,6 U/ml RNasin (Promega), con los reactivos restantes de la transcripción in vitro que se proporcionan en un kit (SureSite, Novagen Inc). Después de la transcripción a 37ºC durante 1 hora, las matrices de ADN se eliminaron mediante una digestión de 15 minutos a 37ºC con 0,5 U/ml de DNasa I libre de RNasa, se extrajeron, y precipitaron con etanol. Las ribosondas se hidrolizaron hasta una longitud final promedio de 150 pares de bases mediante incubación en 40 mM NaHCO_{3}, 60 mM Na_{2}CO_{3}, 80 mM DTT durante aproximadamente 40 minutos a 60ºC. La hidrólisis se finalizó añadiendo acetato sódico, pH 6,0, y de ácido acético glacial hasta 0,09 M y 0,56% (v/v), respectivamente, y las sondas se precipitaron entonces con etanol, se disolvieron en DTT 0,1M, se contaron, y se guardaron a -20ºC hasta utilización. Los días 8,5-9,0, 13,5 y 16,5 los cortes de tejido del embrión de los ratones (Novagen) y el protocolo de hibridación in situ eran exactamente tal como se ha descrito (Chen et al., 1993; Yin et al., 1995).
3. Análisis Northern
El Poly A(+) ARN de las células MC3T3-E1 (alícuotas de 2-10 mg) se sometió a electroforesis sobre un gel de agarosa al 1,25%/formaldehído 2,2 M y se transfirió entonces a una membrana de nylon (Hybond-N, Amersham). El ARN se unió cruzadamente a la membrana mediante exposición a una fuente de luz UV (1,2 x 10^{6} mJ/cm^{2} , UV Stratalinker 2400, Stratagene) y se prehibridó entonces durante > 15 min a 65ºC en tampón Rapid-Hyb (Amersham, Inc). Una sonda cADN específica que estaba formada solamente por la secuencia no traducida del extremo 3' del transcrito, se marcó con P^{32} mediante cebado al azar y se utilizó para hibridación (2 h a 65ºC). Los borrones se lavaron progresivamente hasta condiciones muy severas (0,1X SSC/ SDS al 0,1%, 65ºC) y se dispusieron entonces contra una película de rayos X con pantallas de intensificación (XAR, Kodak) a -86ºC.
4. Preparación de anticuerpos
Se produjeron anticuerpos LTBP-3 contra una única secuencia peptídica encontrada en el dominio #2 (aminoácidos 155-167). El péptido #274 (GESVASKHAIYAVC) (SEC ID Nº: 16) se sintetizó utilizando un sintetizador ABI modelo 431A utilizando la química FastMoc. La secuencia se confirmó utilizando un secuenciador de proteínas ABI473. Se añadió un residuo de cisteína al extremo carboxilo para facilitar la unión cruzada con las proteínas vehículos. Para la producción de anticuerpos, el péptido sintético se acopló con la albúmina sérica de conejo (RSA) utilizando MBS (éster m-maleimidobenzoico -N-hidroxisuccinimida) a una sustitución de 7,5 mg de péptido por mg de RSA. Un mg del conjugado péptido-RSA en 1 ml del adyuvante completo de Freund se inyectó subcutáneamente en 10 sitios distintos a lo largo de los lomos de los conejos. Empezando a las 3 semanas después de la inmunización inicial, a los conejos se les administró bisemanalmente inyecciones de revacunación de 1 mg de péptido-RSA en 100 \mul del adyuvante incompleto de Freund. Se preparó IgG mezclando suero inmune con ácido caprílico (0,7 ml de ácido caprílico por ml de suero), agitando durante 30 minutos, y centrifugando a 5.000 x g durante 10 minutos. Se decantó el sobrenadante y se dializó contra dos cambios de solución salina tamponada (PBS) durante una noche a 4ºC. La solución de anticuerpos se purificó entonces por afinidad, haciéndola pasar por una columna que contenía el péptido de inmunización acoplado a un soporte de afinidad Affi-gel 10. Los anticuerpos unidos se eluyeron con glicina 0,2 M (pH 2,3), dializándose inmediatamente contra PBS, y se concentraron hasta 1mg/ml antes de conservarla a -70ºC.
5. Transfección
Se llevó a cabo una transfección transitoria utilizando protocolos estándar (Sambrook et al., 1989). Brevemente, células subconfluentes (que cubrían menos del 20% de una placa de cultivo tisular de plástico de 100 mm) se lavaron 2X en medio de cultivo tisular DMEM (GIBCO) y se incubaron entonces durante 3 horas a 37ºC en una mezcla estéril de DEAE-dextrano (0,25 mg/ml), cloroquina (55 mg/ml) y 15 mg de ADN plasmídico (Courey y Tjian, 1988). Las células se sometieron entonces a shock incubándolas con DMSO al 10% en PBS estéril durante 2 minutos, a 37ºC, se lavaron 2X con DMEM (Sambrook et al., 1989), y se incubaron en DMEM más suero fetal de ternera al 10% y antibióticos durante 72 horas, a 37ºC.
6. Inmunoprecipitación
Para la inmunoprecipitación, 1 ml de anticuerpos (concentración final de 1:400, en tampón PBS-TDS: 0,38 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 8,1 mM Na_{2}HPO_{4}, 1,5 mM KH_{2}PO_{4}, Triton X-100 al 1%, ácido Desoxicólico al 0,5%, y SDS al 0,1%) se añadió a 1 ml de proteínas del medio marcadas radioactivamente. La mezcla se incubó con agitación a 4ºC durante 1 hora, añadiéndose perlas de proteína A-Sepharosa CL-4B (suspensión de 200 ml, al 10%) y esta mezcla se incubó con agitación durante una hora más a 4ºC. Las proteínas inmunoprecipitadas se sedimentaron mediante centrifugación breve, el sedimento se lavó 6x con tampón PBS-TDS, se añadió 2x de tinte proteico de carga, y las muestras se hirvieron durante 5 minutos y fraccionadas entonces en un SDS-PAGE con gradiente del 4-18% (Bonadio et al., 1985). Se utilizaron para estimar el peso molecular marcadores fríos de peso molecular (de 200 kDa-14,3 kDa, mezcla Rainbow, Amersham). El gel se secó y se expuso a la película durante el tiempo indicado a la temperatura ambiente.
7. Análisis Western
Proteínas fraccionadas en el interior de geles de SDS-poliacrilamida se transfirieron a un filtro de nitrocelulosa durante 2 horas utilizando tampón Tris-glicina-metanol, pH 8,3 a 0,5 mA/cm^{2}. El filtro se bloqueó, se incubó con leche sin grasa más anticuerpos (dilución 1:1000) durante 2 horas, y se lavó. La tinción de los anticuerpos se visualizó utilizando el reactivo de transferencia ECL Western (Amersham) según los protocolos del fabricante.
B. Resultados
En este estudio, los inventores aislaron y caracterizaron un nuevo cADN del tipo de la fibrilina murina que codificaba LTBP-3. Para clonar el gen LTBP-3 murino, se amplificó el cADN de una biblioteca cADN de células 3T3 utilizando iniciadores PCR™ de la fibrilina-1 humana bajo condiciones poco severas (esto es., hibridación inicialmente a 37ºC durante 10 ciclos, seguido por hibridación a 60ºC durante 30 ciclos). Los resultados indicaron que se obtuvo un fragmento de ADN murino de homología inesperadamente escasa (aprox. el 50%) para la fibrilina-1 humana. La clonación molecular del auténtico transcrito de la fibrilina-1 murina se llevó también a cabo, confirmando que las secuencias que codifican la fibrilina-1 murina y humana comparten >95% de la identidad secuencial. Las secuencias de la fibrilina-1 murina y de PCR™ fueron diferentes, lo que sugirió que el producto PCR™ puede haber derivado de un cADN relacionado de tipo fibrilina. La biblioteca cADN de células 3T3 se rastreó severamente utilizando el producto PCR™ murino como sonda con objeto de probar esta hipótesis. Una estrategia de rastreo del cADN dio lugar eventualmente a siete clones de cADN que se solapaban (Fig. 14). Proporciona un único ARNm de 4.314 nucleótidos, con un marco de lectura abierto de 3.753 nucleótidos (SEC ID Nº:2). La molécula que se deduce es un polipéptido único de 1.251 aminoácidos (SEC ID Nº:3). Excluyendo el péptido señal (21 aminoácidos), la nueva molécula de tipo fibrilina está formada por cinco regiones estructuralmente distintas (región 1-Región 5) y aunque similar a la fibrilina-1 murina (Fig. 15A), su estructura de dominios es única, tal como se evidencia por la representación esquemática de LTBP-3 que se muestra en la Fig. 15B.
El dominio #1 es un segmento de 28 aminoácidos con una carga básica neta (est. pI, 12.36) que puede permitir la unión de moléculas ácidas en la matriz extracelular (por ejemplo., proteoglicanos acídicos). Secuencias ricas en aminoácidos básicos pueden funcionar también como señales de procesado endoproteolítico (Barr, 1991; Steiner et al., 1992), lo que sugiere que el extremo NH_{2} puede ser procesado proteolíticamente. El dominio #2 se extiende por 390 aminoácidos, estando formado por una repetición de tipo EGF, un segmento de 135 aminoácidos que era rico en prolina (20, 7%) y rico en glicina (11,8%) pero no en cisteína, un motivo Fib (Pereira et al., 1993), una repetición EGF-CB, y una repetición de tipo TGF-bp. El dominio #3 es un segmento de 113 aminoácidos caracterizado por su alto contenido en prolina (21%). El dominio #4 se extiende por 678 aminoácidos y está formado por 14 repeticiones consecutivas ricas en cisteína. Basándose en homologías estructurales, 12/14 repeticiones eran motivos de unión de calcio a factor de crecimiento epidérmico (EGF-CB) (Hanford et al., 1991), mientras que 2/14 eran motivos de proteínas unidas al factor transformante de crecimiento -\beta (TGF-bp) (Kanzaki et al., 1990). Finalmente, el dominio #5 es un segmento de 22 aminoácidos en el extremo carboxilo. La secuencia conceptual de 45 aminoácidos codificada por el marco de lectura abierto estaba formada por 1.251 aminoácidos (Fig. 15B) con un pI estimado de 5,92, una masa molecular predicha de 134.710 Da, y cinco sitios de glicosilación potencial unida a N. No estaba presente la secuencia RGD.
El análisis de transferencia Northern del ARN embrional murino utilizando una sonda de la región no traducida del extremo 3,' identificó una banda de transcripción de aproximadamente 4,6 kb. A este respecto, se han aislado 4.310 nt mediante clonación del cADN, incluyendo una región no traducida del extremo 3' de 401 nt y una secuencia corriente arriba del extremo 5' de 156 nt. La discrepancia aparente entre el resultado del análisis Northern y el análisis de la secuencia del cADN sugirió que la secuencia corriente arriba del extremo 5' puede incluir aproximadamente 300 nt de
secuencia corriente arriba adicional. Esta estimación estaba de acuerdo con estudios preliminares de mapeo de la extensión de los iniciadores que indicaban que la secuencia corriente arriba del extremo 5' tiene 400-500 nt de longitud.
Se encontraron en los dominios #2 y #4 del polipéptido (LTBP-3) de tipo LTBP murino un total de 19 repeticiones ricas en cisteína. Trece eran de tipo EGF y 11/13 contenían la secuencia de consenso de unión al calcio. Este consenso se derivó de un análisis de 154 repeticiones EGF-CB en 23 proteínas distintas y a partir de los análisis estructurales de la repetición EGF-CB, ambos unidos y no unidos al ión calcio (Selander-Sunnerhagen et al., 1992). Se han notado previamente variaciones sobre el consenso y una de estas, D-L-N/D-E-C_{1}, se identificó en la tercera repetición de tipo EGF del dominio #4. Además, se identificó una secuencia de unión potencial al calcio de la que no se ha informado previamente (E-T-N/D-E-C_{1}), en la primera repetición de tipo EGF del dominio #4. Diez de las 13 repeticiones EGF-CB contenían también una segunda secuencia de consenso que representa una secuencia de reconocimiento para una hidroxilasa Asp/Asn que modifica co y post-traslacionalmente los residuos D/N (Stenflo et al., 1987; Gronke et al., 1989).
Aunque con un tamaño alrededor de la mitad, el polipéptido deducido estaba organizado como la fibrilina-1 porque estaba formado por un péptido señal seguido por 5 dominios estructuralmente distintos, es decir., dos dominios con numerosas repeticiones de tipo EGF, EGF-CB y Fib y un tercero con una secuencia rica en prolina (Pereira et al., 1993). Sin embargo, la comparación de cada uno de estos dominios utilizando los programas GAP y BESTFIT (Genetics Computer Group) ha revelado un bajo nivel de homología aminoácida de sólo el 27% sobre los cinco dominios estructurales compartidos por el polipéptido murino deducido y la fibrilina-2 humana. Estos valores son bajos para un miembro putativo de la familia de la fibrilina porque la fibrilina -1 y la fibrilina-2 comparten aproximadamente el 50% de la identidad (Zhang et al., 1994).
Una investigación de bases de datos disponible reveló que el polipéptido murino deducido era más similar a las proteínas de unión latentes TGF-\beta de la rata y del hombre (Kanzaki et al., 1990; Tsuji et al., 1990). A este respecto, se encontró que la LTBP era similar a la fibrilina porque podía también ser dividida en cinco dominios estructuralmente distintos (Figs. 15A, 15B, 15C). Estos incluyen un dominio relativamente corto corriente abajo del péptido señal con una carga básica neta (aminoácidos 21-33, est. pI, 11.14); un dominio que está formado por los motivos de tipo EGF, EGF-CB, TGF-bp y Fib más una secuencia rica en prolina y glicina (aminoácidos 34-407); un dominio rico en prolina (aminoácidos 408-545); un gran dominio formado por EGF-CB, TGF-bp, y motivos de repetición de tipo TGF-bp (aminoácidos 546-1379); y un dominio relativamente corto en el extremo carboxilo (aminoácidos 1380-1394). La comparación de la secuencia aminoácida de los polipéptidos humanos y murinos deducidos muestra una identidad del 60% para el dominio #1, 52% para el dominio #2, 30% para el dominio #3, 43% para el dominio #4 y 7% para el dominio #5. La identidad promedio respecto a los cinco dominios compartidos por el polipéptido murino y el LTBP humano fue de 38,4%. Significativamente, los residuos de cisteína en ambas secuencias polipeptídicas estaban muy conservados.
Las fibrilinas se expresan exclusivamente por las células conjuntivas en los tejidos en desarrollo (Zhang et al., 1994), mientras que LTBP se expresará conjuntamente con TGF-\beta mediante las células tanto conjuntivas como epiteliales (Tsuji et al., 1990). Los datos de homología estructural predicen por tanto que el gen LTBP-3 murino que se muestra en la Fig. 15B se expresará por ambas células, las del tejido conjuntivo y las epiteliales. La hibridación tisular in situ se utilizó para ensayar esta hipótesis.
Una visión en conjunto del patrón de expresión tal como se determina por el tejido en la hibridación in situ se presenta en las Figs. 17A, 17B, 17C y 17D. Cortes sagitales medios aproximados de embriones murinos normales en los días 8,5-9,0, 13,5 y 16,5 p.c. del desarrollo se hibridizaron con una ribosonda de sentido normal monocatenaria marcada con S^{35} de la misma construcción cADN que se utilizó. En los días 8,5-9,0 del desarrollo, se observó una intensa expresión génica en los tejidos uterinos mesometriales y anti-mesometriales, cono ectoplacentario, placenta, membranas placentarias. El transcrito pareció expresarse ampliamente en los compartimientos tisulares embriomesenquimáticos/conjuntivos murinos, incluyendo el mesénquima facial, en los días 8,5-9,0, 13,5 y 16,5 del desarrollo. Se notó una expresión particularmente intensa del transcrito en el hígado.
La microscopía del día 8,5-9,0 de los embriones confirmó la expresión extendida del gen murino por las células mesenquimáticas. También se observó la expresión significativa del transcrito por las células del sistema nervioso central en desarrollo, de los somitos y del tejido cardiovascular (miocardio más endocardio).
La microscopía del día 13,5 y del día 16,5 de los embriones demostró la expresión del gen murino por las células musculares del esqueleto y por las células implicadas en la formación ósea intramenbranosa y endocondral. El transcrito se expresó por los osteoblastos y por las células periostales de la bóveda craneal, mandíbula y maxilares. El transcrito se identificó también en el cartílago y en el hueso de la extremidad inferior. Se detectó una señal positiva en las células pericondriales y en los condrocitos (proliferantes > maduros > hipertróficos) del cartílago articular, en la presunta placa de crecimiento, y en el modelo de cartílago en el interior del canal central. La señal positiva se expresó también por las células endoteliales de los vasos en el interior de la diáfisis media, y en las células musculares que la rodeaban (Figs. 18A, 18B, 18C, 18D, 18E, 18F, 19G, 18H, 18I, 18J, 18K, 18L, 18M, 18N, 18O y 18P).
Las células epiteliales respiratorias que tapizan las pequeñas vías aéreas que se están desarrollando y las células del tejido conjuntivo en el intersticio pulmonar expresaron el transcrito murino, como lo hicieron las células miocárdicas (aurícula y ventrículos) y el tejido almohadilla endocárdico. Las células en el interior de las paredes de las grandes arterias expresaron también el transcrito. La expresión del gen murino se identificó en diversos órganos del sistema alimentario, incluyendo la lengua, esófago, estómago, intestino pequeño y grueso, páncreas e hígado. Las células epiteliales mucosas que tapizan el tracto digestivo superior e inferior más las células musculares lisas y las del tejido conjuntivo encontradas en la submucosa, expresaron el transcrito, como lo hicieron las acinares del páncreas exocrino. A pesar del alto nivel de la expresión del transcrito en el hígado, estos resultados sugieren que ambas poblaciones celulares expresan el transcrito de LTBP-3.
En el riñón, una expresión superior al nivel basal se observó en las células de las nefronas en desarrollo, en el primordio uretérico, blastema renal y en el intersticio renal. En la piel, expresaron el transcrito murino los queratinocitos epidérmicos y anexos, las células del tejido conjuntivo dérmico, y las células de grasa parda en el interior del subcutis dorsal. En los sistemas nerviosos central y periférico, células ganglionares en el interior del cerebro, tallo cerebral, médula espinal y nervios periféricos, expresaron el transcrito murino. El transcrito se expresó también intensamente por las células de la retina murina en desarrollo.
De este modo, el gen murino es expresado ampliamente por ambos tipos de células, las epiteliales y las del tejido conjuntivo, un patrón que se esperaba para una proteína de unión TGF-\beta latente. Tres observaciones finales razonan que la secuencia (LTBP-3) de tipo LTBP representada en la Fig. 25 no es simplemente el homólogo murino de la LTBP humana. En primer lugar, el dominio #4 de la secuencia (LTBP-3) de tipo LTBP murino, posee un número menor de motivos repetitivos tipo EFG que la LTBP de la rata y del hombre (8 contra 11). En segundo lugar, porciones de la secuencia codificante tipo LTBP de la rata y del hombre se caracterizaron y se encontró que compartían aproximadamente el 90% de identidad con la LTBP murina y humana, pero sólo el 65% de identidad con el gen murino de tipo LTBP. En tercer lugar, los genes humanos LTBP y de tipo LTBP están localizados en cromosomas separados. El LTBP humano se asignó al cromosoma humano 2 basándose en el análisis de progenies híbridas de células somáticas de roedor x humanas (Stenman et al., 1994). La presente invención representa la realización del primer mapa de un gen LTBP en el ratón. El gene de tipo LTBP humano se localizó recientemente en la banda q12 del cromosoma 11, mientras que el gen murino se localizó en la banda B del cromosoma 19 (una región de colinealidad de genoma conservada), utilizando varias aproximaciones independientes que incluyen la hibridación fluorescente in situ.
La primera indicación de corte y empalme alternativo provino de los estudios de clonación molecular en el murino, en los que clones cADN independientes se aislaron con una deleción de 51 pares de bases a partir de la secuencia codificante. El análisis PCR™/transferencia Southern proporcionó evidencia adicional de que la secuencia homóloga de 51 pares de bases se cortaba y empalmaba alternativamente en los tejidos normales embrionarios del murino.
El análisis de transferencia Northern demostró también que el nuevo gen de la fibrilina se expresaba también en el callo de las ratas tres semanas después de la osteotomía, después de que hubiera empezado la mineralización. La expresión del gen en el tejido óseo de la rata adulta normal fue insignificante, lo que sugiere que las microfibrillas son una parte importante de la respuesta de cicatrización de la fractura ósea. El nuevo gen de tipo fibrilina se expresó en el callo como un par de transcritos de alternativamente corte y empalme. Este resultado se ha reproducido independientemente en tres ocasiones. La clonación molecular del nuevo gen de la fibrilina tanto en murinos como en ratas ha identificado sitios potenciales de corte y empalme para este evento alternativo.
Se utilizaron preosteoblastos murinos MC3T3 para demostrar que el producto del gen murino era capaz de unirse al TGF-\beta. Las células MC3T3-E1 se utilizaron porque sintetizan y secretan TGF-\beta, que puede actuar como un regulador autocrino de la proliferación osteoblástica (Amarnani et al., 1933); Van Vlasselaer et al., 1994; López-Casillas et al., 1994).
Para determinar si las células MC3T3-E1 coexpresaban o no el producto del gen murino de TGF-\beta, se sembraron en placas de 100 mm bajo condiciones de diferenciación (Quarles et al., 1992) y el medio se reemplazó dos veces semanalmente. Se sembraron discos paralelos y se ensayaron en cuanto al número de células y la actividad de la fosfatasa alcalina, lo que confirmó que la diferenciación osteoblástica estaba verdaderamente teniendo lugar. Alícuotas iguales del ARN celular total se prepararon a partir de estas células MC3T3-E1 después de 5, 14 y 28 días de cultivo, para el análisis de transferencia Northern. Tal como se muestra en la Fig. 19, la expresión del nuevo gen murino alcanzó su máxima concentración en el día 14 del cultivo. Ya que las células MC3T3-E1 muestran también una concentración máxima en la actividad de la fosfatasa alcalina en el día 14 del cultivo (Quarles et al.,1992), los resultados sugieren por primera vez que la expresión del gen LTBP-2 constituye un marcador temprano de la diferenciación de los osteoblastos.
C. Discusión
Este estudio informa de la clonación molecular de un nuevo gen de tipo LTBP que contiene numerosas repeticiones tipo EGF. El análisis Northern indica que el gen codifica un transcrito simple de aproximadamente 4,6 kb en los tejidos embrionarios murinos. La secuencia aminoácida deducida del producto del gen murino parece ser un polipéptido secretado de 1.251 aminoácidos. Aunque es similar a la fibrilina, la organización estructural global y el patrón de expresión de este producto génico se parece mucho a LTBP, una proteína de unión a TGF-\beta latente que se aisló y caracterizó originariamente por Heldin y colaboradores (Kanzaki et al., 1990). Varias observaciones sugieren intensamente que LTBP y el producto del gen de tipo LTBP murino se derivan por tanto de loci genéticos distintos pero relacionados. En primer lugar, LTBP y la secuencia codificante tipo LTBP comparten aproximadamente el 40% de identidad y existen diferencias en el número de repeticiones EGF-CB en la secuencia polipéptida deducida de las dos moléculas. En segundo lugar, una porción del gen LTBP murino se ha clonado y muestra que comparte aproximadamente una identidad del 90% con la LTBP humana y de la rata. A la inversa, porciones de los genes de tipo LTBP de la rata y del hombre se han clonado y muestran compartir aproximadamente el 90% de la identidad con el gen de tipo LTBP murino. En tercer lugar, los genes LTBP y de tipo LTBP residen en distintos cromosomas humanos (Stenman et al., 1994). Cuando estos datos se toman en conjunto, sugieren que existe una familia de por lo menos dos genes LTBP.
Se ha hecho hincapié previamente en similitudes en la organización estructural de LTBP-1 y los polipéptidos fibrilina-1 y fibrilina-2 (Pereira et al., 1933; Zhang et al., 1994; Taipale et al., 1994). Por ejemplo, LTBP-1 y las fibrilinas son todos constituyentes secretados de la matriz extracelular. Además, cada polipéptido puede organizarse en cinco dominios, dos de los cuales están formados predominantemente por motivos repetitivos de EGF-CB y TGF-bp. LTBP-1 y fibrilin-1 también comparten un dominio que es rico en prolina, y LTBP posee una repetición de 8 cisteínas a la que anteriormente se ha aludido como el "motivo Fib" porque se asumió que era único en la fibrilina (Pereira et al., 1993). Estas similitudes explican probablemente el aislamiento inicial y clonación del producto LTBP-2 PCR™, especialmente desde que los iniciadores oligonucleótidos humanos utilizados para amplificar inicialmente el cADN murino, se diseñaron para dirigir la síntesis de una repetición EGF-CB en el dominio #4.
Otro punto de distinción entre LTBP-2 y la fibrilina se refiere al espaciamiento de las cisteínas conservadas C4 y C5 en las repeticiones de tipo EGF. La fibrilina-1 y la fibrilina-2 contienen cada una > 50 de dichas repeticiones, y en cada uno el espaciamiento es C_{4}-C_{5}. Mientras que este patrón se repite en la mayoría de las repeticiones de tipo EGF en LTBP-1 y LTBP-2, ambos genes contienen también repeticiones con el espaciamiento C_{4}-X-X-C_{5}. Aunque el significado de esta observación no está claro, la variación en el número de aminoácidos entre C_{4} y C_{5} no se espera que altere la función de la repetición de tipo EGF. El EGF maduro es un polipéptido secretado de 48 aminoácidos que está formado por dos subdominios que tienen pocos contactos interdominio (Engel, 1989; Davis, 1990). El subdominio más grande NH_{2}-terminal está formado por los residuos 1-32 y está estabilizado por un par de enlaces disulfuro (C_{1}-C_{3} y C_{2}-C_{4}), mientras que el subdominio más pequeño COOH-terminal (aminoácidos 33-48) está estabilizado por un solo enlace disulfuro (C_{5}-C_{6}). El subdominio COOH-terminal posee una conformación muy conservada que sólo es posible si ciertos residuos y las distancias entre ellos están bien conservadas, mientras que los requerimientos conformación-secuencia para el subdominio NH_{2}-terminal están relativamente relajados. La variación en el espaciamiento C_{4}-C_{5} no se espera que altere la conformación porque estos residuos no forman normalmente un enlace disulfuro y la variación en el espaciamiento ocurre en la interfase de los subdominios que no está predicho que interaccionen. La clonación de genes adicionales decidirá si la variación en el espaciamiento C_{4}-C_{5} es un discriminador de confianza entre miembros de las familias génicas de la fibrilina y de LTBP.
El gen LTBP-2 se expresa más ampliamente durante el desarrollo que la fibrilina-1 ó la fibrilina-2. Estudios en tejidos murinos en desarrollo han mostrado que el gen Fbn-1 se expresa por las células mesenquimáticas del tejido conjuntivo en desarrollo, mientras que el gen murino de tipo LTBP se expresa intensamente por células epiteliales, parenquimáticas y estromáticas. Informes anteriores han sugerido que la TGF-\beta juega un papel en la diferenciación y morfogénesis durante el desarrollo murino (Lyons y Moses, 1990), cuando TGF-\beta es producida por las células epiteliales, parenquimáticas y estromáticas. Tsuji et al., (1990) y otros han sugerido que la expresión de las proteínas de unión a TGF-\beta debería reflejar la del TGF-\beta mismo; el patrón de expresión del gen LTBP-2 sobre el curso del desarrollo murino está de acuerdo con esta esperanza. Sin embargo, el gen LTBP-2 puede no estar completamente corregulado con TGF-\beta. El gen TGF-\beta y la expresión proteica durante el desarrollo murino se ha inspeccionado extensivamente (Heine et al., 1987; Lehnert y Akhurst, 1988; Pelton et al., 1989; Pelton et al., 1990 a,b; Millan et al., 1991); estos estudios no han identificado la expresión por las células musculares del esqueleto, condrocitos, hepatocitos, células gangliónicas, células mucosas que tapizan el tracto digestivo, y células epiteliales de nefronas en desarrollo. Es concebible que la molécula LTBP-2 tenga una función adicional en ciertos tejidos conjuntivos además de tener como diana a TGF-\beta.
Las propiedades de unión del producto del gen LTBP-2 están investigándose. Formalmente, el polipéptido LTBP-2 puede unirse a un TGF-\beta isoforma específico, otro miembro de la superfamilia de TGF-\beta (por ejemplo., una proteína morfogenética ósea, inhibina, activina, o factor de inhibición Mullerian), o un factor de crecimiento no relacionado con TGF-\beta. Se han generado anticuerpos anti péptidos al polipéptido murino LTBP-2 y se han identificado progenies celulares osteoblásticas que expresan la molécula a relativamente altos niveles. Estudios con estos reactivos sugieren que LTBP-2 se reúne intracelularmente en grandes complejos latentes con un factor de crecimiento que se caracteriza mediante procedimientos inmunológicos.
La presencia de aminoácidos dibásicos en la secuencia de LTBP-2 sugiere que puede experimentar proteolisis tisular y celular específica. TGF-\beta regula la producción de la matriz extracelular suprimiendo su degradación (a través de una disminución en la expresión de proteasas tales como la colagenasa, activador plasminógeno, y estromelisina más un aumento en la expresión de inhibidores de la proteinasa tales como el inhibidor del activador plasminógeno-1 y el inhibidor tisular de la metaloproteinasa-1) y por estimular la síntesis de macromoléculas de la matriz (para revisión reciente, véase Lyons y Moses, 1990; Massague, 1990; Laiho y Keski-Oja, 1992; Miyazono et al., 1992). Inversamente, la producción de la matriz extracelular se ha mostrado que regula a la baja la expresión del gen TGF-\beta (Streuli et al., 1993). TGF-\beta puede por tanto regular la producción de la matriz extracelular mediante un sofisticado bucle de retroalimentación que influencia la expresión de un número relativamente elevado de genes. LTBP-1 y LTBP-2 pueden contribuir a esta regulación facilitando la reunión y secreción de complejos de factores de crecimiento latentes y dirigiendo entonces el complejo a tejidos conjuntivos específicos (Taipale et al., 1994).
Si LTBP-3 es como LTBP-1, posee el potencial para funcionar como una proteína estructural extracelular secretada. Tal como aquí se demuestra, el dominio #1 de LTBP-3 parece ser una secuencia única que probablemente tiene una conformación globular. El dominio #1 es también muy básico y puede facilitar la unión de LTBP-2 a moléculas ácidas (por ejemplo., proteoglicanos ácidos) en el interior del espacio extracelular. Las secuencias ricas en aminoácidos básicos han mostrado también que funcionan como señales de procesado endoproteolítico para diversas hormonas peptídicas (Barr, 1991; Steiner et al., 1992). Es posible, por tanto, que el extremo NH_{2} de LTBP-3 se procese proteolíticamente en una forma tisular específica. Los dominios #2 y #4 están formados por repeticiones consecutivas ricas en cisteína, la mayoría de las cuales son del tipo EGF-CB. Además de unir al calcio (Corson et al., 1993), estas repeticiones pueden proporcionar LTBP-3 con una conformación de las regiones capaz de interactuar con otras macromoléculas de la matriz (Engel, 1989). El dominio #3 es rico en prolina y puede ser capaz de unirse (o de funcionar como una bisagra) en el espacio tridimensional (MacArthur y Thornton, 1991). (A este respecto, el dominio #2 es de interés porque tiene un trozo similar de 135 aminoácidos que es rico en prolina y en glicina. Ya que las secuencias ricas en glicina se cree también que son capaces de unirse o funcionar como bisagra en un espacio tridimensional, esta secuencia de aminoácido puede interrumpir la conformación extendida del dominio #2, proporcionado de este modo un cierto grado de flexibilidad en el espacio tridimensional). El dominio #5 parece también tener una secuencia única que posee una conformación globular. La ausencia de un motivo de unión celular conocido puede indicar que, en contraste con LTBP-1, la molécula LTBP-3 puede tener un papel más limitado en la matriz extracelular (es decir., la de una proteína estructural) además de su capacidad para dirigir los complejos TGF-\beta latentes a tejidos conjuntivos específicos.
Los preosteoblastos MC3T3 co-expresan LTBP-3 y TGF-\beta1 y estas proteínas forman un complejo en el medio de cultivo. Estos resultados son particularmente interesantes porque el hueso representa uno de los almacenados más grandes conocidos de TGF-\beta latentes (200 \mug/kg de hueso; Seyedin et al., 1986 y 1987), y porque este factor de crecimiento juega un papel crítico en la determinación de la estructura y función ósea. Por ejemplo, se piensa que TGF-\beta (i) proporciona un estímulo poderoso para la formación ósea en los tejidos en desarrollo, (ii) funciona como un posible "factor de acoplamiento" durante la remodelación ósea (un proceso que coordina la resorción y la formación ósea), y (iii) ejerce un poderoso estímulo ósteo inductor después de la fractura. La activación del complejo latente puede constituir una importante etapa que gobierne los efectos de TGF-\beta, y LTBP puede modular el proceso de activación (por ejemplo., puede "proteger" pequeños complejos latentes del ataque proteolítico).
La expresión de grandes complejos TGF-\beta latentes que llevan LTBP puede ser fisiológicamente importante, es decir., puede ser parte del mecanismo de cascada de diferenciación preosteoblasto \rightarrow osteoblasto. Esto se basa en la evidencia de que las células MC3T3-E1 expresan grandes complejos TGF-\beta latentes que llevan PTBP-2 precisamente cuando se produce la transición desde el preosteoblasto al fenotipo del osteoblasto (aproximadamente el día 14 en el cultivo, o, al principio de la expresión de la fosfatasa alcalina; véase Quarles et al., 1992). El modelo de cultivo de órganos, por ejemplo, está compuesto probablemente de osteoblastos diferenciados pero de pocos progenitores unidos, haciendo a lo mejor de él un modelo dificultoso para estudiar la cascada de diferenciación (Dallas et al., 1984). Se sabe también que las células MG63, ROS17/2.8 y UMR 106 se dividen rápidamente y expresan el fenotipo del osteoblasto. Así, estas progenies celulares de tipo osteblasto no muestran el desacoplamiento de la proliferación y de la diferenciación celulares que caracteriza la transición normal pre-osteoblasto \rightarrow osteoblasto (fisiológicamente importante) (Gerstenfeld et al., 1984; Stein y Lian, 1993). Por tanto, la producción de complejos TGF-\beta latentes pequeños con relación a los grandes puede estar relacionado con fases específicas en la maduración de las células óseas.
La LTBP-3 puede unirse al calcio, ya que las repeticiones EGF-CB han mostrado mediar la unión de alta afinidad al calcio en LTBP-1 y otras proteínas (Colosetti et al., 1993). La unión al calcio, a su vez, puede contribuir a la conformación molecular y a la regulación de sus interacciones con otras moléculas. La presencia de aminoácidos dibásicos sugiere que puede experimentar proteolisis tisular y celular específica. TGF-\beta regula la producción de la matriz extracelular suprimiendo su degradación (a través de una disminución en la expresión de proteasas tales como la colagenasa, activador plasminógeno, y estromelisina más un aumento en la expresión de inhibidores de la proteinasa tales como el inhibidor del activador plasminógeno-1 y el inhibidor tisular de la metaloproteinasa-1) y por estimular la síntesis de macromoléculas de la matriz (para revisión reciente, véase Lyons y Moses, 1990; Massague, 1990; Laiho y Keski-Oja, 1992; Miyazono et al., 1992). Inversamente, la producción de la matriz extracelular se ha mostrado que regula a la baja la expresión del gen TGF-\beta (Streuli et al., 1993). TGF-\beta puede por tanto regular la producción de la matriz extracelular mediante un sofisticado bucle de retroalimentación que influencia la expresión de un núero relativamente elevado de genes. LTBP-1, LTBP-2 y LTBP-3 pueden contribuir a esta regulación facilitando la reunión y secreción de grandes complejos de factores de crecimiento latentes y dirigiendo entonces el complejo a tejidos conjuntivos específicos (Taipale et al., 1994).
Ejemplo XVI Preparación de anticuerpos contra el producto del gen LTBP-3
Se preparó un anticuerpo purificado por afinidad (#274) capaz de inmunoprecipitación, contra el producto del gen LTBP-3 murino. Se reunió un cADN murino de longitud total en un vector de expresión pcADN3 de mamífero (Invitrogen) y se expresó después de la transfección transitoria de las células 293T. Polipéptidos nacientes, marcados radioactivamente mediante adición de Cys S^{35} al medio de las células transfectadas, se inmunoprecipitaron utilizando anticuerpos #274 purificados por afinidad. Tal como se muestra en la Fig. 20, el nuevo polipéptido murino se estimó de unos 180-190 kDa. Para asegurar la especificidad de la unión a #274, se muestra que la preincubación con 10 \mug de péptido sintético bloquea la inmunoprecipitación de la banda de 180-190 kDa.
Finalmente, las células MC3T3 se cultivaron durante 7 días bajo condiciones de diferenciación y se marcaron doblemente con 30 \muCi/ml de S^{35}cisteína y S^{35}metionina en medios deficientes. El medio marcado radioactivamente se dializó en PBS frío con inhibidores de la proteasa. Alícuotas de la muestra del medio dializado (10^{6} CPM incorporados) se analizaron mediante un protocolo combinado de inmunoprecipitación/análisis Western. El polipéptido murino se secretó clara y reproduciblemente por las células MC3T3, emigrando bajo condiciones reducidas como una banda simple de 180-190 kDa (Fig. 21). De acuerdo con los resultados de estudios previos (por ejemplo., Miyazono et al., 1988; Dallas et al., 1994; Moren et al., 1994), bandas de 70 y 50 kDa que correspondían al precursor TGF-\beta se co-inmunoprecipitaron con la proteína LTBP-3 de 180 kDa. Bandas débiles de 40 y 12 kDa se identificaron también en experimentos en los que sólo se llevó a cabo la inmunoprecipitación. Estas últimas no se incluyeron en la Fig. 21 debido a que emigraron al interior de la porción del gel incluido en el análisis Western. Las bandas proteicas de 70-12,5 kDa no son formas variantes de LTBP-3; la Fig. 20 demuestra que LTBP-3 emigra como una banda simple de 180-190 kDa después de la transfección transitoria de las células 293T, lo que no hace TGF-\beta. Mediante inmunoprecipitación, en el inmunoprecipitado LTBP-2 se encontró una banda única de acuerdo con el TGF-\beta monomérico maduro. El anticuerpo #274 es incapaz de unirse a TGF\beta tal como se determina mediante radioinmunoensayo utilizando reactivos comercialmente disponibles (R & D Systems) y los protocolos sugeridos por el fabricante. Estos resultados se han reproducido en 6 experimentos independientes que utilizaron 3 lotes separados de medio MC3T3-E1. Así, el nuevo polipéptido murino LTBP-3 se une in vitro a TGF-\beta.
Ejemplo XVII Aislamiento de un gen que codifica la LTBP-2 murina
Además de determinar el ADN y la correspondiente secuencia polipeptídica del gen LTBP-3 murino, el gen LTBP-2 murino también se clonó y secuenció.
La secuencia nucleótida cADN completa para el LTBP-2 murino se muestra en la Fig. 27 (SEC ID Nº:17). La secuencia aminoácida deducida se muestra en la Fig. 28 (SEC ID Nº:18).
Ejemplo XVIII Expresión del colágeno recombinante de tipo II
El kit de Expresión de Pichia (Invitrogen, Inc) puede utilizarse para preparar colágeno recombinante de tipo II. Este kit, basado en la levadura metilotrófica, Pichia pastoris, permite un alto nivel de expresión de proteínas recombinantes en un sistema fácil de utilizar y relativamente barato. En ausencia de la fuente preferida de carbono, glucosa, P.pastoris utiliza metanol como fuente de carbono. El promotor AOX1 controla el gen que codifica la expresión del enzima alcohol oxidasa, que cataliza el primer paso en el metabolismo del metanol. Este promotor, que es inducido por el metanol, se ha caracterizado e incorporado a una serie de vectores de expresión de Pichia. Esta característica de Pichia se ha explotado para expresar altos niveles de proteínas recombinantes a menudo en el intervalo de gramos por litro. A causa de que es eucariótica, Pichia pastoris utiliza vías de modificación post-traduccional que son similares a las utilizadas por las células de mamífero. Esto implica que el colágeno recombinante de tipo II será glicosilado y contendrá enlaces disulfuro.
Los inventores consideran los siguientes elementos particulares como útiles en la expresión del colágeno recombinante de tipo II: la secuencia de ADN del colágeno humano de tipo II (SEC ID Nº:11) (Lee et al., 1989); colágeno de rata de tipo II (SEC ID Nº:13) (Michaelson et al., 1994); y/ó colágeno de tipo II de ratón (SEC ID Nº:15) (Ortman et al., 1994). Como otras fuentes de secuencias de ADN que codifiquen el colágeno de tipo II están disponibles, estos tres son ejemplos de muchos elementos secuenciales que pueden ser útiles en la presente invención.
Para la preparación de un colágeno de tipo II recombinante, el cADN de colágeno de tipo II original se modifica añadiendo un epítopo marcador disponible comercialmente (epítopo HA, Pharmacia, LKB Biotechnology, Inc). Dichos fragmentos pueden prepararse fácilmente, por ejemplo, sintetizando directamente el fragmento mediante medios químicos, mediante aplicación de la tecnología de reproducción del ácido nucleico, tal como la de PCR™ del documento de Patente U.S. 4.603.102 (que se incorpora a la presente memoria como referencia) o introduciendo secuencias seleccionadas en vectores recombinantes para la producción recombinante. (PCR™ es una marca registrada de Hoffmann-LaRoche,Inc). Esto se sigue por clonación dentro del vector de expresión de Pichia. El plásmido resultante se caracteriza mediante análisis secuencial del ADN, linealizado mediante digestión con NotI, y se prepararán y transformarán esferoplastos con la construcción linealizada según las recomendaciones del fabrican-
te.
La transformación facilita un suceso de recombinación in vivo entre las secuencias 5' y 3' AOX1 en el vector de Pichia y las secuencias en el genoma de Pichia. El resultado es el reemplazamiento de AOX1 con el gen de interés.
Los transformantes se siembran entonces en medios deficientes en histidina, los cuales se seleccionarán para convertirse en células transformadas con éxito. Los transformantes se seleccionarán ulteriormente respecto a crecimiento lento en medios de crecimiento que contengan metanol. Los transformantes positivos se hacen crecer durante 2 días en cultivo líquido y entonces, durante 2-6 días, en medio que utiliza metanol como la única fuente de carbono. La expresión proteica se evalúa mediante electroforesis en gel de poliacrilamida-sulfato dodecil sódico (SDS-PAGE) e hibridación Western, utilizando un antisuero policlonal para el epítopo HA disponible comercialmente (Pharmacia).
La proteína de colágeno de tipo II recombinante puede purificarse según las recomendaciones del fabricante, dializarse contra agua desionizada y doblemente destilada, y liofilizarse en alícuotas de 10 mg. Las alícuotas se esterilizan y utilizan como material de injerto para las matrices osteconductoras.
Todas las composiciones y procedimientos que aquí se han expuesto y reivindicado pueden llevarse a cabo sin experimentación, a la luz de la presente exposición. Aunque las composiciones y métodos de la presente invención se han descrito en términos de formas de realización preferidas, está claro para los expertos en la técnica que pueden aplicarse variaciones a la composición, a los procedimientos y en las etapas o en la secuencia de éstas del procedimiento descrito en la presente memoria, sin apartarse del concepto, espíritu y alcance de la invención. Más específicamente, está claro que ciertos agentes que están química y fisiológicamente relacionados, pueden sustituir a los agentes aquí descritos mientras se alcancen los mismos o similares resultados. Dichos sustitutos similares y modificaciones claras para los expertos en la materia, se considera que pertenecen al espíritu, alcance y concepto de la invención, tal como se definen en las reivindicaciones adjuntas.
Referencias
Las siguientes citas de la literatura así como las anteriormente citadas se incorporan a la presente memoria, en la parte correspondiente, como referencia por las razones citadas en el texto anterior.
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(1) INFORMACIÓN GENERAL:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
SOLICITANTE:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE: REGENTS OF THE UNIVERSITY OF MICHIGAN
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
CALLE: 3003 S. State Street
\hskip4.2cm
The Wolverine Tower, Room 2071 
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CIUDAD: Ann Arbor
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
ESTADO: Michigan
\vskip0.500000\baselineskip
(E)
PAIS: Estados Unidos de América
\vskip0.500000\baselineskip
(F)
CÓDIGO POSTAL: 48109-1280
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
INVENTORES: BONADIO, Jeffrey
\hskip3.85cm
ROESSLER, Blake J. 
\hskip3.85cm
GOLDSTEIN, Steven A. 
\hskip3.85cm
LIN, Wushan 
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
TITULO DE LA INVENCIÓN: MÉTODOS Y COMPOSICIONES PARA ESTIMULAR LAS CÉLULAS ÓSEAS
\vskip0.800000\baselineskip
(iv)
NUMERO DE SECUENCIAS: 18
\vskip0.800000\baselineskip
(v)
DIRECCIÓN PARA LA CORRESPONDENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
DESTINATARIO: Arnold, White & Durkee
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
CALLE: P.O. Box 4433
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CIUDAD: Houston
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
ESTADO: Texas
\vskip0.500000\baselineskip
(E)
PAIS: Estados Unidos de América
\vskip0.500000\baselineskip
(F)
CÓDIGO: 77210
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
FORMA LEGIBLE DEL ORDENADOR:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
TIPO DE MEDIO: Disco blando
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
IBM PC compatible
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS/ASCII
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
SOFTWARE: PatentIn Release #1.0, Versión #1.30
\vskip0.800000\baselineskip
(vii)
DATOS HABITUALES DE SOLICITUD:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NUMERO DE SOLICITUD: DESCONOCIDO
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
FECHA CLASIFICACIÓN: ADJUNTA CONCURRENTEMENTE
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CLASIFICACIÓN: DESCONOCIDA
\vskip0.800000\baselineskip
(viii)
DATOS ANTERIORES DE LA SOLICITUD:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NUMERO DE SOLICITUD: US 08/316, 650
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
FECHA CLASIFICACIÓN: 30-SEP-1994
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CLASIFICACIÓN: DESCONOCIDA
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NUMERO DE SOLICITUD: US 08/199, 780
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
FECHA CLASIFICACIÓN: 18-FEB-1994
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CLASIFICACIÓN: DESCONOCIDA
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
PROCURADOR/AGENTE DE INFORMACIÓN:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE: Parker, David L.
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
NUMERO DE REGISTRO: 32.165
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
NUMERO DE REFERENCIA/REGISTRO: UMI0009P
\vskip0.800000\baselineskip
(x)
INFORMACIÓN DE TELECOMUNICACIÓN:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
TELÉFONO: (512) 418-3000
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TELEFAX: (713) 789-2679
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TELEX: 79-0924
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO: 1
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 417 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE FILAMENTO: simple
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
1
2
3 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
4 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO: 2
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 3753 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE FILAMENTO: simple
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN: 1..3753
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO:2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
5 
\vskip1.000000\baselineskip
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
17 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO: 3
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 1251 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE FILAMENTO: simple
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGIA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO:4
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 24 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE FILAMENTO: simple
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO.4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
AACATGACGC TCATCGGAGA GAAC 
\hfill
24 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO:5
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 18 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE FILAMENTO: simple
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO:5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
AGGTGATCGC AGATCCTC 
\hfill
18 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO:6
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 24 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE FILAMENTO: simple
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 6
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
TACCGATGCT ACCGCAGCAA TCTT 
\hfill
24 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO:7
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 22 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE FILAMENTO: simple
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO:7
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ATGCCTAAAC TCTACCAGCA CG 
\hfill
22 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO:8
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 22 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE FILAMENTO: simple
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA:SEC ID NO:8
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GAGTCACGTC ATCCATTCCA CA 
\hfill
22 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO:9
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 22 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE FILAMENTO: simple
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO:9
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
CGTCCAAGTT GTGTCTTAGC AG 
\hfill
22 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO:10
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 53 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE FILAMENTO: simple
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 10
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
28 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO: 11
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 159 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE FILAMENTO: simple
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 11
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
29 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO: 12
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 1442 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE FILAMENTO: simple
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 12
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
30
31
32
33
34
35
36
37
38
39
40 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
41 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO: 13
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 267 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE FILAMENTO: simple
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGIA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 13
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
42 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO: 14
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 54 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE FILAMENTO: simple
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGIA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 14
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
43 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO: 15
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 731 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE FILAMENTO: simple
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGIA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 15
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
44 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
45 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO: 16
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 14 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE FILAMENTO: simple
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGIA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 16
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Gly Glu Ser Val Ala Ser Lys His Ala Ile Tyr Ala Val Cys}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO: 17
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 5502 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE FILAMENTO: simple
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGIA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
DESCRIPCIÓN: /desc="ADN"
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN: 1..5502
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 17
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
46 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
47
48
49
50
51
52
53
54
55
56
57
58
59
60
61
62
63
64
65 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO: 18
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 1834 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGIA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 18
66 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
67
68
69
70
71
72
73
74
75
76
77
78
79
80

Claims (39)

1. Composición que comprende un segmento aislado de ácido nucleico y una matriz óseo-compatible para su utilización en medicina humana y veterinaria, en la que dicho segmento aislado de ácido nucleico codifica una proteína osteotrópica, polipéptido o péptido, y en la que dicha matriz es una matriz colágena, metálica, de hidroxilapatito, metálica revestida con hidroxilapatito, de biovidrio, de aluminato, biocerámica, de un polímero de éster acrílico, de un polímero de ácido láctico, de un polímero de ácido glicólico, o de un polímero de ácido láctico/ácido glicólico, copolímeros en bloque de PLGA, un sulfato cálcico biodegradable y químicamente definido, fosfato tricálcico, polianhídrido, una matriz de proteínas purificadas, una composición matricial extracelular semipurificada, calcio-aluminato-fosfato, polímeros o ortoésteres, anhídridos, o propilen-cofumaratos.
2. Composición según la reivindicación 1, en la que dicho segmento de ácido nucleico es un gen osteotrópico aislado, siendo capaz dicha composición de promover la expresión del gen en células progenitoras óseas y de estimular a dichas células.
3. Composición según la reivindicación 2, en la que la composición es capaz de promover el crecimiento del tejido óseo.
4. Composición según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en la que dicha composición se prepara poniendo el segmento de ácido nucleico o el gen en contacto con la matriz óseo-compatible para formar una composición matriz-segmento de ácido nucleico/gen.
5. Composición según la reivindicación 4, en la que dicha composición comprende dicho segmento o gen en asociación con la matriz óseo-compatible y un agente plurónico para formar una composición matriz-segmento de ácido nucleico/gen inyectable.
6. Composición según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en la que dicha composición comprende además un agente detectable para utilizarlo en una modalidad de formación de imágenes.
7. Composición según la reivindicación 6, en la que dicha composición comprende además un agente radiográfico.
8. Composición según la reivindicación 6, en la que dicha composición comprende además un ión paramagnético.
9. Composición según la reivindicación 6, en la que dicha composición comprende además un ión radioactivo.
10. Composición según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en la que dicha composición comprende además fosfato de calcio.
11. Composición según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en la que dicho segmento de ácido nucleico es una molécula de ADN o una molécula de ARN.
12. Composición según la reivindicación 1, en la que dicha matriz es una matriz de titanio o una preparación de colágeno.
13. Composición según la reivindicación 12, en la que dicha matriz es una matriz de titanio revestida con hidroxilapatito, hidroxilapatito sinterizado, o en la que la matriz es una preparación de colágeno de tipo I o de tipo II.
14. Composición según la reivindicación 1, en la que dicha matriz óseo-compatible es una matriz de un polímero ácido láctico/ácido glicólico.
15. Composición según la reivindicación 13, en la que dicha preparación de colágeno de tipo II se obtiene de cartílago hialino, es una preparación de colágeno de tipo II recombinante, o una preparación de colágeno de tipo II mineralizado.
16. Composición según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15, en la que dicho segmento de ácido nucleico es una molécula lineal de ácido nucleico, un plásmido, una inserción recombinante en el interior del genoma de un virus recombinante, o un segmento de ácido nucleico asociado con un liposoma; porque dicho gen osteotrópico está en forma de ADN plasmídico, una inserción de ADN en el interior del genoma 35 de un adenovirus recombinante, una inserción de ADN en el interior del genoma de un virus a deno-asociado recombinante (AAV), una inserción de ADN en el interior del genoma de un retrovirus recombinante, o un segmento de ADN asociado con un liposo-
ma.
17. Composición según cualquiera de las reivindicaciones 2 a 16, en la que dichas células progenitoras óseas son células troncales, macrófagos, fibroblastos, células vasculares, osteoblastos, condroblastos, ó osteoclastos.
18. Composición según la reivindicación 17, en la que dichas células progenitoras óseas son fibroblastos.
19. Composición según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 18, en la que dicho segmento de ácido nucleico o gen osteotrópico se absorbe en el interior de dicha matriz óseo-compatible, o se adsorbe a la misma, o se impregna en la misma.
20. Composición según la reivindicación 19, en la que el gen osteotrópico es un gen de la hormona paratiroidea (PTH), un gen de la proteína morfogenética ósea (BMP), un gen del factor de crecimiento, un gen del receptor del factor de crecimiento, un gen citoquínico, o un gen del factor quimiotáctico.
21. Composición según la reivindicación 20, en la que el gen osteotrópico es un gen PTH1-34, un gen BMP-2 ó un gen BMP-4, un gen del factor transformante de crecimiento (TGF), un gen del factor fibroblástico de crecimiento (FGF), un gen del factor estimulante colonial granulocito/macrofágico (GMCSF), un gen del factor de crecimiento epidérmico (EGF), un gen del factor de crecimiento derivado de las plaquetas (PDGF), un gen del factor de crecimiento de tipo insulínico (IGF), un gen del factor inhibitorio leucémico (LIF), o un gen LTBP-2 ó LTBP-3.
22. Composición según la reivindicación 20 ó 21, en la que el gen osteotrópico es un gen TGF-\alpha, ó TGF-\beta1, ó TGF-\beta2, o un gen LTBP-3.
23. Composición según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 22, en la que la composición comprende una matriz óseo-compatible y dos o tres segmentos de ácido nucleico ó dos ó tres genes osteotrópicos.
24. Composición según la reivindicación 23, en la que la composición comprende un gen PTH y un gen BMP.
25. Composición según la reivindicación 24, en la que la composición comprende un gen PTH1-34 ó un gen BMP-4.
26. Utilización de la composición según cualquiera de las reivindicaciones anteriores en la preparación de una fórmula ó medicamento para transferir un segmento de ácido nucleico a células progenitoras óseas.
27. Utilización de la composición según cualquiera de las reivindicaciones 2 a 25 en la preparación de una fórmula o medicamento para promover la expresión de un gen osteotrópico en las células progenitoras óseas, así como estimular a éstas.
28. Utilización según la reivindicación 26 ó 27, en la que dichas células progenitoras óseas están en el interior de un sitio tisular progenitor óseo de un animal.
29. Utilización según la reivindicación 27, en la que dicha fórmula o medicamento se aplica a un lugar de fractura ósea o se injerta en el interior de una cavidad ósea para promover el crecimiento tisular óseo en dicho animal.
30. Utilización según la reivindicación 29, en la que el sitio de la cavidad ósea es uno que es el resultado de cirugía dental ó periodontal, ó de la eliminación de un osteosarcoma.
31. Utilización según cualquiera de las reivindicaciones 26 a 30, en la que las células progenitoras óseas son fibroblastos.
32. Utilización de la composición según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 25, en la preparación de un medicamento destinado a promover la cicatrización de las heridas y la reparación relacionada de los tejidos.
33. Procedimiento in vitro para transferir un segmento de ácido nucleico ó gen a células progenitoras óseas, comprendiendo el procedimiento la etapa de poner en contacto las células progenitoras óseas con la composición según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 25.
34. Procedimiento según la reivindicación 33, en el que las células progenitoras óseas son fibroblastos.
35. Kit que comprende, en unos medios contenedores apropiados, la matriz osteo-compatible y el segmento aislado de ácido nucleico o el gen, tal como se definen en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 25 en una forma farmacéuticamente aceptable.
36. Kit según la reivindicación 35, caracterizado porque dicho segmento de ácido nucleico comprende una preparación génica liofilizada.
37. Dispositivo osteotrópico que comprende un gen osteotrópico aislado tal como se define según cualquiera de las reivindicaciones 2 a 25, en el que dicho dispositivo es capaz de estimular la formación ósea cuando se injerta en el interior de un sitio hístico progenitor óseo de un animal.
38. Dispositivo según la reivindicación 37, en el que es un dispositivo osteotrópico de titanio revestido con hidroxilapatito.
\newpage
39. Dispositivo según la reivindicación 37 ó 38, en el que dicho dispositivo adopta una forma que se adapte al sitio de una fractura ósea, o una que rellene el sitio de una cavidad ósea en dicho animal o en el que dicho dispositivo es una articulación artificial.
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