KR100751690B1 - 조골 세포와 생체 기질 성분의 혼합물을 이용한 골 생성용조성물 및 그 제조방법 - Google Patents

조골 세포와 생체 기질 성분의 혼합물을 이용한 골 생성용조성물 및 그 제조방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 조골 세포와 생체 기질 성분의 혼합물을 이용한 골 생성용 조성물 및 그 제조방법에 관한 것으로서, 특히 동물의 조직으로부터 조골 세포를 분리하여 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's Medium) 또는 α-MEM(Minimum Essential Medium, Alpha Modification) 배양액으로 증식 배양시켜 조골 세포 현탁액을 제조하는 현탁액 제조 단계와; 상기 조골 세포 현탁액에 생체 기질 성분을 혼합하여 조골 세포 치료제를 제조하는 치료제 제조단계로 이루어지는 것을 특징으로 한다.
상기와 같은 본 발명에 따르면 골 생성을 위해 조골 세포와 생체 기질 성분의 혼합물을 골 생성을 목적으로 하는 부위에 주입함으로 임상적으로는 거부 반응이 없도록 하며, 조골 세포 현탁액 주입으로 인해 주입된 조골 세포가 뼈 형성 부위를 벗어나 혈류를 타고 다른 부위로 전파되어 원치 않는 부위에 골조직을 만들 수 있는 문제점 등도 보완하여 어느 정도 성형된 조성물을 주입함으로 인해 효과적이고 빠른 골 생성을 이룰 수 있다.
조골 세포, 생체 기질, 골 생성

Description

조골 세포와 생체 기질 성분의 혼합물을 이용한 골 생성용 조성물 및 그 제조방법{Bone formation composition composed of mixture of osteoblast and bio-matrix and its manufacturing method}
도 1은 골의 구성성분 비율을 나타낸 그래프,
도 2는 본 발명에 따른 조골 세포와 생체 기질 성분의 혼합물을 이용한 골 생성용 조성물 제조방법의 공정을 나타낸 공정도,
도 3은 조골 세포와 생체 기질 성분의 혼합물인 3차원 조골 세포 치료제를 면역 결핍 마우스의 피하 층에 주입하는 사진,
도 4는 조골 세포와 생체 기질 성분의 혼합물인 3차원 조골 세포 치료제 이식 4주 후의 면역 결핍 마우스의 사진,
도 5는 조골 세포와 생체 기질 성분의 혼합물인 3차원 조골 세포 치료제를 면역 결핍 마우스에 이식 4주 후에 이식물을 채취한 사진,
도 6은 조골 세포와 생체 기질 성분의 혼합물인 3차원 조골 세포 치료제 이식 4주 후의 면역 결핍 마우스의 방사선사진,
도 7은 조골 세포와 생체 기질 성분의 혼합물인 3차원 조골 세포 치료제를 면역결핍 마우스에 이식 8주 후 골 형성을 확인할 수 있는 Hematoxylin-Eosin 염색,
도 8은 조골 세포와 생체 기질 성분의 혼합물인 3차원 조골 세포 치료제를 면역결핍 마우스에 이식 8주 후 Masson's Trichrom 염색.
본 발명은 조골 세포와 생체 기질 성분의 혼합물을 이용한 골 생성용 조성물 및 그 제조방법에 관한 것으로서, 상세하게는 골 결손 치료 시 혹은 골 생성이 필요한 부위에 골 생성을 목적으로 이식할 수 있는 조골 세포와 생체 기질 성분의 혼합물을 이용한 골 생성용 조성물 및 그 제조방법에 관한 것이다.
세계보건기구(WHO)에 의하면 65세 이상 노인인구의 50% 이상이 고질적인 골질환에 고통받고 있으며, 지난 10여년간 골다공증을 원인으로 한 골절의 비율이 2배 이상 증가하였다. 50세 이상 여성인구의 거의 40% 이상에 해당된다.
미국의 경우 매년 약 560만명이 골절상을 당하고, 이중 310만명이 수술을 받는데 1995년 MDI(medical data international)의 통계에 따르면, 약 426,000례의 골이식술이 시행되었다. 골 이식에 대한 비용은 전세계적으로 매년 8억 달러 정도가 사용되고, 1995년 한해 동안 58% 정도가 자가골 이식, 동종골 이식은 34%, 합성물 이식은 8%가 시행되었다.
보통 단순 골절의 경우 몇 주간의 석고 고정으로도 충분한 치유가 이루어지지만 골절이 심한 경우나 골 결손이 있는 경우에는 골 이식술을 시행하였다.
그러나, 자가골이식(autograft)의 경우 채취 부위에 통증이 심하고, 회복기 간도 오래 걸리며, 골이식 공여부의 확보에 어려움이 따른다.
그리고, 동종골이식(allograft)의 경우, 멸균에 따른 골강도의 약화, 면역 거부반응, 간염이나 AIDS와 같은 감염의 가능성이 있다는 치명적인 단점을 가지고 있다.
다른 골 이식 방법으로는 생물활성이나 생물비활성 세라믹으로 도포된 금속 등이 정형외과 수술에 지지체로 사용 되나 금속의 부식, 세라믹-금속의 표면의 마모, 뼈와 이식물 표면의 심한 fibrose tissue 형성 등의 문제점 등을 가지고 있어 금속을 골 이식제로 사용하는 데는 많은 어려움이 있다.
골 형성 인자에 대해서는 Urist와 Mclean(1952)의 골형성단백의 골 형성에 대한 발표 후 여러 가지 인자들이 연구되고는 있지만, 그 생산 과정이 복잡하고 고가의 과정에 소량을 얻는 비효율성으로 인하여 일반 임상에의 적용에는 한계가 있다.
골수 주입술(bone marrow injection)은 Huggins(1931), Friedenstein(1973), Ashton(1980)등이 골수 내의 골 생성 전구 세포(osteoprogenitor cell)가 골 형성을 유도하고 촉진한다고 한 주장에 근거를 둔다. 이는 주로 골절 치유를 위해 단독으로 주입되기도 하지만, 골 이식과 병행하여 주입되기도 한다. 다른 골 이식술과는 달리 공여 부위를 피부 절개를 통한 수술이 아니므로 공여 부위의 문제점이 없고, 합병증이나 부작용이 없다는 것이 큰 장점이다.
그 후 많은 임상 적용의 발표를 통해 좋은 결과도 발표되고는 있지만, 많은 결과들이 일정하지 않고, 먼저 한 곳에서 뽑을 수 있는 골수의 양이 제한되어 있 고, 또한 골수에 포함된 골 형성 전구 세포의 수는 매우 제한되는 이론적 근거가 불명확한 단점이 있다.
그리하여 충분한 수의 골모 세포로 증폭 배양한 후, 생체 기질 성분과 혼합하여 골 생성 부위에 주입하는 새로운 골 생성 이식 방법은 매우 효과적인 방법으로 기존의 자가 골 이식이나 동종골 이식 및 골수 주입에 비해 많은 장점과 효과를 내포하고 있으며 골 생성 치료법(Bone regeneration therapy)에서 각광받고 있는 조직공학의 한 분야이다.
본 발명은 상기와 같은 인플란트나 골 이식 등의 문제점을 개선하고자 창안한 것으로, 골 생성을 위해 혼합물인 조골 세포와 생체 기질 성분의 혼합물을 골 생성을 목적으로 하는 부위에 주입함으로 임상적으로는 거부 반응이 없도록 하며, 조골 세포 현탁액 주입으로 인해 주입된 조골 세포가 뼈 형성 부위를 벗어나 혈류를 타고 다른 부위로 전파되어 원치 않는 부위에 골조직을 만들 수 있는 문제점 등도 보완하여 어느 정도 성형된 조성물을 주입함으로 인해 효과적이고 빠른 골 생성을 이룰 수 있도록 하는 조골 세포와 생체 기질 성분의 혼합물을 이용한 골 생성용 조성물 및 그 제조방법을 제공하는데 그 목적이 있다.
상기와 같은 목적을 달성하기 위한 본 발명의 특징은,
동물의 조직으로부터 조골 세포를 분리하여 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's Medium) 또는 α-MEM(Minimum Essential Medium, Alpha Modification) 배양액으로 증식) 배양시켜 조골 세포 현탁액을 제조하는 현탁액 제조 단계와; 상기 조골 세포 현탁액에 생체 기질 성분을 혼합하여 조골 세포 치료제를 제조하는 치료제 제조단계로 이루어지는 것을 특징으로 한다.
여기에서, 상기 치료제 제조단계는 상기 조골 세포 현탁액에 상기 생체 기질 성분을 혼합한 상기 조골 세포 혼합액에 응고제를 혼합하는 혼합단계를 더 포함한다.
여기에서 또한, 상기 혼합단계는 상기 조골 세포 혼합액에 응고제로 트롬빈(thrombin)을 10IU/m~100IU/ml로 혼합하는 트롬빈 혼합 단계; 및 상기 트롬빈이 혼합된 혼합액에 응고제로 피브리노겐(fibrinogen)을 20~100mg/ml로 혼합하는 피브리노겐 혼합 단계로 이루어진다.
여기에서 또, 상기 생체 기질 성분은 콜라겐(collagen) 또는 하이드록시아파티트(hydroxyapatite) 또는 이들을 혼합한 것이다.
여기에서 또, 상기 콜라겐은 상기 조골 세포 현탁액에 67μg/ml~20mg/ml가 첨가되고, 상기 하이드록시아파티트는 상기 조골 세포 현탁액에 30μg/ml~3.4mg/ml가 첨가된다.
여기에서 또, 상기 콜라겐은 상기 조골 세포 현탁액에 혼합 전에 pH가 중화되도록 중화 용액을 첨가하여 중화시킨다.
여기에서 또, 상기 트롬빈은 상기 조골 세포와 생체 기질 성분의 혼합액에 첨가하기 전에 동결건조 상태의 트롬빈에 골 무기질 성분으로 인산이온(PO43-)이 첨 가된 DMEM 또는 α-MEM 액체 배지로 용해시키되, 인산이온(PO43-)이 배양액내 포함량의 2배가 되도록 첨가하고, 상기 피브리노겐은 상기 조골 세포 혼합액에 첨가하기 전에 동결건조 상태의 피브리노겐에 골 무기질 성분으로 칼슘이온(Ca2+)이 첨가된 DMEM또는 α-MEM 액체 배지로 용해시키되, 칼슘이온(Ca2+)이 첨가된 배양액내 포함량의 2배가 되도록 첨가한다.
본 발명의 다른 특징은,
상기의 조골 세포와 생체 기질 성분의 혼합물을 이용한 골 생성용 조성물 제조방법에 의해 제조된 골 생성용 조성물을 특징으로 한다.
이하, 본 발명에 따른 조골 세포와 생체 기질 성분의 혼합물을 이용한 골 생성용 조성물 제조방법을 첨부된 도면을 참조하여 상세하게 설명하면 다음과 같다.
인플란트나 골 이식 등의 기존의 뼈 관련 질환의 치료법이 가지는 단점을 극복하기 위해서는 기존의 치료 방법의 개선과 함께 궁극적인 치료 방법으로 조골 세포를 배양하여 환부에 부작용이 없는 자기 유래 조골 세포를 이식하는 기술이 개발되어왔다.
하지만 보다 빠른 골 생성을 위해서는 세포와 기질 성분과의 혼합은 필수적이며 이를 통해 보다 광범위한 병변의 치료가 가능함으로 인해 세포만으로 이루어진 액상의 조골 세포 현탁액 주입에 의해서 수혜를 받지 못하는 더 많은 골 질환을 치료할 수 있다.
조골 세포와 생체 기질 성분의 혼합물인 3차원 조골 세포 치료제는 cell therapy에 기반을 둔 액상의 조골 세포 현탁액 주입법을 한 차원 승화시킨 제품이라 할 수 있다. 기존의 세포만을 이식하는 액상의 조골 세포 현탁액 주입법은 한정된 유형의 골 결손만을 치료할 수 있으며 주입된 조골 세포가 뼈 형성 부위를 벗어나 혈류를 타고 다른 부위로 전파되어 원치 않는 부위에 골조직을 만들 수 있는 문제점 등이 있으나 이에 반해 본 발명에 따른 조골세포와 생체 기질 성분의 혼합물인 3차원 조골세포 치료제는 조골 세포와 생체기질 혼합체로 이루어져 있기에 보다 광범위한 범위의 결손과 심화된 골질환도 빠르고 효과적으로 치료할 수 있다.
뼈는 세포와 이들 세포간에 존재하는 다량의 골 기질(bone matrix)로 이루어져 있으며, 골기질의 대부분은 교원섬유(collagen fiber)로 구성된 유기질 성분(35%)과 칼슘과 인산 등으로 구성된 무기질 성분(65%)으로 이루어져 있다.
뼈는 도 1에 도시된 바와 같이 일종의 생체 합성물로서 구성비율 순으로 보면 무기질, 콜라겐, 수분, 비콜라겐성 단백질, 지질, 혈관 성분, 그리고 세포 등으로 이루어져 있다.
뼈 구성에서 가장 많은 비율을 차지하는 무기질은 지질학적 무기질의 하나인
하이드록시아파티트(hydroxyapatite : 수산화 인회석)의 유사 물질이다.
뼈 인회석은 칼슘이나 수산화기 대신에 주로 탄산, 그 외에 마그네슘, 칼륨, 붕소, 인산, 구연산등으로 치환되어 있는 것이 일반적이다.
뼈의 성숙도에 따라 뼈 무기질중의 탄산의 함량이 높아진다. 탄산은 수산화기나 인산기를 치환하거나 뼈 인회석의 표면에 흡착되어 있기도 하다
두 번째로 풍부한 뼈의 구성성분은 콜라겐으로서 주로 제1형 콜라겐인데 콜 라겐은 뼈에 탄력성과 유연성을 부여하며 기질의 구성에 대한 방향성을 제공한다.
본 발명은 조골 세포와 생체 기질 성분을 혼합하여 골 질환 부위에 주입하여야 하며 골을 구성하는 성분인 콜라겐(collagen), 하이드록시아파티트(Hydroxyapatite)를 혼합하여 병변 부위에 주입하므로 인해 골의 물리적인 성질을 미리 확보하여 보다 빠른 골 생성 및 무기질화된 뼈로 만들 수 있다.
이러한 골 기질의 주성분인 조골세포와 생체 기질 성분의 혼합에 있어서 가장 중요한 요소 중 하나는 안정성이며 기질 안에서 필요한 세포 수 확보를 위해 세포의 생존율을 높여야 하며, 이식 후 세포의 생착률을 높이는 것도 또한 중요하다.
도 2는 본 발명에 따른 조골 세포와 생체 기질 성분의 혼합물을 이용한 골 생성용 조성물 제조방법의 공정을 나타낸 공정도이다.
도 2를 참조하면, 본 발명은 조직으로부터 조골 세포를 분리하여 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's Medium) 또는 α-MEM(Minimum Essential Medium, Alpha Modification) 배양액으로 증식) 배양시켜 조골 세포 현탁액을 제조하는 현탁액 제조 단계(S100)와, 조골 세포 현탁액에 생체 기질 성분을 혼합하여 조골 세포 치료제를 제조하는 치료제 제조단계(S200)로 이루어지는 것을 특징으로 한다.
여기에서, 조골 세포 현탁액 내의 조골 세포의 개수는 병변의 크기와 위치에 따라 그 개수가 각각 다르게 배양되며, 보통 100만개~1200만개가 바람직하며, 그 이상의 세포수도 무방하다.
여기에서 또한, 치료제 제조단계(S200)는 조골 세포 현탁액에 생체 기질 성 분을 혼합한 조골 세포와 생체 기질 성분의 혼합액에 응고제를 혼합하는 혼합단계를 더 포함한다.
여기에서 또, 혼합단계는 조골 세포와 생체 기질 성분의 혼합액에 응고제로 트롬빈(thrombin)을 10IU/m~100IU/ml로 혼합하는 트롬빈 혼합 단계(S220)와, 트롬빈이 혼합된 혼합액에 응고제로 피브리노겐(fibrinogen)을 20~100mg/ml로 혼합하는 피브리노겐 혼합 단계(S230)로 이루어진다.
여기에서, 생체 기질 성분은 콜라겐(collagen) 또는 하이드록시아파티트(hydroxyapatite) 또는 이들을 혼합한 혼합액이 이용되고, 혼합액인 경우 콜라겐 67μg/ml~20mg/ml, 하이드록시아파티트 30μg/ml~ 3.4mg/ml로 혼합한다.
한편, 콜라겐의 최소 농도는 조골 세포 배양시 배양 용기의 코팅제로 콜라겐을 사용하였을 때 세포 분화와 증식을 유도하는 배양 최적 농도였다. 이때 적용된 콜라겐의 농도를 메트릭스의 성분으로 적용 시켰을 때 조골 세포와 생체 기질 성분을 혼합한 조성물 주입에서 조골 세포가 콜라겐을 발현하기 이전 주입된 콜라겐 성분이 기본적인 메트릭스 네트워크(matrix network)를 형성하여 세포 분화를 유도하며, 빠른 무기질화를 이루어 최소량의 함량에도 빠른 골 생성을 확인할 수 있었다. 콜라겐을 단독 메트릭스로 사용하였을 때는 3mg/ml(0.3%)의 농도 이상이 되어야 일정 조건 하에서 겔(gel)화가 일어나 메트릭스를 형성하며, 최대 20mg/ml이 되면 콜라겐이 유동성이 급격히 감소하여 콜라겐 메트릭스에 조골 세포가 균일하지 하게 혼합되지 않아 세포 기질 메트릭스로서 적용하기 어렵다.
그리고, 하이드록시아파티트는 이 성분이 기질 혼합체에서 무기질화를 촉진 하는 농도여야 한다. 과량이 함유 될 경우 오히려 세포 기질 혼합물에서 하이드록시아파티트가 차지하는 공간적인 제약으로 인하여 세포의 분화를 저해한다. 본 발명에서는 기질 성분에서 하이드록시아파티트가 무기질화의 핵으로서 적용될 수 있는 최소 농도와 무기질화 촉진을 위한 적정 농도를 적용시켰다.
한편, 콜라겐은 조골 세포 현탁액에 혼합전에 pH가 중화되도록 중화 용액을 첨가하여 중화시킨다.
또한, 트롬빈은 상기 조골세포와 생체 기질 성분의 혼합액에 첨가하기 전에 동결건조 상태의 트롬빈에 인산이온(PO43-)이 첨가된 DMEM 또는 α-MEM 액체 배지로 용해시키되, 인산이온(PO43-)이 첨가된 배양액내 포함량의 2배가 되도록 첨가하고, 피브리노겐은 혼합액에 첨가하기 전에 동결건조 상태의 피브리노겐에 칼슘이온(Ca2+)이 첨가된 DMEM 또는 α-MEM 액체 배지로 용해시키되, 칼슘이온(Ca2+)이 첨가된 배양액내 포함량의 2배가 되도록 첨가한다. 여기에서 인산이온과 칼슘이온은 조골 세포에 세포 독성을 나타내지 않으며, 골 무기질 성분을 보완한다.
그리고, 혼합액에 응고제인 트롬빈(thrombin)을 10IU/m~100IU/ml로 혼합하고, 트롬빈이 혼합된 혼합액에 응고제인 피브리노겐(fibrinogen)을 혼합액에 20~100mg/ml로 혼합한다.
트롬빈은 피브린(Fibrin)의 중합 시간(polymerization time)을 결정하게 되는데, 트롬빈의 농도에 따라 중합 시간이 4시간에서 3초 이하의 시간으로 단축시킬 수 있다. 본 발명에 따른 조성물을 골 생성 부위에 주입하였을 때 조골 세포와 생 체 기질 혼합 조성물이 병변 위치에서 흘러내리지 않게 조형되며 환부에 주입되어 빠르게 중합되고, 조골 세포의 골 형성을 위한 최적의 fibrin pore matrix를 형성하는 트롬빈의 농도를 적용시켰다.
이하, 본 발명의 실시예에 따른 조골 세포와 생체 기질 성분의 혼합물을 이용한 골 생성용 조성물의 효과를 첨부된 도면을 참조하여 상세하게 설명하면 다음과 같다.
《실시예 1》
먼저, 조직으로부터 세포를 분리하여 DMEM 또는 α-MEM 배양액으로 4주간 증식 배양하여 DMEM 또는 α-MEM 배양액으로 이루어진 조골 세포 현탁액을 준비한다. 생체 기질 성분으로 혼합할 콜라겐을 준비한다.
그리고, 조골 세포 현탁액과 콜라겐을 혼합하여 총 1ml의 골 생성 조성물을 준비한다.
《실시예 2》
조직으로부터 세포를 분리하여 DMEM 또는 α-MEM 배양액으로 4주간 증식 배양하여 DMEM 또는 α-MEM 배양액으로 이루어진 조골 세포 현탁액을 준비한다. 생체 기질 성분으로 콜라겐과 하이드록시아파티트를 준비한다. 조골 세포 현탁액에 1/10 부피의 하이드록시아파티트를 첨가한 후 잘 섞어준다. 생체 기질 성분으로 혼합할 2/5 부피의 콜라겐을 준비한다.
조골 세포 현탁액과 콜라겐을 혼합하여 총 1ml의 골 생성 조성물을 준비한다.
《실시예 3》
조직으로부터 세포를 분리하여 DMEM 또는 α-MEM 배양액으로 4주간 배양하여 DMEM 또는 α-MEM 배양액으로 이루어진 조골 세포 현탁액을 준비한다. 생체 기질성분으로 콜라겐과 하이드록시아파티트를 준비한다. 조골 세포 현탁액에 2/5 부피의 콜라겐, 1/10 부피의 하이드록시아파티트를 첨가한 후 잘 섞어 생체 기질 성분과 혼합된 조골 세포 치료제를 준비한다.
의약품으로 나와 있는 피브린 글루 셋트(fibrin glue set)를 실온에 준비한 후 동결 건조 상태인 피브리노겐 바이알(fibrinogen vial)에 적량의 DMEM 또는 α-MEM 액체 배지를 넣어 피브리노겐을 용해시킨다. 또한 동결 건조 상태인 트롬빈 바이알(thrombin vial)에도 적량의 DMEM 또는 α-MEM 액체 배지를 첨가하여 용해시킨다.
생체 기질 성분이 혼합된 액상의 조골 세포 현탁액에 용해시킨 트롬빈 1/10 부피를 첨가한 후 잘 혼합해 준다.
트롬빈과 생체 기질 성분이 혼합된 조골 세포 현탁액에 동량의 피브리노겐을 혼합하여 총 1ml의 골 생성 조성물을 준비한다.
《실시예 4》
조직으로부터 세포를 분리하여 DMEM 또는 α-MEM 배양액으로 4주간 증식 배양하여 DMEM 또는 α-MEM 배양액으로 이루어진 조골 세포 현탁액을 준비한다. 생체 기질 성분으로 콜라겐과 하이드록시아파티트를 준비한다. 조골 세포 현탁액에 2/5 부피의 콜라겐, 1/10 부피의 하이드록시아파티트를 첨가한 후 잘 섞어 생체 기질 성분과 혼합된 조골 세포 치료제를 준비한다.
의약품으로 나와 있는 피브린 글루 셋트(fibrin glue set)를 실온에 준비한 후 동결 건조 상태인 피브리노겐 바이알(fibrinogen vial)에 적량의 DMEM 또는 α-MEM 액체 배지를 넣어 피브리노겐을 용해시킨다. 또한 동결 건조 상태인 트롬빈 바이알(thrombin vial)에도 적량의 DMEM 또는 α-MEM 액체 배지를 첨가하여 용해시킨다.
이때 사용하는 DMEM 또는 α-MEM 액체 배지의 인산이온(PO43-) 농도가 2mg/ml의 농도가 되도록 첨가하여 사용한다. 또한 동결 건조 상태인 트롬빈 바이알에도 적량의 DMEM 또는 α-MEM 액체 배지를 첨가하여 용해시킨다. 이때 사용하는 DMEM 또는 α-MEM 액체 배지의 칼슘이온(Ca2+)이 4mg/ml의 농도가 되도록 첨가하여 사용한다. 이때 사용되는 칼슘이온(Ca2+)과 인산이온(PO43-)의 량은 세포에 세포 독성을 나타내지 않으며, 배양용액의 첨가물로서 골 무기질 성분을 보완하는 역할을 하는 최적의 용량이다.
생체 기질 성분이 혼합된 액상의 조골 세포 현탁액에 용해시킨 트롬빈 1/10 부피를 첨가한 후 잘 혼합해 준다.
트롬빈과 생체 기질 성분이 혼합된 조골 세포 현탁액에 동량의 피브리노겐을 혼합하여 총 1ml의 골 생성 조성물을 준비한다.
《결과》
15마리의 면역결핍 마우스를 6그룹으로 나누어(triple trial) 조골세포와 생 체 기질 혼합물인 3차원 조골세포 치료제를 준비하여 누드 마우스의 경갑골에 subcutaneous injection하였다. 각각 1ml의 조골 세포 치료제를 면역결핍 마우스의 피하층에 주입하였고, 4주와 8주 후에 결과를 확인하였다.
Group1 Group2 Group3
cell number(cells) 1×106cells 6×106cells 1.2×107cells
injection volume(cc) 1ml 1ml 1ml
표 1은 동일한 생체 기질 혼합물 조성에 조골 세포수를 달리하여 면역결핍 마우스에 조골세포와 생체 기질성분의 혼합물인 3차원 세포 치료제를 이식한 표이다.
Group1 Group2 Group3
size volume(cc) 0.26 0.24 0.25
bone formation good good good
여기에서, bone formation grade는 exellent/good/fair/poor 순이다.
표 2는 표 1의 8주후 골생성 결과를 나타낸 것이다.
Group4 Group5 Group6
cell number(cells) 6×106cells 6×106cells 6×106cells
collagen vol. 1/5 2/5 1
injection volume(cc) 1ml 1ml 1ml
표 3은 생체 기질 성분의 첨가량을 달리하여 면역결핍 마우스에 조골세포와 생체 기질 성분의 혼합물인 3차원 세포 치료제를 이식한 표이다.
Group4 Group5 Group6
size volume(cc) 0.24 0.52 0.50
bone formation good exellent exellent
여기에서, bone formation grade는 exellent/good/fair/poor 순이다.
표 4는 표 3의 8주후 골생성 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 조골 세포와 생체 기질 성분의 혼합물인 3차원 조골 세포 치료제를 면역 결핍 마우스의 피하 층에 주입하는 사진을 나타낸 것이고, 도 4는 조골 세포와 생체 기질 성분의 혼합물인 3차원 조골 세포 치료제 이식 4주 후의 면역 결핍 마우스(점선 내부의 불룩한 모습으로 관찰됨)의 골 생성을 나타낸 사진이다.
도 5는 면역 결핍 마우스에 조골 세포와 생체 기질 성분의 혼합물인 3차원 조골 세포 치료제 이식 4주 후에 골 생성 이식물을 채취한 모습으로 이식물 주변에 혈관이 유도되어 있는 것이 확인되며, 도 6은 조골 세포와 생체 기질 성분의 혼합물인 3차원 조골 세포 치료제 이식 4주 후의 면역 결핍 마우스의 방사선 사진인데, 점선 원 내부의 등뼈 위로 새로운 뼈가 생성된 것이 관찰된다.
도 7은 조골 세포와 생체 기질 성분의 혼합물인 3차원 조골 세포 치료제 이식 8주 후 골 생성을 확인할 수 있는 Hematoxylin-Eosin 염색으로, Osteoid(Block arrow)가 관찰되며, Lacuna(White arrow)안에 분포한 조골 세포도 확인할 수 있다.
도 8은 조골 세포와 생체 기질 성분의 혼합물인 3차원 조골 세포 치료제 이식 8주 후 Masson's Trichrom 염색으로, 결따라 콜라겐과 혼재되어 골형성이 이루어지고 있으며, 메트릭스 사이 혈관이 침투된 것을 확인할 수 있다.
따라서, 본 발명에 따르면 조골 세포와 생체 기질 성분의 혼합물을 골 생성을 목적으로 하는 부위에 주입함으로 임상적으로는 거부 반응이 없으며 어느 정도 성형된 조성물을 주입함으로 인해 효과적이고 빠른 골 생성을 유도하는 효과가 있다.
상기와 같이 구성되는 본 발명인 조골 세포와 생체 기질 성분의 혼합물을 이용한 골 생성용 조성물 및 그 제조방법에 따르면, 골 생성을 위해 조골 세포와 생체 기질 성분의 혼합물을 골 생성을 목적으로 하는 부위에 주입함으로 임상적으로는 거부 반응이 없도록 하며, 조골 세포 현탁액 주입으로 인해 주입된 조골 세포가 뼈 형성 부위를 벗어나 혈류를 타고 다른 부위로 전파되어 원치 않는 부위에 골조직을 만들 수 있는 문제점 등도 보완하여 어느 정도 성형된 조성물을 주입함으로 인해 효과적이고 빠른 골 생성을 이룰 수 있다.

Claims (8)

  1. 조골 세포와 생체 기질 성분의 혼합물을 이용한 골 생성용 조성물의 제조방법에 있어서,
    동물의 조직으로부터 조골 세포를 분리하여 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's Medium) 또는 α-MEM(Minimum Essential Medium, Alpha Modification) 배양액으로 증식 배양시켜 조골 세포 현탁액을 제조하는 현탁액 제조 단계와;
    상기 조골 세포 현탁액에 생체 기질 성분으로서 콜라겐(collagen) 또는 하이드록시아파티트(hydroxyapatite)를 혼합하여 조골 세포 치료제를 제조하는 치료제 제조단계로 이루어지는 것을 특징으로 하는 조골 세포와 생체 기질 성분의 혼합물을 이용한 골 생성용 조성물 제조방법.
  2. 제 1 항에 있어서,
    상기 치료제 제조단계는,
    상기 조골 세포 현탁액에 상기 생체 기질 성분을 혼합한 상기 조골 세포 혼합액에 응고제를 혼합하는 혼합단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 조골 세포와 생체 기질 성분의 혼합물을 이용한 골 생성용 조성물 제조방법.
  3. 제 2 항에 있어서,
    상기 혼합단계는,
    상기 조골 세포 혼합액에 응고제로 트롬빈(thrombin)을 10IU/m~100IU/ml로 혼합하는 트롬빈 혼합 단계; 및
    상기 트롬빈이 혼합된 혼합액에 응고제로 피브리노겐(fibrinogen)을 20~100mg/ml로 혼합하는 피브리노겐 혼합 단계로 이루어지는 것을 특징으로 하는 조골 세포와 생체 기질 성분의 혼합물을 이용한 골 생성용 조성물 제조방법.
  4. 삭제
  5. 제 1 항에 있어서,
    상기 하이드록시아파티트는,
    상기 조골 세포 현탁액에 30μg/ml~3.4mg/ml가 첨가되는 것을 특징으로 하는 조골 세포와 생체 기질 성분의 혼합물을 이용한 골 생성용 조성물 제조방법.
  6. 삭제
  7. 제 3 항에 있어서,
    상기 트롬빈은,
    상기 조골 세포와 생체 기질 성분의 혼합액에 첨가하기 전에 동결건조 상태의 트롬빈에 골 무기질 성분으로 인산이온(PO43-)이 첨가된 DMEM 또는α-MEM 액체 배지로 용해시키되, 인산이온(PO43-)이 배양액내 포함량의 2배가 되도록 첨가하고,
    상기 피브리노겐은,
    상기 조골 세포 혼합액에 첨가하기 전에 동결건조 상태의 피브리노겐에 골 무기질 성분으로 칼슘이온(Ca2+)이 첨가된 DMEM또는 α-MEM 액체 배지로 용해시키되, 칼슘이온(Ca2+)이 첨가된 배양액내 포함량의 2배가 되도록 첨가하는 것을 특징으로 하는 조골 세포와 생체 기질 성분의 혼합물을 이용한 골 생성용 조성물 제조방법.
  8. 제 1 항의 조골 세포와 생체 기질 성분의 혼합물을 이용한 골 생성용 조성물 제조방법에 의해 제조된 골 생성용 조성물.
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