KR20130124862A - 골 재생 유도용 조성물 - Google Patents

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이정수
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Abstract

본 발명은 골 재생 유도 조성물에 관한 것이다. 일 구체예에 따른 골 재생 유도 조성물은 흡수성, 생체 적합성 및 생분해성이 우수하므로, 효과적으로 골 재생을 유도할 수 있다.

Description

골 재생 유도용 조성물{Composition for induction of bone regeneration}
본 발명은 골 재생 유도 조성물에 관한 것이다.
인체의 경조직을 대체하는 방법 중 경조직의 자가이식(autografting) 또는 동종이식(allografting)이 골형성 측면에서 가장 효과적인 방법이나, 골 채취 부의 감염, 동통, 혈종 등과 같은 합병증이 발병할 수 있으며, 동종골 이식은 공여자로부터 질병의 전염, 감염, 그리고 자가골 이식에 비해 유합 및 형성 효과가 저조한 단점을 갖고 있어서, 이를 보완하고자 인공골의 필요성이 대두되기 시작하였다.
골 대체재는 조직과의 적합성이 우수하여야 하고, 형태의 부여가 용이해야 하며, 부여한 형태가 장기간 변화되지 않아야 한다. 또한, 생체 조직에 의해 대체되거나 조직이 자라는데 있어서 장애가 되지 않아야 한다. 그러나, 이러한 요구 조건을 충분히 만족시킬 만한 합성골은 현재까지 개발되지 않은 실정이다.
현재 이용중인 대부분의 합성골은 블록(block), 칩(chip) 또는 분말(powder) 형태로 식염수와 혼합하여 사용하는 형태로 사용이 불편하고, 골유도성이 없어서 치유기간이 긴 단점이 있다. 따라서, 효과적인 골 대체재를 개발하기 위해서는 뼈의 구성성분과 유사한 조건을 갖는 재료인 합성골(β-TCP)과 골세포의 완전한 증식을 도울 수 있는 골형성인자(BMPs)를 혼합한 골대체용 복합재료의 개발이 필요한 실정이다. 합성골(β-TCP)과 골 형성인자의 복합체는, 수용성이며 반감기가 짧기 때문에, 임상적으로 사용 시 이식 부위에 골 형성인자의 유지와 계속적인 분비가 매우 어려워 장기간의 유지, 분비를 위한 적절한 매개체가 필요하다.
따라서, 생체친화성이 높고, 독성, 및 발암성이 없으며, BMP의 장기간 유지와 분비를 향상시키고, 골형성과 함께 흡수되어 소실되거나, 가공 및 성형이 용이한 특징을 갖는 새로운 골 재생 유도이식재의 필요성이 요구되고 있다.
일 구체예는 골 재생 유도 조성물을 제공하는 것이다.
일 양상은 골 형태 생성 단백질이 코팅된 β-TCP 입자; 및
녹말(starch) 및 소듐 카르복시메틸 셀룰로오즈(sodium carboxymethyl cellulose)의 혼합물을 포함하는 골 재생 유도 조성물을 제공한다.
일 구체예에 따른 골 재생 유도 조성물은 골 형태 생성 단백질이 코팅된 β-TCP 입자를 포함할 수 있다.
β-TCP(beta-tricalcium phosphate)는 인산(phosphoric acid)의 칼슘염인 트리칼슘 포스페이트(tricalcium phosphate)의 일종으로, 뼈의 이식에 사용되는 매개체 역할을 할 수 있다. 본 발명에서, β-TCP는 입성장(grain prowth) 방법에 의해 직경이 약 0.01 mm 내지 0.7 mm가 되도록 입자로 제조하여 사용될 수 있으며, 이러한 β-TCP 입자 표면에 골 형태 생성 단백질이 균일하게 코팅된 상태로서 사용될 수 있다.
골 형태 생성 단백질(bone morphogenic protein, BMP)은 골의 기질에서 유래한 호모이량체 단백질 중 하나로, 줄기세포 또는 전구세포의 골 분화 유도 및 골모 세포 이동 촉진을 통하여 골을 재생시키는 기능을 하는 것으로 알려져 있으며, 예를 들어, BMP-2, BMP-4, BMP-5, BMP-6, BMP-7, BMP-9, BMP-10, BMP-12 또는 BMP-13 등이 이에 포함된다. 또한, 본 명세서에서 상기 BMP는 천연 또는 재조합 BMP를 포함할 수 있다. 일 구체예에 따른 골 재생 유도 조성물에 포함되는 골 형태 생성 단백질은 원핵 및 진핵 세포 발현 시스템을 이용한 당업계에 공지된 방법에 따른 유전자 재조합 기술에 의해 제조된 것일 수 있다.
상기 BMP 중에서 특히, BMP-2는 미국과 유럽 FDA 허가를 받아 현재 임상에서 사용되고 있다. 그러나, BMP-2 단백질이 임상에서 사용되는 경우, 체내 반감기가 짧아서 상대적으로 많은 양을 필요로 한다. 일 구체예에 따른 골 재생 유도 조성물은 상기 BMP-2의 양을 최소한으로 하여 적은 양으로 최대의 골 재생 유도 효과를 나타낼 수 있다. 일 구체예에 따르면, 상기 β-TCP 입자는 10 ㎍/㎖ 내지 100 ㎍/㎖, 더욱 바람직하게는, 20 ㎍/㎖ 내지 80 ㎍/㎖, 가장 바람직하게는 50 ㎍/㎖의 골 형태 생성 단백질이 코팅된 것일 수 있다. 다만, 상기 BMP-2의 양은 개별적인 환자 또는 치료를 요하는 질환에 따라 다소 달라질 수 있다.
또한, 상기 조성물은 녹말(starch) 및 소듐 카르복시메틸 셀룰로오즈(sodium carboxymethyl cellulose)의 혼합물을 포함할 수 있다.
소듐 카르복시메틸 셀룰로오즈는 대표적인 친수성 고분자 및 생체 적합성 고분자로서, 일 구체예에 따른 골 재생 유도 조성물에 포함된 구성 성분들의 접착력을 상승시키는 결합제의 역할을 할 수 있다. 또한, 녹말은 탄수화물에 다수의 α-글루코스 분자가 글리코시드 결합에 의해 중합된 천연 고분자로서, 우수한 면역학적 적합성을 가지며, 가공 처리가 용이하여 일 구체예에 따른 골 재생 유도 조성물 내에서 담체(carrier)의 기능을 할 수 있다.
일 구체예에 따르면, 상기 혼합물은 녹말 및 소듐 카르복시메틸 셀룰로오즈의 중량비가 2 : 1 내지 4 : 1, 가장 바람직하게는 3 : 1이 되도록 혼합할 수 있다.
일 구체예에 따른 골 재생 유도 조성물은 골 형태 생성 단백질이 코팅된 β-TCP 입자 및 녹말 및 소듐 카르복시메틸 셀룰로오즈의 혼합물을 적절한 비율로 혼합한 것일 수 있다. 상기 조성물은 골 형태 생성 단백질이 코팅된 β-TCP 입자 및 녹말 및 소듐 카르복시메틸 셀룰로오즈의 혼합물의 중량비가 2 : 8 내지 6 : 4, 가장 바람직하게는 4 : 6으로 혼합된 것일 수 있다. 상기와 같이 혼합된 조성물은 필요에 따라 적당한 양으로 나누어 제품의 형태로 제조될 수 있으며, 예를 들어, 멸균 주사기에 상기 조성물을 0.3 내지 30 cc 만큼 충진된 형태로 제조할 수 있다.
일 구체예에 따르면, 상기 조성물은 하이드로겔 타입일 수 있다. 상기 조성물은 수분을 흡수하여 팽윤하는 성질을 갖게 되는데, 이러한 팽윤 상태의 하이드로겔은 생체의 조직과 매우 유사한 성질을 갖게 되므로, 본 발명의 조성물은 뛰어난 흡수성과 생체 적합성, 우수한 생분해성의 특징을 갖게 될 수 있다.
일 구체예에 따른 골 재생 유도 조성물은 흡수성, 생체 적합성 및 생분해성이 우수하므로, 효과적으로 골 재생을 유도할 수 있다.
도 1은 β-TCP 입자에 코팅된 BMP-2를 보여주는 주사전자현미경 사진을 나타낸다.
도 2는 일 구체예에 따른 Rafugen COM의 BMP-2 방출량을 시간 별로 나타낸 그래프이다.
도 3a 및 도 3b는 토끼의 경골에 이식된 Rafugen COM의 조직 염색 사진을 나타낸 것이다. 도 3a는 Rafugen COM의 이식 3주차 관찰 결과를, 도 3b는 Rafugen COM의 이식 6주차 관찰 결과를 나타낸다.
이하 하나 이상의 구체예를 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 하나 이상의 구체예를 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 골 재생 유도조성물의 제조
입성장(grain growth)의 방법으로 β-TCP 입자를 제조하고, ISO 11137-2 규정에 따라 Cobalt-60 감마선을 이용하여 25~50 kGy로 멸균하였다. 제조 원료인 인간 재조합 BMP-2 및 BMP-9는 WHO TRS 902 Annex 6 part7에 의거하여 무균처리 후, 상기 제조한 1 g의 β-TCP 입자에 50 ug/ml의 농도로 동결 건조 코팅하였다. 녹말(Starch) 및 소듐 카르복시메틸 셀룰로오즈(sodium carboxymethyl cellulose; CMC)는 USP 등급으로 제작되어 판매되는 제품(SPECTRUM)을 구입하여 각각 5.7% CMC와 8% 녹말을 제조한 후, 질량비가 3:1이 되도록 혼합하였다. 이후, 상기 인간 재조합 BMP-2 및/또는 BMP-9가 코팅된 β-TCP 입자와 상기 혼합된 녹말 및 소듐 카르복시메틸 셀룰로오즈를 4:6의 질량비로 혼합하였다. 상기 제품은 모두 무균 공정 하에 제작하였다. 이하, 상기 방법으로 제작된 녹말 및 CMC와 혼합된 인간 재조합 BMP-2 및/또는 BMP-9이 코팅된 β-TCP 입자를 Rafugen COM으로 명명하기로 한다. 한편, 상기 제작된 Rafugen COM의 표면을 관찰한 사진을 도 1에 나타내었다.
실시예 2: 골 재생 유도조성물의 BMP -2 방출 실험
β-TCP 입자에 인간 재조합 BMP-2를 50 ug/ml의 농도로 동결 건조 코팅한 대조군(TCP-BMP)과 상기 실시예 1에서 제작된 Rafugen COM을 실험군으로 하여, BMP-2의 방출 실험을 Spectrophotometer 방출분석을 통하여 수행하였다. Rafugen COM을 15 mL 튜브에 PBS와 같이 넣은 후, 1, 3, 5, 7, 15일째 생체활성 물질이 방출된 PBS를 수거하고, 수거한 PBS를 Spectrophotometer를 이용하여 분석해 생체활성 물질의 방출거동을 시간에 따라 분석하였다. 그 결과, 도 2에서 보는 바와 같이, TCP-BMP에서는 3일 사이에 전체 BMP양의 67%가 초기에 과다 방출되는 양상을 보였으나, Rafugen COM에서는 35%로 현저히 감소되는 것을 확인할 수 있었다. 이는 Rafugen COM의 하이드로겔 성분인 녹말과 CMC 겔이 수분을 흡수하여 팽윤하면서 BMP의 초기 과다방출을 억제하는 것으로 볼 수 있다.
실시예 3: 골 재생 유도조성물의 골 형성능 확인
Rafugen COM으로부터 인간 재조합 BMP가 첨가되지 않은 상태의 대조군과 Rafugen COM을 New Zealand white(NZW) 토끼의 경골에 이식한 다음, 6주 동안 적용 후 조직 염색을 수행하였으며, 형태학적 차원에서의 조직의 변화, 조직/재료의 경계면으로부터 염증 관련 세포의 관찰 및 다공성 이식재료의 구멍 안쪽으로 자라난 뼈 조직의 양을 관찰하였다.
Rafugen COM의 이식 3주차 조직학적 염색 관찰 결과 (좌; hematoxyline & eosin 염색, 우; Masson's trichrome 염색) Rafugen COM(상)에서 대조군 (하)에 비해 빠른 골흡수를 보였으며, 입자들 사이에서 중간엽 세포들의 침투 현상이 활발한 것으로 관찰되었다(도 3a). 또한 이식 6주차 조직학적 염색 관찰 결과, Rafugen COM(상)에서 대조군(하)에 비하여 TCP particle 사이에서 골 흡수 현상과 신생골이 관찰되었으며, 일부에서는 성숙한 골 조직이 생성된 것을 확인할 수 있었다(도 3b).
실시예 4: 골 재생 유도조성물의 안정성 평가
Rafugen COM의 독성 여부를 파악하기 위해 한국 건설 생활 환경 시험 연구원에 독성시험을 의뢰하였다. 시험은 뉴질렌드계 백색 토끼에서 단회, 반복의 독성 및 회복에 관한 시험을 실시하였다.
실시예 4-1: 발열성 물질시험
Rafugen COM의 용출물을 시험동물의 이정맥에 10㎖/kg의 용량으로 단회 투여하여 체온변화를 통한 발열반응을 관찰하였다. 용출물의 용출용매는 멸균 생리 식염수로 하였고, 시험동물은 3마리를 사용하였다. 시험동물이 안정되었을 때 체온을 읽어 대조 체온으로 한 다음, Rafugen COM을 주사하였고, Rafugen COM 투여 후 60분부터 180분까지 30분 간격으로 5회 체온을 측정하였다.
대조체온과 주사 후 최고체온의 차를 조사한 결과, 세 마리의 모든 시험동물에서 체온이 0.5 ℃ 이상 상승한 동물이 없음을 확인할 수 있었다. 따라서, Rafugen COM의 용출물은 발열성 물질 음성으로 판정되어 의료기기 발열성물질시험의 판단기준에 적합한 것으로 판단되었다.
실시예 4-2: 세포독성시험
L-929 마우스 섬유아세포(ATCC CCL1, NCTC Clone 929)를 사용하여 Rafugen COM에 대한 세포독성시험을 수행하였다. Rafugen COM을 4 g/20 ㎖ 비율로 37 ℃에서 24시간 동안 용출하여 그 용출액을 시험액으로 사용하였다. 상기 시험액을 L-929 세포에 48시간 동안 처리한 후, 세포관찰 및 정량, 정성분석을 하였다. 정성분석 결과, 시험물질을 처리한 농도군에서 1% 미만의 세포 원형화(cell rounding)가 관찰되었으며, 세포에서 과립이상과 세포 용해(cell lysis)도 관찰되지 않았다. 따라서, Rafugen COM의 용출물은 세포독성이 없는 것으로 판단되며, ISO10993-5:2009의 세포독성 판단기준에 따른 세포독성 반응성은 0으로 판단되었다. 이와 같은 결과로 볼 때, Rafugen COM의 용출물은 의료기기의 세포독성 판단기준에 적합한 것으로 판단되었다.
실시예 4-3: 피내반응시험
백색 수토끼(NZW 계)를 대상으로 Rafugen COM에 대한 생물학적 안전성 시험을 수행하였다. Rafugen COM의 용출액을 시험동물의 등 부위에 단회 투여하여 3일간의 피내반응을 평가하였다. 용출액은 멸균생리식염 주사액과 면실유(Cotton Seed Oil)를 사용하였다. 시험동물은 각각 2마리씩을 사용하였고, 등부위의 정중앙선 좌측에는 시험액을 5개소에, 우측에는 대조액을 5개소에 투여하였다. 투여 24, 48, 72시간 후의 투여부위의 시험군과 대조군의 피부반응(홍반, 가피형성, 부종)점수의 평균을 구한 후 각각을 합하고 이들을 12로 나눈값이 시험군과 대조군의 점수 차이가 1.0 이하이어야 적합한 것으로 인정한다.
그 결과, 멸균생리식염 주사 용출액의 평균 점수 차이는 0.0이었으며, 면실유 용출액의 평균 점수 차이는 0.0이었다. 이상과 같이, 본 시험에서 관찰된 결과를 종합할 때, Rafugen COM은 기준에 적합한 것으로 판단되었다.
실시예 4-4: 급성독성시험
Rafugen COM에 대한 급성전신독성시험을 수행하였다. 암컷 ICR Mouse 20마리를 이용하여 50 ㎖/㎏ 의 투여용량으로 극성용매(멸균생리식염수 용출액 및 공시험액)는 미정맥으로 비극성용매(Cotton Seed Oil 용출액 및 공시험액)는 복강 내로 투여하였다. 투여 후 3일 동안 사망동물, 일반증상관찰 및 체중변화를 매일 관찰 하였다. 그 결과, 시험기간 중 모든 군에서 시험물질 투여와 관련된 사망동물 및 특이한 임상증상은 관찰되지 않았다. 투여 3일 후의 체중과 투여 시 체중을 비교하였을 때 10% 이상의 체중감소가 관찰되는 동물은 없었다. 또한 시험 종료 시 모든 생존동물의 부검 결과 시험물질 투여에 의한 것으로 사료되는 특이한 육안소견은 관찰되지 않았다. 이상의 결과로 보아 본 시험조건에서 Rafugen COM의 용출물은 급성전신 독성을 일으키지 않는 것으로 판단되었다.
실시예 4-5: 무균시험
Rafugen COM에 대한 무균시험을 수행하였으며, 이는 기술문서 등 심사에 관한 자료에 의하였다(대한약전「제9개정」일반시험법 중 무균 시험법). 그 결과, Rafugen COM으로부터 균의 발육이 관찰되지 않음을 확인할 수 있었다.

Claims (6)

  1. 골 형태 생성 단백질이 코팅된 β-TCP 입자; 및
    녹말(starch) 및 소듐 카르복시메틸 셀룰로오즈(sodium carboxymethyl cellulose)의 혼합물을 포함하는 골 재생 유도 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 혼합물은 녹말 및 소듐 카르복시메틸 셀룰로오즈의 중량비가 2 : 1 내지 4 : 1인 것인 골 재생 유도 조성물.
  3. 제1항에 있어서, 상기 조성물은 하이드로겔 타입인 것인 골 재생 유도 조성물.
  4. 제1항에 있어서, 상기 골 형태 생성 단백질은 BMP-2, BMP-4, BMP-5, BMP-6, BMP-7, BMP-9, BMP-10, BMP-12 및 BMP-13으로 이루어진 군으로부터 선택되는 골 재생 유도 조성물.
  5. 제1항에 있어서, 상기 β-TCP 입자는 10 ㎍/㎖ 내지 100 ㎍/㎖ 농도의 골 형태 생성 단백질이 코팅된 것인 골 재생 유도 조성물.
  6. 제1항에 있어서, 상기 조성물은 골 형태 생성 단백질이 코팅된 β-TCP 입자 및 녹말 및 소듐 카르복시메틸 셀룰로오즈의 혼합물의 중량비가 2 : 8 내지 6 : 4인 것인 골 형성 유도 조성물.
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KR20200073000A (ko) * 2018-12-13 2020-06-23 건양대학교산학협력단 세포 독성이 감소된 생체흡수성 뼈 지혈제의 제조방법

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