CN103480040A - 含有脐带间充质干细胞分泌的多种蛋白的骨基质材料及制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种含有脐带间充质干细胞分泌的多种蛋白的骨基质材料及制备方法，该材料为在同种异体脱钙骨基质表面接种有分泌出成骨诱导功能蛋白而促进成骨的脐带间充质干细胞的动物骨基质材料。该骨基质材料具有骨组织的天然结构和特性以及良好的成骨诱导效果，在骨缺损修复中具有更强的促进成骨作用，该骨基质材料有助于组织工程骨的规模化制备和临床应用。

Description

含有脐带间充质干细胞分泌的多种蛋白的骨基质材料及制备方法

技术领域

本发明涉及一种生物医学的骨基质材料，特别涉及一种含有脐带间充质干细胞分泌的多种蛋白的骨基质材料及制备方法。

背景技术

因外伤、感染、肿瘤等各种原因所致的骨缺损十分常见，其治疗和修复是骨科临床中最常见的难题之一，而理想的骨缺损修复方法还在不断地探索中。近年来，个体化组织工程骨的修复方式给骨缺损修复带来新的希望。然而，该修复方式需要体外构建、细胞扩增、骨回植等一系列冗繁的过程，周期长达3-4周，费用昂贵，技术标准要求严格，且受患者自体种子细胞质量、年龄、疾病等多种因素影响，预期在临床应用尚早。

骨修复过程，是一个多蛋白、多因子协调作用的复杂调控过程。种子细胞分泌的多种功能蛋白在组织工程骨成骨修复的不同阶段具有不同的作用。然而，组织工程骨修复成骨过程的具体机制还不明确。其中，种子细胞在植入体内发挥的具体作用存在较大的争议。有文献报道，种子细胞植入体内后因氧分子弥散距离有限（150-200μm）、局部血凝块形成屏障等因素限制，导致种子细胞在短期内大部分细胞出现死亡或调亡。[1、Sun XJ,Peng W,Yang ZL,etal,Heparin-chitosan-coated acellular bone matrix enhances perfusion ofblood and vascularization in bone tissue engineering scaffolds.TissueEng Part A..2011.0027.2、Jeroen Rouwkema,Nicolas C,Rivron1etal.Vascularization in tissue engineering.cell,26June2008]。目前，普遍认同的观点是种子细胞分泌的功能蛋白或细胞因子在组织工程骨修复成骨中发挥着重要作用[2、Hou T,Wu X,Luo F,etal.VEGF and physiologicalcompressive loading synergistically promote bone formation oftissue-engineered bone.Tissue Eng Part A.2013Jun20.]。转化生长因子β(TGF-β)、血管内皮生长因子（VEGF）、类胰岛素生长因子(IGF)、血小板衍化生长因子（PDGF）、碱性成纤维生长因子(FGF)等，这些因子经体外培养观察，均有复制细胞、合成DNA和骨基质及刺激细胞增殖与分化作用，其中有些起直接刺激，有些起中间介导和调节作用。已有的研究也表明多因子作用修复组织缺损具有协同作用，其效果明显优于单因子。

同种异体骨基质（DBM）是目前最常用的组织工程骨支架材料，经过深低温冻存、脱脂、脱功能蛋白、脱钙、γ射线辐照等一系列处理后，有极小的免疫源性，因其天然的三维空间结构、一定的骨诱导活性等是一种理想的组织工程骨支架材料。

脐带间充质干细胞（ESCs）及骨髓间充质干细胞(BMSCs)是骨组织工程临床应用良好的种子细胞来源。BMSCs受来源、手术操作、扩增复杂等多种条件限制，适应于组织工程的个体化治疗，不能规模制备满足临床需求。而源于新生胎儿脐带的ESCs具有来源广泛，取材可控性高，干细胞分化潜能高等特点，较适合临床规模化制备及应用。但脐带间充质干细胞接种DBM后，通过不同时期体外培养后行脱细胞处理而作为一种骨基质材料还未见报道。

因此，目前如何解决骨组织工程研究及临床应用中面临的种子细胞获取难、费用昂贵、临床应用难、运输难、规模化制备难等问题，是本领域关注的问题。

发明内容

本发明的目的是提供一种含有脐带间充质干细胞分泌的多种蛋白的骨基质材料及制备方法，该骨基质材料具有骨组织的天然结构和特性以及良好的成骨诱导效果，在骨缺损修复中具有更强的促进成骨作用，该骨基质材料有助于组织工程骨的规模化制备和临床应用。

本发明的技术方案是：

一种含有脐带间充质干细胞分泌的多种蛋白的骨基质材料，其特征在于：该材料为在同种异体脱钙骨基质表面接种有分泌出成骨诱导功能蛋白而促进成骨的脐带间充质干细胞的动物骨基质材料。

所述成骨诱导功能蛋白为骨形态发生功能蛋白、血小板源性生长因子、转化生长因子、碱性成纤维生长因子、血管内皮生长因子和类胰岛素样生长因子。

所述骨基质材料为人骨或羊骨。

接种有脐带间充质干细胞的骨基质材料的制备方法，有以下步骤：

1）取同种异体骨基质材料，脱钙：在密闭容器中盛入0.2～0.6M盐酸，按5ml/g骨基质投入其中浸泡，在常温下，浸泡24小时，每8小时更换盐酸一次，处理后的骨基质呈海绵状，能压缩并自动恢复原状，放入无菌蒸馏水中反复冲洗浸泡，直至PH≈7；

2）步骤1）得到的骨基质材料用钴-60γ射线灭菌，置-80℃深低冻存；

3）步骤2）所述的灭菌冻存的骨基质材料，室温下，用DMEM/F12培养液浸泡，每隔2天更换一次培养液，至培养液不再变色，取出，放入37℃孵箱中蒸干骨基质材料中的水分；

4）获取脐带间充质干细胞；

5）扩增脐带间充质细胞得到P0、P1、P2、P3、P4、P5代细胞；

6）P3-P5代的脐带间充质干细胞按1～3×10⁷/mL接种于步骤3）得到骨基质上，放置在细胞培养板内孵育2h，再加入DMEM/F12培养液继续培养12d，得到接种有脐带间充质干细胞的骨基质材料；

7）步骤6）接种有脐带间充质干细胞的骨基质材料，进行无菌冷冻干燥24h的脱细胞处理，得到脐带间充质干细胞分泌的多种成骨诱导蛋白的基质材料。

步骤2）所述的钴-60γ射线灭菌，用剂量为25KGay的钴-60γ射线照射骨基质材料12h。

步骤6）所述的接种时，在1cm×1cm×0.5cm的骨基质材料的正反面分别接种0.1mL的细胞悬液，正反面接种的间隔时间2h。

步骤4）所述的获取脐带间充质干细胞，有以下步骤：

（1）剥离血管、筋膜，将其剪成0.5-1mm³的组织块（尽可能地剪碎）；37℃孵箱倒扣培养2小时；若未发生污染，在培养箱中继续培养5天；

(2)第6天进行半换液，此后每2-3天半换液一次，直至细胞长出，组织块附近细胞单层融合80%时，传代、收集单个细胞，计数，以10⁵/瓶的密度接种75cm²培养瓶，记为P0代细胞。

步骤5）所述的扩增脐带间充质细胞，有以下步骤：

（1）细胞贴壁融合至80%时，对其传代处理；

（2）吸去培养液，生理盐水清洗1遍，加入胰酶，吹打；

（3）离心，弃上清，重悬细胞，按1：3比例接种培养，记为P0代；

（4）当P0代细胞生长融合至80%时，再次对其进行传代，记为P1代，如此反复，得到P2、P3、P4、P5代；

（5）.种子细胞用于支架复合前，其培养液作无感染原检测，种子细胞作干细胞表面抗原检测。

步骤（5）中所述种子细胞作干细胞表面抗原检测为：HIV、梅毒、甲肝、乙肝、丙肝、内毒素、真菌、细菌检测。

采用上述技术方案，将脐带间充质干细胞接种于脱钙DBM上，经过深低温等方法尽可能去除免疫源性，脐带间充质干细胞分泌出的成骨诱导功能蛋白，在局部微环境中诱导骨发生，发挥骨再生及修复作用，使已应用于临床的脱钙骨基质材料具有较强的成骨诱导活性，避免因异体骨成骨能力不足而取自体骨的缺陷，该骨基质材料具有较好的成骨诱导功能，有助于组织工程骨的规模化制备和临床应用，本发明所构建的复合材料是组织工程骨支架材料未来发展的趋势之一。

脐带间充质干细胞有着良好的成骨、成软骨、成内皮细胞的分化潜能，在骨的发生及血管化中发挥重要作用。细胞来源充足无创取材，增殖及扩增的代数远高于骨髓间充质干细胞；并且血管化亦优于骨髓间充质干细胞，细胞裂解后，其骨发生相关因子与骨髓源间充质干细胞类似。所以脐带间充质干细胞是较理想的种子细胞。脐带间充质干细胞接种于DBM可明显促进其成骨分化及增殖。[1]Honsawek S,Dhitiseith D,Phupong V.Effects of demineralized bonematrix on proliferation and osteogenic differentiation of mesenchymalstem cells from human umbilical cord.J Med Assoc Thai.2006Sep;89Suppl3:S189-95.[2]Liu G,Li Y,Sun J,et al.In vitro and in vivo evaluationof osteogenesis of human umbilical cord blood-derived mesenchymal stemcells on partially demineralized bone matrix.Tissue Eng Part A.2010Mar;16(3):971-82.

本发明所述基质材料与现有的组织工程基质材料相比有以下区别：

1.组织工程骨的构建理念不同:现有构建方法为体外接种种子细胞，体外细胞培养扩增后移植体内行个体化应用，利用移植的干细胞的特性来诱导成骨；而本发明所述含有多种功能蛋白的组织工程骨为依靠干细胞分泌的多种功能蛋白诱发体内成骨机制而促进成骨，该方法构建的组织工程骨可以批量制备、广泛化应用、方便存储及运输。

2.本发明所述方法制备的组织工程支架材料除具备脱细胞骨基质的特性外，与现有支架材料不同的是:本发明利用体外干细胞分泌的多种功能蛋白及细胞因子增强其在体内的骨诱导活性，而不是采用包裹或滴加细胞因子或生长因子的方式。

3.现有的组织工程骨支架材料不具有或具有较低的骨诱导功能，常常需要同费用昂贵的生长因子或自体骨等联合使用;本发明所述材料富含多种成骨诱导功能蛋白，如：骨形态发生功能蛋白（BMPs）、血小板源性生长因子（PDGF）、转化生长因子（TGF）、血管内皮生长因子（VEGF）、碱性成纤维生长因子（bFGF）、和类胰岛素样生长因子（IGF）等，其中骨形态发生功能蛋白－2（BMP-2）成骨活性在BMPs家族中最强，是一种可以独立诱导骨形成的生长因子，已被美国FDA批准应用于临床。碱性成纤维生长因子(bFGF)尚能刺激细胞复制和DNA合成。类胰岛素样生长因子（IGF）明显促进成骨细胞的有丝分裂,影响成骨细胞分化,增强碱性磷酸酶活性,促进骨钙素合成及增强骨连接素的表达,从而达到促进骨重建的目的。血小板源性生长因子（PDGF）有PDGF-AA、PDGF-BB和PDGF-AB等多种亚型,在体外具有促进纤维细胞生长的作用,它对所有起源于间叶的细胞(包括成骨细胞)具有丝裂原作用,既能促进骨形成,又能刺激骨吸收,对骨重建起双向调节作用，PDGF能够刺激间充质细胞的增殖及迁移。血管内皮生长因子（VEGF）是一种能特异性促进血管内皮细胞有丝分裂的因子，能诱发骨折断端及周围软组织新生血管生成，增加血液的通透性，为断端的氧气、营养成份的运输提供条件，同时清除断端的残留坏死组织，从而促进骨愈合。转化生长因子（TGF）能改变成纤维细胞贴壁生长特性而获得在琼脂中生长的能力，并失去生长中密度信赖的抑制作用。TGF在治疗伤口愈合，促进软骨和骨修复以及通过免疫抑制治疗自身免疫性疾病和移植排斥等方面有潜在的应用前景。

骨生长因子在骨形成的过程中作用机制极其复杂,它们互相促进或抑制,成网络状联系,在骨形成中起着重要的作用，其协同作用主要表现如下：

1、PDGF与IGF的协同作用：PDGF能使处于静止期(G1/G0)的细胞转变为具有复制DNA潜能的细胞,而IGF则可在PDGF的基础上,使细胞通过G0、G1期进入S期进行DNA复制,继而发生有丝分裂，因此二者联合应用最终有利于骨的增殖

2、VEGF与BMP的协同作用：BMP可以上调VEGF的表达,而VEGF又通过促进局部血管增生和成骨细胞分化参与BMP的诱导成骨作用。

3、BMP与bFGF的协同作用：bFGF促进血管形成并长入移植骨和促进细胞增殖是加速了新骨形成的决定因素,弥补了单一使用BMP的不足。

因此，在同种异体脱钙骨基质表面接种有能分泌出成骨诱导功能蛋白的脐带间充质干细胞，可增加在体内的成骨诱导活性。

本发明所述基质材料具有以下优点：

1.基本没有免疫原性；

2.具有骨传导性和良好的骨诱导性；

3.具有天然骨的良好的三维结构和高孔隙率；

4.可根据需要随意加工成各种形状和大小，并在植入后可保持再生组织的大体形态内态；

5.便于保存和运输，可实现临床“随取随用”的原则。

本发明所述骨基质材料仍保留骨组织的天然三维结构、生物学特性及低免疫原性，同时脐带间充质干细胞分泌出的成骨诱导功能蛋白具有良好的局部成骨诱导功能。该材料作为骨缺损修复材料、脊柱融合填充材料或组织工程骨支架具有明显的促进成骨诱导作用且，且加工制作科学合理、简便易行、便于运输，并有助于组织工程骨的规模化制备和临床应用。

附图说明

图1为含有多种蛋白的基质材料孔径观察电镜扫描图；

图2为冻干后细胞残体的电镜扫描图；

图3为不同时相点冻干后和未冻干DBM/细胞复合体的蛋白量的柱状图；

图4为蛋白芯片检测冻干DBM/细胞复合体富含的功能蛋白的柱状图；

图5为用单纯DBM对12周裸鼠股骨股四头肌肌袋异位成骨的示图；

图6为用本发明所述骨基质材料对12周裸鼠股骨股四头肌肌袋异位成骨的示图；

图7为用单纯DBM对16周山羊股骨2cm骨缺损修复的骨塑形示图；

图8为用本发明所述骨基质材料对对16周山羊股骨2cm骨缺损修复的骨塑形的示图。

具体实施方式

一.试剂和材料：盐酸（市售的分析纯），DMEM/F12培养液(hyclone公司，美国)，DBM（北京大清生物技术有限责任公司，北京），羊脐带（中国人民解放军第三军医大学西南医院，中国），

二.接种有脐带间充质干细胞的骨基质材料的制备方法:

1.脱钙

（1）取市售的或自制的同种异体骨基质材料，在密闭玻璃容器中盛入0.2～0.6M盐酸，按5ml/g骨基质投入其中浸泡，在常温下，浸泡24小时，每8小时更换盐酸一次，处理后的骨基质呈海绵状，能压缩并自动恢复原状，放入无菌蒸馏水中反复冲洗浸泡，直至PH≈7；

（2）灭菌储存

采用钴-60γ射线灭菌，剂量为25KGay,时间12h，置-80℃深低温冰箱冻存3个月后待用。

2.脐带间充质干细胞接种

（1）将已灭菌并在-70℃冻存的DBM取出，恢复至室温，用DMEM/F12培养液(hyclone公司，美国)浸泡7天，每隔2天换液一次，直到培养液不再变色为止，吸出培养液，将培养板放入取出水盆的37℃孵箱中使DBM中的水分缓慢蒸发干。

（2）将P3-P5代的长满培养瓶的人或山羊的脐带间充质干细胞以1～3×10⁷/mL的浓度均匀接种于DBM上，每块1cm×1cm×0.5cm大小的DBM支架正反面分别接种0.1mL的细胞悬液，间隔时间2h，再加入一定量DMEM/F12培养液(hyclone公司，美国)继续培养12d。

3.冷冻干燥脱细胞处理

将培养12d的组织工程骨在无菌操作下行冷冻干燥24h脱细胞处理，得到含有脐带间充质干细胞分泌的多种蛋白的骨基质材料，放进-80℃深低温冰箱中储存备用。

三.含有脐带间充质干细胞分泌的多种蛋白的骨基质材料的生物安全性评价

1.热源试验：

收集培养细胞3d后的培养液，称作浸提液，在BALB/c小鼠皮下注射前后体温波动在0.5℃以内，且注射后不高于注射前体温.波动幅度小于1.0℃。本实验结果为前后体温波动为0.2±0.05℃，波动幅度为0.3±0.18℃。

2.皮肤刺激试验：

注射BALB/c腹部皮下后各时间点观察显示，注射浸提液（培养细胞3d后的培养液）及生理盐水处未发现有红斑，水肿或坏死出现，注射20％酒精生理盐水后6小时至72小时可见注射区有1.0—1.5cn直径的红斑，中心部分水肿明显，且水肿中心部分出现不规则的坏死，并有结痂形成。

3.肌肉埋植试验：

将本发明所述骨基质材料植入BALB/c小鼠股骨后48小时伤口有稍微的红肿并有轻微炎性细胞浸润，l周后伤口愈合。植入2周后.有明显的纤维包膜形成，且炎性细胞减少，材料周围可见多核巨噬细胞吞噬外来小颗粒。镜下未见有肌肉组织变性、坏死或植入物被排斥现象发生。

4.细胞毒性试验：

取含有多种蛋白的骨基质材料5g，按0.1ml/g的比例加入浸提介质DMEM培养基，37℃恒温箱中保持72小时，无菌过滤，得到浸提液。100%、50%浓度的浸提液为实验组，阴性对照组为DMEM培养基，通过MTT比色法观察，具体方法：将浓度为6×104cell/mL的L-929细胞（小鼠成纤维细胞，购于中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心）悬液种植于96孔板中,按100μL/孔种植9组,每组8孔,共3板。培养10h,细胞牢固贴壁后倒掉原培养液,按100μL/孔加入浸提液。培养72h时弃去，加入MTT液(全称为溴化3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四唑，Sigma公司,美国)继续培养4h，吸出孔内液体，加入DMSO（二甲基亚砜，Sigma公司,美国）震荡10分钟，用酶联免疫检测仪(波长490nm)测定OD值。计算细胞相对增殖率(relative growth rate,RGR),RGR=(各材料组OD均值/阴性对照组OD均值)×100%。根据ISO和GB/T中细胞毒性实验的反应分级标准评定材料的毒性,RGR≥100为0级，75～99%为1级，50～74%为2级，25～49%为3级，1～24%为4级，0为5级，其中毒性反应0～1级为合格医用材料。结果示：100%、50%、DMEM三组的OD值分别为0.31±0.05、0.33±0.03、0.36±0.07，两两比较无统计学意义（P＜0.05，在许多研究领域，0.05的p值通常被认为是可接受错误的边界水平，p值的结果≤0.05被认为是统计学意义的边界线）,RGR%分别为105.8、108.6、112.4，细胞毒性均为0级，说明含有多种蛋白的骨基质材料没有毒性，对细胞的增殖没有影响。

四.含有脐带间充质干细胞分泌的多种蛋白的骨基质材料的有效性评价

1.含多种蛋白的骨基质具有天然骨的三维立体网孔结构，孔径约为390±205μm，孔隙连通率为72±21%，（参见图1），这种结构适合细胞的长入、生长及基质分泌（参见图2）。

2.不同时相点冻干骨与未冻干骨的蛋白量检测

实验方法：将DBM+ESCs组（对照组）和DBM+ESCs冻干组（实验组）组织剪碎后加入裂解液,用高速机械匀浆器破碎组织。加抽提试剂充分混匀。室温静置10分钟。离心后，溶液分为两相，中间为蛋白膜。吸除上层液体；随后用吸头或针头轻轻拨开蛋白膜，吸除下液体。蛋白膜将附着于离心管壁。室温10分钟空气干燥沉淀。（参见图3）

3.蛋白芯片定量检测

实验方法：将DBM与脐带间充质干细胞（ESCs）培养一定时间后，随机分选DBM+ESCs组（对照组）和DBM+ESCs冻干组（实验组），提取蛋白后，通过蛋白芯片技术高通量定量筛选检测相关成骨的蛋白表达量。

结果：对照组与实验组均含有多种成骨相关蛋白表达（参见图4）。

4.裸鼠股四头肌肌袋异位成骨实验：

实验方法：4-6周龄的裸鼠（第三军医大学动物中心提供）16只，雌雄不限，麻醉后，制备股骨股四头肌，完全去除骨膜后分别在左右股骨后外侧植入2x2x2mmDBM(对照组)和含有脐带间充质干细胞分泌的多种蛋白的骨基质材料（实验组），术后8周观察肌袋异位成骨效果。

Micro-CT结果：实验组新生骨面积大，骨质密度高，连续性好，对照组新生骨面积小，骨质密度低，连续性差，实验组的成骨效果明显高于对照组（参见图5-6）。

5.山羊股骨原位临界骨缺损修复实验：

实验方法：12-15个月的雄性青山羊（中国人民解放军第三军医大学动物中心提供）麻醉后，用髓内钉固定，截取2cm临界骨缺损（参见图7），分别用DBM材料（对照组）及含有脐带间充质干细胞分泌的多种蛋白的骨基质材料（实验组）修复骨缺损，术后16周观察原位成骨效果。

结果：实验组骨塑型良好，对照组还未完全骨连接，实验组的成骨效果明显高于对照组（参见图8）。

Claims (9)

1.一种含有脐带间充质干细胞分泌的多种蛋白的骨基质材料，其特征在于：该材料为在同种异体脱钙骨基质表面接种有分泌出成骨诱导功能蛋白而促进成骨的脐带间充质干细胞的动物骨基质材料。

2.根据权利要求1所述的材料，其特征在于：所述成骨诱导功能蛋白为骨形态发生功能蛋白、血小板源性生长因子、转化生长因子、碱性成纤维生长因子、血管内皮生长因子和类胰岛素样生长因子。

3.根据权利要求1所述的材料，其特征在于：所述骨基质材料为人骨或羊骨。

4.接种有脐带间充质干细胞的骨基质材料的制备方法，其特征在于，有以下步骤：

1）取同种异体骨基质材料，脱钙：在密闭容器中盛入0.2～0.6M盐酸，按5ml/g骨基质投入其中浸泡，在常温下，浸泡24小时，每8小时更换盐酸一次，放入无菌蒸馏水中反复冲洗浸泡，直至PH≈7；

2）步骤1）得到的骨基质材料用钴-60γ射线灭菌，置-80℃深低冻存；

3）步骤2）所述的灭菌冻存的骨基质材料，室温下，用DMEM/F12培养液浸泡，每隔2天更换一次培养液，至培养液不再变色，取出，放入37℃孵箱中蒸干骨基质材料中的水分；

4）获取脐带间充质干细胞；

5）扩增脐带间充质细胞得到P0、P1、P2、P3、P4、P5代细胞；

6）P3-P5代的脐带间充质干细胞按1～3×10⁷/mL接种于步骤3）得到骨基质上，放置在细胞培养板内孵育2h，再加入DMEM/F12培养液继续培养12d，得到接种有脐带间充质干细胞的骨基质材料；

7）步骤6）接种有脐带间充质干细胞的骨基质材料，进行无菌冷冻干燥24h的脱细胞处理，得到脐带间充质干细胞分泌的多种成骨诱导蛋白的基质材料。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：步骤2）所述的钴-60γ射线灭菌，用剂量为25KGay的钴-60γ射线照射骨基质材料12h。

6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：步骤6）所述的接种时，在1cm×1cm×0.5cm的骨基质材料的正反面分别接种0.1mL的细胞悬液，正反面接种的间隔时间2h。

7.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：步骤4）所述的获取脐带间充质干细胞，有以下步骤：

（1）剥离脐带间充质干细胞中的血管、筋膜，将其剪成0.5-1mm³的组织块，37℃培养2小时，若未发生污染，在培养箱中继续培养5天；

(2)第6天进行半换液，此后每2-3天半换液一次，直至细胞长出，组织块附近细胞单层融合80%时，传代、收集单个细胞，计数，以10⁵/瓶的密度接种75cm²培养瓶，记为P0代细胞。

8.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：步骤5）所述的扩增脐带间充质细胞，有以下步骤：

（1）细胞贴壁融合至80%时，对其传代处理；

（2）吸去培养液，生理盐水清洗1遍，加入胰酶，吹打；

（3）离心，弃上清，重悬细胞，按1：3比例接种培养，记为P0代；

（4）当P0代细胞生长融合至80%时，再次对其进行传代，记为P1代，如此反复，得到P2、P3、P4、P5代；

（5）.种子细胞用于支架复合前，其培养液作无感染原检测，种子细胞作干细胞表面抗原检测。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于：步骤（5）中所述种子细胞作干细胞表面抗原检测为：HIV、梅毒、甲肝、乙肝、丙肝、内毒素、真菌、细菌检测。

Images