CN110923201B - 一种增强人脐带间充质干细胞成骨能力的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种增强人脐带间充质干细胞成骨能力的方法，包括：提供人脐带间充质干细胞，分别对所述人脐带间充质干细胞进行成骨和内皮向双向预诱导分化，再将两种分化后的细胞混合共培养，即得到具有较强成骨能力的细胞。本发明成功制备得到具有较强成骨能力的双分化人脐带间充质干细胞，该细胞与β‑三磷酸钙支架的相容性较好，为人脐带间充质干细胞在组织工程骨中的应用提供新的方法。

Description

一种增强人脐带间充质干细胞成骨能力的方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种增强人脐带间充质干细胞成骨能力的方法。
背景技术
外伤、感染、肿瘤切除和先天畸形等均可导致严重骨缺损，影响患者颌面部的外形和功能，“金标准”自体骨移植修复需开辟第二术区，会引起新的骨缺损，给患者的生理、心理和经济带来巨大负担，且修复效果也并不理想。而以干细胞为基础的、结合三维(threedimension,3D)打印构建的组织工程骨移植可无创、安全、个性化修复骨缺损，具有广阔的应用前景。
干细胞包括成体干细胞、围产期干细胞、胚胎干细胞和诱导多潜能干细胞。成体干细胞获取有创，细胞性能与供体全身状况密切相关。当供体年龄较大或伴有全身性疾病时，干细胞的生长、增殖、分化能力均会受累。胚胎干细胞具有无限增殖、自我更新和多向分化的特性，但是必须破坏胚胎才能获得，因此其临床应用存在巨大伦理争议。诱导多潜能干细胞则由于添加了4个重编程基因，存在致癌的风险，暂不适合用于大范围临床应用。而围产期干细胞(来源于脐带、脐带血、绒毛膜、羊膜、羊水等)来源广泛、获取无创、具有优异的增殖活性、性能最接近胚胎干细胞，不仅无致瘤风险，而且拥有良好的免疫调节功能，近年来受到了研究人员的青睐，在临床治疗难治性疾病中取得了显著的疗效。
脐带外层为羊膜，中间有一条管腔粗大的静脉和两条管腔较小的动脉通过。羊膜和血管之间是起保护作用的华通胶。华通胶是脐带中最丰富的组织。研究显示华通胶或整体脐带来源的干细胞较脐带衬里、动脉及静脉周围组织来源的干细胞成骨分化性能更佳。尽管有学者认为人脐带间充质干细胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells,hUCMSCs)成骨能力较人骨髓间充质干细胞(human bone marrow mesenchymal stemcells,hBMSCs)弱，但越来越多的研究表明hUCMSCs在支架上具有良好的成骨性能，适合作为骨组织工程的种子细胞来源。
骨缺损越大，则用于修复的组织工程骨体积越大，需要的种子细胞数量便越多。但由于缺乏氧气和营养的供应，越靠近支架中心的细胞越难存活，基于这个问题提出的成骨性细胞(干细胞、成骨细胞等)和血管生成细胞(内皮祖细胞、内皮细胞等)共培养方式，经研究证实在促成骨和血管生成方面具有协同效应，有利于成骨性细胞在支架内的存活和转归，保证组织工程骨的顺利骨化。然而，体外培养内皮祖细胞和内皮细胞收获细胞数量少、培养困难、增殖能力有限。同时，在这两种细胞共培养的临床应用中，也会因为细胞来源不同，增加免疫排斥风险和疾病传染风险。
发明内容
本发明要解决的技术问题是克服现有细胞分化及成骨能力不足的难题，提供一种增强人脐带间充质干细胞成骨能力的方法。
本发明上述目的通过以下技术方案实现：
本发明提供一种增强人脐带间充质干细胞成骨能力的方法，包括：提供人脐带间充质干细胞，分别对所述人脐带间充质干细胞进行成骨和内皮向双向预诱导分化，再将两种分化后的细胞混合共培养，即得到具有较强成骨能力的细胞。
可选地，将细胞混合共培养时，将成骨诱导分化的细胞与内皮向诱导分化的细胞置于成骨诱导培养基与内皮细胞诱导培养基混合而成的混合培养基中培养。
可选地，成骨诱导分化的细胞与内皮向诱导分化的细胞数量之比为(4-0)：(0-4)，还可以为(1-3)：(1-3)，包括但不限于1：3、2：2、3：1和4：0，优选为3：1。
可选地，成骨诱导培养基与内皮细胞诱导培养基体积之比为(4-0)：(0-4)，还可以为(1-3)：(1-3)，包括但不限于1：3、2：2、3：1和4：0，优选为3：1。
可选地，成骨诱导分化的细胞与内皮向诱导分化的细胞数量之比等于所述成骨诱导培养基与所述内皮细胞诱导培养基的体积之比。
可选地，所述成骨诱导培养基含有如下组分：增殖培养基、地塞米松、β-甘油磷酸、L-抗坏血酸。
可选地，所述成骨诱导培养基含有如下组分：100nM地塞米松、10mMβ-甘油磷酸、50μg/mL L-抗坏血酸，余量为增殖培养基。
可选地，按体积百分比计，所述增殖培养基含有如下组分：10％胎牛血清、1％青霉素-链霉素混合溶液，余量为Dulbecco改良的Eagle培养基-高葡萄糖。
可选地，所述内皮细胞诱导培养基含有如下组分：25ng/mL血管内皮生长因子(human VEGF)、10ng/mL成纤维细胞生长因子(human bFGF)，余量为EGM-2BulletKit培养基。EGM-2BulletKit培养基可以从市场上购买得到。
可选地，对所述人脐带间充质干细胞进行成骨预诱导分化时，预诱导分化时间可以为4-10天，包括但不限于4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天。
可选地，对所述人脐带间充质干细胞进行内皮向预诱导分化时，预诱导分化时间可以为4-10天，包括但不限于4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天。
可选地，将两种分化后的细胞混合共培养的时间可以为3-20天，包括但不限于3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天、15天、16天、17天、18天、19天、20天。
本发明还提供上述方法制得的具有较强成骨能力的细胞。
本发明还提供上述细胞在制备骨组织工程支架中的应用。
本发明还提供负载有上述细胞的骨组织工程支架。
可选地，所述骨组织工程支架包括但不限于β-三磷酸钙支架等。
本发明具有以下有益效果：
本发明先对人脐带间充质干细胞分别进行成骨和内皮向预诱导分化，再按不同比例进行混合共培养，并筛选培养基条件，最后通过对比不同比例混合细胞与3D打印β-三磷酸钙(β-tricalcium phosphate,β-TCP)支架复合构建组织工程骨修复颅骨极限骨缺损效果，探讨人脐带间充质干细胞双向预诱导共培养对成骨和血管生成的影响。本发明成功制备得到具有较强成骨能力的双分化人脐带间充质干细胞，该细胞与β-三磷酸钙支架的相容性较好，为人脐带间充质干细胞在组织工程骨中的应用提供新的方法。
附图说明
图1显示为本发明实施例中人脐带间充质干细胞分离培养和鉴定结果图。
图2显示为本发明实施例中人脐带间充质干细胞在增殖培养基PM和成骨诱导培养基OM中的成骨向分化情况图。
图3显示为本发明实施例中人脐带间充质干细胞在干细胞培养基SM和内皮向诱导培养基EIM中的分化情况图。
图4显示为本发明实施例中双向预诱导人脐带间充质干细胞共培养培养基筛选结果图。
图5显示为本发明实施例中双向预诱导人脐带间充质干细胞共培养时细胞增殖、成骨、成血管能力分析图。
图6显示为本发明实施例中成骨向分化人脐带间充质干细胞和内皮向分化人脐带间充质干细胞共培养时成血管能力图。
图7显示为本发明实施例中3D打印β-TCP支架结构和细胞相容性结果图。
图8显示为本发明实施例中体内成骨能力检测结果图。
具体实施方式
以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。
由于细胞来源不同会增加免疫排斥风险和疾病传染风险，采用来源丰富的一种干细胞分别向成骨细胞和内皮细胞诱导分化，再进行共培养便可降低这一系列的风险，关于这方面的研究非常匮乏。
与单独培养的成骨性细胞相比，加入血管生成细胞共培养更接近体内生理情况，并且，成骨过程和成血管过程可相互协同促进。本发明实施例分别对人脐带间充质干细胞进行成骨预诱导分化和内皮向预诱导分化3d，再进行共培养，以期增强其成骨分化效果。我们将成骨预诱导和内皮向预诱导的人脐带间充质干细胞分别按4:0、3:1、2:2和1:3混合，通过茜素红染色筛选四种培养方案，发现这四种在比例混合培养基中培养时钙结节形成差异明显，且3:1组钙化结节形成最多，遂选择此方案进行共培养。对于钙化结节形成最多的3:1组，其增殖速率较慢，可能较早进入细胞分化阶段，成骨早期标志物ALP、RUNX2的表达，促血管生成基因ANG的表达，以及周细胞相关表面标志物CD146基因和蛋白的表达均明显升高，提示3:1共培养后可有效促进某些成骨和血管生成相关的生理过程，最终加速成骨分化。
本发明实施例采用生物相容性良好的3D打印β-TCP支架作为载体，双向预诱导分化的人脐带间充质干细胞作为种子细胞构建大鼠颅骨缺损体内修复模型，进一步证实了3:1共培养组较4:0组新骨形成显著增加。
实施例1
材料和方法：
细胞培养：
临床级hUCMSCs由华南生物医药研究院裴雪涛教授团队提供，在无血清人干细胞培养基SM(表1)中扩增，置于37℃，5％CO2培养箱培养，0.05％胰酶(Gibco,美国)消化传代，6-8代用于后续实验。
成骨诱导hUCMSCs(os-hUCMSCs)：hUCMSCs接种后在增殖培养基PM(表1)中进行增殖培养，细胞汇合达70％，换OM进行成骨诱导培养。
内皮向诱导hUCMSCs(en-hUCMSCs)：细胞接种贴壁后，换内皮细胞诱导培养基EIM(表1)诱导分化，镜下观察细胞形态。表1中的百分比均为体积百分比。
表1细胞培养基
孔板共培养
将预诱导3d的os-hUCMSCs和en-hUCMSCs分别按4:0、3:1、2:2、1:3和0:4的数量比混合后，除4:0组在OM中作为成骨阳性对照、0:4组在EIM中作为内皮分化的阳性对照外，其余组分别按以下四种方案进行共培养。
方案一：PM中培养；
方案二：OM中培养；
方案三：OM与EIM的体积比为1:1混合的EMM(表1)中培养；
方案四：OM：EIM等于os-hUCMSCs：en-hUCMSCs的PMM(表1)中培养。
依照茜素红染色结果选择一种方案作为共培养的培养基。
碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)染色
成骨诱导培养4d、7d和10d，PBS洗2次，4％多聚甲醛固定15mins，将碱性磷酸酶显色缓冲液、5-溴-4-氯-3-吲哚基-磷酸盐(5-Bromo-4-Chloro-3-Indolyl Phosphate,BCIP)溶液和四唑氮蓝(Nitro-Blue-Tetrazolium,NBT)溶液按300:1:2的体积比配制为BCIP/NBT染色工作液(Beyotime,China)，避光孵育20mins，终止反应，拍照。
ALP活性检测
成骨诱导后4d、7d和10d，以及共培养后1d、2d，用1％Triton X-100冰上裂解细胞，BCA蛋白定量试剂盒(BestBio,China)测定各样本蛋白浓度。同时用BCA法测定各样本的蛋白浓度，按照碱性磷酸酶测试盒(Nanjing Jiancheng,China)说明书操作，30μL样本与50μL缓冲液和50μL基质液在37℃反应15mins，加入150μL显色剂显色，酶标仪(ThermoFisher,USA)测定520nm的光密度(optical density,OD)值，计算ALP浓度和活性。
定量逆转录-聚合酶链反应(quantitative reverse transcription-polymerasechain reaction,qRT-PCR)
用TRIzol(Invitrogen,USA)提取细胞RNA，用NanoDrop 2000(ThermoFisher,USA)检测RNA浓度，用PrimeScriptTM RT Master Mix(Takara,China)将500ng总RNA在PCR仪(BIO-RAD,USA)中逆转录为cDNA，取10ng cDNA用TB Green Premix Ex Taq II(Takara,China)在实时荧光定量PCR仪中(BIO-RAD,USA)进行PCR扩增，以GAPDH为内参计算基因的相对表达量2-△△CT。引物由公司(Generay,China)合成，序列如下：
ALP sense:GGCTGTAAGGACATCGCCTA(SEQ ID NO:1)；
antisense:GGGTCAAGGGTCAGGAGTTC(SEQ ID NO:2)；
RUNX2 sense:TACTATGGCACTTCGTCAGGA(SEQ ID NO:3)；
antisense:GATTCATCCATTCTGCCACTA(SEQ ID NO:4)；
COL 1 sense:CGATGGATTCCAGTTCGATGTGGT(SEQ ID NO:5)；
antisense:TGTTCTTGCAGTGGTAGGTGATG(SEQ ID NO:6)；
OPN sense:GCTAAACCCTGACCCATC(SEQ ID NO:7)；
antisense:CTTTCGTTGGACTTACTTGG(SEQ ID NO:8)；
EFNB2 sense:CTCCTCAACTGTGCCAAACCA(SEQ ID NO:9)；
antisense:GGTTATCCAGGCCCTCCAAA(SEQ ID NO:10)；
EPHB4 sense:GATGCCTGGAGTTACGGGATTG(SEQ ID NO:11)；
antisense:TCCAGCATGAGCTGGTGGAG(SEQ ID NO:12)；
VEGF sense:GGAGGCAGAGAAAAGAGAAAGTGT(SEQ ID NO:13)；
antisense:TAAGAGAGCAAGAGAGAGCAAAAGA(SEQ ID NO:14)；
bFGF sense:AGTCTTCGCCAGGTCATTGAGATC(SEQ ID NO:15)；
antisense:CGTCCTGAGTATTCGGCAACAG(SEQ ID NO:16)；
SERPINF-1 sense:ATAGTCCAGCGGGAAGGT(SEQ ID NO:17)；
antisense:TAGCAAGATCACAGGCAAAC(SEQ ID NO:18)；
ANGPTL-1 sense:TACCTCCCAGCAGACCAG(SEQ ID NO:19)；
antisense:TTTTCCCGACAAGACACC(SEQ ID NO:20)；
SPROUTY1 sense:ATTGCCCTTTCAGACCTA(SEQ ID NO:21)；
antisense:AATAATAACTACGAGCACAGAC(SEQ ID NO:22)；
ANG sense:TGGTGACCTGGAAAGAAG(SEQ ID NO:23)；
antisense:GCACTATGATGCCAAACC(SEQ ID NO:24)；
CD146 sense:GAGACAGGTGTTGAATGCACG(SEQ ID NO:25)；
antisense:TGTTGGCTCTGGTATGAGGAC(SEQ ID NO:26)；
PDGFB sense:ATGGAGTTTGCTGTTGAGGTGG(SEQ ID NO:27)；
antisense:GCAGGGTGGAGGTAGAGAGATG(SEQ ID NO:28)；
GAPDH sense:GCACCGTCAAGGCTGAGAAC(SEQ ID NO:29)；
antisense:TGGTGAAGACGCCAGTGGA(SEQ ID NO:30)。
茜素红染色
4％多聚甲醛固定20mins，茜素红(0.2％，pH8.3)染色，显微镜观察拍照。10％氯化十六烷基吡啶(hexadecylpyridinium chloride monohydrate,CPC)溶解钙结节，562nm检测吸光度值，进行定量分析。
血管生成实验
在血管生成载玻片(ibidi,Germany)微孔中加入10μL不含生长因子的基质胶(BD,USA)，37℃成胶后，每孔接种50μL含2×104个细胞的悬液，培养2.5h，拍照，倒置显微镜(Leica,Germany)观察血管形成情况。
Dil标记乙酰化低密度脂蛋白(acetylated low density lipoprotein,labeledwith Dil,Dil-ac-LDL)吞噬实验
将培养基更换为含10μg/mL Dil-ac-LDL(Invitrogen,USA)的EIM，37℃孵育4h，PBS清洗3遍。5μg/mL Hoechst(Sigma-Aldrich,USA)复染细胞核，PBS清洗后激光共聚焦显微镜(Leica,Germany)成像。
细胞免疫荧光
内皮向诱导4d，4％多聚甲醛固定15mins，PBS清洗后用冰冻甲醇在-20℃通透10mins，PBS清洗后，封闭液(Beyotime,China)室温封闭1h，一抗兔抗人ephrinB2(Abcam,UK,1:100)和EphB4(CST,USA,1:800)4℃孵育过夜，PBS清洗，二抗山羊抗兔(Biotium,USA,1:750)室温孵育1h，PBS清洗，5μg/mL Hoechst(Sigma-Aldrich,USA)复染细胞核15min，PBS清洗后激光共聚焦显微镜(Leica,Germany)拍照。
Western Blot
加有1％蛋白酶抑制剂cocktail(ComWin Biotech,China)的RIPA(ComWinBiotech,China)裂解细胞，离心，取上清，BCA蛋白法进行定量。10％SDS-PAGE凝胶电泳分离蛋白，目的蛋白转至PVDF膜，用含3％FBS的1‰PBST封闭1h，与一抗兔抗人Runx2(CST,USA,1:1000)、鼠抗人CD146(CST,USA,1:1000)、兔抗人β-actin(CST,USA,1:1000)4℃孵育过夜，再分别与山羊抗兔(CST,USA,1:2000)、兔抗鼠(CST,USA,1:2000)二抗反应1h，ECL(Beyotime,China)发光，胶片显影，凝胶成像系统(BIO-RAD,USA)拍照，ImageJ灰度分析。
Alarmar Blue检测细胞增殖
按5×103个细胞/孔接种到48孔板中，200μL培养基培养，加入20μL的AlarmarBlue(Invitrogen,USA)，培养3h，测定570nm和620nm时的OD值，按增值率(％)＝[117216×A570-80586×A600(sample)]/[117216×A570-80586×A600(control)]计算细胞的增殖率。
3D打印β-TCP支架
适量β-TCP粉末溶于蒸馏水中制成悬浮液，随后加入适量C、羟丙基甲基纤维素(HPMC)和聚乙烯亚胺(PEI)，进行分散、乳化和凝聚，形成打印浆料，使用生物3D打印机(Regenovo,China)打印直径5mm、厚2mm、孔径350-400μm的圆盘形支架。打印结束后，将支架放在室温下干燥24h，然后400℃、1h去除有机物，最后在1100℃烧结1h得到最终的支架。
组织工程骨构建
调整细胞浓度为6.67×106/mL，取15μL接种在直径5mm、厚1mm的3D打印β-TCP支架上，即1×105个细胞/支架，待细胞黏附3h后，补够培养基。
扫描电镜
2.5％戊二醛(Leagene,China)固定12h，PBS漂洗、梯度酒精脱水、干燥、喷金，扫描电镜(Hitachi,Japan)观察并拍照。
活死染色
细胞接种在β-TCP支架上3d，用活细胞/死细胞染色试剂盒(BestBio,China)进行染色，过程为取1mL试剂C加9mL无菌去离子水稀释，混匀即成1X染色缓冲液，每10mL 1X染色缓冲液中加入10uL染色液A和3-10uL染色液B，充分混匀，即成染色工作液。4℃避光孵育15-30mins，激光共聚焦(Leica,Germany)下，使用488nm波长激发，拍照。
SD大鼠极限骨缺损修复
选择12只12周龄雄性SD大鼠，体重250-300g，共制备24个颅骨极限骨缺损模型，随机分为4组，包括空白组、TCP支架组、4:0组和3:1组。本实验已获广州医科大学实验动物伦理委员会批准。将成骨预诱导和内皮向预诱导3d的os-hUCMSCs和en-hUCMSCs按4:0和3:1接种到β-TCP支架上，体外培养3d。采用戊巴比妥钠(Sigma-Aldrich,USA)，按30mg/kg腹腔注射麻醉后，手术区消毒。于大鼠颅骨中心切开皮肤、皮下组织及筋膜，钝性分离肌肉，显露颅骨骨膜。在颅骨左右两边分别用环形钻作直径5mm的全厚骨缺损。术中注意保护大鼠硬脑膜，保证颅骨断面平整垂直。颅骨截取后，用20ml生理盐水将缺损处骨碎屑、骨髓组织等彻底冲洗，并将骨缺损部位的骨膜充分去除。按分组植入TCP复合物，缝合皮肤，消毒切口，单笼饲养，自由进食。术后连续3d肌肉注射青霉素40万U。术后4周异氟烷(Yipin,China)吸入麻醉下断颈处死，暴露颅骨，沿骨缝剪开，再沿矢状缝左右分开，4％多聚甲醛固定。
Micro CT检测
修剪样本，使用micro CT机(Bruker,Belgium)扫描，扫描参数为1mm铝滤片、分辨率2000×1332、像素大小9μm、电压80KV、电流100μA，再将扫描后数据导入NRecon 1.0软件中重建，利用Dataviewer软件选择感性区，并保存冠状面图片，在CTAn1.13软件中选取支架作为感兴区域，分别设定新生骨和支架的阈值，分析新生骨量、骨小梁数目和骨小梁厚度，感性区域图像通过CTvol2.0重建。由于空白组缺损区中间无新生骨，周边新生骨是由原颅骨长入，因此新生骨量、骨小梁数目和骨小梁厚度默认为0。
HE染色
EDTA脱钙后，将标本流水冲洗过夜，梯度脱水，横向正中切开，正立后石蜡包埋，层厚4μm切片，自动染色机(Sakura,Japan)行HE染色，观察成骨情况。
马森染色
使用马森染色套装(Servicebio,China)。具体操作为石蜡切片脱蜡至水；重铬酸钾染色，自来水洗；铁苏木素染色3mins，自来水洗，分化液分化，自来水洗，返蓝液返蓝，流水冲洗；丽春红酸性品红染色5-10mins，自来水漂洗；磷钼酸浸染1-3mins；苯胺蓝染液染3-6mins；用1％冰醋酸分化；无水乙醇脱水；透明封片。镜检。
统计学分析
所有实验均重复最少3次，使用GraphPad Prism 6.0e进行统计学分析，多组间均数两两比较采用one-way ANOVA中Tukey’s multiple comparisons test进行分析，多个时间点组间均数比较采用two-way ANOVA中Sidak’s multiple comparisons test进行分析。P<0.05，认为差异有统计学意义。
结果：
hUCMSCs获取及鉴定
图1显示为hUCMSCs分离培养和鉴定结果图，A：脐带组织的HE染色：可见较宽大的静脉和两个小动脉伴行；B：华通式胶的免疫组化染色，抗CD31和抗CD34染色阴性，表明胶质内无血管内皮相关细胞；C：华通式胶来源的P1代细胞；D：流式细胞术检测P5代细胞的表面标志物，表明该细胞为间充质干细胞。
hUCMSCs成骨诱导分化
图2显示为hUCMSCs在增殖培养基PM和成骨诱导培养基OM中的成骨向分化情况图，A：碱性磷酸酶染色显示细胞在OM中培养4d后颜色更深，碱性磷酸酶高表达；B：ALP活性定量检测发现相似的结果；C：qRT-PCR检测成骨相关基因ALP、RUNX2、COL1和OPN的表达，4d时基因表达相对较高，成骨活性较强；D：茜素红染色显示OM中培养3周可见点状钙结节，5周钙结节显著增加。*：P<0.05；**：P<0.01；***P<0.001；****P<0.0001。
hUCMSCs经成骨诱导4d、7d和10d后，与PM中相比，ALP染色紫色加深，4d时颜色最深(图2-A)。这与ALP活性的定量检测相同，成骨诱导后3个时间点的活性均较未诱导时明显升高，而且4d时最高，约为7d时的2倍，10d时的3倍(图2-B)。同时，所有检测时间点成骨诱导后ALP和OPN mRNA的表达均较未诱导组显著升高，并随时间延长逐渐升高，而RUNX2和COL1基因的表达仅在4d时较对照组明显升高(图2-C)。茜素红染色发现诱导后3w时出现散在钙结节，5w时出现成片钙结节，PM组自始至终未见钙结节(图2-D)。
hUCMSCs内皮向诱导分化
图3显示为3hUCMSCs在干细胞培养基SM和内皮向诱导培养基EIM中的分化情况图，A：分别在两种培养基中培养3d，EIM培养基中细胞出现血管样结构(红色箭头)，SM培养基中未发现该现象；B：培养4d后，基质胶上血管生成情况和D：细胞免疫荧光检测细胞高表达EphrinB2和EPHB4蛋白；C：激光共聚焦下Dil-ac-LDL吞噬情况，蓝色为细胞核，红色为Dil标记的ac-LDL；表明诱导后的细胞具有类似内皮细胞吞噬功能E：qRT-PCR检测促血管形成相关基因EFNB2、EPHB4、VEGF和bFGF的表达和F：抑制血管形成相关基因SERPINF1、ANGPTL1和SPROUTY1的表达。*：P<0.05；**：P<0.01；***P<0.001；****P<0.0001。
经EIM诱导后3d，相差显微镜下可见细胞变拉长，呈多角型，有大量血管样结构形成(图3-A)。基质胶上成血管和吞噬ac-LDL是判断是否具有内皮细胞功能的两个重要实验，我们发现诱导后4d，hUCMSCs接种到基质胶上2.5h可形成网格状结构，而未诱导的细胞则是成团散在分布(图3-B)；同样地，诱导后的细胞可吞噬Dil-ac-LDL，蓝色细胞核周围见吞噬进胞内的红色荧光标记的ac-LDL，未诱导细胞同样不具备此吞噬功能(图3-C)。细胞免疫荧光染色可见诱导后细胞连接呈环状结构，胞浆中同时表达动脉内皮细胞标志物ephrinB2和静脉内皮细胞标志物EphB4(图3-D)。诱导后4d、7d和10d RT-PCR检测发现促血管生成基因EFNB2、EPHB4、VEGF和bFGF的表达，发现除了EFNB2、VEGF和bFGF在4d时表达明显升高，所有基因在7d和10d的表达均有下降，且多数为显著下降(图3-E)；抑制血管形成基因除SPROUTY1的表达显著下降外，SERPINF1和ANGPTL1的表达与促成血管基因EFNB2、VEGF和bFGF的表达刚好相反，且随时间延长表达逐渐升高(图3-F)。
共培养培养基筛选
图4显示为双向预诱导hUCMSCs共培养培养基筛选结果图，A：共培养17d时茜素红染色发现：成骨向和成血管向细胞分别以3：1、2：2和1：3比例，在PM、OM和2：2(OM:PM)及3：1或1：3(OM:PM)中共培养时，细胞矿化能力不同，钙结节沉积量有显著差异。其中，3：1组细胞在3：1(OM:PM)中矿化能力最强，遂选择该共培养方式用于后续研究。B：钙结节溶解后定量分析。
*：P<0.05；**：P<0.01；***P<0.001；****P<0.0001。
预诱导os-hUCMSCs和en-hUCMSCs在孔板中共培养17d时，茜素红染色发现细胞按3:1、2:2和1:3混合后在PM中共培养也具备成骨分化能力，能够形成钙结节(图4-A)，与阳性对照4:0组无统计学差异(图4-B)。另外，PM、OM和EMM三种培养方案形成的钙结节与4:0组也没有统计学差异(图4-A,B)。唯有PMM培养方案中，3:1组形成大量散在钙结节(图4-A)，较阳性对照组和其他所有实验组显著增多，OD值约为4:0组的5倍，差异具有明显统计学意义(图4-B)。因此后续共培养的培养基选择PMM。
共培养对细胞增殖、成骨和血管生成的影响
图5显示为双向预诱导hUCMSCs共培养时细胞增殖、成骨、成血管能力分析图，A：alamar blue检测细胞增殖，内皮细胞比例高组增殖速度较快，成骨细胞比例高组增殖情况相反，可能由于成骨细胞矿化所致；B：碱性磷酸酶定量检测，早期1d时碱性磷酸酶即高表达，2d略有下降；C：成骨和血管生成基因共培养3d时相关基因的表达情况，3：1组和2：2组成骨成血管相关基因表达量较高，具有协同性；D：共培养3d时转录因子RUNX2的表达；E：与血管稳定相关的周细胞标志物CD146蛋白的表达。
*：P<0.05；**：P<0.01；***P<0.001；****P<0.0001。
共培养后3:1组细胞增殖率、ALP活性与4:0组最为相似(图5-A,B)，但3d时RUNX2基因、蛋白表达显著增高(图5-C,D)；2:2和1:3组细胞长期保持较高增殖率(图5-A)，2:2组3d时ALP基因、RUNX2基因和蛋白表达水平最高(图5-C,D)；1:3组1d、2d的ALP活性最高(图5-B)，3d的ALP基因表达水平降低(图5-C)，但RUNX2的基因、蛋白表达仍高于4:0组(图5-C,D)。
与0:4组相比，共培养3d时3:1组ANG mRNA表达水平最高(图5-C)，2:2组PDGFBmRNA表达水平最高(图5-C)，而1:3组VEGF mRNA表达水平最高(图5-C)，差异都具有统计学意义。与血管稳定相关的周细胞标志物CD146基因和蛋白的表达从3:1组到0:4组逐渐降低(图5-C,E)。
图6显示为成骨向分化hUCMSC和内皮向分化hUCMSCs共培养时成血管能力图，预诱导3d后不同比例成骨向分化hUCMSC和内皮向分化hUCMSCs混合后在基质胶上生成血管的情况。成骨向分化hUCMSC和内皮向分化hUCMSCs共培养3d时在基质胶上生成血管的情况。
预诱导后3d共培养时，en-hUCMSCs含量越高，在基质胶上生成血管环数目越多，形状越完整、连续(图6)；但共培养3d后，0:4组依然具备良好的血管生成能力，但其他组的血管生成能力明显减弱，仅有少量分枝状结构(图6)。
β-TCP支架结构和细胞相容性检测结果
图7显示为3D打印β-TCP支架结构和细胞相容性结果图，A：扫描电镜下正面观；B：扫描电镜高倍下支架微观结构；C：hUCMSCs接种于β-TCP支架上3d时的活死染色结果，激光共聚焦下见大量绿色的活细胞；D：扫描电镜下hUCMSCs粘附在β-TCP支架上。
扫描电镜下可见3D打印β-TCP支架柱子整齐，孔径约350-400μm，非常均匀(图7-A)，高倍镜下见支架表面具有大量的微孔结构，微孔直径为几百纳米-数微米(图7-B)，大的孔隙有利于成骨细胞的长入，微孔有利于细胞伪足的附着(图7-D)。hUCMSCs接种后3d，经活死染色，激光共聚焦显微镜下可见几乎全为存活的绿色活细胞，未见明显的红色死细胞(图7-C)，表明支架的细胞相容性较好。扫描电镜也观察到细胞贴附在支架表面，伸展良好。
大鼠颅骨骨缺损修复结果
图8显示为体内成骨能力检测结果图，A：4周缺损区支架micro CT重建图及组织学。白色为β-TCP支架，绿色为新生骨；HE染色可见3：1组再生骨较多，沿支架内部孔隙可见均质骨陷窝结构。空白组仅缺损周缘有新骨生成。CT：结缔组织；SF：支架；OD：类骨质；NB：新骨；HB：宿主骨。马森三色浅蓝色为胶原纤维；深蓝色为未成熟的新骨；浅红色为纤维素和红细胞；深红色为成熟的新骨；SF：支架；NB：新骨。B：支架上新生骨体积、骨小梁数目和骨小梁厚度统计图。C：组织学统计图。
*：P<0.05；**：P<0.01；***P<0.001；****P<0.0001。
术后，所有大鼠均顺利苏醒，活动正常，无术后感染、死亡。术后月，micro CT扫描重建后见空白组周边有少量从旧骨长出的新生骨，但是缺损中央未见新生骨，单纯支架组支架上见少许新骨生成，4:0组支架上均匀生成较多新骨，3:1组新骨生成最多，不仅在支架表面有新骨形成，在孔隙内也有部分新骨产生(图8-A)。统计分析发现，默认空白组无新骨生成的情况下，新骨体积和新生骨小梁数目在3:1组最高，其次是4:0组，最后才是支架组，差异具有明显统计学意义，而骨小梁厚度没有区别(图8-B)。HE染色也发现空白组骨缺损区由新生结缔组织填充，紧邻旧骨的地方有少许新骨向缺损区长入；支架组见靠近旧骨的区域有少量新骨长入，中央部位仅见不多的类骨质形成，多数为结缔组织；4:0组除了周边有少量旧骨长入外，支架中央也有成熟的新骨新城，并见大量的类骨质；3:1组整个支架周围均有大量成熟新骨形成，也有类骨质形成，结缔组织较少(图8-A)。马森三色染色可见空白组由胶原纤维修复，分布有少量毛细血管；支架组中央部位有大量胶原纤维，并可见大量毛细血管分布；4:0组可见明显新骨和胶原纤维，毛细血管减少；3:1组新骨占大部分，成熟新骨中有散在的未成熟新骨分布，周围也可见胶原纤维，毛细血管不多见(图8-A)。统计学结果显示3：1组新骨生成更多(图8-C)。
综上所述，本发明实施例先对人脐带间充质干细胞分别进行成骨和内皮向预诱导分化，再按不同比例进行混合共培养，并筛选培养基条件，最后通过对比不同比例混合细胞与3D打印β-三磷酸钙(β-tricalcium phosphate,β-TCP)支架复合构建组织工程骨修复颅骨极限骨缺损效果，探讨人脐带间充质干细胞双向预诱导共培养对成骨和血管生成的影响，为人脐带间充质干细胞在组织工程骨中的应用提供新的办法。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (2)

1.一种细胞在制备骨组织工程支架中的应用，其特征在于，所述细胞的制备方法包括以下步骤：
提供人脐带间充质干细胞，分别对所述人脐带间充质干细胞进行成骨和内皮向双向预诱导分化4天，再将成骨诱导分化的细胞与内皮向诱导分化的细胞置于成骨诱导培养基与内皮细胞诱导培养基混合而成的混合培养基中培养3天；
所述成骨诱导分化的细胞与内皮向诱导分化的细胞数量之比为3：1；成骨诱导培养基与内皮细胞诱导培养基体积之比为3：1；
所述成骨诱导培养基含有如下组分：100nM地塞米松、10mMβ-甘油磷酸、50μg/mL L-抗坏血酸，余量为增殖培养基；
按体积百分比计，所述增殖培养基含有如下组分：10％胎牛血清、1％青霉素-链霉素混合溶液，余量为Dulbecco改良的Eagle培养基-高葡萄糖；
所述内皮细胞诱导培养基含有如下组分：25ng/mL血管内皮生长因子(human VEGF)、10ng/mL成纤维细胞生长因子(human bFGF)，余量为EGM-2BulletKit培养基；
所述骨组织工程支架用于修复颅骨极限骨缺损。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述骨组织工程支架包括β-三磷酸钙支架。
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GR01 Patent grant
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