KR101988912B1 - 패턴을 이용한 조골세포 분화 촉진용 배양지지체 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 마루(ridge)와 골(groove)로 구성된 구조를 포함하는 줄기세포 또는 전구세포로부터 조골세포로의 분화 촉진용 배양지지체, 상기 배양지지체를 이용한 키트 및 줄기세포 또는 전구세포로부터 조골세포로의 분화 방법에 관한 것이다. 본 발명의 배양지지체는 줄기세포 또는 전구세포의 종류에 따라 최적의 패턴을 가짐으로써 조골세포로의 분화능을 향상시킨다. 특히, 골분화를 유도하는 보충인자를 소량만 첨가하여도 우수한 조골세포 분화능을 나타낸다는 특징이 있다. 더욱이 세포 밀도 변화에 의해서 조골세포 분화능이 크게 영향을 받지 않고, 세포의 분화시 증가하는 염증인자들에 의해 형성되는 염증환경에 영향을 받지 않고 조골세포로의 분화 유도가 가능한 바, 조골세포로의 분화효율이 높다는 이점이 있다. 이에 따라 우수한 뼈 재생능을 가지는 본 발명의 배양지지체는 치아 임플란트, 인공관절 및 외상고정장치 등 다양한 의생명 및 의료 분야에 활용할 수 있다.

Description

패턴을 이용한 조골세포 분화 촉진용 배양지지체{Culture scaffold for enhancing differentiation of osteoblast using pattern}
본 발명은 마루(ridge)와 골(groove)로 구성된 구조를 포함하는 줄기세포 또는 전구세포로부터 조골세포로의 분화 촉진용 배양지지체, 상기 배양지지체를 이용한 키트 및 줄기세포 또는 전구세포로부터 조골세포로의 분화 방법에 관한 것이다.
조골세포는 다양한 기원의 줄기세포로부터 분화된다. 이러한 조골세포의 분화에는 여러 가지 요인이 작용하는 것으로 알려져 있고, 특히 기계적인 스트레스(mechanical stress)는 조골세포의 분화에 중요한 기작으로 알려져 왔다. 최근 생체 외 배양조건에서 줄기세포 분화유도 기술을 이용하여 조골세포로 분화시키고 이를 이용하여 골조직의 기능을 강화하거나 손상을 치료하고자 하는 노력이 급증하고 있다. 이에 따라 줄기세포를 이용한 조골세포 분화 유도 및 이를 치료제로 활용하기 위한 기술개발이 활발히 이루어지고 있다.
특히, 생리적인 뼈의 성장과 달리 외상이나 보형물의 삽입과 같은 조건에서 뼈의 형성은 염증을 동반하게 된다. 이와 관련하여 현재 치아 임플란트(dental implant), 인공관절(orthopedic hip and knee joint) 및 외상고정장치(trauma fixation device)에서 뼈의 형성을 유도하기 위해 재료의 표면을 코팅하거나 무작위적인 변경을 가하는 방법을 활용하고 있다. 하지만 이러한 방법은 효과적인 골형성을 유도하기에는 매우 제한적인 접근 방법이고, 특히 염증환경에서의 조골세포 형성의 억제하고자 하는 시도는 거의 이루어지고 있지 않다. 따라서 외상 또는 염증환경에서 조골세포의 효과적인 분화유도기술을 통해 환자의 치료기간이 단축과 회복에 매우 중요한 것으로 환자의 삶의 질을 획기적으로 개선할 수 있다. 이를 위해 현재 BMP-4(bone morphogenetic protein-4)와 같은 골형성 유도 성장인자(osteogenic factor)를 사용하기도 하나, 비용이 많이 소모되는 단점이 있고 염증조건에서 조골세포의 개선에 대해서는 연구된 바가 없다.
따라서 조골세포의 전구세포로부터 조골세포로의 효과적인 분화를 위한 배양지지체에 대한 연구가 필요한 실정이며 특히 외상 또는 염증환경에서도 효과적으로 조골세포의 분화를 유도할 수 있는 배양지지체에 대한 필요성이 급증하고 있다.
이에 본 발명자들은, 보조적인 골형성 유도 성장인자 없이 염증인자가 존재하는 조건 하에서도 조골세포의 전구세포 종류에 따라 최적화된 패턴으로 구성된 배양지지체에 의해 다양한 기원의 전구세포를 조골세포로 효과적으로 분화시킬 수 있음을 확인하고 본 발명을 완성하였다.
KR 공개특허공보 제10-2016-0000576호 KR 공개특허공보 제10-2011-0116616호
본 발명의 목적은 마루와 골로 구성된 구조를 포함하는, 줄기세포 또는 전구세포로부터 조골세포로의 분화 촉진용 배양지지체 및 상기 배양지지체를 포함하는 조골세포 분화 촉진용 키트를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 배양지지체를 이용한, 줄기세포 또는 전구세포로부터 조골세포로의 분화 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 줄기세포 또는 전구세포로부터 조골세포로의 분화 촉진용 배양지지체의 제조방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 마루와 골로 구성된 구조를 포함하는, 줄기세포 또는 전구세포로부터 조골세포로의 분화 촉진용 배양지지체를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 배양지지체를 포함하는 조골세포 분화 촉진용 키트를 제공한다.
또한, 본 발명은 (a) 상기 배양지지체에 줄기세포 또는 전구세포를 접종하여 배양하는 단계; 및 (b) 상기 배양된 줄기세포 또는 전구세포를 조골세포로 분화시키는 단계를 포함하는, 줄기세포 또는 전구세포로부터 조골세포로의 분화 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 (a) 마루와 골로 구성된 주형을 제조하는 단계; (b) 상기 주형으로부터 음성 주형을 제조하는 단계; (c) 상기 음성 주형으로부터 배양지지체인 고분자를 제조하는 단계;를 포함하는, 줄기세포 또는 전구세포로부터 조골세포로의 분화 촉진용 배양지지체의 제조방법을 제공한다.
본 발명의 배양지지체는 줄기세포 또는 전구세포의 종류에 따라 최적의 패턴을 가짐으로써 조골세포로의 분화능을 향상시킨다. 특히 골분화를 유도하는 보충인자를 소량만 첨가하여도 우수한 조골세포 분화능을 나타낸다는 특징이 있다. 더욱이 세포 밀도 변화에 의해서 조골세포 분화능이 크게 영향을 받지 않고, 세포의 분화시 증가하는 염증인자들에 의해 형성되는 염증환경에 영향을 받지 않고 조골세포로의 분화 유도가 가능한 바, 조골세포로의 분화효율이 높다는 이점이 있다. 이에 따라 우수한 뼈 재생능을 가지는 본 발명의 배양지지체는 치아 임플란트, 인공관절 및 외상고정장치 등 다양한 의생명 및 의료 분야에 활용할 수 있다.
도 1은 마루 및 골 패턴을 가지는 지지체의 제조방법을 도식화하여 나타낸 도이다.
도 2는 주사전자현미경(SEM)을 이용하여 마루 및 골 패턴을 가지는 지지체의 형상을 확인한 결과를 나타내는 도이다.
도 3은 표면각 분석기를 이용하여 마루 및 골 패턴을 가지는 지지체의 경계면 접촉각을 확인한 결과를 나타내는 도로, 구체적으로 도 3b는 도 3a에 나타낸 결과를 그래프화하여 나타낸 도이다.
도 4는 이산화 티타늄(Ti) 코팅한 마루 및 골 패턴을 가지는 지지체의 제조방법을 도식화하여 나타낸 도이다.
도 5는 이산화 티타늄 코팅한 마루 및 골 패턴을 가지는 지지체의 세포독성을 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 6은 광화작용(mineralization) 분석을 통한 마루 및 골 패턴을 가지는 지지체의 조골세포로의 분화 유도 효과를 확인한 결과를 나타내는 도로, 구체적으로 도 6b는 도 6a를 그래프화하여 나타낸 도이며, 도 6c는 상기 도 6b에 나타낸 값을 3차 다항식으로 함수화하여 우수한 파골세포 형성을 유도하는 마루 및 골 폭 구간을 히트 맵(heat map)으로 나타낸 도이다.
도 7은 마루 및 골 패턴을 가지는 지지체 상에서 조골세포로의 분화 유도에서 골분화 보충인자의 영향을 광화작용 분석을 통해 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 8은 마루 및 골 패턴을 가지는 지지체 상에서 조골세포로의 분화 유도 과정에서 세포 밀도의 영향을 광화작용 분석을 통해 확인한 결과를 나타낸 도로, 구체적으로 도 8a는 평평한 지지체(PS, flat)상에서 수행한 결과를 나타내었으며, 도 8b는 마루 및 골 패턴을 가지는 지지체(TPT; aict-0, AZ-2, AZ-6)상에서 수행한 결과를 나타내는 도이다.
도 9는 마루 및 골 패턴을 가지는 지지체 상에서 조골세포로의 분화 유도 과정에서 염증 인자의 영향을 광화작용 분석을 통해 확인한 결과를 나타낸 도로, 구체적으로 도 9b는 도 9a를 그래프화하여 나타낸 도이다.
도 10은 마루 및 골 패턴을 가지는 지지체 상에서 분화된 조골세포의 물리적 특징을 SEM 관찰을 통해 확인한 결과를 나타내는 도로, 구체적으로 도 10a는 MC3T3 세포에 대한 결과를 나타내고, 도 10b는 Ad-MSC 세포에 대한 결과를 나타내었으며, 도 10c는 PDLSC에 대한 결과를 나타낸 도이다.
도 11은 마루 및 골 패턴을 가지는 지지체에 의한 분화 관련 유전자의 발현 변화를 정량적인 RT-PCR 수행을 통해 확인한 결과를 나타내는 도로, 구체적으로 도 11a는 Runx2 (runt-related transcription factor 2), ALPL (alkaline phosphatase gene), SP7 (osterix), BGLAP (osteocalcin), PIAS (protein inhibitor of activated STAT)의 발현 변화를 확인한 결과를 나타내는 도이고, 도 11b는 COL1A1 (typeⅠ collagen)의 발현 변화를 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 12는 면역 형광 염색을 통한 마루 및 골 패턴을 가지는 지지체의 반응성 활성산소(ROS)에 대한 영향을 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 13은 고해상도 단층촬영(Micro-computed tomography)을 통한 Ti-코팅된 마루 및 골 패턴을 가지는 지지체에 의한 뼈 재생 효과를 확인한 결과를 나타낸 도로, 구체적으로 도 13a는 Ti-코팅된 그루브 패턴을 이식한 후 래트 두개골 결손 모델 내의 두개골 결손에서 뼈의 밀도 변화를 확인한 결과를 나타내는 도이고, 도 13b는 뼈 브릿지 및 유니온의 변화를 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 14는 조직학적 분석을 통한 Ti-코팅된 그루브 패턴을 가지는 지지체에 의한 뼈 재생 효과를 확인한 결과를 나타낸 도이다.
이하, 본 발명에 대해 상세히 설명한다.
일례로 본 발명은 마루(ridge)와 골(groove)로 구성된 구조를 포함하는, 줄기세포 또는 전구세포로부터 조골세포로의 분화 촉진용 배양지지체를 제공한다.
또한, 또 다른 예로 본 발명은 상기 배양지지체를 포함하는 조골세포 분화 촉진용 키트를 제공한다.
본 발명에 있어서, ‘마루’는 양각으로 가장 크게 변위가 일어난 부분을 지칭하고, ‘골’은 음각으로 가장 크게 변위가 일어난 홈 부분을 지칭한다.
본 발명에 있어서, 상기 ‘마루와 골로 구성된 구조’는 평면에 일정 간격으로 마루와 골이 형성된 패턴을 가지는 구조물을 지칭하며, 구체적인 마루 및 골의 형태는 도 1에서 확인할 수 있다.
하기 수학식 1 내지 3에 따른 마루 및 골을 가지는 경우, 파골세포 형성 결과로부터 함수로 관계식을 도출할 수 있다. 이때, 본 발명은 조골세포 전구세포에 대해서는 수학식 1의 마루 및 골 패턴, 간엽줄기세포에 대해서는 수학식 2의 마루 및 골 패턴, 치주인대 줄기세포의 경우 수학식 3의 마루 및 골 패턴을 가지는 경우, 최적의 골분화능을 가지는 것이 특징이다. (f(x, y)값은 파골세포 형성 결과값이고, x는 마루의 너비, y는 골의 너비이다.)
[수학식 1]
Figure 112017064854616-pat00001
[수학식 2]
Figure 112017064854616-pat00002
[수학식 3]
Figure 112017064854616-pat00003
구체적으로 본 발명에 있어서, 상기 마루의 너비는 0.1 내지 5 μm이고 상기 골의 너비는 0.5 내지 7 μm인 것을 특징으로 하며, 보다 바람직하게는 상기 마루의 너비는 0.5 내지 4 μm이고 상기 골의 너비는 1.1 내지 6 μm이나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 수치값은 배양지지체의 분화 시작이 되는 세포의 종류에 따라 달라질 수 있는데, 구체적으로 하기 값에 의하여 본 발명이 제한되는 것은 아니나 조골세포 전구세포에 대해서는 마루의 너비 및 골의 너비가 각각 0.1~3 μm 및 1.5~7 μm일 수 있고, 바람직하게는 각각 0.5~2.83 μm 및 1.1~6 μm일 수 있으며, 보다 바람직하게는 각각 0.5~2 μm 및 1.8~4 μm이다. 간엽줄기세포에 대해서는 마루의 너비 및 골의 너비가 각각 0.1~3 μm 및 0.76~7 μm일 수 있고, 바람직하게는 각각 0.5~2.83 μm 및 1.1~6 μm일 수 있으며, 보다 바람직하게는 각각 0.5~2 μm 및 1.8~4 μm이다. 또한, 치주인대 줄기세포에 대해서는 마루의 너비 및 골의 너비가 각각 0.5~5 μm 및 1.5~7 μm일 수 있고, 바람직하게는 각각 1~4μm 및 2~6 μm일 수 있으며, 보다 바람직하게는 2~2.83 μm 및 2~6 μm이다.
본 발명에 있어서, ‘줄기세포’는 자기복제능력을 가지면서 두 개 이상의 세포로 분화하는 능력을 갖는 세포를 지칭하는 것으로, 크게는 만능줄기세포(totipotent stem cell), 전분화능 줄기세포(pluripotent stem cell), 다분화능 줄기세포(multipotent stem cell)로 분류할 수 있다. 또한, 줄기세포는 그 유래에 따라 다양하게 분류할 수 있는데, 본 발명의 줄기세포는 골수, 지방, 근육, 신경, 피부, 치아조직, 혈액, 제대혈, 간장, 위장관, 양막, 태반 또는 탯줄로부터 유래된 것을 특징으로 하고, 바람직하게는 골수 유래인 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, ‘전구세포(precursor cell)’는 특정 세포의 형태 및 기능을 갖추기 전 단계의 세포로 위탁줄기세포라고도 한다. 이에, 조골세포 분화를 통한 뼈를 재생하고자 하는 본 발명은 조골세포의 전구세포를 이용하는 것이 바람직하다.
본 발명에 있어서, ‘조골세포(osteoblast)’는 골기질을 합성, 분비하고, 기질에 칼슘 및 마그네슘 이온 등의 무기염을 침착시킴으로써 골조직을 석회화시키는 능력을 갖는 세포를 지칭하는 것으로, 골화 등에 의해 뼈의 신생이 이루어지는 부위에서 볼 수 있는 것이 특징이다.
본 발명에 있어서, ‘분화(differentiation)’는 세포가 분열 증식하여 성장하는 동안에 서로 구조나 기능이 특수화하는 현상으로, 생물의 세포, 조직 등이 각각에게 주어진 일을 수행하기 위하여 형태나 기능이 변해가는 것을 지칭한다. 아울러, ‘골분화’는 동물의 발달과정에서 나타나는 전구세포가 분화되어 골기질을 형성하고, 상기 형성된 골기질이 석회화되어 골을 형성하는 일련의 생리적인 반응인 골형성 과정 중에서도 골기질을 형성하는 과정, 또는 자연적 혹은 인위적으로 동물의 줄기세포의 분화를 유도하여 골기질을 형성하는 과정을 모두 포함하는 개념이다.
본 발명에 있어서, ‘배양지지체’는 세포 배양에 사용되는 고정물을 넓게 포함하는 개념으로, 본 발명의 목적상 마루 및 골 패턴이 새겨진 고분자 자체를 지칭하나 이에 본 발명이 제한되는 것은 아니다.
상기 배양지지체의 재질은 트리메틸로프로판 프로폭실레이트 트리아크릴레이트 (TPT; trimethylolpropane propoxylate triacrylate), 트리프로필렌글리콜 디아크릴레이트 (TPD, tripropylene glycol diacrylate), 트리에틸렌글리콜 디메타아크릴레이트 (TGD, triethylene glycol dimetacrylate), 트리아릴시아네이트 (TAC, triarylcyanate), 트리메틸올프로판 트리메타아크릴레이트 (TPTM, trimethylolpropane trimethacrylate), 폴리카프로락톤 (PCL; polycaprolactone), 콜라겐, 젤라틴, 히아루론산 (hyaluronic acid), 키토산, 라미닌, 케라틴, 알지네이트 (alginate), 피브로넥틴 (fibronectin), 폴리글리콜산 (PGA; polyglycolic acid), 폴리락트산(PLA; poly lactic acid), 폴리락트산-글리콜산공중합체 (PLGA), 폴리아미노산, 폴리안히드라이드 (polyanhydride), 폴리오르쏘에스테르 (polyorthoester) 또는 폴리우레탄 (polyurethane)인 것이 바람직하고, TPT인 것이 보다 바람직하나, 이에 제한되는 것은 아니다. 아울러, 상기 배양지지체는 티타늄(Ti), 알루미늄(Al), 바나듐(V), 티타늄 합금, 스테인레스, 코발트 합금 또는 니켈-티타늄 합금으로 코팅된 것일 수 있고, 보다 바람직하게는 티타늄 코팅된 것일 수 있으며, 생명체에 삽입하여도 세포 독성을 나타내지 않는 재질이라면 제한 없이 포함된다. 이때, 본 발명의 목적상 상기 코팅된 물질로부터 고분자를 분리한 후 코팅한 물질 자체를 배양지지체로 사용할 수 있다.
종합하면, 본 발명의 배양지지체의 재질은 고분자, 금속으로 코팅된 고분자 또는 금속 자체일 수 있고, 구체적으로는 TPT, TDP, TGD, TAC, TPTM, PCL, 콜라겐, 젤라틴, 히아루론산, 키토산, 라미닌, 케라틴, 알지네이트, 피브로넥틴, 폴리글리콜산, 폴리락트산, 폴리락트산-글리콜산공중합체, 폴리아미노산, 폴리안히드라이드, 폴리오르쏘에스테르, 폴리우레탄, 티타늄(Ti), 알루미늄(Al), 바나듐(V), 티타늄 합금, 스테인레스, 코발트 합금 및 니켈-티타늄 합금으로 이루어진 군으로부터 1이상 선택된 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 배양지지체는 골분화 보충인자를 소량만 첨가하여도 골분화를 유도할 수 있는바, 경제적인 이점이 존재한다. 이때 상기 골분화 보충인자는 BMP-4, 비타민 C (아스코르브산, ascorbic acid, AA), β-글리세로포스페이트 (β-glycerophosphate), 제대혈 혈청, 타우로우루소데옥시콜릭산, 덱사메타손, L-알라닐-L-글루타민, 글리세롤 2-인산 및 이들의 조합일 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 배양지지체는 염증조건, 즉 염증인자가 존재하는 조건에서도 골분화가 잘 일어나는 것이 특징이다. 즉, 상기 분화는 염증조건에서 이루어질 수 있다. 상기 염증인자는 TNF (tumor necrosis factor)-α, IL (interleukin)-1β을 비롯한 사이토카인 (cytokine) 또는 내독소 (LPS, lipopolysaccharide)일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 배양지지체는 반응성 활성산소(ROS) 생성을 억제하는 것이 특징이다. 이에 따라 본 발명의 배양지지체가 세포의 분화에 따른 염증환경에 의해서 생성되는 활성산소를 억제함으로 조골세포의 분화를 강화하는 것이 특징이다.
본 발명에 있어서, 상기 배양지지체는 세포의 밀도에 크게 영향을 받지 않는다. 다만, 배양지지체로 활용하는 경우 최적의 분화를 유도하기 위한 세포 밀도는 1×102 내지 1×105세포/웰일 수 있고, 보다 바람직하게는 3×103 내지 3×104세포/웰일 수 있으나, 이는 24 웰을 기준으로 한 것이며, 웰의 크기에 따라 충분히 달라질 수 있는바 상기 수치에 본 발명이 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, ‘키트’는 보다 효과적으로 줄기세포를 골세포로 분화시킬 수 있도록, 본 발명의 배양지지체 외에 줄기세포 또는 전구세포의 분화에 적합한 한 종류 또는 그 이상의 용액 또는 장치 등의 다양한 구성요소를 추가로 포함할 수 있다. 상기 추가로 포함되는 구성요소는 골세포로의 분화에 영향을 미칠 수 있는 한 특별히 이에 제한되지 않으나, 바람직하게는 줄기세포 배양용 배지, 줄기세포 분화유도물질, 배양용기, 줄기세포 공동배양용 내피세포 등을 단독으로 또는 조합하여 사용할 수 있다.
또 다른 예로, 본 발명은 (a) 상기 배양지지체에 줄기세포 또는 전구세포를 접종하여 배양하는 단계; 및 (b) 상기 배양된 줄기세포 또는 전구세포를 조골세포로 분화시키는 단계를 포함하는, 줄기세포 또는 전구세포로부터 조골세포로의 분화 방법을 제공한다.
본 발명에 있어서, 상기 (b) 단계의 ‘분화’는 소량의 골분화 보조인자를 사용하여 유도할 수도 있고, 분화를 유도하는 배지를 이용하여 유도할 수도 있다. 상기 배지는 이 기술 분야에서 일반적으로 사용되는 분화 유도용 배지를 사용할 수도 있고, 바람직하게는
또 다른 예로, 본 발명은 (a) 마루와 골로 구성된 주형을 제조하는 단계; (b) 상기 주형으로부터 음성 주형을 제조하는 단계; (c) 상기 음성 주형으로부터 배양지지체인 고분자를 제조하는 단계;를 포함하는, 줄기세포 또는 전구세포로부터 조골세포로의 분화 촉진용 배양지지체의 제조방법을 제공한다.
본 발명에 있어서, 상기 제조방법은 ‘상기 배양지지체에 자외선 오존 (ultraviolet ozone, UVO)을 처리하는 단계’ 또는 ‘상기 배양지지체에 티타늄(Ti), 알루미늄(Al), 바나듐(V), 티타늄 합금, 스테인레스, 코발트 합금 및 니켈-티타늄 합금으로 이루어진 군으로부터 선택된 것을 처리하는 단계’를 더 포함할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 주형(mold)은 틀이라고도 지칭하는 것으로, 일정한 형태를 가지는 고체물질로 본 발명의 배양지지체를 제조하기 위하여 사용하는 물질이다.
상기 (c) 단계의 고분자는 TPT, TDP, TGD, TAC, TPTM, PCL, 콜라겐, 젤라틴, 히아루론산, 키토산, 라미닌, 케라틴, 알지네이트, 피브로넥틴, 폴리글리콜산, 폴리락트산, 폴리락트산-글리콜산공중합체, 폴리아미노산, 폴리안히드라이드, 폴리오르쏘에스테르 또는 폴리우레탄일 수 있고, 생체 내에서 사용할 수 있는 고분자라면 제한 없이 사용할 수 있다.
또한, 상기 (c) 단계의 고분자는 광개시제를 더 포함하는 물질일 수 있으며, 이때 상기 고분자와 광개시제의 혼합비율은 95:5(v/v)인 것을 특징으로 하나, 이에 제한되지 않는다. 아울러, 상기 광개시제는 2’-히드록시-2-메틸-프로피오페논(HOPP, 2-hydroxy-2-methyl-propiophenone), 2,2'-디에톡시아세토페논, 2,2'-디부톡시아세토페논, p-t-부틸트리클로로아세토페논, p-t-부틸디클로로아세토페논, 4-클로로아세토페논, 2,2'-디클로로-4-페녹시아세토페논, 벤조페논, 4,4'-디메틸아미노벤조페논, 4,4'-디클로로벤조페논, 3,3'-디메틸-2-메톡시벤조페논, 4-페닐 벤조페논, 히드록시 벤조페논, 아크릴화 벤조페논, 4,4'-비스(디메틸 아미노)벤조페논, 4,4'-비스(디에틸 아미노) 벤조페논, 티오크산톤, 2-크롤티오크산톤, 2-메틸티오크산톤, 이소프로필 티오크산톤, 1-[9-에틸-6-(2-메틸벤조일)-9H-카바졸-3-3-일]-1-(O-아세틸옥심), 2,4-디에틸 티오크산톤, 2,4-디이소프로필 티오크산톤, 2-클로로 티오크산톤, 벤조인, 벤조인 메틸 에테르, 벤조인 에틸에테르, 벤조인 이소프로필에테르, 벤조인 이소부틸에테르, 벤질디메틸케탈, 4,6-트리클로로-s-트리아진, 2-페닐-4,6-비스(트리클로로메틸)-s-트리아진, 비스(트리클로로메틸)-6-스티릴-s-트리아진, 2-4-트리클로로 메틸(피페로닐)-6-트리아진, 2-4-트리클로로메틸(4'-메톡시스티릴)-6-트리아진, 2-(3',4'-디메톡시 스티릴)-4,6-비스(트리클로로메틸)-s-트리아진, 2-(4'-메톡시 나프틸)-4,6-비스(트리클로로메틸)-s-트리아진, 2-(p-메톡시페닐)-4,6-비스(트리클로로메틸)-s-트리아진 또는 2-피페닐-4,6-비스(트리클로로메틸)-s-트리아진일 수 있으며, 바람직하게는 HOPP일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
중복되는 내용은 본 명세서의 복잡성을 고려하여 생략하며, 본 명세서에서 달리 정의되지 않은 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상적으로 사용되는 의미를 갖는 것이다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다. 다만 하기의 실시예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 실시예는 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.
실시예 1: 마루 및 골 패턴을 가지는 지지체의 제조 및 확인
1-1. 마루 및 골 패턴을 가지는 지지체의 제조 및 표면 형상 확인
1-1-1. 제조
우선, 표준 포토리소그라피(photolithography) 및 드라이 에칭(dry etching)을 통하여 실리콘 마스터 주형(master)을 제조하였다. 이와 별개로 실리콘 탄성중합체 베이스 및 실리콘 탄성중합체 경화제(curing agent)를 10:1 (w/w) 비율로 혼합하여 poly (dimethylsiloxane) (PDMS) 용액(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)을 제조하였고, 이 후 이를 상기 실리콘 마스터 주형에 넣고 탈기(degrass) 하였다. 그리고 나서 PDMS 용액을 4시간 동안 80 ℃에서 경화하였다. 경화한 PDMS 주형은 PDMS의 낮은 표면력 및 탄성을 이용하여 마스터 주형으로부터 벗겨내었다.
이어서 세포 배양 플레이트에서 패턴화된 지지체를 제조하기 위해, TPT (Mn=~644) (Sigma-Aldrich)와 광개시제인 HOPP (97%, Sigma-Aldrich)를 95:5(v/v)비율로 혼합하여 TPT 전구체 용액을 제조하고, 이를 세포 배양 플레이트에 첨가하였으며, 그 위에 PDMS 주형을 덮었다. 이 후 상기 TPT 전구체 용액을 365 nm의 파장 및 135 mW/cm2의 UV 빛(Fusion cure system, Minuta Technology, Republic of Korea)으로 90분 동안 경화하였으며, 경화된 마루 및 골 패턴을 가지는 TPT로부터 PDMS 주형을 분리하였다. 이어서 잔여 TPT 올리고머를 최소화하기 위하여 90분 동안 패턴화된 TPT 위에서 UV를 이용하여 추가적인 경화과정을 수행하였으며, 표면의 물성을 증가시키기 위하여 상기 패턴화된 구조에 1시간 동안 오존 경화 시스템의 UVO를 처리하였다. 이 후 모든 패턴화된 TPT, 즉, 지지체 샘플은 멸균해놓았다. 상기 일련의 과정은 도 1에 도식화하여 나타내었다.
1-1-2. 마루 및 골 패턴을 가지는 지지체의 표면 형상 확인
상기 실시예 1-1-1에서 제작한 지지체 내 패턴 이미지는 필드 방사 주사전자현미경(FE-SEM, S-4800, Hitachi, Tokyo, Japan)으로 분석하였다. 아울러, 추가적으로 상기 패턴의 형상을 검증하기 위하여, 지지체 샘플을 스프터-코팅(sputter-coated)하고, FE-SEM을 이용하여 5 kV의 가속 전압으로 이미지화하였다. 그 결과는 도 2에 나타내었다.
도 2에 나타낸 바와 같이, 상기 실시예 1-1-1을 통하여 제조한 지지체는 고정된 마루 또는 골을 가지는 두 개의 마이크로 크기의 패턴(AZ pattern 또는 SU pattern)과 나노 크기의 패턴(aict pattern), 즉 하기 표 1과 같은 마루의 너비가 0.35 내지 7 μm이고 골의 너비가 0.65 내지 6 μm인 다양한 조합의 그루브 패턴을 가짐을 확인하였다.
마루의 너비(μm) 골의 너비(μm)
대조군 평평한 지지체(flat) 0 0
실험군 aict-3 0.35 0.65
aict-2 0.65 0.76
aict-1 0.85 1.1
aict-0 0.5 1.8
AZ-2 2 2
AZ-4 2 4
AZ-6 2 6
SU-4 2.83 3
SU-6 5.47 3
SU-8 7 3
또한, 탈이온화된 물을 이용하여 액체가 본 발명의 지지체 상의 그루브 패턴과 접할 때 형성되는 경계면의 접촉각(contact angle, CA)을 Phenix 150 표면각 분석기(Surface Electro Optics, Suwon, Republic of Korea)로 측정하고, Image XP 5.9 소프트웨어로 분석하였다. 그 결과는 도 3a에 나타내고, 이를 그래프화한 것을 도 3b에 나타내었다.
도 3에 나타낸 바와 같이, 일반 배양접시에 주로 사용되는 폴리스티렌(PS)에 대한 접촉각은 약 45°, UVO를 처리 전에 접촉각은 약 70°이고, UVO 처리 후에는 PS와 같은 접촉각을 갖게 됨을 확인하였다. 또한 본 실시예에서는 UVO를 처리한 후 6일 동안 접촉각의 변화가 없음을 확인함으로써 UVO의 처리에 의해 시간의 경과에 따른 추가적 물성 변화가 발생하지 않음을 확인하였다.
1-2. 이산화 티타늄(titanium dioxide; Ti) 코팅한 마루 및 골 패턴을 가지는 지지체의 제조 및 세포 독성 확인
1-2-1. 제조
TPT를 세포 배양 플레이트에 첨가하는 대신 폴리에틸렌 테레프탈레이트(PET) 필름(Kolon Industries, Gwacheon, Republic of Korea)에 첨가하는 것 외에는 상기 실시예 1-1-1과 동일한 방식으로 마루 및 골 패턴을 가지는 지지체를 제조하였다. 이 후, 50 nm 이하의 Ti 필름을 DC 마크네트론 스퍼터 시스템(KVS-2004L; Vacuum Tech, Gimpo, Republic of Korea)을 이용하여 패턴화된 지지체인 TPT에 스퍼터를 뿌렸다. 그리고 나서, Ti 표적 및 기질의 거리를 15 cm로, 스퍼터 챔버 내 기본 압력은 10-6 Torr으로 설정하고 하고, 99.99%의 Ti 표적(RND Korea, Gwangmyeong, Republic of Korea)을 사용하였다. 그리고 나서 10분 동안 스퍼팅하기 위한 플라즈마로 100 W의 직류(DC)와 15 sccm의 유속 및 2×10-3 Torr의 압력을 가지는 Ar(아르곤) 가스를 만들어내었다. 생체 내 동물 실험을 수행하기 위하여, Ti-코팅한 그루브 패턴을 가지는 지지체를 디스크 형태의 구조물(12 mm 지름) 형태로 절단하여 제작하였다. 이는 생체 내 골재형성을 평가하기 위한 단계이다. 상기 일련의 과정은 도식화하여 도 4에 나타내었다.
1-2-2. 세포 독성 확인
Ti-코팅된 마루 및 골 패턴을 가지는 지지체의 세포 외 세포 독성을 측정하기 위하여, 상기 실시예 1-2-1에서 제조한 지지체 샘플을 24-웰 배양 플레이트 위에 처리하고, 이어서 그 위에 MC3T3 세포를 3×104 세포/웰 농도로 분주하였다. 24시간 동안 배양한 후에, 세포 생존력을 제조자가 제공하는 메뉴얼에 따라 CCK-8 분석 키트(Sigma-Aldrich)로 측정하였다. 그 결과는 도 5에 나타내었다.
도 5에 나타낸 바와 같이, 패턴을 가지는 지지체를 Ti로 코팅하여도 세포 독성을 가지지 않음을 확인하였다. 이는 본 발명의 Ti-코팅된 패턴을 가지는 지지체를 생체 내에서 사용할 수 있음을 나타낸다.
실험예 1: 본 발명의 마루 및 골 패턴을 가지는 지지체에 의한 조골세포로의 분화
1-1. 조골세포의 전구세포 또는 줄기세포의 확보 및 배양
조골세포의 전구세포인 MC3T3 세포(이하, ‘MC3T3’)는 American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, USA)으로부터 구입하였고, 아스코르브산 없는 10% 소태아혈청, 1% 페니실린/스트렙토마이신 및 1% 글루타민(Life Technologies, Carlsbad, CA, USA)으로 보충한 α-MEM 배지에서 배양하였다.
사람의 지방조직으로부터 지방유래 간엽줄기세포(adipose tissue-derived mesenchymal stem cells, Ad-MSC)를 얻었고, 컨디션드 배지 (conditioned medium)로서 내피 성장 배지 (EGM, Lonza, Basel, Switzerland)와 DMEM (Life Technologies)을 4:1로 혼합한 배지에서 배양하였다.
또한 발치한 치아표면에서 인대를 분리한 후, 이를 3 mg/mL의 콜라게나아제 유형 Ⅰ(Sigma-Aldrich) 및 4 mg/mL의 디스페이즈(Sigma-Aldrich) 용액 내에서 1시간 동안 37 ℃ 조건에서 반응시켜 치주인대 줄기세포(periodontal ligament stem cells, PDLSC)를 분리하였다.
이 후 각 세포들을 혈청이 보충된 패지가 포함된 배양 플레이트에 첨가하였고, 플레이트 위에 세포가 잘 부착되도록 이틀 동안 배양하였다. 그리고 나서, 상기 세포들을 실시예 1-1-1에서 제조한 마루 및 골 패턴의 지지체와 대조군(flat)인 TPT 지지체 및 일반적으로 세포 배양에 사용되는 지지체인 PS 지지체를 사용하고, 세포는 바닥이 거의 채워지는 농도(3x104 세포/웰)로 분주하였다.
이하의 실험에서는 Ad-MSC 및 PDLSC는 2~4 계대의 세포를 사용하였으며, 연구 프로토콜은 서울대학교 생명윤리위원회(서울대학교병원 IRB 승인, C-1401-121-550)의 승인을 받았다.
1-2. 골분화 보충인자 첨가에 따른 조골세포로의 분화
각 세포의 조골세포로의 분화를 유도하기 위하여, AA (100 μg/mL 또는 50 μg/mL, Sigma-Aldrich) 및 BGP (10 mM 또는 5 mM, Sigma-Aldrich)를 포함하는 골분화 보충인자(supplement)를 추가적으로 넣은 것 외에는 상기 실험예 1-1과 동일한 방식으로 실험을 수행하였다.
이때, 골분화 보충인자는 최적 용량(full-dose)인 AA 100 μg/mL 및 BGP 10 mM를 처리한 실험군과 최적 용량의 절반 용량(half-dose)인 AA 50 μg/mL 및 BGP 5 mM를 처리한 실험군에 대하여 실험을 각각 수행하였다.
1-3. 세포 밀도를 달리하여 유도한 조골세포로의 분화
세포 밀도 변화에 따른 본 발명 지지체의 조골세포 분화 효과 차이를 확인하기 위하여, 사용하는 세포밀도만을 달리하여 상기 실험예 1-1과 동일한 방식으로 실험을 수행하였다. 이때, 세포 밀도는 웰당 3×104, 3.75×103, 1.87×103, 0.93×103, 0.46×103세포를 처리하여 실험을 수행하였다.
1-4. 염증인자의 첨가에 따른 조골세포로의 분화
염증인자에 의한 본 발명 지지체의 조골세포 분화 효과 차이를 확인하기 위하여, 세포 배지에 LPS로 자극한 비장세포, 사이토카인인 TNF-α (10 ng/ml, PeproTech, Rocky Hill, NJ, USA) 혹은 IL-1β (10 ng/ml, PeproTech)를 처리한 것 외에는 상기 실험예 1-1과 동일한 방식으로 실험을 수행하였다.
이때, C57BL/6J 마우스로부터 분리한 비장세포(중앙대 실험동물 연구회, Seoul, Republic of Korea)를 24시간 동안 37℃, 5% CO2의 조건에서 LPS (1 μg/mL)로 자극한 후 분리하였고, 분리한 배양액에 대하여 5분 동안 500 xg에서 원심분리를 수행한 후 상층액만을 분리한 것을 사용하였다. 상기 LPS로 자극한 비장세포를 배양액이라 지칭하였다.
실험예 2: 본 발명의 마루 및 골 패턴을 가지는 지지체에 의한 조골세포로의 분화 및 특성 확인
2-1. 광화작용 분석(mineralization assay)을 통한 조골세포로의 분화 확인
2-1-1. 조골세포로의 분화 확인
실험예 1-1에 개시한 방식으로 MC3T3, Ad-MSCs와 PDLSC를 조골세포로 분화시키면서 각각 배양 10일, 20일 및 8일째가 되었을 때, 분화 결과를 Alizarin Red S(Sigma-Aldrich) 염색법으로 분석하였다. 즉, Alizarin Red S 염색을 통하여 조골세포의 세포 내 칼슘 축적 정도를 확인함으로써 조골세포로의 분화 정도를 확인하였다.
구체적으로, 실험예 1-1을 통해 배양한 각 세포를 인산화 완충 생리식염수(phosphate-buffered saline, PBS)로 세척하고 10% 포름알데히드(formaldehyde)로 실온에서 15분 동안 고정하였다. 이 후 이를 증류수로 2회 세척한 후 40 nM Alizarin Red S (pH 4.1)와 20분간 반응시켜 조골세포에서 형성된 칼슘이 붉게 염색된 것을 확인하였다. 광학현미경(Olympus, Tokyo, Japan)으로 이미지를 획득하였으며, 이를 도 6a에 나타내었다. 아울러, 상기 이미지의 정량적인 분석은 Image J (NIH, http://imagej.nih.gov/ij/, National Institute of Health, Bethesda, MD, USA) 프로그램을 이용하여 세포층의 면적을 통한 표준화를 통해 세포층 내 칼슘 축적의 정량화 (Alizarin Red S value, arbitrary unit)를 수행하였으며, 그 결과는 도 6b에 나타내었다.
아울러, MC3T3, Ad-MSC 및 PDLSC가 본 발명의 지지체의 다양한 그루브 패턴에 따라 분화 정도가 변화하는지 여부를 확인하기 위하여 대략적인 Alizarin Red S 값을 측정하였으며, 이를 위해 두 개의 변수를 가지는 3차 다항식으로 평평(flat) 또는 8개의 그루브 패턴(aict-2, aict-1, aict-0, AZ-2, AZ-4, SU-4, SU-6 및 SU-8)에 대한 자료의 보간(interpolation)을 계산하였다. 이에 따라, 상기 실험 결과자료를 3차 보간 다항식으로 치환하여 얻은 선형의 방정식 시스템으로 다항식을 도출하였다. 효과적인 그루브 패턴을 찾기 위하여, 다항식의 보간은 비교적 큰 최소값을 가지는 마루-골 범위에 대한 삼각형 서브도메인을 가짐을 확인하였다. 그 결과는 도 6c에 나타내었다.
도 6a 및 6b에 나타낸 바와 같이, 각 그루브 패턴에서 MC3T3, Ad-MSC 및 PDLSC가 잘 분화됨을 확인할 수 있고, 특히 aict-0, AZ-2, AZ-4, AZ-6, SU-4 및 SU-6 패턴화된 지지체에서 특히 분화가 활발하게 이루어짐을 확인할 수 있었다.
구체적으로, MC3T3는 패턴의 마루의 너비가 0.5~2.83 μm, 골의 너비가 1.1~6 μm인 지지체에서 대조군인 평평한 지지체에 비하여 우수한 골 분화능을 가짐을 확인하였고, 최대 골분화는 마루가 0.5~2 μm, 골이 1.8~4 μm인 지지체에서 나타남을 확인하였다.
또한, Ad-MSC는 패턴의 마루의 너비가 0.5~2.83 μm, 골의 너비가 1.1~6 μm인 지지체에서 대조군인 평평한 지지체에서 보다 우수한 골 분화능을 가짐을 확인하였고, 최대 골분화는 마루의 너비가 0.5~2 μm, 골의 너비가 1.8~4 μm을 확인하였다.
아울러, PDLSC는 패턴의 마루의 너비가 1~4 μm, 골의 너비가 2~6 μm인 지지체에서 대조군인 평평한 지지체에서 실험을 수행한 경우 보다 우수한 골 분화능을 가짐을 확인하였고, 최대 골분화능은 마루의 너비가 2~2.83 μm, 골의 너비가 2~6 μm일 때임을 확인하였다.
종합하여, 상기 값을 보간하여 나타낸 도인 도 6c에 나타낸 바와 같이, 각 세포들의 조골세포로의 분화를 위한 최적 마루-골(ridge-groove) 범위를 측정할 수 있는 다음의 수학식 1 내지 3을 도출하였으며, 각 식은 MC3T3, Ad-MSC 및 PDLSC에 대한 값이다. 이때, f(x, y)값은 파골세포 형성 결과값이고, x는 마루의 너비, y는 골의 너비이다.
[수학식 1]
Figure 112017064854616-pat00004
[수학식 2]
Figure 112017064854616-pat00005
[수학식 3]
Figure 112017064854616-pat00006
2-1-2. 골분화 보충인자에 의한 영향 확인
본 발명의 마루 및 골 패턴을 가지는 지지체에 의한 조골세포로의 분화에 있어서, 종래 조골세포 분화에 필수적이라고 알려진 골분화 보충인자가 미치는 영향을 확인하기 위하여, 실험예 1-2의 방식으로 조골세포로의 분화를 유도한 각 세포들의 분화 정도를 확인하였다. 그리고 나서, 상기 세포들에 대한 분석은 상기 실험예 2-1-1에 개시한 바와 같이, Alizarin Red S 염색법 후 Image J로 분석하였다. 그 결과는 보간법으로 계산하였다. 상기 결과는 도 7에 나타내었다.
도 7에 나타낸 바와 같이, 아스코르브산과 β-글리세로포스페이트의 처리 농도를 줄여도 패턴을 가지는 지지체의 조골세포 분화능에 유의적인 차이가 존재하지 않음을 확인하였다. 이는 마루 및 골 패턴 자체가 갖는 물리적인 특성이 조골세포 분화에 필요한 환경을 제공하는 것임을 나타낸다.
2-1-3. 세포 밀도에 의한 영향 확인
본 발명의 마루 및 골 패턴을 가지는 지지체에 의한 조골세포로의 분화에 있어서, 세포의 밀도가 미치는 영향을 확인하기 위하여, 실험예 1-3의 방식으로 조골세포로의 분화를 유도한 각 세포들의 분화 정도를 확인하였다. 상기 세포들에 대한 분석은 상기 실험예 2-1-1에 개시한 바와 같이, Alizarin Red S 염색법 후 Image J로 분석하였으며, 그 결과는 보간법으로 계산하였다. 평평한 지지체(PS, flat)에 대하여 수행한 결과는 도 8a에 나타내었으며, 본 발명의 마루 및 골 패턴을 가지는 지지체(TPT; aict-0, AZ-2, AZ-6)에 대하여 수행한 결과는 도 8b에 나타내었다.
도 8에 나타낸 바와 같이, 평평한 지지체에서는 세포 밀도가 줄어듦에 따라 세포의 분화 정도가 현저하게 감소함을 확인(도 8a)하였으나, 본 발명의 그루브 패턴을 가지는 지지체는 적정 세포 밀도인 3X104 세포/웰의 1/10 밀도인 3X103 세포/웰에서도 조골세포로의 분화가 잘 유지됨을 확인(도 8b)하였다. 이는 그루브 패턴이 갖는 물리적인 특성이 조골세포 분화에 필요한 환경을 제공하는 것으로 환경적인 한계를 극복하는 역할을 함을 나타낸다.
2-1-4. 염증 인자에 의한 영향 확인
본 발명의 마루 및 골 패턴을 가지는 지지체에 의한 조골세포로의 분화에 있어서, 외상이나 보형물의 삽입에 의하여 일반적으로 발생되는 염증에 의한 효과, 즉 조골세포로의 분화에 염증인자가 미치는 영향을 확인하기 위하여, 실험예 1-4의 방식으로 조골세포로의 분화를 유도한 각 세포들의 분화 정도를 확인하였다. 상기 세포들에 대한 분석은 상기 실험예 2-1-1에 개시한 바와 같이, Alizarin Red S 염색법 후 Image J로 분석하였다. 그 결과는 보간법으로 계산하였다. 상기 결과는 도 9a에 나타내었으며, 이를 그래프화한 것을 도 9b에 나타내었다.
도 9에 나타낸 바와 같이, 대조군인 평평한 지지체에서의 세포 배양시에는 염증 사이토카인에 의하여 조골세포로의 분화가 억제되나, 본 발명의 마루 및 골 패턴을 가지는 지지체(TPT; aict-0, AZ-2, AZ-6)의 세포는 세포 유형에 구애받지 않고 염증인자에 의한 분화억제 효과를 유의적인 수준으로 극복하는 것을 확인하였다. 이는 특정 마루 및 골 패턴이 염증에 의한 조골세포 분화 억제 효과를 막아, 궁극적으로는 효과적인 뼈 재생효과를 가짐을 나타낸다.
2-2. SEM 관찰을 통한 본 발명의 마루 및 골 패턴을 가지는 지지체에 의한 분화된 조골세포의 물리적 특징 확인
본 발명의 마루 및 골 패턴을 가지는 지지체 위에서 배양된 세포의 배열 상태 및 외형의 특이점을 관찰하기 위하여, 실험예 1-1에서 배양한 각 세포를 평평한 지지체 또는 마루 및 골 패턴을 가지는 지지체에 분주하고, 이틀 동안 배양하였다. 이어서, 상기 각 지지체의 표면에 부착된 세포를 4시간 동안 PBS에 용해된 2% 파라포름알데히드 및 2% 글루트알데하이드(Sigma-Aldrich)로 이루어진 변형된 Karnovsky's fixative에 고정하였다. 이 후, 상기 샘플을 에탄올 연속 배양(50-60-70-80-90-100%, 각 5~10분 동안 처리)으로 탈수시켰고, 헥사메틸디실라젠(hexamethyldisilazane, Sigma-Aldrich)을 15분 동안 처리하였다. 이어서, 상기 샘플을 FE-SEM(S-4800)으로 관찰하기 위하여 금으로 스퍼터-코팅(sputter-coated)하였다. 그 결과 이미지는 Image J로 분석하였고, 이후에 길이(L), 너비(W) 및 W/L비(너비×100/길이) 또는 둘레를 측정하였다. 아울러, 세포의 윤곽부분을 관찰하기 위하여, 평평한 지지체 또는 마루 및 골 패턴을 가지는 지지체에 부착된 세포의 막 부분을 중심으로 관찰하였다. 세포막의 윤곽부분은 컴퓨터-보조된 형태계측(morphometry)(Rhinoceros 3D, Seattle, WA, USA)으로 분석하였다. MC3T3 세포에 대한 결과는 도 10a에 나타내고, Ad-MSC 세포에 대한 결과는 도 10b에 나타내었으며, PDLSC에 대한 결과는 도 10c에 나타내었다.
도 10에 나타낸 바와 같이, 평평한 지지체에서 길이(length)의 변화는 거의 없고, 너비(width)는 세포 유형에 따라 달라짐을 확인하였다. 그러나 본 발명의 마루 및 골 패턴을 가지는 지지체는 세포 길이가 세포 유형에 따라 최대치로 신장하였으나, 너비는 거의 변화하지 않음을 확인하였다. 즉, W/L비가 세포 길이의 신장과 함께 거의 비례하여 증가함을 확인하였다. 구체적으로 본 발명의 마루 및 골 패턴을 가지는 지지체는 다음과 같은 길이 신장이 나타났다 (mean±standard error of mean [SEM]): MC3T3의 경우, 평평한 지지체(flat)=105.1±5.48 μm, aict-3=80.9±3.19 μm, aict-2=82.0±5.54 μm, aict-1=86.2±5.31 μm, aict0=120.3±9.91 μm, AZ-2=97.7±5.65 μm, AZ-4=77.9±4.89 μm, AZ-6=86.7±3.70 μm, SU-4=77.1±4.87 μm, SU-6=97.7±4.63 μm, 및 SU-8=104.3±8.48 μm; Ad-MSC의 경우, 평평한 지지체=117.3±10.37 μm, aict-0=136.3±6.61 μm, AZ-2=297.2±24.11 μm, AZ-4=237.1±21.19 μm, 및 AZ-6=189.1±5.56 μm; 및 PLDSC의 경우, 평평한 지지체=117.3±9.57 μm, aict-0=142.1±13.92 μm, AZ-2=217.5±13.92 μm, AZ-4=277.8±14.30 μm, 및 AZ-6=673.3±18.39 μm.
이는 세포의 특성이 배양되는 지지체의 표면 형태(topography)에 반응하여 세포의 신장 정도가 변화함을 의미한다. 특히, 이는 특정 마루 및 골 패턴을 가지는 지지체에 의하여 조골세포로의 분화에 필요한 인장응력을 유도하여 세포의 신장을 유도하는 것임을 시사한다.
2-3. 정량적인 RT-PCR 수행을 통한 조골세포 분화 관련 유전자의 발현 분석
실험예 1-1에 개시한 바와 같이 MC3T3를 조골세포로 분화시키면서 0, 1, 5 및 10일이 경과했을 때, 세포를 회수하여 RNA를 추출하고(RNeasy Mini kit, Qiagen, Valencia, CA, USA) 이로부터 cDNA를 합성하였다. 합성된 cDNA는 qPCR PreMix (Bioneer, Daejeon, Republic of Korea)를 사용하여 Exicycler™ 96 Quantitative Real-Time PCR System (Bioneer)로 정량적인 PCR을 통해서 분석하였다.
또한 아래 표 2에 개시한 프라이머 세트를 이용하여 조골세포 분화와 관련된 유전자 Runx2 (runt-related transcription factor 2), ALPL (alkaline phosphatase gene), SP7 (osterix), BGLAP (osteocalcin), PIAS (protein inhibitor of activated STAT)의 발현을 분석하고 그 결과를 도 11a에 나타내었다.
유전자 비고 서열번호 염기서열
Runx2 정방향 1 5’-CGGCCCTCCCTGAACTCT-3’
역방향 2 5’-TGCCTGCCTGGGATCTGTA-3’
ALPL 정방향 3 5’-TTGTGCCAGAGAAAGAGAGAG-3’
역방향 4 5’-GTTTCAGGCATTTTTCAAG-3’
SP7 정방향 5 5’-CCCTTCTCAAGCACCAATGG-3’
역방향 6 5’-AGGGTGGGTAGTCATTTGCATAG-3’
BGLAP 정방향 7 5’-CTGACAAAGCCTTCATGTCCAA-3’
역방향 8 5’-GCGGGCGAGTCTGTTCACTA-3’
PIAS 정방향 9 5’-CCTTATTCCAGTTGATCCCCAGT-3’
역방향 10 5’-TATGACCCCTGTCTCACTCCT-3’
GAPDH 정방향 11 5’-CAAGGTCATCCATGACAACTTTG-3’
역방향 12 5’-GGCCATCCACAGTCTTCTGG-3’
또한, AA(100 μg/mL)을 첨가한 상태에서 MC3T3 세포를 평평한 지지체 또는 본 발명의 마루 및 골 패턴을 가지는 지지체(aict-0)에서 배양한 후, 1, 2 및 3일이 경과되었을 때 COL1A1의 발현량을 측정하였으며, 그 결과는 도 11b에 나타내었다. 상기 각 도에 나타낸 값은 대조군 유전자인 GAPDH의 발현으로 표준화한 값이며, 평평한 지지체에서의 실험은 대조군으로 수행하였다.
도 11a에 나타낸 바와 같이, RUNX2는 평평한 지지체에서와는 달리, 본 발명의 그루브 패턴을 가지는 지지체에서 분화 초기 단계일 때 발현량이 증가되다가 분화 말기로 갈수록 RUNX2의 발현량이 감소하는 것을 확인하였고, 분화가 충분히 이루어졌을 때 ALP, SP7 및 BGLAP의 발현량이 증가하는 것을 확인하였다.
또한, 도 11b에 나타낸 바와 같이, 조골세포 분화의 주요 인자인 유형 1 콜라겐을 qRT-PCR로 분석한 결과, AA를 첨가시키지 않아도 조골세포의 분화가 유도되나, AA를 첨가하는 경우 유형 1 콜라겐(COL1A1) 및 유형 3 콜라겐 mRNA의 발현량 증가를 통해 조골세포의 분화가 더욱 증가되는 것을 확인할 수 있다.
이는 본 발명의 마루 및 골 패턴을 가지는 지지체는 전사 단계에서의 발현을 조절하여 조골세포로의 분화를 촉진하는 것임을 나타낸다.
2-4. 면역 형광 염색을 통한 반응성 활성산소(ROS)에 의한 영향 확인
염증 부위에서 호중구에 의하여 반응성 활성산소의 생성이 촉진되고, 과도한 반응성 활성산소는 조골세포의 분화를 억제한다는 것이 잘 알려져 있는바, 본 발명의 패턴화된 지지체에서 조골세포의 전구세포 배양에 따른 활성산소의 수준 변화를 측정하였다.
우선, 실험예 1-1에서와 같이 MC3T3를 조골세포로 분화시키고, 평평한 지지체 또는 본 발명의 마루 및 골 패턴을 가지는 지지체(aic-0)에서 자란 MC3T3에, H2O2 (2 mM), TNF-α (10 ng/ml), IL-1β (10 ng/ml), LPS (1 μg/ml)를 3일간 처리한 마우스의 비장세포 배양액을 각각 처리하고 DCFDA (Life Technologies, Carlsbad, CA, USA) 염색법을 이용하여 활성산소의 발생 정도를 분석하였다. 구체적으로, 활성산소의 측정을 위해서 세포를 PBS로 세척 후 10 μM DCFDA로 37°C 에서 30분간 배양하고, DAPI(4',6-diamidino-2-phenylindole, Sigma-Aldrich)로 대조염색 하였다. 염색한 이미지는 형광현미경(Olympus)으로 획득하고, ProgRes　 Capture Pro 소프트웨어(Jenoptik, Jena, Germany)로 이미지를 분석하였다. 그 결과는 도 12에 나타내었다.
도 12에 나타낸 바와 같이, 대조군으로 실험을 수행한 평평한 지지체에서와 달리, 본 발명의 그루브 패턴을 가지는 지지체(aict-0)에서 활성산소의 발생이 억제됨을 확인하였다. 따라서 본 발명의 그루브 패턴에 의한 조골세포 형성이 염증조건에서도 잘 일어나는 것과 같은 맥락으로 염증환경에 의해서 생성되는 활성산소를 본 발명의 그루브 패턴을 가지는 지지체가 억제함으로 조골세포의 분화를 강화하는 것을 알 수 있다. 즉, 기계적인 스트레스에 의한 세포의 활성의 변화와 활성산소의 억제는 조골세포와 관련된 유전자의 발현과 함께 조골세포 분화를 유도하는 것임을 나타낸다.
실험예 3. 본 발명의 마루 및 골 패턴을 가지는 지지체에 의한 생체 내 뼈 재생 효과 확인
3-1. 실험동물 및 이의 사육
8주 된 수컷 Sprague Dawley 래트(220-240 g, Orient Bio Inc. (Seongnam, Republic of Korea))를 서울대학교 치과대학의 동물실 내 무균 환경 하에서 사육하였다. 모든 실험은 서울대학교 실험동물자원관리원의 동물실험윤리위원회의 승인(#SNU-160912-18-1) 하에서 수행하였다. 모든 표본은 에틸렌 옥사이드 가스를 사용하여 이식을 수행하기 전 멸균하였다.
3-2. 래트 두개골 결손 모델의 제조 및 본 발명의 Ti-코팅된 마루 및 골 패턴을 가지는 지지체의 이식
래트 두개골 결손 모델(rat calvarial defect model)을 이용하여 본 발명의 Ti-코팅된 마루 및 골 패턴을 가지는 지지체에 의한 뼈 재생능을 측정하였다.
구체적으로 상기 실험예 3-1에서 사육한 랫트를 졸라제팜(zolazepam) 및 틸레타민(tiletamine) 혼합물(30 mg/kg, Zoletil; Virbac Laboratories, Carros, France) 및 자일라진(xylazine; Rompun; Bayer, Leverkusen, Germany) 10 mg/kg을 복강 내 주사하여 마취시켰다. 이어서 머리뼈의 뒤쪽 표면의 털을 제거하고, 해당 부위를 소독하였다. 상기 부위에 5 cm의 중간크기의 절개를 만들었고, 전기드릴(TPHB-B8; Osung, Gumi, Republic of Korea)에 부착된 트레핀을 이용하여 8-mm 지름의 뼈 결손(defect)을 만들었다. 이 후 두개골 디스크를 제거하였다. 이식을 위하여 상기 실시예 1-2-1에서 제조한 Ti-코팅된 마루 및 골 패턴을 가지는 지지체(12 mm 지름)를 결손 부위에 위치시켰다. 이 후 상기 지지체를 골막으로 덮고, 봉합한 후에 고정시켰으며, 4-0 실크 봉합선을 이용하여 피부를 덮었다.
3-3. 고해상도 단층촬영(Micro-computed tomography)을 통한 본 발명의 Ti-코팅된 마루 및 골 패턴을 가지는 지지체에 의한 뼈 재생 효과 확인
상기 실험예 3-2에 개시한 방식으로 래트 두개골 결손 모델에 본 발명의 Ti-코팅된 마루 및 골 패턴을 가지는 지지체를 이식하고 12주가 경과한 후에, 상기 래트를 이산화탄소 가스를 이용하여 안락사 시켰다. 이 후 90 kV 및 88 μA의 X-레이 듀브로 마이크로CT 스캐너(Quantum GX In-vivo Micro-CT; PerkinElmer, Waltham, MA, USA)로 새로운 뼈 형성을 확인하고, 이를 시야범위 72 mm, 최초 복셀 크기 144 μm, 재건 서브볼륨 후 복셀 크기 9 μm로 설정하여 고해상도 스캔 모드를 가지는 스캐너로 이미지화하였으며, 상기 이미지화한 자료는 부드러운 조직을 제거하고 뼈의 밀도를 관찰할 수 있는 역치를 가지는 OsiriX Lite Image 소프트웨어(ver. 5.0.2; Pixmeo, Bernex, Switzerland)를 이용하여 재구성하였다. 그 결과는 도 13a에 나타내었다.
아울러, 본 발명의 Ti-코팅된 그루브 패턴을 이식한 후 래트 두개골 결손 모델 내의 두개골 결손에서 뼈 브릿지 및 유니온의 변화를 5개의 범주(0, 결손 내 뼈 형성 부존재; 1, 결손으로부터 퍼진 골편이 거의 존재하지 않음; 2, 결손 경계면에서만 뼈 브릿지 형성; 3, 결손에서 부분적으로 뼈 브릿지 형성; 4, 가장 긴 길이(8 mm) 내 결손의 전체 부분에서 뼈 브릿지 형성)로 구분하여 측정하였다. 그 결과는 도 13b에 나타내었다.
도 13에 나타낸 바와 같이, 대조군으로 사용된 평평한 지지체에 비하여 본 발명의 마루 및 골 패턴을 가지는 지지체, 특히 AZ-2 및 AZ-4에서 뼈 재생이 유의하게 발생함을 확인하였다. 이는 본 발명의 Ti-코팅된 마루 및 골 패턴을 가지는 지지체가 세포의 조골세포로의 분화를 유도하여, 궁극적으로는 우수한 뼈 재생 효과를 가짐을 나타낸다.
3-4. 조직학적 분석을 통한 본 발명의 Ti-코팅된 그루브 패턴을 가지는 지지체에 의한 뼈 재생 효과 확인
상기 실험예 3-3을 통하여 확인한 뼈 재생 효과를 보다 명확하게 확인하기 위하여 조직학적 분석을 수행하였다. 구체적으로, 상기 실험예 3-2에 개시한 방식으로 래트 두개골 결손 모델에 본 발명의 Ti-코팅된 마루 및 골 패턴을 가지는 지지체를 이식하고 12주가 경과한 후, 조직학적 분석을 위하여 희생시켰다. 그리고 나서, 조직 주변의 결손을 4일 동안 10%(v/v) 중성-완충된 포르말린으로 고정시켰고, 탈칼슘제(Leica Decalcifier; Leica Biosystems, Nussloch, Germany)로 칼슘을 제거시켰다. 이어서, 파라핀 왁스를 로스트랄 부분(rostral faces)에 밀어 넣었다. 상기 파라핀 왁스 샘플은 세로 방향으로 4 μm 두께의 절편이 되도록 절단한 후 자일렌으로 파라핀을 제거하였으며, 알코올로 수화하였다. 그리고 나서 이 기술분야에서 일반적으로 사용되는 방식으로 H&E 염색을 수행한 후, Aperio ImageScope(Leica Biosystems)를 이용하여 관찰하였다. 그 결과는 도 14에 나타내었다.
도 14에 나타낸 바와 같이, 평평한 지지체에 비하여 본 발명의 마루 및 골 패턴을 가지는 지지체, 특히 AZ-2 및 AZ-4에서 뼈 재생이 유의하게 발생함을 확인하였다. 아울러, 상기 실험 결과는 본 발명의 마루 및 골 패턴을 가지는 지지체를 이용하는 경우, 별도의 골분화 보조인자를 첨가하지 않아도 세포의 조골세포로의 분화가 유도됨을 나타낸다.
실험예 4: 통계분석
모든 데이터는 평균(mean)과 평균의 표준오차(standard error of mean, SEM)로 표기하였다. 데이터의 비교는 양측 Student t-검정(two-tailed Student's t-test) 또는 일원배치 분산분석(one-way ANOVA)을 이용하여 비교한 후, Dunnett's post hoc 검정을 수행하였으며, P 값이 0.05 미만인 경우에 대해서 통계적으로 의미 있다고 판단하였다. 통계적인 분석은 GraphPad Prism 소프트웨어 ver. 5.01 (GraphPad Software, La Jolla, CA)을 이용하여 수행하였다.
종합적으로, 본 발명의 배양지지체는 줄기세포 또는 전구세포의 종류에 따라 최적의 패턴을 가짐으로써 조골세포로의 분화능을 향상시킨다. 특히, 골분화를 유도하는 보충인자를 소량만 첨가하여도 우수한 조골세포 분화능을 나타낸다는 특징이 있다. 더욱이 세포 밀도 변화에 의해서 조골세포 분화능이 크게 영향을 받지 않고, 세포의 분화시 증가하는 염증인자들에 의해 형성되는 염증환경에 영향을 받지 않고 조골세포로의 분화 유도가 가능한 바, 조골세포로의 분화효율이 높다는 이점이 있다. 이에 따라 우수한 뼈 재생능을 가지는 본 발명의 배양지지체는 치아 임플란트, 인공관절 및 외상고정장치 등 다양한 의생명 및 의료 분야에 활용할 수 있다.
<110> Seoul National University R&DB Foundation KIM, Chang su <120> Culture scaffold for enhancing differentiation of osteoblast using pattern <130> 1-128P <150> KR 1020160087090 <151> 2016-07-08 <160> 12 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for Runx2 <400> 1 cggccctccc tgaactct 18 <210> 2 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for Runx2 <400> 2 tgcctgcctg ggatctgta 19 <210> 3 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for ALPL <400> 3 ttgtgccaga gaaagagaga g 21 <210> 4 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for ALPL <400> 4 gtttcaggca tttttcaag 19 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for SP7 <400> 5 cccttctcaa gcaccaatgg 20 <210> 6 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for SP7 <400> 6 agggtgggta gtcatttgca tag 23 <210> 7 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for BGLAP <400> 7 ctgacaaagc cttcatgtcc aa 22 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for BGLAP <400> 8 gcgggcgagt ctgttcacta 20 <210> 9 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for PIAS <400> 9 ccttattcca gttgatcccc agt 23 <210> 10 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for PIAS <400> 10 tatgacccct gtctcactcc t 21 <210> 11 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for GAPDH <400> 11 caaggtcatc catgacaact ttg 23 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for GAPDH <400> 12 ggccatccac agtcttctgg 20

Claims (14)

  1. 마루(ridge)와 골(groove)로 구성된 구조를 포함하는, 줄기세포로부터 조골세포로의 분화 촉진용 배양지지체로서,
    상기 줄기세포는 지방 조직 유래 줄기세포 또는 치주인대 유래 줄기세포이고,
    상기 줄기세포가 지방 조직 유래 줄기세포인 경우, 마루의 너비가 2 μm이고 골의 너비가 2~4 μm이며,
    상기 줄기세포가 치주인대 유래 줄기세포(periodontal ligament stem cell, PDLSC)인 경우, 마루의 너비가 2~2.83 μm이고 골의 너비가 2~6 μm인, 배양지지체.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. 삭제
  6. 제1항에 있어서,
    상기 배양지지체의 재질은 트리메틸로프로판 프로폭실레이트 트리아크릴레이트 (TPT; trimethylolpropane propoxylate triacrylate), 트리프로필렌글리콜 디아크릴레이트 (TPD, tripropylene glycol diacrylate), 트리에틸렌글리콜 디메타아크릴레이트 (TGD, triethylene glycol dimetacrylate), 트리아릴시아네이트 (TAC, triarylcyanate), 트리메틸올프로판 트리메타아크릴레이트 (TPTM, trimethylolpropane trimethacrylate), 폴리카프로락톤 (PCL; polycaprolactone), 콜라겐, 젤라틴, 히아루론산 (hyaluronic acid), 키토산, 라미닌, 케라틴, 알지네이트 (alginate), 피브로넥틴 (fibronectin), 폴리글리콜산 (PGA; polyglycolic acid), 폴리락트산(PLA; poly lactic acid), 폴리락트산-글리콜산공중합체 (PLGA), 폴리아미노산, 폴리안히드라이드 (polyanhydride), 폴리오르쏘에스테르 (polyorthoester), 폴리우레탄 (polyurethane), 티타늄(Ti), 알루미늄(Al), 바나듐(V), 티타늄 합금, 스테인레스, 코발트 합금 및 니켈-티타늄 합금으로 이루어진 군으로부터 1 이상 선택된 것을 특징으로 하는, 배양지지체.
  7. 제1항에 있어서, 상기 분화는 염증인자인 사이토카인 또는 내독소의 존재하에서 이루어지는 것을 특징으로 하는, 배양지지체.
  8. 삭제
  9. 제1항, 제6항 및 제7항 중 어느 한 항의 배양지지체를 포함하는 줄기세포로부터 조골세포로의 분화 촉진용 키트로서,
    상기 줄기세포는 지방 조직 유래 줄기세포 또는 치주인대 유래 줄기세포인, 키트.
  10. (a) 제1항, 제6항 및 제7항 중 어느 한 항의 배양지지체에 줄기세포를 접종하여 배양하는 단계로서,
    상기 줄기세포는 지방 조직 유래 줄기세포 또는 치주인대 유래 줄기세포이고,
    (b) 상기 배양된 줄기세포를 조골세포로 분화시키는 단계를 포함하는, 줄기세포로부터 조골세포로의 분화 방법.
  11. (a) 마루와 골로 구성된 주형을 제조하는 단계;
    (b) 상기 주형으로부터 음성 주형을 제조하는 단계; 및
    (c) 상기 음성 주형으로부터 배양지지체인 고분자를 제조하는 단계;를 포함하는, 줄기세포로부터 조골세포로의 분화 촉진용 배양지지체의 제조방법으로서,
    상기 줄기세포는 지방 조직 유래 줄기세포 또는 치주인대 유래 줄기세포이고,
    상기 줄기세포가 지방 조직 유래 줄기세포인 경우, 상기 (a) 단계에서 마루의 너비가 2 μm이고 골의 너비가 2~4 μm이고,
    상기 줄기세포가 치주인대 유래 줄기세포(periodontal ligament stem cell, PDLSC)인 경우, 상기 (a) 단계에서 마루의 너비가 2~2.83 μm이고 골의 너비가 2~6 μm인, 제조방법.
  12. 제11항에 있어서, 상기 제조방법은 (d) 상기 배양지지체에 자외선 오존(UVO)을 처리하는 단계;를 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 제조방법.
  13. 제11항에 있어서, 상기 제조방법은 (d) 상기 배양지지체에 티타늄(Ti), 알루미늄(Al), 바나듐(V), 티타늄 합금, 스테인레스, 코발트 합금 및 니켈-티타늄 합금으로 이루어진 군으로부터 선택된 1 이상의 물질을 처리하는 단계;를 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 제조방법.
  14. 제11항에 있어서, 상기 (c) 단계의 고분자는 광개시제를 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 제조방법.
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