KR101782673B1 - 나노구조를 포함하는 줄기세포 분화 촉진용 배양지지체 - Google Patents

나노구조를 포함하는 줄기세포 분화 촉진용 배양지지체 Download PDF

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Abstract

본 발명은 마루와 골로 구성된 나노구조를 형성하고, 줄기세포의 골분화를 촉진시킬 수 있는 효과를 나타내는 배양지지체, 상기 배양지지체를 포함하는 골분화 촉진용 키트 및 상기 배양지지체를 이용하여 줄기세포를 골세포로 분화시키는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 마루와 골로 구성된 나노구조가 형성된 배양지지체를 이용하면, 줄기세포의 골분화를 촉진시킬 수 있으므로, 줄기세포에서 분화된 골조직을 이용한 각종 골질환의 치료에 널리 활용될 수 있을 것이다.

Description

나노구조를 포함하는 줄기세포 분화 촉진용 배양지지체{Culture scaffold for enhancing differentiation of stem cell comprising nano-structure}
본 발명은 나노구조를 포함하는 줄기세포 분화 촉진용 배양지지체에 관한 것으로, 보다 구체적으로 본 발명은 마루와 골로 구성된 나노구조를 형성하고, 줄기세포의 골분화를 촉진시킬 수 있는 효과를 나타내는 배양지지체, 상기 배양지지체를 포함하는 골분화 촉진용 키트 및 상기 배양지지체를 이용하여 줄기세포를 골세포로 분화시키는 방법에 관한 것이다.
줄기세포는 다양한 종류의 세포로 분화할 수 있는 독특한 능력으로 특징지어지며, 조직공학 및 재생의약에 있어 많은 대안 및 기회를 제공한다. 따라서 생물학과 공학을 통합하는 측면에서 줄기세포 기능을 조절하거나 향상시키는 플랫폼을 개발하는 것이 중요하다. 줄기세포는 체내에서 용해성 및 비용해성 인자의 복합체 및 조절된 생화학적 화합물과 같이 유용하고 조직 특이적인 환경 안에 존재한다. 특히 줄기세포가 십 내지 수백 나노미터 범위의 크기 특징(직경 및 간격)을 갖는 피브릴라 콜라겐 및 엘라스틴과 같은 단백질 파이버의 복합체 및 성분이 정의된 나노구조로 이루어진 세포외 기질(ECM)에 높은 민감성을 보인다는 것은 널리 받아들여지고 있는 사실이다. 이러한 관찰결과와 함께 종래 체외 및 체내에서의 연구는 나노토포그래피칼 신호(nanotopographical cue)의 사용이 줄기세포 기능을 조절하는데 상당한 가능성을 가지고 있다는 것을 시사하고 있다.
뼈, 치아, 신경, 피부, 근육, 및 심장을 포함한 다양한 조직에서의 천연 ECM의 구조는 보통 나노미터 규모의 다양한 길이를 갖는 매우 방향 지향적이고 골이 있는 경향의 구조를 보인다. 예를 들어 동심원의 나노크기-두께의 실린더는 피질골의 기계적 특성을 향상시키지만, 피부층의 진피에 있는 정렬된 콜라겐 기질은 비등방성 기계적 특성을 보인다. 상기 초미세구조 관찰에서 영감을 얻어, 나노골 배양지지체를 개발하기 위한 나노공학기술의 활용은 고전적인 줄기세포학 및 재생의약 분야의 생물학자 및 기술자들에게 상당히 매력적인 것이 되어왔다. 종래 연구에 따라 조절된 극성과 그 후의 기계적 긴장은 세포의 확산, 이동, 증식, 세포분열, 조직 기능, 및 조직 형성과 더 중요하게는 줄기세포 분화와 같은 세포 행동에 있어서 중요한 것으로 규명되었다. 성형된 나노골은 핵 극성을 유도함으로써 hMSCs의 이동, 줄기세포특성, 및 뉴런생성을 향상시킬수 있고, 나노임프린티드 나노피트 정렬(nanoimprinted nanopit arrays)의 약간 무질서한 배열이 규칙적인 배열에 비하여 골 생성을 더 잘 유도할 수 있으며, 단방향으로 정렬된 배양지지체가 무작위로 정렬된 것에 비하여 뉴런을 보다 효과적으로 생성시키는데, 이는 증가된 줄기세포 극성 때문인 것으로 추정된다고 알려져 있으므로, 줄기세포 기반 조직 공학 및 재생 의약을 발전시킬 수 있는 주요한 수단으로서 나노토포그래피칼 신호를 활용하려는 연구가 활발히 진행되고 있다.
예를 들어, 미국특허공개 제2009-0248157호에는 근접한 격자점 사이의 거리는 10 nm 내지 10㎛ 가 되도록 개념적 대칭성을 이루는 격자를 구성하는 패턴화된 토포그래프적 특성을 갖는 배양지지체를 이용하여 세포분화를 촉진시키는 방법이 개시되어 있다. 그러나, 아직까지는 상기 토포그래프적 특성과 줄기세포의 분화간의 상관관계가 명확히 규명되지 않고 있는데, 이는 목적하는 형태의 토포그래프적 특성이 형성된 기판을 제작하는 것이 용이하지 않아, 토포그래프적 규칙과 줄기세포의 상관관계를 규명하는 데이터를 수집하는 것이 어렵기 때문인 것으로 알려져 있다. 따라서, 보다 규칙적인 토포그래프적 특성을 나타내는 기판을 이용하여 줄기세포의 분화와 관련된 연구를 수행하려는 연구가 활발히 진행되고 있으나, 아직까지는 별다른 성과가 보고되지 않고 있는 실정이다.
이러한 배경하에서, 본 발명자들은 토포그래프적 규칙과 줄기세포의 상관관계를 규명하고자 예의 연구노력한 결과, 마루와 골로 구성된 토포그래프적 특성을 나타내는 배양지지체를 구성함에 있어서, 마루의 너비에 비하여 다양한 비율의 골의 너비를 갖는 나노구조가 형성된 배양지지체를 이용하여, 상기 나노구조의 토포그래피적 특성이 줄기세포의 분화에 미치는 효과를 규명한 결과, 상기 배양지지체의 마루의 너비에 비하여 골의 너비의 비율이 증가된 나노구조가 형성된 배양지지체를 사용할 경우, 줄기세포의 골분화가 촉진됨을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 하나의 목적은 마루와 골로 구성된 나노구조를 형성하고, 줄기세포의 골분화를 촉진시킬 수 있는 효과를 나타내는 배양지지체를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 배양지지체를 포함하는 골분화 촉진용 키트를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 배양지지체를 이용하여 줄기세포를 골세포로 분화시키는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명자들은 토포그래프적 규칙과 줄기세포의 상관관계를 규명하고자, 생체내의 골조직을 전계 방사 스캐닝 전자 현미경으로 조사하여 골조직에 포함된 나노구조를 확인한 결과, 인간의 망상골 구조에서 마루와 골로 구성된 나노구조가 형성되어 있음을 확인하였다. 이에, 상기 나노구조가 골조직의 분화에 어떠한 영향을 미치는 지를 확인하고자, 상기 확인된 나노구조와 유사한 형태의 토포그래피적 특성을 나타내는 배양지지체를 인위적으로 합성하였는데, 상기 토포그래피적 특성의 규칙을 규명하기 위하여, 나노구조가 형성되지 않은 배양지지체(대조군)와 나노구조의 마루와 골의 너비의 비율이 각각 1:1, 1:3 및 1:5인 배양지지체를 각각 합성하고, 상기 합성된 배양지지체에 줄기세포를 배양한 다음, 상기 줄기세포에 미치는 나노구조가 형성된 배양지지체의 효과를 검증하였다. 그 결과, 대조군의 배양지지체에서 배양된 줄기세포에 비하여, 나노구조가 형성된 배양지지체에서 배양된 줄기세포는 줄기세포의 증식수준이 변화되지 않으면서도, 일정한 방향성과 세포형태의 유사성을 나타내고, 이러한 방향성과 세포형상의 유사성은 배양시간이 증가함에 따라 심화되었으며, 마루의 너비에 비하여 골의 너비의 비율이 증가할 수록 상기 방향성과 세포형상의 유사성이 더욱 심화됨을 확인하였다. 아울러, 상기 줄기세포의 골분화를 유도할 경우, 대조군의 배양지지체에서 배양된 줄기세포에 비하여, 나노구조가 형성된 배양지지체에서 배양된 줄기세포는 골분화가 촉진되었고, 이러한 골분화는 나노구조에 포함된 마루와 골의 너비에 따라 변화됨을 확인하였다.
따라서, 마루와 골로 구성된 나노구조가 형성된 배양지지체를 이용할 경우, 줄기세포의 골분화를 촉진시킬 수 있고, 이러한 골분화의 수준은 상기 나노구조에 포함된 마루와 골의 너비에 의존적이었으므로, 상기 나노구조가 형성된 배양지지체는 골분화의 촉진을 위하여 사용될 수 있음을 알 수 있었다.
상술한 목적을 달성하기 위하 일 실시양태로서, 본 발명은 나노단위(nm)의 높이(height)와 너비(width)를 갖는 마루(ridge)와 골(groove)로 구성된 나노구조를 포함하는, 줄기세포의 골분화 촉진용 배양지지체를 제공하는 것이다.
본 발명의 용어 "나노구조가 형성된 배양지지체"란, 평면에 나노단위(nm)의 높이(height)와 너비(width)를 갖는 마루(ridge)와 골(groove)이 형성된 배양지지체(culture scaffold)를 의미하는데, 상기 배양지지체는 나노기술에 의하여 평면에 나노단위의 높이와 너비를 갖는 마루를 일정간격으로 형성시키고, 이에 따라 상기 마루 사이에 골이 형성되는 방식으로 제조될 수도 있고, 상기 평면에 나노단위의 깊이와 너비를 갖는 골을 일정간격으로 형성시키고, 이에 따라 상기 골 사이에 마루가 형성되는 방식으로 제조될 수도 있다.
본 발명에 있어서, 상기 배양지지체는 줄기세포가 접종 및 배양될 수 있는 지지체로서 사용된다. 상기 배양지지체에 형성된 나노구조의 마루와 골의 너비는 1 내지 5000nm가 될 수 있고 마루와 골 간의 높이 역시 1 내지 5000 nm가 될 수 있다. 상기 마루와 골의 너비의 비율인 공간율(spacing ratio)이 서로 다르게 구성될 수 있고, 상기 공간율은 줄기세포의 접종 및 배양이 수행될 수 있는 한, 특별히 이에 제한되지 않으나, 바람직하게는 1:1 이상이 될 수 있고, 보다 바람직하게는 1:1 내지 1:5가 될 수 있으며, 가장 바람직하게는 1:3이 될 수 있다. 또한, 상기 배양지지체의 재질은 줄기세포의 접종 및 배양이 수행될 수 있는 한, 특별히 이에 제한되지 않으나, 바람직하게는 폴리비닐알코올 수지, 폴리에틸렌 수지, 폴리프로필렌 수지, 폴리에틸렌글리콜 수지, 폴리(L-락타이드-co-글리콜라이드) 수지, 폴리카프로락톤 수지, 폴리락트산(poly lactic acid, PLA) 수지, 폴리글리콜산(poly glycolic acid, PGA) 수지, 키토산, 젤라틴, 콜라겐 등이 단독으로 또는 복합적으로 사용할 수 있다.
본 발명의 용어 "줄기세포"란, 자기 복제 능력을 가지면서 두 개 이상의 새로운 세포로 분화하는 능력을 갖는 세포를 의미하며, 분화능에 따라 만능 줄기세포(totipotent stem cell), 전분화능 줄기세포(pluripotent stem cells), 다분화능 줄기세포(multpotent stem cells)로 분류할 수 있고, 줄기세포의 유래조직에 따라 성체줄기세포, 배아줄기세포 및 역분화줄기세포로 분류할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 줄기세포는 본 발명에서 제공하는 나노구조가 형성된 배양지지체에 접종되어 분화될 수 있는 한, 특별히 이에 제한되지 않으나, 바람직하게는 골수, 지방조직, 치아, 치아조직, 혈액, 제대혈, 간장, 피부, 위장관, 태반, 자궁, 태아로부터 유래한 줄기세포일 수 있고, 보다 바람직하게는 성체 줄기세포일 수 있으며, 가장 바람직하게는 인간유래 중간엽 줄기세포일 수 있다.
본 발명의 용어 "골분화(osteogenic differentiation)"란, 동물의 발달과정에서 나타나는, 골아세포 또는 골전구세포가 분화되어 골기질을 형성하고, 상기 형성된 골기질이 석회화되어 골을 형성하는 일련의 생리적 반응인 골형성(osteogenesis) 과정 중에서 골기질을 형성하는 단계를 의미할 수도 있고, 자연적으로 또는 인위적으로 동물의 줄기세포의 분화를 유도하여 골기질을 형성하는 과정을 의미할 수도 있다.
본 발명에 있어서, 상기 골분화는 동물에서 유래된 중간엽 줄기세포에 골분화 유도물질을 처리하여 골세포로의 분화를 유도하는 것으로 해석될 수 있는데, 이때 사용되는 골분화 유도물질은 본 발명의 나노구조가 형성된 배양지지체에서 접종 및 배양된 줄기세포를 골세포로 분화시킬 수 있는 한, 특별히 이에 제한되지 않으나, 바람직하게는 제대혈 혈청, β-글리세로포스페이트, 타우로우루소데옥시콜린산, 덱사메타손, 아스코르브산, L-알라닐-L-글루타민, 글리세롤 2-인산 등을 단독으로 또는 조합하여 사용할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 의하면, 인간의 골조직을 분리하고, 상기 분리된 골조직을 전계 방사 스캐닝 전자 현미경으로 관찰한 결과, 골조직에 마루와 골로 구성된 토포그래피적 특성을 나타내는 나노구조가 형성되어 있음을 확인하고(도 1a). 상기 나노구조와 유사한 나노구조가 형성된 배양지지체를 합성하였다. 이때, 나노구조에 포함된 토포그래피적 특성의 규칙을 규명하기 위하여 상기 나노구조에 포함된 마루와 골의 너비가 각각 1:1, 1:3 및 1:5가 되도록 하였다(도 1b 및 1c).
상술한 목적을 달성하기 위하 다른 실시양태로서, 본 발명은 상기 배양지지체를 포함하는 골분화 촉진용 조성물 또는 키트를 제공하는 것이다.
본 발명에서 제공하는 나노구조가 형성된 배양지지체는 줄기세포가 접종 및 배양되는 지지체로서 사용되어, 상기 배양된 줄기세포를 골세포로 분화시킬 때, 골세포로의 분화효율을 증진시킬 수 있으므로, 상기 나노구조가 형성된 배양지지체는 줄기세포의 골분화를 촉진시키는 조성물 또는 키트의 유효성분으로 사용될 수 있다. 이때, 상기 줄기세포 및 배양지지체는 상술한 바와 동일하다.
한가지 예로서, 본 발명에서 제공하는 골분화 촉진용 조성물은 1:1 내지 1:5의 공간율을 갖는 마루와 골을 포함하는 나노구조가 형성된 배양지지체를 포함할 수 있고, 상기 조성물에 줄기세포를 접종, 배양 및 분화시켜서, 상기 줄기세포를 골세포로 분화시킬 수 있다.
또 다른 예로서, 본 발명에서 제공하는 골분화 촉진용 키트는 1:1 내지 1:5의 공간율을 갖는 마루와 골을 포함하는 나노구조가 형성된 배양지지체를 포함할 수 있고, 상기 키트에 줄기세포를 접종, 배양 및 분화시켜서, 상기 줄기세포를 골세포로 분화시킬 수 있다. 이때, 본 발명에서 제공하는 골분화 촉진용 키트를 이용하여 보다 효과적으로 줄기세포를 골세포로 분화시킬 수 있도록, 상기 골분화 촉진용 키트는 상기 나노구조가 형성된 배양지지체 이외에 줄기세포의 분화에 적합한 한 종류 또는 그 이상의 용액 또는 장치 등의 다양한 구성요소를 추가로 포함할 수 있다.
상기 추가로 포함되는 구성요소는 골세포로의 분화에 영향을 미칠 수 있는 한 특별히 이에 제한되지 않으나, 바람직하게는 줄기세포 배양용 배지, 줄기세포 분화유도물질, 배양용기, 줄기세포 공동배양용 내피세포 등을 단독으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 특히, 내피세포의 경우, 줄기세포와 공동배양함으로써, 줄기세포의 골분화 효율을 향상시킬 수 있는데, 상기 내피세포는 줄기세포의 분화효율을 향상시킬 수 있는 한, 특별히 이에 제한되지 않으나, 바람직하게는, 혈관내피세포, 제대정맥내피세포 등이 될 수 있다.
상술한 목적을 달성하기 위하 또 다른 실시양태로서, 본 발명은 상기 배양지지체를 이용하여 줄기세포를 골세포로 분화시키는 방법을 제공하는 것이다.
상술한 바와 같이, 본 발명에서 제공하는 나노구조가 형성된 배양지지체는 줄기세포가 접종 및 배양되는 지지체로서 사용되어, 상기 배양된 줄기세포를 골세포로 분화시킬 때, 골세포로의 분화효율을 증진시킬 수 있으므로, 상기 나노구조가 형성된 배양지지체, 상기 배양지지체를 포함하는 조성물 또는 키트를 사용하여 줄기세포를 골세포로 분화시킬 수 있다.
따라서, 본 발명의 줄기세포를 골세포로 분화시키는 방법은 (a) 줄기세포를 상기 배양지지체에 접종하여 배양하는 단계; 및 (b) 상기 배양된 줄기세포를 골세포로 분화시키는 단계를 포함한다.
본 발명에서 제공하는 줄기세포를 골세포로 분화시키는 방법에 사용되는 줄기세포 및 배양지지체는 상술한 바와 동일하고, 상기 배양지지체에 접종되는 줄기세포의 수는 골세포로 분화될 수 있는 한 특별히 이에 제한되지 않으나, 바람직하게는 배양지지체 당 1 X 103 내지 1 X 1011 세포수가 될 수 있으며, 상기 줄기세포를 골세포로 분화시키는 방법은 상술한 골분화 유도물질을 줄기세포에 처리하여 수행될 수 있다.
아울러, 본 발명의 줄기세포를 골세포로 분화시키는 방법은 상기 (a) 단계에서 줄기세포 배양시, 줄기세포와 내피세포를 공동배양하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 의하면, 줄기세포의 일종인 인간의 중간엽 줄기세포(hMSC 세포)와 인간의 제대정맥 내피세포(HUVEC 세포)를 나노구조가 형성된 배양지지체에 접종 및 배양한 다음, 상기 각 세포의 증식수준이 배양지지체에 의해 변화되는지의 여부를 확인한 결과, 상기 배양지지체에 의하여 각 세포의 증식수준이 변화되지는 않음을 확인하였다(도 4). 그러나, 알리자린 레드 S 염색결과(도 5a 및 5b), 골분화 마커인 오스테오칼신(OCN)(도 5d)과 오스테오폰틴(OPN)(도 5e)의 발현수준 및 골분화 수준(도 5f)을 비교하면, 상기 배양지지체에 의하여 줄기세포의 분화수준이 변화됨을 확인하였다. 또한, 상기 hMSC 세포의 배양시, 나노구조가 형성된 배양지지체와, HUVEC 세포의 공동배양을 선택적으로 사용하여 배양 및 골분화를 유도하고, 이의 수준을 비교한 결과, 상기 hMSC 세포의 골분화에 있어서, 상기 나노구조가 형성된 배양지지체와, HUVEC 세포의 공동배양은 각각 상기 hMSC 세포의 골분화 수준을 향상시켰고, 상기 나노구조가 형성된 배양지지체와, HUVEC 세포의 공동배양을 함께 사용할 경우, 상기 hMSC 세포의 골분화 수준이 가장 높은 값을 나타냄을 확인하였다(도 6).
본 발명의 마루와 골로 구성된 나노구조가 형성된 배양지지체를 이용하면, 줄기세포의 골분화를 촉진시킬 수 있으므로, 줄기세포에서 분화된 골조직을 이용한 각종 골질환의 치료에 널리 활용될 수 있을 것이다.
도 1은 다양한 크기를 가진 골조직 유사 나노패턴 배양지지체의 합리적 설계 및 제작과정을 나타내는 개략도를 나타내는데, 도 1a는 체외 골 조직의 형상 및 SEM 사진으로서, 골조직에 정렬된 나노구조물이 형성되어 있음을 나타내고, 도 1b는 다양한 형태로 합성된 PUA(polyurethane acrylate) 배양지지체의 사진이며, 도 1c는 상기 PUA 배양지지체의 SEM 사진이고, 도 1d는 다양한 형태의 나노패턴이 구비된 PUA 배양지지체에서 hMSC 및 HUVEC를 배양할 경우에 예측되는 결과를 나타내는 개략도이며, 도 1e는 폴리카프로락톤 수지(PCL)로 전기방사하여 제조한 골조직 유사 나노패턴을 가지는 세포배양용 배양지지체의 표면을 나타내는 사진이다.
도 2는 나노구조가 형성된 배양지지체에서 배양된 hMSC 세포(검은색 화살표) 및 HUVEC 세포(흰색 화살표)의 형태 및 방향성을 나타내는 사진으로서, 도 2a는 다양한 나노구조가 형성된 배양지지체에서 배양된 hMSC 및 HUVEC 세포의 방향성을 나타내고, 도 2b는 다양한 나노구조가 형성된 배양지지체에서 배양된 hMSC 세포의 SEM 사진을 나타내며, 도 2c는 다양한 나노구조가 형성된 배양지지체에서 배양된 HUVEC 세포의 SEM 사진을 나타내고, 도 2d는 내부 대조군인 F-액틴에 대한 면역염색 사진을 나타낸다. 이때, (a)는 나노구조가 형성되지 않은 배양지지체를 나타내고, (b)는 공간율 1:1의 나노구조가 형성된 배양지지체를 나타내며, (c)는 공간율 1:3의 나노구조가 형성된 배양지지체를 나타내고, (d)는 공간율 1:5의 나노구조가 형성된 배양지지체를 나타내며, 상기 공간율은 나노구조의 마루너비와 골너비의 비율을 의미한다.
도 3은 나노구조가 형성된 배양지지체에서 배양된 hMSC 세포 및 HUVEC 세포의 배양시간 경과에 따른 세포 형태 및 방향성을 분석한 결과를 나타내는 사진 및 그래프로서, 도 3a는 나노구조가 형성된 배양지지체에서 6시간 또는 7일 동안 배양된 hMSC 세포 및 HUVEC 세포의 형광염색사진이고, 도 3b는 나노구조가 형성된 배양지지체에서 6시간 또는 7일 동안 배양된 hMSC 세포 및 HUVEC 세포의 CEF(cell elongation factor)를 비교한 그래프이며, 도 3c는 나노구조가 형성된 배양지지체에서 6시간 또는 7일 동안 배양된 hMSC 세포 및 HUVEC 세포의 방향성을 정량분석한 결과를 나타내는 그래프이고, 도 3d는 폴리카프로락톤 수지(PCL)로 구성된 나노구조가 형성된 배양지지체에서 6시간 동안 배양한 hMSC 세포의 접착 정도를 정량분석한 결과를 나타내는 그래프이며, 도 3e는 상기 배양지지체에 1일, 3일 및 7일 동안 배양시키며 증식 정도를 정량분석한 결과를 나타내는 그래프이다. 이때, a는 나노구조가 형성되지 않은 배양지지체(Flat)를 나타내고, b는 공간율 1:1의 나노구조가 형성된 배양지지체(550_550)를 나타내며, c는 공간율 1:3의 나노구조가 형성된 배양지지체(550_1,650)를 나타내고, d는 공간율 1:5의 나노구조가 형성된 배양지지체(550_2,750)를 나타내며, 상기 공간율은 나노구조의 마루너비와 골너비의 비율을 의미하고, Nanopattern은 나노구조가 형성된 배양지지체를 의미하며, TCPS는 폴리스티렌으로 제조된 배양지지체를 의미한다.
도 4는 나노구조가 형성된 배양지지체에서 배양된 hMSC 세포 및 HUVEC 세포의 배양시간 경과에 따른 증식수준을 분석한 결과를 나타내는 그래프 및 사진으로서, 도 4a는 세포배양 시작일(0 day), 3일 경과(3 days) 및 7일 경과(7 days) 시점에서 hMSC 세포 및 HUVEC 세포의 증식수준을 비교한 결과를 나타내는 그래프이고, 도 4b는 세포배양후 1일 및 7일이 경과된 시점에서 공간율 1:1의 나노구조가 형성된 배양지지체에서 배양된 세포의 밀도를 나타내는 FESEM 사진이다. 이때, a는 나노구조가 형성되지 않은 배양지지체(Flat)를 나타내고, b는 공간율 1:1의 나노구조가 형성된 배양지지체(550_550)를 나타내며, c는 공간율 1:3의 나노구조가 형성된 배양지지체(550_1,650)를 나타내고, d는 공간율 1:5의 나노구조가 형성된 배양지지체(550_2,750)를 나타내며, 상기 공간율은 나노구조의 마루너비와 골너비의 비율을 의미한다.
도 5는 나노구조가 형성된 배양지지체가 hMSC 세포의 골분화에 미치는 영향을 분석한 결과를 나타내는 사진 및 그래프로서, 도 5a는 나노구조가 형성된 배양지지체에서 배양된 hMSC 세포 및 HUVEC 세포를 대상으로 골분화를 유도한 다음, 알리자린 레드 S로 염색한 결과를 나타내는 사진이고, 도 5b는 나노구조가 형성된 배양지지체에서 배양된 hMSC 세포 및 HUVEC 세포를 대상으로 골분화를 유도한 다음, 알리자린 레드 S로 염색하여, 골분화의 수준을 측정한 결과를 나타내는 그래프이며, 도 5c는 골분화가 유도된 세포의 수를 나타내는 그래프이고, 도 5d는 나노구조가 형성된 배양지지체에서 배양된 hMSC 세포에서 골분화마커 단백질인 오스테오칼신(OCN)을 면역염색한 결과를 나타내는 사진이며, 도 5e는 나노구조가 형성된 배양지지체에서 배양된 hMSC 세포에서 골분화마커 단백질인 오스테오폰틴(OPN)의 수준을 웨스턴 블럿 분석을 통해 측정한 결과를 나타내는 사진이고, 도 5f는 나노구조가 형성된 배양지지체에서, hMSC 세포를 단독배양(1 X 104 세포수) 또는 hMSC 세포(0.5 X 104 세포수)와 HUVEC 세포(0.5 X 104 세포수)를 공동배양한 후, 골분화를 유도하고, 골분화의 수준을 비교한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 6은 hMSC 세포의 골분화 수준에 미치는 HUVEC 세포와의 공동배양 및 나노구조가 형성된 배양지지체의 효과를 분석한 결과를 나타내는 사진 및 그래프로서 도 6a는 나노구조가 형성되지 않은 배양지지체(flat) 또는 나노구조가 형성된 배양지지체(nanopatterned)에서 hMSC 세포를 단독배양(monoculture) 또는 공동배양(co-culture)하여 골분화를 유도하고 알리자린 레드 S로 염색한 결과를 나타내는 사진이고, 도 6b는 상기 염색된 알리자린 레드 S의 수준을 측정한 결과를 나타내는 그래프이다.
이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 골조직에 존재하는 나노구조의 확인
뼈를 포함하는 인간 조직에는 조직 특이적 기능을 위하여 자연적으로 잘 조직된 나노규모 토포그래피가 형성되어 있다는 것이 공지되어 있으므로, 이를 확인하고자 하였다.
구체적으로, 아주대학교 의과대학(수원, 대한민국)의 심의 위원회의 승인을 얻어 만성 중이염 수술 중 환자로부터 골 조직을 분리하였다. 상기 분리된 골조직에 고정액(2% 글루타르알데하이드, 0.1 M 소듐 카코딜레이트 및 3 mM 칼슘 클로라이드, pH 7.4)을 가하고 4℃에서 하룻밤동안 침지시켜서 고정하였다. 상기 고정된 골조직을 PBS로 3회 세척하고, 1% 오스뮴 테트록사이드를 사용하여 관류시킨 다음, 조직 회전기에서 30분동안 방치하고, 다시 PBS로 3회 세척하였다. 그런 다음, 상기 골조직에 50, 70, 90, 95 및 100%의 아세톤을 순차적으로 가하여 탈수시키고, 탈수된 조직에 HMDS(hexamethyldisilazane)을 가한 다음, 공기 건조시켰다. 상기 건조된 시료를 스터브에 위치시켜서 금으로 스푸터-코팅을 수행한 다음, 이를 전계 방사 스캐닝 전자 현미경(FESEM; JEOL, JSM-5410LV, 일본)으로 관찰하였다(도 1).
도 1은 다양한 크기를 가진 골조직 유사 나노패턴 배양지지체의 합리적 설계 및 제작과정을 나타내는 개략도를 나타내는데, 도 1a는 체외 골 조직의 형상 및 SEM 사진으로서, 골조직에 정렬된 나노구조물이 형성되어 있음을 나타내고, 도 1b는 다양한 형태로 합성된 PUA(polyurethane acrylate) 배양지지체의 사진이며, 도 1c는 상기 PUA 배양지지체의 SEM 사진이고, 도 1d는 다양한 형태의 나노패턴이 구비된 PUA 배양지지체에서 hMSC 및 HUVEC를 배양할 경우에 예측되는 결과를 나타내는 개략도이다.
상기 도 1a에서 보듯이, 체외 인간 망상골 조직의 초미세구조 분석에서 상당히 정렬되어있는 나노골 형태를 확인할 수 있었는데(도 1a), 이는 인간 뼈 내부에 정렬된 나노구조가 골 재생에 있어서 hMSCs 및 내피세포의 구조와 기능을 이끄는 특이적 토포그래피칼 신호를 제공할 수 있다는 것을 시사하는 것으로 분석되었다.
실시예 2: 나노구조가 형성된 배양지지체의 합성
골조직의 나노구조 및 내피 세포가 골 재생에 있어서 줄기세포의 기능, 특히 골형성을 향상 시키기 위한 더욱 생리적으로 밀접한 줄기세포 환경을 제공할 것이라는 가정하고, 자연적인 인간 골 조직에 포함된 나노구조에 착안하여 UV-지원형 CFL 및 전기방사법을 이용하여 골조직 유사 나노패턴을 가지는 세포배양 배양지지체를 제작하였다.
구체적으로, 550nm 너비를 가진 나노마루와, 550, 1650 또는 2750nm의 너비를 가진 나노골(각각 공간률: 1:1, 1:3 또는 1:5)을 포함하는 배양지지체를, 미리 제작된 25 X 25㎟ 이상의 면적을 갖는 실리콘 주형으로부터 제작하였다. 표준 포토리소그라피를 이용하여 실리콘 주형을 제작하고 드라이 에칭하였다. 복제단계에서, UV-경화성 PUA 전구체(미누타 테크., 대한민국)를 주형에 떨어트리고 뒤판으로서 100mm-두께의 폴리에틸렌 테르에프탈레이트(PET) 필름과 접촉시켰다. 상당량의 UV를 수십초 동안 조사한 후, PET 필름에서 음성 PUA 복제물이 형성되었다. 그 후 주형으로서 복제된 PUA 패턴을 이용하여 깨끗한 커버슬립에서 동일한 복제과정을 수행하였다. 평평한 표면 및 패턴 표면을 동일한 실험조건을 유지하기 위해 같은 커버슬립에서 생성하였다. 제작된 샘플은 금으로 코팅하였고 2 kV의 가속전압에서 FESEM(JEOL, JSM-5410LV)으로 촬영하였다(도 1b 및 1c). 이때, 세포의 부착성을 향상시키기 위하여 상기 제작되 배양지지체의 표면에 젤라틴을 코팅하였고, 상기 코팅된 배양지지체의 표면에서 hMSCs 및 HUVECs를 배양할 경우, 나노구조의 패턴에 따라 서로 상이한 결과를 얻을 수 있을 것으로 예상하였다(도 1d).
끝으로, 전기방사법을 이용하여 폴리카프로락톤 수지 (PCL)로 구성된 골조직 유사 나노패턴을 가지는 세포배양용 배양지지체를 제작하였고, 상기 제작된 세포배양용 배양지지체는 나노구조의 패턴에 골 재생에 있어서 줄기세포의 기능을 높일 수 있을 것으로 예상하였다(도 1e).
실시예 3: 나노구조가 형성된 배양지지체를 이용한 줄기세포배양 및 특성분석
줄기세포의 일종인 인간의 중간엽 줄기세포(hMSC 세포)와 인간의 제대정맥 내피세포(HUVEC 세포)를 대상으로 나노구조가 형성된 배양지지체의 효과를 검증하고자 하였다.
실시예 3-1: hMSC 세포의 분리 및 배양
지방 조직은 아주대학교 의과대학(수원, 대한민국)에서 귀 수술을 받는 환자에게서 충분한 설명과 동의 하에 분리되었다. 실험 프로토콜은 동 대학의 심의 위원회로부터 승인 받았다. 조직을 PBS로 세척하고 100 Unit/ mL 콜라게나제 타입 I(시그마 알드리치, St. 루이스, MO, 미국) 이 첨가된 저글루코스 덜베코의 수정된 이글스 배지(DMEM; 깁코-BRL, 그랜드 아일랜드, NY, 미국)로 소화시켰으며, 지방 조직을 분해하기 위해 8시간 동안 배양시켰다. 배양지지체 부분을 원심분리로 수거하였고, 그 후 세포여과기(100mm 크기)에 통과시켜 큰 세포 덩어리 및 조각을 제거하였다. 지방유래 hMSCs의 세포 배양 및 증식을 위하여, 세포를 37 ℃, 5% CO2 공기조건에서 10% 태아 송아지 혈청(FBS) 및 1% 페니실린-스트렙토마이신(깁코, 밀란, 이탈리아)이 함유된 저글루코스 DMEM으로 배양하였다. 본 연구에서는 모든 세포를 3 또는 4 계대에 사용하였다.
실시예 3-2: HUVEC 세포의 배양
HUVECs는 론자(워커스빌, 미국)에서 구매하였으며 37 ℃, 5% CO2 공기조건에서 2% FBS, 0.4% 섬유아세포 성장 인자, 0.04% 하이드로코티손, 0.1% 인슐린 유사 성장 인자, 0.1% 아스코빅 산, 0.1% 헤파린, 및 0.1% 젠타마이신(깁코, 밀란, 이탈리아)이 함유된 내피 성장 배지로 배양하였다. 본 연구에서는 모든 세포를 3 또는 4 계대에 사용하였다.
실시예 3-3: 나노구조가 형성된 배양지지체를 이용한 세포배양
상기 실시예 3-1 및 3-2에서 배양된 hMSC 세포 및 HUVEC 세포를 상기 실시예 2에서 제작된 다양한 배양지지체에 세포수 기준 1:1의 비율로 접종하고, 일반 배지(10% FBS 및 1% 항생제가 함유된 DMEM)를 사용하여 배양하였다. 이때, 상기 배지는 일주일에 2회 또는 3회 교체하였다.
실시예 3-4: 나노구조가 형성된 배양지지체에서 배양된 세포의 형태 및 방향성 분석
상기 실시예 3-3의 배양을 14시간 동안 수행한 다음, 배양이 종료된 후, 세포 종류를 시각화하기 위하여, hMSC 및 HUVEC를 각각 친유성 형광 염색제인 비브란트-DiO 및 DiD(인비트로젠, 미국)로 염색하였다. 이어, 50개 내지 100개의 세포를 대상으로 형광 현미경(짜이스, 독일)으로 세포의 사진을 촬영하고, 주문 제작한 MATLAB 스크립트를 이용하여 이들의 형태 및 방향성을 분석하였다(도 2a 내지 2c).
한편, 상기 hMSC 및 HUVEC 세포에 포함된 F-액틴을 면역형광 염색하고, 이의 사진을 촬용하여, 세포의 방향성을 분석하였다(도 2d). 이때, 상기 면역형광 염색은 상기 각 세포에 4% 파라포름알데하이드 용액을 가하고 20분 동안 고정시킨 다음, 0.2% 트리톤 X- 100을 가하여 15분 동안 투과화 시켰으며, 항-F-액틴 항체와 FITC-결합된 염소 항-마우스 이차 항체를 사용하여 반응시킴으로써 수행되었다. 상기 염색된 세포를 형광 현미경을 이용하여 촬영하였다.
도 2는 나노구조가 형성된 배양지지체에서 배양된 hMSC 세포(검은색 화살표) 및 HUVEC 세포(흰색 화살표)의 형태 및 방향성을 나타내는 사진으로서, 도 2a는 다양한 나노구조가 형성된 배양지지체에서 배양된 hMSC 및 HUVEC 세포의 방향성을 나타내고, 도 2b는 다양한 나노구조가 형성된 배양지지체에서 배양된 hMSC 세포의 SEM 사진을 나타내며, 도 2c는 다양한 나노구조가 형성된 배양지지체에서 배양된 HUVEC 세포의 SEM 사진을 나타내고, 도 2d는 내부 대조군인 F-액틴에 대한 면역염색 사진을 나타낸다. 이때, (a)는 나노구조가 형성되지 않은 배양지지체를 나타내고, (b)는 공간율 1:1의 나노구조가 형성된 배양지지체를 나타내며, (c)는 공간율 1:3의 나노구조가 형성된 배양지지체를 나타내고, (d)는 공간율 1:5의 나노구조가 형성된 배양지지체를 나타내며, 상기 공간율은 나노구조의 마루너비와 골너비의 비율을 의미한다.
상기 도 2a에서 보듯이, hMSC 세포 및 HUVEC 세포 모두 나노구조가 형성되지 않은 배양지지체에서는 정렬되지 않은 상태로 배양되었으나, 나노구조가 형성된 배양지지체에서는 정렬된 상태로 배양됨을 확인하였다.
또한, 도 2b 및 2c에서 보듯이, hMSC 세포 및 HUVEC 세포 모두 나노구조가 형성되지 않은 배양지지체에서는 무작위적인 형태를 나타내었으나, 나노구조가 형성된 배양지지체에서는 나노구조의 골을 따라 길게 늘어난 형태를 나타냄을 확인하였다.
아울러, 도 2d에서 보듯이 전기방사로 제작한 나노구조 배양지지체에서도 나노구조의 골을 따라 hMSC 세포가 길게 늘어난 형태를 나타냄을 확인 하였다.
끝으로, 세포골격을 형성하는 F-액틴의 면역형광 염색결과, 이러한 방향성 및 형태는 세포내 세포골격의 변화에 의한 것임을 확인하였다.
따라서, 나노구조가 형성된 배양지지체는 세포내의 세포골격을 변화시켜서, 세포의 형태 및 방향성을 조절할 수 있음을 알 수 있었다.
실시예 3-5: 나노구조가 형성된 배양지지체에서 배양된 세포의 배양시간에 따른 형태 및 방향성 분석
상기 실시예 3-1 및 3-2에서 배양된 hMSC 세포 및 HUVEC 세포를 대상으로 친유성 형광 염색을 수행하여, hMSC 세포는 빨간색으로 HUVEC 세포는 녹색으로 염색한 다음, 상기 염색된 각 세포를 상기 실시예 2에서 제작된 다양한 배양지지체에 세포수 기준 1:1의 비율로 접종하고, 일반 배지(10% FBS 및 1% 항생제가 함유된 DMEM) 또는 골형성 분화 배지(100 nM 덱사메타손, 50 mM 아스코빅 산, 및 10mM 글리세롤 2-인산이 함유된 일반 배지)를 사용하여 6시간 및 7일 동안 배양하였다(도 3a). 상기 배양이 완료된 후, 배양된 세포를 PBS로 세척하고, 상기 배양지지체로부터 세포를 분리하였으며, 분리된 세포의 CEF(cell elongation factor)를 측정하였다(도 3b). 이때, 상기 CEF는 세포의 단축의 길이와 장축의 길이를 측정하고, 상기 측정된 단축의 길이에 대한 장축의 길이의 비율로 산출하였다. 끝으로, 상기 6시간 및 7일 동안 배양된 세포를 대상으로 방향성을 정량분석하였다(도 3c). 이때, 각도 막대는 세포체의 극성화 된 각도에 대응하는 연관 개연성을 나타낸다.
도 3은 나노구조가 형성된 배양지지체에서 배양된 hMSC 세포 및 HUVEC 세포의 배양시간 경과에 따른 세포 형태 및 방향성을 분석한 결과를 나타내는 사진 및 그래프로서, 도 3a는 나노구조가 형성된 배양지지체에서 6시간 또는 7일 동안 배양된 hMSC 세포 및 HUVEC 세포의 형광염색사진이고, 도 3b는 나노구조가 형성된 배양지지체에서 6시간 또는 7일 동안 배양된 hMSC 세포 및 HUVEC 세포의 CEF(cell elongation factor)를 비교한 그래프이며, 도 3c는 나노구조가 형성된 배양지지체에서 6시간 또는 7일 동안 배양된 hMSC 세포 및 HUVEC 세포의 방향성을 정량분석한 결과를 나타내는 그래프이고, 도 3d는 폴리카프로락톤 수지(PCL)로 구성된 나노구조가 형성된 배양지지체에서 6시간 동안 배양한 hMSC 세포의 접착 정도를 정량분석한 결과를 나타내는 그래프이며, 도 3e는 상기 배양지지체에 1일, 3일 및 7일 동안 배양시키며 증식 정도를 정량분석한 결과를 나타내는 그래프이다. 이때, a는 나노구조가 형성되지 않은 배양지지체(Flat)를 나타내고, b는 공간율 1:1의 나노구조가 형성된 배양지지체(550_550)를 나타내며, c는 공간율 1:3의 나노구조가 형성된 배양지지체(550_1,650)를 나타내고, d는 공간율 1:5의 나노구조가 형성된 배양지지체(550_2,750)를 나타내며, 상기 공간율은 나노구조의 마루너비와 골너비의 비율을 의미하고, Nanopattern은 나노구조가 형성된 배양지지체를 의미하며, TCPS는 폴리스티렌으로 제조된 배양지지체를 의미한다.
먼저, 도 3a에서 보듯이, 나노구조가 형성된 배양지지체에서 배양된 세포는 낮은 세포밀도로 인하여 배양초기에는 공간적으로 상호 격리되어 있으나, 배양시간이 경과함에 따라, 세포가 방향성을 갖고 증식되어 두종류의 세포가 접촉될 수 있음(노란색 형광, 화살표)을 확인하였다.
또한, 도 3b에서 보듯이, 나노구조가 형성된 배양지지체에서 배양된 세포는 배양시간이 경과함에 따라 세포의 길이가 증가하고, 이러한 세포길이의 증가는 나노구조의 공간율에 비례함을 확인하였다. 즉, 나노구조의 공간율이 1:1에서 1:5로 증가하면, 이에따라 배양된 hMSC 세포 및 HUVEC 세포의 CEF가 증가하였다.
다음으로, 도 3c에서 보듯이, 나노구조가 형성된 배양지지체에서 배양된 세포는 나노구조의 공간율 및 배양시간에 비례하여 방향성이 증가함을 확인하였다.
아울러, 도 3d에서 보듯이, 폴리카프로락톤 수지(PCL)로 구성된 나노구조가 형성된 배양지지체(Nanopattern) 또는 통상적인 배양용기의 재질인 폴리스티렌으로 구성된 배양지지체(TCPS)에 hMSC 세포를 접종하여 6시간 동안 배양하고, 배양된 세포의 부착정도를 정량분석한 결과, 본 발명의 나노구조가 형성된 배양지지체에서 배양된 세포의 부착수준은 현재 세포 부착수준이 가장 우수하다고 알려진 TCPS와 버금가는 수준을 나타냄을 확인하였다.
끝으로, 도 3e에서 보듯이, 상기 폴리카프로락톤 수지(PCL)로 구성된 나노구조가 형성된 배양지지체(Nanopattern) 또는 통상적인 배양용기의 재질인 폴리스티렌으로 구성된 배양지지체(TCPS)에 hMSC 세포를 접종하고, 1, 3 및 7일 동안 배양한 후, 세포증식수준을 비교한 결과, 세포증식 수준 역시 본 발명의 나노구조가 형성된 배양지지체에서 배양된 세포가 TCPS에서 배양된 세포에 버금가는 수준을 나타냄을 확인하였다.
실시예 4: 골형성에 미치는 나노구조가 형성된 배양지지체의 효과
상기 hMSC 세포 및 HUVEC 세포의 증식은 골재생에 있어 중요한 역할을 수행하므로, 본 발명에서 제공하는 나노구조가 형성된 배양지지체가 골형성에 미치는 효과를 확인하고자 하였다.
실시예 4-1: hMSC 세포 및 HUVEC 세포의 증식에 미치는 나노구조가 형성된 배양지지체의 효과
3일 또는 7일간 배양하는 것을 제외하고는, 상기 실시예 3-3의 방법과 동일한 방법을 수행하여, 나노구조가 형성된 배양지지체에서 hMSC 세포 및 HUVEC 세포를 배양하고, 상기 배양된 세포를 회수한 다음, OD 450nm에서 흡광도를 측정하여 배양시간의 경과에 따른 각 줄기세포의 증식수준을 분석하였다(도 4a).
다음으로, 상기 배양된 세포를 사용하는 것을 제외하고는, 상기 실시예 1의 방법과 동일한 방법을 수행하여, 증식된 줄기세포의 분포 및 형태를 분석하였다(도 4b).
도 4는 나노구조가 형성된 배양지지체에서 배양된 hMSC 세포 및 HUVEC 세포의 배양시간 경과에 따른 증식수준을 분석한 결과를 나타내는 그래프 및 사진으로서, 도 4a는 세포배양 시작일(0 day), 3일 경과(3 days) 및 7일 경과(7 days) 시점에서 hMSC 세포 및 HUVEC 세포의 증식수준을 비교한 결과를 나타내는 그래프이고, 도 4b는 세포배양후 1일 및 7일이 경과된 시점에서 공간율 1:1의 나노구조가 형성된 배양지지체에서 배양된 세포의 밀도를 나타내는 FESEM 사진이다. 이때, a는 나노구조가 형성되지 않은 배양지지체(Flat)를 나타내고, b는 공간율 1:1의 나노구조가 형성된 배양지지체(550_550)를 나타내며, c는 공간율 1:3의 나노구조가 형성된 배양지지체(550_1,650)를 나타내고, d는 공간율 1:5의 나노구조가 형성된 배양지지체(550_2,750)를 나타내며, 상기 공간율은 나노구조의 마루너비와 골너비의 비율을 의미한다.
도 4a 및 4b에서 보듯이, 나노구조가 형성되지 않은 배양지지체 또는 나노구조가 형성된 배양지지체에서 배양된 줄기세포는 배양시간이 경과함에 따라 동일한 수준으로 각 줄기세포의 수준이 향상되었고, 배양지지체의 차이에 따라 증식수준이 변화되지는 않음을 확인하였다.
실시예 4-2: 골형성에 미치는 나노구조가 형성된 배양지지체의 효과
골형성 분화 배지(100 nM 덱사메타손, 50 mM 아스코빅 산, 및 10mM 글리세롤 2-인산이 함유된 일반 배지)를 사용하여 21일간 배양하는 것을 제외하고는, 상기 실시예 3-3의 방법과 동일한 방법을 수행하여, 나노구조가 형성된 배양지지체에서 hMSC 세포 및 HUVEC 세포를 배양하고 이들의 골분화를 유도하였다. 상기 배양된 hMSC 세포의 골화수준을 비교하기 위하여, 상기 세포를 알리자린 레드 S로 염색하고(도 5a), 염색된 세포에 세틸피리디늄 클로라이드(cetylpyridinium chloride)를 가하여 염색된 조직으로부터 염료를 추출하고, 추출된 염료의 흡광도를 540 nm에서 측정함으로써, 알리자린 레드 S로 염색된 세포의 골화수준을 산출하였다(도 5b).
또한, 상기 분화된 세포의 수를 측정하고 비교하고(도 5c), 분화된 각 세포에서 발현된 골분화마커 단백질인 오스테오칼신(OCN)을 녹색형광으로 면역염색하여 각 배양지지체별로 비교하였으며(도 5d), 7일 또는 14일 동안 분화된 각 세포에서 발현된 골분화마커 단백질인 오스테오폰틴(OPN)의 수준을 웨스턴 블럿 분석을 통해 측정하고 비교하였으며(도 5e), 나노구조가 형성된 배양지지체에 hMSC 세포를 단독으로(1 X 104 세포수) 또는 hMSC 세포(0.5 X 104 세포수)와 HUVEC 세포(0.5 X 104 세포수)를 공동으로 21일 동안 배양하고 골분화를 유도한 다음, 골분화의 수준을 비교하였다(도 5f).
도 5는 나노구조가 형성된 배양지지체가 hMSC 세포의 골분화에 미치는 영향을 분석한 결과를 나타내는 사진 및 그래프로서, 도 5a는 나노구조가 형성된 배양지지체에서 배양된 hMSC 세포 및 HUVEC 세포를 대상으로 골분화를 유도한 다음, 알리자린 레드 S로 염색한 결과를 나타내는 사진이고, 도 5b는 나노구조가 형성된 배양지지체에서 배양된 hMSC 세포 및 HUVEC 세포를 대상으로 골분화를 유도한 다음, 알리자린 레드 S로 염색하여, 골분화의 수준을 측정한 결과를 나타내는 그래프이며, 도 5c는 골분화가 유도된 세포의 수를 나타내는 그래프이고, 도 5d는 나노구조가 형성된 배양지지체에서 배양된 hMSC 세포에서 골분화마커 단백질인 오스테오칼신(OCN)을 면역염색한 결과를 나타내는 사진이며, 도 5e는 나노구조가 형성된 배양지지체에서 배양된 hMSC 세포에서 골분화마커 단백질인 오스테오폰틴(OPN)의 수준을 웨스턴 블럿 분석을 통해 측정한 결과를 나타내는 사진이고, 도 5f는 나노구조가 형성된 배양지지체에서, hMSC 세포를 단독배양(1 X 104 세포수) 또는 hMSC 세포(0.5 X 104 세포수)와 HUVEC 세포(0.5 X 104 세포수)를 공동배양한 후, 골분화를 유도하고, 골분화의 수준을 비교한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 5a에서 보듯이, 나노구조가 형성되지 않은 배양지지체에서 분화유도된 hMSC 세포 보다는 나노구조가 형성된 배양지지체에서 분화유도된 hMSC 세포가 알리자린 레드 S로 더 많이 염색됨을 확인하였다. 상기 알리자린 레스 S는 세포내 칼슘과 결합하여 발색되므로, 나노구조가 형성된 배양지지체에서 배양 및 분화유도된 hMSC 세포는 상대적으로 높은 칼슘함량을 나타낸다고 분석되었다. 따라서, 상기 나노구조가 형성된 배양지지체는 hMSC 세포의 골분화를 촉진시킬 수 있음을 알 수 있었다.
도 5b에서 보듯이, 나노구조가 형성된 배양지지체에 따른, 골분화가 유도된 hMSC 세포에 염색된 알리자린 레스 S의 수준을 비교한 결과, 나노구조가 형성되지 않은 배양지지체에서 배양 및 골분화가 유도된 세포는 나노구조가 형성된 배양지지체에서 배양 및 골분화가 유도된 세포 보다도 염색된 알리자린 레스 S의 수준이 낮음을 확인하였다. 따라서, 상기 나노구조가 형성된 배양지지체는 hMSC 세포의 골분화를 촉진시킬 수 있음을 다시한번 알 수 있었다.
도 5c에서 보듯이, 나노구조가 형성된 배양지지체에 따른 골분화가 유도된 hMSC 세포의 수준을 비교한 결과, 나노구조가 형성된 배양지지체에서 배양 및 골분화가 유도된 세포는 나노구조가 형성되지 않은 배양지지체에서 배양 및 골분화가 유도된 세포에 비하여 동등하거나 다소 낮은 수준을 나타내었으나, 통계적으로 유의하지는 않았다.
도 5d에서 보듯이, 나노구조가 형성된 배양지지체에서 골분화가 유도된 hMSC 세포에서 발현된 골분화마커 단백질인 오스테오칼신(OCN)의 수준은 나노구조가 형성되지 않은 배양지지체의 것 보다 더욱 높은 값을 나타내었고, 상기 OCN의 수준은 공간율 1:3의 나노구조가 형성된 배양지지체까지는 증가하였으나, 공간율 1:5의 나노구조가 형성된 배양지지체에서는 오히려 감소함을 확인하였다. 상기 결과는 나노구조가 형성된 배양지지체를 사용할 경우 골분화를 촉진시킬 수 있음을 암시하는 동시에 나노구조가 형성된 배양지지체의 공간율이 hMSC 세포의 분화에 영향을 미칠 수 있다는 점을 시사하는 것으로 분석되었다.
도 5e에서 보듯이, 골분화시간에 상관없이 나노구조가 형성된 배양지지체에서 골분화가 유도된 hMSC 세포에서 발현된 골분화마커 단백질인 오스테오폰틴(OPN)의 수준은 나노구조가 형성되지 않은 배양지지체의 것보다 더욱 높은 값을 나타냄을 확인하였다. 따라서, 나노구조가 형성된 배양지지체를 사용할 경우 골분화를 촉진시킬 수 있음을 다시 한번 알 수 있었다.
도 5f에서 보듯이, 나노구조가 형성된 배양지지체에서 배양하더라도, hMSC 세포를 단독으로 배양하는 것 보다는, hMSC 세포와 HUVEC 세포를 공동으로 배양할 경웅, 골분화의 수준이 증가됨을 확인하였다. 특히, 상기 공동배양시에는 단독배양시 보다도 hMSC 세포의 수가 50%에 불과하였으나, 골분화의 수준이 더욱 높은 값을 나타내었으므로, hMSC 세포의 골분화를 촉진하는 구성요소로는 나노구조가 형성된 배양지지체 뿐만 아니라 HUVEC 세포가 사용될 수 있음을 알 수 있었다.
실시예 4-3: 골형성에 미치는 나노구조가 형성된 배양지지체와 내피세포의 상승 효과
상기 실시예 4-2의 결과로부터 hMSC 세포의 골분화를 촉진하는 구성요소로는 나노구조가 형성된 배양지지체 뿐만 아니라 HUVEC 세포가 사용될 수 있음을 확인하였으므로, 이들 구성요소가 hMSC 세포의 골분화에 대하여 상승효과를 나타내는지의 여부를 확인하고자 하였다.
구체적으로, hMSC 세포(2 X 104 세포수)를 단독으로 또는 HUVEC 세포와 공동으로, 나노구조가 형성되지 않은 배양지지체 또는 나노구조가 형성된 배양지지체(550_550)에 접종하여 14일 동안 배양하고, 골분화를 유도한 다음, 알리자린 레드 S로 염색하고(도 6a), 이에 사용된 염료의 수준을 비교하였다(도 6b).
도 6은 hMSC 세포의 골분화 수준에 미치는 HUVEC 세포와의 공동배양 및 나노구조가 형성된 배양지지체의 효과를 분석한 결과를 나타내는 사진 및 그래프로서, 도 6a는 나노구조가 형성되지 않은 배양지지체(flat) 또는 나노구조가 형성된 배양지지체(nanopatterned)에서 hMSC 세포를 단독배양(monoculture) 또는 공동배양(co-culture)하여 골분화를 유도하고 알리자린 레드 S로 염색한 결과를 나타내는 사진이고, 도 6b는 상기 염색된 알리자린 레드 S의 수준을 측정한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 6에서 보듯이, 나노구조가 형성되지 않은 배양지지체(flat) 보다는 나노구조가 형성된 배양지지체(550_550)을 사용할 경우에, 골분화의 수준이 증가하였고, 이러한 경향은 hMSC 세포를 단독배양할 때 보다는 공동배양할 때 더욱 심화됨을 확인하였다. 따라서, hMSC 세포의 골분화에 있어서, 나노구조가 형성된 배양지지체와 내피세포의 공배양은 상승효과를 나타냄을 알 수 있었다.
본 명세서는 본 발명의 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자이면 충분히 인식하고 유추할 수 있는 내용은 그 상세한 기재를 생략하였으며, 본 명세서에 기재된 구체적인 예시들 이외에 본 발명의 기술적 사상이나 필수적 구성을 변경하지 않는 범위내에서 보다 다양한 변형이 가능하다. 따라서 본 발명은 본 명세서에서 구체적으로 설명하고 예시한 것과 다른 방식으로 실시될 수 있으며, 이는 본 발명의 기술 분야에 통상의 지식을 가진 자이면 이해할 수 있는 사항이다.

Claims (13)

  1. 나노단위(nm)의 높이(height)와 너비(width)를 갖는 마루(ridge)와 골(groove)로 구성된 나노구조를 포함하는, 줄기세포의 골분화 촉진용 배양지지체로서,
    상기 마루와 골의 너비의 비율은 1:3 내지 1:5인 것인 배양지지체.
  2. 삭제
  3. 제1항에 있어서,
    상기 높이는 1 내지 5000nm인 것인 배양지지체.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 배양지지체의 재질은 폴리비닐알코올 수지, 폴리에틸렌 수지, 폴리프로필렌 수지, 폴리에틸렌글리콜 수지, 폴리(L-락타이드-co-글리콜라이드) 수지, 폴리카프로락톤(PCL) 수지, 폴리락트산(poly lactic acid, PLA) 수지, 폴리글리콜산(poly glycolic acid, PGA) 수지, 키토산, 젤라틴, 콜라겐 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 배양지지체.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 줄기세포는 골수, 지방조직, 치아, 치아조직, 혈액, 제대혈, 간장, 피부, 위장관, 태반, 자궁 또는 태아로부터 유래한 중간엽 줄기세포인 것인 배양지지체.
  6. 제1항, 및 제3항 내지 제5항 중 어느 한 항의 배양지지체를 포함하는 골분화 촉진용 키트.
  7. 제6항에 있어서,
    줄기세포 배양용 배지, 줄기세포 분화유도물질, 배양용기, 줄기세포 공동배양용 내피세포 또는 이들의 조합을 추가로 포함하는 것인 키트.
  8. 제7항에 있어서,
    상기 줄기세포 분화유도물질은 골분화 유도물질인 것인 키트.
  9. 제8항에 있어서,
    상기 골분화 유도물질은 제대혈 혈청, β-글리세로포스페이트, 타우로우루소데옥시콜린산, 덱사메타손, 아스코르브산, L-알라닐-L-글루타민, 글리세롤 2-인산 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 키트.
  10. 제7항에 있어서,
    상기 내피세포는 혈관내피세포 또는 제대정맥내피세포인 것인 키트.
  11. (a) 제1항, 및 제3항 내지 제5항 중 어느 한 항의 배양지지체에 줄기세포를 접종하여 배양하는 단계; 및
    (b) 상기 배양된 줄기세포를 골세포로 분화시키는 단계를 포함하는, 줄기세포를 골세포로 분화시키는 방법.
  12. 제11항에 있어서,
    상기 줄기세포는 배양지지체 당 1 X 103 내지 1 X 1011 세포수로 접종하는 것인 방법.
  13. 제11항에 있어서,
    상기 (a) 단계에서 줄기세포 배양시, 줄기세포와 내피세포를 공동배양하는 단계를 추가로 포함하는 것인 방법.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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KR102125979B1 (ko) * 2020-02-04 2020-06-25 주식회사 나노바이오시스템 섬유아세포 배양 지지체의 선택방법 및 체외 배양 방법
KR102353946B1 (ko) * 2020-02-25 2022-01-20 주식회사 나노바이오시스템 치주조직 재생 유도제 및 이의 제조장치와 제조방법
KR102621037B1 (ko) * 2021-08-17 2024-01-03 전남대학교산학협력단 연골 재생용 지지체

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101171774B1 (ko) 2009-11-30 2012-08-06 아주대학교산학협력단 탄소나노튜브를 줄기세포의 배양 지지체로 사용하는 방법 및 탄소나노튜브를 포함하는 배양 지지체
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Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP5497011B2 (ja) 2008-05-27 2014-05-21 オーフス ウニベルシテット 哺乳類の幹細胞の成長および分化のための生体適合性材料
KR101171774B1 (ko) 2009-11-30 2012-08-06 아주대학교산학협력단 탄소나노튜브를 줄기세포의 배양 지지체로 사용하는 방법 및 탄소나노튜브를 포함하는 배양 지지체

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2020138562A1 (ko) * 2018-12-28 2020-07-02 전남대학교산학협력단 회전 근개 파열 치료용 스캐폴드

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