KR102125979B1

KR102125979B1 - 섬유아세포 배양 지지체의 선택방법 및 체외 배양 방법

Info

Publication number: KR102125979B1
Application number: KR1020200013325A
Authority: KR
Inventors: 김장호
Original assignee: 주식회사 나노바이오시스템
Priority date: 2020-02-04
Filing date: 2020-02-04
Publication date: 2020-06-25
Also published as: KR20200018524A

Abstract

본 발명은 조직 재생용 세포 배양 지지체 및 이의 이용방법에 관한 것으로, 본 발명의 조직 재생용 세포 배양 지지체는 다양한 폭과 간격을 갖는 패턴에 의하여 다양한 국소 밀도(local density)를 형성하는바, 생체 내 조직의 필요에 따라 그에 적합한 패턴을 갖는 지지체를 제조함으로써, 조직 재생을 위한 재료로서 효과적으로 사용될 수 있다.

Description

조직 재생용 세포 배양 지지체 및 조직 재생용 키트{CELL CULTURE SCAFFOLD FOR TISSUE REGENERATION AND KIT INCLUDING THE SAME}

본 발명은 조직 재생용 세포 배양 지지체 및 조직 재생용 키트에 관한 것이다.

인체의 조직재생 능력은 매우 복잡하고 미묘한 조직구조 때문에 자체적으로 재생하는 능력은 매우 한정적이다. 인체는 줄기세포를 비롯한 다양한 세포 및 구성 환경 덕분에 조직 손상시 재생 가능성을 보유하고 있지만 사고, 질병, 노화 등의 이유로 인해 재생 기능의 한계를 벗어나는 일이 생기게 된다. 최근 고령화 사회로의 진입과 함께 다양한 질병 및 사고의 증가로 인해 생체의 장기 조직은 재생력의 한계에 부딪히게 되면서 장기 조직의 재생에 대한 필요성이 급증하고 있다.

또한 생체조직을 효과적으로 대체하거나 이식할 수 있는 기술 개발이 점점 요구되고 있으며 인체 조직과 기관을 복원하려는 노력은 오랫동안 크게 주목을 받아 왔다. 초기에는 인공적인 대용품에서 생체적합재료의 개발, 장기이식 등으로 시도되었으나, 최근에는 생명과학, 공학 그리고 의과학을 통합 응용하는 생체조직공학으로 발전하고 있다.

조직공학(Tissue Engineering)은 세포에서부터 인공장기에 이르는 재생의료의 영역으로, 조직이나 기관의 복원을 도울 수 있는 생체물질부터 재료에 이르는 생물학적, 공학적인 기술을 다루는 학문을 기반으로 미래의 생명과학과 의료분야의 중요한 기술의 하나로 인식되고 있다. 생체 조직의 구조와 기능의 상관관계를 이해하고, 나아가서 생체 대용품을 만들어 이식함으로써 우리 몸의 기능을 복원, 유지, 향상시키려는 목적을 달성하기 위한 다양한 방법이 연구되고 있다.

조직공학의 핵심 기술 중 하나는 세포가 붙어 자랄 수 있도록 지지역할을 하는 지주(support) 또는 지지체(scaffold)를 만들어내는 일이다. 2차원 막이나 캡슐과 달리 지지체는 3차원 형으로, 3차원 구조를 가진 모든 체내 세포가 부착되어 분화 및 증식을 할 수 있는 공간을 일컫는다.

지지체는 생체조직공학에서 매우 중요한 역할을 수행한다. 지지체는 다공성 구조 내에 파종된 세포와 조직 주변으로부터 이동되는 세포의 성장에 중요한 역할을 수행한다. 거의 대부분의 인체내 세포는 부착되어 성장되는 부착세포로써 만일 부착할 곳이 없으면 세포는 성장되지 못하고 사멸하게 된다. 따라서 지지체는 세포의 부착, 분화, 성장 및 세포 이동에 대한 적합한 환경을 제공해야 한다. 지지체는 다양한 소재로 제조될 수 있는데, 현재, 천연재료, 합성 고분자, 생체 세라믹스 및 고분자-세라믹 복합소재를 사용하여 조직재생용 지지체를 개발하려는 연구가 활발하게 이루어지고 있다.

이에, 본 발명자들은 세포외기질(extracellular matrix, ECM)의 지형적 특징(topographic features)이 생체 내에서 생리적으로 관련된 세포 기능의 조절에 결정적인 역할을 할 수 있을 것으로 기대하고 연구하던 중, 일 방향으로 배열된 복수개의 선형 나노패턴 및 이들의 구성 밀도에 따라 형성된 배양 지지체를 이용하여 본 발명을 완성하였다.

대한민국 등록특허공보 제10-1186093호

본 발명은 일 방향으로 배열된 복수개의 선형 나노패턴을 포함하는, 조직 재생용 세포 배양 지지체를 제공하는 것을 목적으로 한다.

또한 본 발명은 상기 조직 재생용 세포 배양 지지체를 포함하는, 조직 재생용 키트를 제공하는 것을 목적으로 한다.

1. 일 방향으로 배열된 복수개의 선형 나노패턴을 포함하는, 조직 재생용 세포 배양 지지체.

2. 위 1에 있어서, 상기 패턴은 폭과 간격이 서로 독립적으로 100 내지 900 nm인, 조직 재생용 세포 배양 지지체.

3. 위 1에 있어서, 상기 패턴의 폭과 간격은 그 길이비가 1: 0.5 내지 1.5인, 조직 재생용 세포 배양 지지체.

4. 위 1에 있어서, 상기 패턴은 높이가 서로 독립적으로 100 내지 900 nm인, 조직 재생용 세포 배양 지지체.

5. 위 1에 있어서, 상기 조직은 상피 또는 결합 조직이고, 상기 패턴은 폭과 간격이 서로 독립적으로 400 내지 600 nm인, 조직 재생용 세포 배양 지지체.

6. 위 1에 있어서, 상기 세포 배양 지지체는 기판; 및 상기 패턴을 갖는 패턴층을 포함하는, 조직 재생용 세포 배양 지지체.

7. 위 6에 있어서, 상기 패턴층은 폴리우레탄아크릴레이트(PUA) 수지, 폴리비닐알코올 수지, 폴리에틸렌 수지, 폴리프로필렌 수지, 폴리에틸렌글리콜 수지, 폴리(L-락타드-co-글리콜라이드) 수지, 폴리카프로락톤(PCL) 수지, 폴리라틱애시드(poly lactic acid, PLA) 수지, 폴리글리코릭애시드(poly glycolic acid, PGA) 수지, 키토산, 젤라틴, 콜라겐 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 재질의 층인, 조직 재생용 세포 배양 지지체.

8. 위 1 내지 7 중 어느 하나의 조직 재생용 세포 배양 지지체를 포함하는, 조직 재생용 키트.

9. 위 8에 있어서, 상기 조직은 상피 또는 결합 조직이고, 상기 패턴은 폭과 간격이 서로 독립적으로 400 내지 600 nm인, 조직 재생용 키트.

도 1은 본 발명의 조직 재생용 세포 배양 지지체를 도시한 것으로 a) 사시도, b) 단면도, 및 c) 일 실시예에 따른 접착면을 포함하는 단면도를 나타낸 도이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 배양 지지체의 a) 나노패턴 배열을 생성하는 데 사용되는 미세 가공 공정의 개략도, b) PUA 수지를 사용한 배양 지지체의 합성된 나노패턴의 SEM 이미지, 및 c) PCL 수지를 사용한 배양 지지체의 합성된 나노패턴의 SEM 이미지를 나타낸 도이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 배양 지지체에서 배양된 섬유아세포의 형태를 나타낸 것으로, a) 단일 세포 수준에서 NIH3T3 섬유아세포의 F-actin(적색) 면역염색 이미지, b) 세포체의 정량, 및 c) 세포체의 신장(장축/단축)의 정량 분석을 나타낸 도이다. 3 회의 독립적인 실험이 수행되었고 50-100 개의 세포가 정량화에 사용되었으며, 오류 막대는 평균에 대한 표준편차를 나타내고, 통계적 유의성은 "*"(p <0.05) 및 "**"(p <0.01)로 나타냈다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 배양 지지체에서 배양된 섬유아세포의 배향 및 이동을 나타낸 것으로, a) 섬유아세포의 정량, 및 b) 이동 속도를 나타낸 도이다. 3 회의 독립적인 실험이 수행되었고 50-100 개의 세포가 정량화에 사용되었으며, 오류 막대는 평균에 대한 표준편차를 나타내고, 통계적 유의성은 "**"(p <0.01)로 나타냈다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 배양 지지체에서 배양된 섬유아세포의 스트레스 섬유 분포 및 국소 접착(FA) 배향을 나타낸 것으로, a) F-actin(적색) 및 FA(녹색)의 면역염색 이미지, b) FA 클러스터링 지수, lamellipodial 영역에서 밀도가 높은(dense) 나노토포그라피(c), 밀도가 낮은(sparse) 나노토포그라피(d)의 액틴 필라멘트 및 빈셀린(vinculin) 밴드 이미지, e) 액틴 세포 골격 및 국소 부착의 정량적 및 상관 분석을 나타낸 도이다. 3 회의 독립적인 실험이 수행되었고 50-100 개의 세포가 정량화에 사용되었으며, 오류 막대는 평균에 대한 표준편차를 나타내고, 통계적 유의성은 "****"(p <0.0001)로 나타냈다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따른 배양 지지체에서 배양된 섬유아세포의 피브로넥틴(FN) 섬유의 형태를 나타낸 것으로, a) F-actin(적색), FN 섬유(녹색) 및 핵(청색)의 면역염색 이미지, b) 핵 신장(장축/단축)의 정량 분석, 및 c) FN 섬유 다발의 길이에 대한 정량 분석을 나타낸 도이다. 3 회의 독립적인 실험이 수행되었고 50-100 개의 세포가 정량화에 사용되었으며, 오류 막대는 평균에 대한 표준편차를 나타내고, 통계적 유의성은 "****"(p <0.0001)로 나타냈다.
도 7은 본 발명의 일 실시예에 따른 배양 지지체 또는 평면 지지체에서 배양된 섬유아세포의 피브로넥틴(FN) 섬유의 형태를 나타낸 것으로, F-actin(적색), FN 섬유(녹색) 및 핵(청색)의 면역염색 이미지를 나타낸 도이다.
도 8은 본 발명의 일 실시예에 따른 in vitro 상처 치유 결과를 나타낸 것으로, 상처 치유 모델의 평면 또는 나노 패턴의 배양 지지체에서 각각 48 시간 동안 섬유아세포에 의해 덮힌 부위를 나타낸 도이다.
도 9는 본 발명의 일 실시예에 따른 배양 지지체를 이용한 in vitro 상처 치유 결과를 나타낸 것으로, a) 쥐 피부의 진피에서 관찰된 정렬된 콜라겐 섬유 다발의 그래픽 일러스트 및 SEM 이미지, b) 상처 치유 실험 방법의 개략도, 및 c) 섬유아세포에 의해 채워진 나노 매트릭스 면적의 정량화, 및 d) F-actin(적색) 및 FN 섬유(녹색)의 면역염색 이미지를 나타낸 도이다. 3 회의 독립적인 실험이 수행되었다.
도 10은 본 발명의 일 실시예에 따른 평면 또는 나노 패턴의 배양 지지체에서 배양된 섬유아세포 FN 섬유(녹색)의 면역염색 이미지를 나타낸 도이다.
도 11은 본 발명의 일 실시예에 따른 배양 지지체를 이용한 상처 치유 과정을 모식화하여 나타낸 도이다.

이하 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 일 방향으로 배열된 복수개의 선형 나노패턴을 포함하는, 조직 재생용 세포 배양 지지체를 제공한다.

일방향으로 배열된 복수개의 선형 나노패턴을 포함함으로써, 세포를 일방향으로 정렬/배향시킬 수 있고, 이에 따라 세포 이동, 세포 신장 등의 행동을 조절하여 세포 조직을 조절하고 재생을 촉진할 수 있다. 선형 나노패턴은 일 방향으로 배열되는 것으로서, 구체적으로는 평행하게 배열될 수 있다. 본 명세서에서 "평행"은 완전한 평행뿐만 아니라 실질적으로 평행하다고 볼 수 있는 수준으로 배열된 것까지 포함하는 의미이다.

패턴은 선형 패턴으로써 세포를 일정한 방향성을 갖게 배열시킬 수 있는 것이라면 그 모양은 특별히 제한되지 않으며, 예를 들면 종단면이 서로 독립적으로 삼각형, 사각형, 오각형, 원형, 또는 타원형일 수 있으며, 보다 규칙적인 세포 배열의 측면에서 바람직하게는 사각형일 수 있다.

패턴의 폭과 패턴간 간격은 재생 대상 조직의 세포외기질(ECM)의 구조와 유사한 구조를 갖도록 적절히 선택될 수 있으며, 예를 들면 서로 독립적으로 100 nm 내지 900 nm일 수 있다. 이때, 상기 패턴의 폭과 간격은 규칙적인 배열의 측면에서 상기 범위 내에서 그 길이비가 예를 들면 1: 0.5 내지 1.5, 바람직하게는 1: 0.8 내지 1.2, 보다 바람직하게는 1:1일 수 있다.

또한, 패턴의 높이는 재생 대상 조직의 세포외기질(ECM)의 구조와 유사한 구조를 갖도록 적절히 선택될 수 있으며, 예를 들면 1 nm 내지 900 nm일 수 있고, 바람직하게는 300 nm 내지 500 nm일 수 있다.

본 발명의 조직 재생용 세포 배양 지지체는 상기와 같이 패턴의 폭과 간격을 다양하게 조절함으로써 지형학적 밀도(topographical density)를 다양하게 조절할 수 있다. 예를 들면 상기 패턴의 폭과 간격이 300 내지 400 nm 범위인 경우 고밀도(dense), 500 내지 600 nm 범위인 경우 중간 밀도(intermediate), 700 내지 800 nm 범위인 경우 저밀도(sparse)일 수 있다.

상기와 같이 지형학적 밀도를 다양하게 조절함으로써, 재생하고자 하는 대상 조직의 세포외기질의 구조와 유사한 구조를 갖도록 할 수 있고, 이에 따라 대상 조직에 맞게 세포를 배열시키고 이동 속도를 조절할 수 있다. 예를 들면, 본 발명의 세포 배양 지지체가 상피 또는 결합 조직(예를 들면, 피부 혹은 힘줄 조직) 재생용으로 사용되는 경우, 상기 패턴의 폭과 간격이 서로 독립적으로 400 내지 600 nm일 때, 상피 또는 결합 조직 내 세포의 손상된 부위로의 이동이 촉진됨으로써, 세포 증식에 따른 조직 재생 효과를 높일 수 있다.

따라서, 본 발명의 배양 지지체는 생체 내 다양한 조직에 따라 그에 적합한 패턴을 갖도록 제조될 수 있다.

본 발명의 조직 재생용 세포 배양 지지체는 상기 선형 나노 패턴(14)을 패턴층에 포함할 수 있다. 예를 들면, 본 발명의 조직 재생용 세포 배양 지지체는 기판(11) 및 상기 패턴(14)을 갖는 패턴층(13)을 포함할 수 있다.

기판(11)은 글라스, 고분자 등 당 분야에 공지된 소재를 제한 없이 사용할 수 있다.

패턴층(13)은 기판 상측에 위치한다.

패턴층(13)에는 예를 들면 폴리우레탄아크릴레이트(PUA) 수지, 폴리비닐알코올 수지, 폴리에틸렌 수지, 폴리프로필렌 수지, 폴리에틸렌글리콜 수지, 폴리(L-락타드-co-글리콜라이드) 수지, 폴리카프로락톤(PCL) 수지, 폴리라틱애시드(poly lactic acid, PLA) 수지, 폴리글리코릭애시드(poly glycolic acid, PGA) 수지, 키토산, 젤라틴, 콜라겐 등이 단독으로 또는 복합적으로 사용될 수 있으며, 생체 적합성의 측면에서 바람직하게는 폴리우레탄아크릴레이트(PUA) 수지, 폴리카프로락톤(PCL) 수지, 폴리(L-락타드-co-글리콜라이드) 수지가 사용될 수 있고, 조직 재생의 측면에서 보다 바람직하게는 폴리카프로락톤(PCL) 수지가 사용될 수 있으나, 특별히 이에 제한되지 않는다.

패턴층(13)은 예를 들면 기판(11) 상에 패턴층 소재를 도포한 다음, 패턴(14)이 형성된 몰드로 가압하여 형성된 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

구체적으로, 패턴층(13)은 모세관력 리소그래피(capillary force lithography; CFL)에 의해 형성된 것일 수 있다.

모세관력 리소그래피는 모세관 작용이라는 자연적인 힘을 이용하여 고분자를 몰드의 빈 공간으로 끌어올려 패턴을 형성하는 방법으로, 미세하고 정교하게 나노 패턴을 형성할 수 있다.

몰드는 예를 들면 PUA(PolyUrethane Acrylate) 몰드 또는 PDMS(polydimethyl siloxane) 몰드를 사용할 수 있다. PUA(Young’s modulus: 100-400 MPa) 몰드와 PDMS(polydimethyl siloxane)(Young's modulus: 2 MPa) 몰드는 영율(Young’s modulus)이 달라서 모세관력 리소그래피를 이용한 나노 사이즈의 패턴을 제조할 재료에 따라 선택할 수 있다. 폴리우레탄아크릴레이트(PUA) 수지, 폴리카프로락톤(PCL) 수지, 폴리(L-락타드-co-글리콜라이드) 수지를 이용하여 나노 패턴을 이용할 때는 PUA(PolyUrethane Acrylate) 몰드를 사용할 때 더욱 섬세한 패턴을 제조할 수 있다. 따라서 본 발명자의 조직 재생을 위한 세포 배양 지지체는 PUA 몰드를 이용하여 제조한 것일 수 있다.

필요에 따라, 기판(11)과 패턴층(13) 사이에 접착층(12)이 더 포함될 수 있다.

접착층(12)은 상기 기판과 패턴층을 접착시킬 수 있는 소재라면 특별히 제한되지 않으며, 예를 들면 인산아크릴레이트 및 프로필렌글리콜모노메틸에테르아세테이트를 조합하여 사용할 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 조직 재생용 세포 배양 지지체를 포함하는 조직 재생용 키트를 제공한다.

본 발명의 키트는 재생이 필요한 조직에 부착되어 사용될 수 있으며, 보다 효과적인 조직 재생을 위해, 상기 배양 지지체 이외에 적합한 한 종류 또는 그 이상의 용액 또는 장치 등의 다양한 구성요소를 추가로 포함할 수 있다.

본 발명의 키트가 상피 또는 결합 조직(예를 들면, 피부 혹은 힘줄 조직) 재생용으로 사용되는 경우, 상기 패턴은 폭과 간격이 서로 독립적으로 400 내지 600 nm일 때, 상피 또는 결합 조직 내 세포의 이동을 촉진함으로써, 조직 재생 효과를 높일 수 있다.

이하, 본 발명을 구체적으로 설명하기 위해 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.

[제조예]

1. 폴리우레탄 아크릴레이트 (PolyUrethane Acrylate, PUA) 몰드 제조

실리콘 웨이퍼를 감광액 (Shipley, Marlborough, MA)으로 스핀 코팅 한 다음 전자빔 리소그래피 (JBX-9300FS, JEOL)를 통해 패터닝하였다. 감광액 현상 (MF320, Shipley) 후, 노출된 실리콘은 deep reactive ion 에칭 (STS ICP Q34 Etcher) 공정을 통해 어레이를 형성하였다. 실리콘 웨이퍼 상에 남아있는 감광액은 애싱 공정 (BMR ICP PR Asher)을 통해 제거한 다음, 실리콘 마스터로 다이싱 (dicing)하여 후속 복제 몰딩하였다.

PUA는 토포그라픽 나노패턴 어레이(topographic nanopattern arrays)를 제작하기 위한 실리콘 마스터의 소재로 사용하였다. 즉, UV 경화성 PUA 전구체 (Minuta Tech., South Korea)를 마스터에 떨어뜨려 100 μm 두께의 PET 필름 (SKC Inc., 대한민국)을 지지면으로 하여 접촉시키고 UV를 수십 초 동안 연속적으로 조사하여, PET 필름에서 음성 PUA 복제물이 형성되도록 하였다.

2. 다양한 국소 밀도(local density)의 나노 패턴을 포함하는 배양 지지체 디자인 및 제조

25×25 mm² 면적의 조립식 마스터 PUA 몰드로부터 다양한(300, 400, 500, 600, 700, 및 800 nm) 폭과 간격(ridge/groove)을 포함하는 나노 매트릭스(배양 지지체)를 제조하였다.

2-1. 폴리우레탄아크릴레이트(PUA) 배양 지지체의 제조

먼저 유리 기판을 이소프로필 알콜로 세정하고, 증류수로 완전히 세정한 후, 질소 기류 중에서 건조시켰다. 그 후, 접착제 (인산아크릴레이트:프로필렌글리콜모노메틸에테르아세테이트 = 1:10, 부피비)를 3000 rpm으로 30 초 동안 ~100 nm의 두께를 형성하도록 스핀 코팅하였다. 소량의 동일한 PUA 전구체를 기판상에 떨어뜨리고, 제조예 1에서 제조한 PUA 몰드를 표면상에 직접 접촉시켰다. 이때, PUA 전구체는 모세관 현상에 의해 자발적으로 몰드의 공동(cavity)을 채우고, 투명한 백플레인(dose = 100mJcm^-2)을 통해 ~30 초 동안 UV광 (λ = 250~400 nm)에 노출시킴으로써 경화되었다. 경화 후, 날카로운 집게를 사용하여 기판으로부터 몰드를 분리하였다.

2-2. 폴리카프로락톤(PCL) 배양 지지체의 제조

PUA 전구체 대신 PCL 전구체를 사용한 것 및 UV광 대신 60 내지 120 ℃의 열을 이용하여 경화한 것을 제외하고는, 상기 제조예 2-1과 동일한 방법으로 제조하였다.

[실험예]

1. 세포 배양

NIH3T3 섬유아세포(4x10⁴ cells/매트릭스)를 나노 매트릭스 상에 접종(seeding)하고, 10 % 소태아혈청 (Sigma-Aldrich, Milwaukee, WI, USA) 및 1 % 항생제 (Sigma-Aldrich, Milwaukee, WI, USA)와 함께 Dulbecco's modified Eagle's 배지 (Sigma-Aldrich, Milwaukee, WI, USA)에서 37 ℃, 5 % CO₂ 조건으로 배양하였다.

2. 면역형광 염색

나노 매트릭스 상에 부착된 세포를 20 분 동안 4 % 파라포름알데히드 용액 (Sigma-Aldrich, Milwaukee, WI, USA)으로 고정시키고, 15 분 동안 0.2 % Triton X-100 (Sigma-Aldrich, WI, Milwaukee, USA)를 침투시킨 후, 1 시간 동안 TRITC-conjugated phalloidin (Millipore, Bellerica, MA, USA), 4,6-diamidino-2-phenylindole (Millipore, Billerica, MA, 미국) 또는 fibronectin antibody (Sigma-Aldrich, WI, Milwaukee, USA)로 염색하였다.

FA(focal adhesion)는 monoclonal antivinculin antibody (1 : 100; Millipore, Billerica, MA, USA) 및 FITC-conjugated 염소 anti-mouse 2차 antibody (1 : 500; Millipore, Billerica, MA, USA)로 염색하였다.

형광 현미경 (Zeiss, Germany)을 사용하여 염색된 세포의 이미지를 촬영하였으며, 기질 내 세포의 body 및 nuclear 모양의 정량 분석을 위해 형광 현미경으로 얻은 이미지를 custom written MATLAB script를 사용하여 분석하였다.

3. 세포 이동(migration) 분석

200 mm 두께의 PDMS(polydimethyl siloxane) 시트를 두 개의 손상되지 않은 예리한 블레이드로 절단하여 폭 500 mm/길이 20 mm의 슬래브(slab) 제조하여 나노 매트릭스 상에 놓아 세포 이동을 조사하기 위한 무-세포(cell-free) 영역을 생성하였다. 상기 PDMS 슬래브의 conformal sealing으로 인해 보호 지역(protected area)에서 성장한 세포는 없었다.

4. 통계 분석

통계 분석을 위해 student's t-test를 사용했으며, 모든 정량 결과는 평균 ± 표준 편차 (SD)로 나타내었다.

[실시예]

1. 제조된 배양 지지체의 나노토포그라피(nanotopography) 확인

ECM의 나노토포그라피적 특징 중 하나인 국소 밀도(local density)가 세포의 구조 및 기능을 조절하기 위한 필수적인 수단을 제공할 수 있을 것으로 기대하고, 자연 ECM의 기하학적 특징과 동일하게 이방성(anisotropic) 나노토포그라피 밀도를 설계하여, 전자빔 리소그래피 및 UV-assisted CFL을 사용하여 제조예 2의 방법으로 배양 지지체를 제조하였으며, 도 2a는 상기 제조 과정을 나타내는 개략도이다.

제조된 배양 지지체는 PUA 수지의 경우, 도 2b에 나타낸 바와 같이, 300~800 nm의 다양한 폭과 간격(ridges/grooves), 400 nm의 높이를 갖는 평행한 선형 토포그라피 패턴(topographic pattern)을 가지는 것을 확인하였고, PCL 수지의 경우, 도 2c에 나타낸 바와 같이, 350 nm의 폭과 간격, 400 nm의 높이를 갖는 평행한 선형 토포그라피 패턴을 가지는 것을 확인하였다. 하기의 분석에는 PUA 수지를 사용한 배양 지지체를 사용하였다.

2. 배양 지지체에서 배양된 세포 형태 분석

배양 지지체의 나노토포그라피적 국소 밀도에 따른 세포의 형태 변화를 확인하기 위하여, 모델 세포주인 NIH-3T3 섬유아세포를 12 시간 동안 배양 지지체에서 배양하여 세포를 완전히 접착시킨 다음, 면역형광 염색하여 세포 형태를 관찰하였다.

그 결과, 도 3에 나타낸 바와 같이, 세포체의 신장(장축/단축, Ly/Lx)은 먼저 밀도가 높은(dense) 나노토포그라피(300 및 400 nm 폭/간격)에서 중간(intermediate) 밀도의 나노토포그라피(500 및 600 nm 폭/간격)로 증가한 다음, 밀도가 낮은(sparse) 나노토포그라피(700 및 800 nm 폭/간격)로 감소하여, 500-600 nm 범위에서 피크를 나타냄으로써 이상(biphasic) 경향을 나타냄을 확인할 수 있었다.

보다 구체적으로, 나노토포그라피적 밀도 변화에 따라 세포 폭(단축, Lx)의 차이는 적었지만, 세포의 길이(장축, Ly)가 큰 차이로 변하여(도 3b), 결과적으로 세포체의 신장 모양을 결정하는 것을 확인함으로써(도 3c), 나노토포그라피적 국소 밀도가 세포의 모양 및 극성(세포 길이, 둘레 및 면적)에 영향을 미치는 것을 확인할 수 있었다.

이러한 결과는, 나노미터 수준(<1 μm)에서 배양 지지체의 나노토포그라피적 국소 밀도가 세포 모양을 제어하는데 중요한 역할을 할 수 있으며, 세포의 기능을 조절할 수 있음을 시사한다.

3. 배양 지지체에서 배양된 세포 배향 및 이동 분석

먼저, 나노토포그라피의 국소 밀도에 따른 세포의 배향을 확인하기 위하여, 배양 지지체에 대한 세포 배향 각도(orientation angle)를 측정하였다.

그 결과, 도 4a에 나타낸 바와 같이, NIH3T3 섬유아세포는 나노토포그라피 밀도와 무관하게 나노토포그라피적 특징(nanotopographical features)의 방향을 따라 잘 배향되는 것을 확인하였다.

이러한 결과는, 나노미터 수준(<1 μm)의 토포그라피적 패턴의 방향을 따라 세포를 배향시킬 수 있음을 시사한다.

다음으로, 나노토포그라피의 국소 밀도에 따른 세포의 이동을 확인하기 위하여, 서로 다른 국소 밀도의 배양 지지체에서 NIH3T3 섬유아세포의 이동 속도를 측정하였다.

그 결과, 도 4b에 나타낸 바와 같이, 나노토포그라피 밀도와 무관하게 평평한(flat) 기질에 비해 나노패턴(nanopatterned) 기질에서 더 높은 세포 이동 속도가 관찰되었으며, 300 nm 너비의 나노토포그라피에서 가장 높은 세포 이동 속도(45 μmh^-1)가 관찰되고, 나노토포그라피의 골 너비가 800 nm로 증가함에 따라 세포 이동 속도가 감소하는 것을 확인하였다.

이러한 결과는, 세포의 이동이 나노토포그라피의 국소 밀도에 민감 할 수 있으며, 밀도가 높은(dense) 나노토포그라피가 밀도가 낮은(sparser) 나노토포그라피 보다 세포의 더 빠른 이동을 유도할 수 있음을 시사한다.

상기 내용을 종합한 결과, 최대 신장 계수는 500~600 nm의 폭/간격을 갖는 나노토포그라피에서 관찰되었지만, 최대 이동 속도는 300 nm의 폭/간격을 갖는 나노토포그라피에서 나타남을 확인함으로써, 세포의 신장 인자의 최대 지점과 이동 속도의 최대 지점이 분리되어 있음을 알 수 있었다. 즉, 나노토포그라피의 국소 밀도가 세포 형태 및 세포 이동에 영향을 미치지만, 두 요인 간에는 상관관계가 없음을 확인하였다.

4. 배양 지지체에서 배양된 세포의 스트레스 섬유 분포(Stress Fiber Distribution) 및 국소 접착(Focal Adhesions) 배향 분석

세포와 나노토포그라피적 밀도 사이의 상호 작용을 분석하기 위하여 세포의 스트레스 섬유 분포 및 국소 접착(FA) 배향을 관찰하였다.

먼저, 배양 지지체에서 NIH3T3 섬유아세포를 12 시간 동안 배양하고, 면역 형광 염색 분석을 사용하여 FA 및 스트레스 섬유 분포에 대한 나노토포그라피적 국소 밀도의 효과를 확인하였다.

그 결과, 도 5a에 나타낸 바와 같이, 세포의 스트레스 섬유가 나노토포그라피의 배향을 따라 분극화되어, 밀도가 낮은(sparser) 나노토포그라피에 비해 상대적으로 밀도가 높은(dense) 나노토포그라피에서 보다 분극화되는 것을 확인할 수 있었고(300 > 500 > 800 nm), 세포 골격은 중간(intermediate) 밀도 나노토포그라피(500 nm) 및 밀도가 낮은(sparse) 나노토포그라피(800 nm)에서 세포의 FA 사이 골을 가로질러 서로 연결되어있는 반면, 밀도가 높은(dense) 나노토포그라피(300 nm)에서는 개별 마루에 국한되어있는 것을 확인할 수 있었다.

이와는 대조적으로, FA는 나노토포그라피 국소 밀도에 관계없이 나노토포그라피의 방향을 따라 잘 분극된 것을 확인할 수 있었다. 다만, 간격이 ~500 nm 보다 작으면, 마루(groove)의 상단에 선택적으로 FA가 형성되어, 간격에 따라 성숙한 FA의 크기가 결정되는바, FA의 단위 크기를 250 nm로 정했을 때, 중간(intermediate) 밀도 나노토포그라피(500 nm) 및 밀도가 낮은(sparse) 나노토포그라피(800 nm)의 클러스터링 지수(단위 크기에 대한 FA 크기의 비율)는 밀도가 높은(dense) 나노토초그라피(300 nm)의 경우보다 훨씬 크게 나타나는 것을 확인하였다.

이러한 결과는, 밀도가 낮은 나노토포그라피는 스트레스 섬유를 다양한 방향으로 형성하게 할 수 있지만, 밀도가 높은 나노토포그라피는 그렇지 않다는 것을 시사한다.

이에, 나노토포그라피적 국소 밀도가 FA 및 스트레스 섬유 분포에 미치는 영향을 보다 상세히 분석하기 위해 정량 분석을 수행하였다.

그 결과, 도 5b에 나타낸 바와 같이, 밀도가 높은(dense) 나노토포그라피 보다 밀도가 낮은(sparse) 나노토포그라피에서 더 큰 FA가 관찰되었다. 특히 FA 크기는 평평한 표면에 비해 300 nm 골 너비의 나노토포그라피에서 더 작게 나타나는 것을 확인함으로써, 나노토포그라피적 국소 밀도가 FA의 크기에 영향을 주는 것을 확인할 수 있었다.

또한, lamellipodial에서의 세포 골격 및 FA 사이의 상관 관계 분석 결과에 따르면, 액틴 필라멘트와 빈셀린(vinculin) 밴드의 공동화(colocalization)에 있어서, 밀도가 낮은(sparse) 나노토포그라피(도 5d)에 비해, 밀도가 높은(dense) 나노토포그라피(도 5c)에서 상관관계 더 높게 나타나는 것을 확인할 수 있었으며, 스트레스 섬유 및 FA의 공동화(colocalization)에 있어서도, 밀도가 낮은(sparse) 나노토포그라피에 비해 밀도가 높은(dense) 나노토포그라피에서 세포의 스트레스 섬유가 기판에 더 많이 분산되어, 상관관계 더 높게 나타나는 것 (dense > intermediate > sparse)을 확인할 수 있었다(도 5e).

이러한 결과는 세포 이동 속도의 추세와 높은 상관관계가 있으며, 종함하면, 나노토포그라피적 국소 밀도가 세포의 기계적 전달 경로를 재구성함으로써 세포 기능을 조절할 수 있음을 시사한다.

5. 다세포 수준(multicellular level)에서, 배양 지지체에서 배양된 세포 형태 및 배향 분석

다세포 수준(multicellular level)에서 배양 지지체의 나노토포그라피의 국소 밀도에 따른 세포의 배향 및 형태 변화를 확인하기 위하여, 배양 지지체에 NIH3T3 섬유아세포를 7 일 동안 배양하였다.

그 결과, 먼저 도 6a에 나타낸 바와 같이, 세포 배향의 측면에서 세포는 나노토포그라피적 국소 밀도에 상관없이, 나노토포그라피의 방향을 따라 정렬되고 배향된 형태를 나타내었으며, 세포가 평평한(flat) 표면과 나노 패턴(nanopatterned) 표면을 동시에 포함하는 플랫폼에서 배양되었을 때는 평평한 표면에 비해 나노 패턴 표면에서 보다 고도로 정렬되고 배향된 형태를 보이는 것을 확인하였다(도 7). 또한, 세포 신장의 측면에서도 단세포 수준(single cell level, 도 3)에서와 유사하게, 밀도가 높은(dense) 나노토포그라피에서 중간(intermediate) 밀도 나노토포그라피로 급속히 증가한 다음, 밀도가 낮은(sparse) 나노토포그라피로 갈수록 감소하는 것을 확인하였다.

다음으로, 세포체 신장을 상세하게 분석하기 위해 핵의 신장 계수를 계산한 결과, 도 6b에 나타낸 바와 같이, 500 nm 간격의 나노토포그라피에서 더 높은 값을 나타냄으로써 세포체와 비슷한 경향을 나타냈다.

이러한 결과는, 나노미터 수준(<1 μm)에서 배양 지지체의 나노토포그라피적 국소 밀도가 다세포 수준에서도 세포 조직을 조절할 수 있으며, 상처 치유를 비롯한 다양한 생물학적 과정에서 조직 구성에 영향을 미칠 수 있음을 시사한다.

다음으로, 나노토포그라피적 국소 밀도가 세포에서 새로운 ECM 단백질의 생산에 영향을 미칠 수 있는지 여부를 확인하기 위하여, 피브로넥틴(fibronectin)을 시각화함으로써 ECM 구성을 분석하였다.

그 결과, 도 8에 나타낸 바와 같이, 7 일 동안 배양된 NIH3T3 섬유아세포에서 나노토포그라피적 국소 밀도에 관계없이 정렬된 피브로넥틴 섬유 다발(bundles)이 합성된 것을 확인할 수 있었다. 이때, 합성된 피브로넥틴 섬유 다발의 평균 길이(섬유 길이는 뒤틀린 포인트 사이의 직선의 길이로 결정)는 도 6c에 나타낸 바와 같이, 밀도가 높은(dense) 나노토포그라피에서 중간(intermediate) 밀도의 나노토포그라피로 증가한 다음, 밀도가 낮은(sparse) 나노토포그라피로 감소함을 확인함으로써, 나노토포그라피적 국소 밀도가 기판상의 편광된 섬유 다발의 크기에도 물리적으로 영향을 미치는 것을 확인할 수 있었다.

이러한 섬유 다발 길이의 증가는 세포 신장과 높은 상관관계가 있었으며(도 6a 및 6b), 종합하면, 배양 지지체가 세포체 주위에 침착될 때, 세포의 형태가 매트릭스에 의해 재구성됨으로써 새로운 ECM 단백질이 생산될 수 있음을 시사한다.

6. ( In Vitro ) 진피 상처 치유(Dermal Wound Healing)

상기 실시예들의 결과를 종합하면, 나노토포그라피적 국소 밀도가 세포 형태, 세포 이동 속도 및 새로운 ECM 단백질의 생산에 영향을 미친다는 사실을 알 수 있는바, 나노토포그라피적 국소 밀도가 토포그라피적 신호(topographical cues), 즉 접촉 유도를 통한 피부 상처 치유의 주요 인자가 될 것이라고 가정하고, 피부 상처 치료에서 나노토포그라피 밀도의 역할을 확인하기 위하여, 하기와 같이 실험하였다.

세포 접종(seeding) 전에, 얇은 PDMS(polydimethyl siloxane) 슬래브(slab)를 배양 지지체 상에 먼저 배치하고, NIH3T3 섬유아세포를 접종하여 배양하였다. 그 후, 섬유아세포가 이동 및 증식하여 세포 없는 영역을 채울 수 있도록 PDMS 슬래브를 제거하고, 세포로 덮힌 영역의 이미지를 촬영하였다. 세포의 피복율은 이전에 보고된 것과 유사한 방법을 사용하여 평가하였으며, 도 9b는 세포 접종 전에 배양 지지체 상에 먼저 PDMS 슬래브가 배치된 실험설계를 나타낸다.

48 시간 이상 경과 관찰 결과, 도 9c에 나타낸 바와 같이, 나노토포그라피적 국소 밀도에 관계없이 NIH3T3 섬유아세포가 세포가 없는 영역(표적 영역)으로 이동하여, 전체 범위를 채우는 것을 확인하였다. 이때, 피복율(covering rate)은 300 nm 간격의 토포그라피에서 최대로 관찰되어, 나노토포그라피 밀도에 직접 반비례(dense > intermediate > sparse)하는 것으로 나타났으며, 세포 이동 속도(도 3b)에서 관찰된 것과 유사한 경향을 보였다. 마찬가지로, 나노 패턴(nanopatterned)의 피복율은 평평한(flat) 표면의 피복율보다 빠르게 나타났다(도 8).

또한, 세포가 채워진 영역의 세포 골격 및 합성된 피브로넥틴 섬유 다발의 조직을 관찰한 결과, 도 9d 및 도 10에 나타낸 바와 같이, 밀도가 높은(dense) 나노토포그라피(300 및 400 nm 폭/간격)는 이방성으로 조직화된 세포 및 합성된 피브로넥틴 섬유 다발을 보인 반면, 밀도가 낮은(sparse) 나노토포그라피(700 및 800 nm 폭/간격)는 조직화된 세포 및 합성된 피브로넥틴 섬유 다발을 보이는 것을 확인하였다.

종합적으로, 도 11에 나타낸 바와 같이, 다양한 밀도의 나노토포그라피에 의한 토포그라피적 가이드(topographical guide)를 통하여, 상처 치유 과정을 정확하게 제어할 수 있을 것으로 기대된다.

11: 기판
12: 접착층
13: 패턴층
14: 패턴

Claims

재생 대상 조직의 세포외기질의 지형학적 밀도에 대응되는 지형학적 밀도를 갖는 배양 지지체를 선택하는 단계;를 포함하고,
상기 배양 지지체는 일 방향으로 배열된 복수개의 선형 나노 패턴을 갖는 고분자 패턴층을 포함하고,
상기 배양 지지체의 지형학적 밀도는 고밀도, 중간밀도 또는 저밀도이고,
상기 고밀도는 패턴의 폭과 간격이 300 내지 400nm, 중밀도는 500 내지 600nm, 저밀도는 700 내지 800nm인, 섬유아세포 배양 지지체의 선택 방법.
청구항 1에 있어서, 상기 패턴층은 폴리우레탄아크릴레이트(PUA) 수지, 폴리비닐알코올 수지, 폴리에틸렌 수지, 폴리프로필렌 수지, 폴리에틸렌글리콜 수지, 폴리(L-락타드-co-글리콜라이드) 수지, 폴리카프로락톤(PCL) 수지, 폴리라틱애시드(poly lactic acid, PLA) 수지, 폴리글리코릭애시드(poly glycolic acid, PGA) 수지, 키토산, 젤라틴, 콜라겐 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 재질의 층인, 섬유아세포 배양 지지체의 선택 방법.
청구항 1에 있어서, 상기 패턴의 폭과 간격의 길이비가 1: 0.8 내지 1.2이고, 높이가 300 내지 500nm인, 섬유아세포 배양 지지체의 선택 방법.
재생 대상 조직의 세포외기질의 지형학적 밀도에 대응되는 지형학적 밀도를 갖는 배양 지지체 상에서 섬유아세포를 배양하는 단계;를 포함하고,
상기 배양 지지체는 일 방향으로 배열된 복수개의 선형 나노 패턴을 갖는 고분자 패턴층을 포함하고,
상기 배양 지지체의 지형학적 밀도는 고밀도, 중간밀도 또는 저밀도이고,
상기 고밀도는 패턴의 폭과 간격이 300 내지 400nm, 중밀도는 500 내지 600nm, 저밀도는 700 내지 800nm인, 섬유아세포의 체외 배양 방법.
청구항 4에 있어서, 상기 패턴층은 폴리우레탄아크릴레이트(PUA) 수지, 폴리비닐알코올 수지, 폴리에틸렌 수지, 폴리프로필렌 수지, 폴리에틸렌글리콜 수지, 폴리(L-락타드-co-글리콜라이드) 수지, 폴리카프로락톤(PCL) 수지, 폴리라틱애시드(poly lactic acid, PLA) 수지, 폴리글리코릭애시드(poly glycolic acid, PGA) 수지, 키토산, 젤라틴, 콜라겐 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 재질의 층인, 섬유아세포의 체외 배양 방법.
청구항 4에 있어서, 상기 패턴의 폭과 간격의 길이비가 1: 0.8 내지 1.2이고, 높이가 300 내지 500nm인, 섬유아세포의 체외 배양 방법.