KR101224882B1

KR101224882B1 - 히알루론산으로 이루어진 나노섬유 시트 및 그를 이용한 조직배양용 나노섬유 지지체

Info

Publication number: KR101224882B1
Application number: KR1020100036140A
Authority: KR
Inventors: 전흥재; 박영환; 고재훈; 김성진
Original assignee: 가톨릭대학교 산학협력단
Priority date: 2010-04-20
Filing date: 2010-04-20
Publication date: 2013-01-22
Also published as: KR20110116616A

Abstract

본 발명은 히알루론산으로 이루어진 나노섬유 시트 및 그를 이용한 조직배양용 나노섬유 지지체에 관한 것이다.
본 발명은 히알루론산을 전기방사법에 의해 나노섬유 시트를 제조하기 위한, 히알루론산 함유 방사용액의 최적화 및 전기방사성을 개선하기 위한 최적공정을 통하여, 전기방사에 의해 히알루론산 단일소재로 이루어진 나노섬유 시트를 제공하고, 본 발명의 히알루론산 나노섬유 시트는 생체유래 고분자인 히알루론산 단일소재로 구성되므로 생체적합성이 우수하고, 가교제없이 전기방사법에 의해 제조됨으로써, 가교제로 잔류에 따른 독성의 문제가 없고, 나노섬유상의 시트로 제공됨으로써, 나노섬유 고유의 강도 및 유연성을 부여하므로 의료용 재료로서 유용하다.

Description

히알루론산으로 이루어진 나노섬유 시트 및 그를 이용한 조직배양용 나노섬유 지지체{NANOFIBROUS SHEET COMPRISING HYALURONIC ACID AND NANOFIBROUS SCAFFOLD FOR ENHANCED TISSUE REGENERATION USING THE SAME}

본 발명은 히알루론산으로 이루어진 나노섬유 시트 및 그를 이용한 조직배양용 나노섬유 지지체에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 친수성 및 양친화성의 히알루론산을 전기방사법에 의해 나노섬유 시트를 제조하기 위하여 히알루론산 함유방사용액의 최적의 제조조건 및 전기방사성을 개선하기 위한 최적공정을 통하여 제조된 히알루론산 단일소재로 이루어진 나노섬유 시트 및 그를 이용한 조직배양용 나노섬유 지지체에 관한 것이다.

전기방사는 수 kV 이상의 고전압에 의한 정전기력에 의해서 고분자 용액 또는 고분자 용융체가 저장소(reservoir)의 노즐을 통해 그라운드(ground) 처리가 되어있는 집적판으로 이동하면서 수십에서 수백 나노 크기의 단면적을 갖도록 유도하는 연신기술이다. 즉, 외부에서 가해진 전기장이 특정 임계값을 넘어가면 노즐에서 압출된 고분자 용액의 표면에서 발생되는 전하가 고분자 용액의 표면장력보다 커지므로 액체 분사물이 발생된다. 이렇게 발생된 극세사는 전기적으로 발생된 굴곡 불안정성을 거쳐서 초극세사로 연신된다. 이러한 공정은 전기장의 크기와 고분자 용액의 농도를 다양화함으로써 섬유의 굵기를 조절할 수 있다.

전기방사를 통해 제조된 나노섬유의 직경은 수십∼수백 ㎚의 범위로 형성되므로 표면적의 극대화를 구현할 수 있다. 극대화된 표면적은 높은 반응성과 감응성을 나타내어 고성능을 갖출 수 있는데, 나노섬유는 같은 두께의 일반 재료에 비해 높은 강도를 나타내며, 섬유직경이 매우 미세하므로 다른 형태에 비하여 유연성이 매우 우수한 특징을 지니고 있다.

이에 많은 연구자들은 나노섬유의 특성을 의료용도에 적용하고 있는데, 그 일례로 미국특허 제6,685,956호 및 제6,689,374호에는 의료용으로 이용 가능한 생분해성 섬유재료에 대하여 기재하고 있으며, 미국특허 제6,790,455호에는 섬유성 기저층 위에 중간층으로 세포층을 만들고 그 위의 다공성이며, 섬유성인 얇은 상층을 형성하여 산소나 영양분의 전달이 용이하도록 하여 세포의 전달체로 사용하는 방법에 대하여 기재하고 있다. 또한, 미국특허 제6,689,166호에는 생분해성 또는 비분해성 생체적합성의 부직포형 나노섬유를 조직공학용으로 이용하는 방법에 대하여 기재하고 있으며, 미국특허 제6,306,424호에는 생분해성 고분자를 사용하여 3차원의 다공성 폼을 섬유층과 결합시켜 복합체로 제조하여 조직공학용으로 적용하고 있다. 또한, 미국특허 제6,753,454호에는 수용성 고분자 및 약한 소수성 고분자의 균질 혼합용액으로부터 전기방사에 의해 새로운 섬유를 제조하여 창상피복재로서의 활용을 보고하고 있다.

그러나, 상기와 같은 종래기술들은 생분해성 합성고분자를 이용하였으며, 이들은 생체 유래물질이 아니므로 조직 또는 혈액과의 직접 접촉시 염증성 반응을 피할 수 없다는 문제점과 특정한 부위에 고정시키기가 용이하지 않다는 문제점이 있다.

이에, 최근에는 생분해성 합성고분자의 문제점을 극복하기 위해서 생체유래 고분자를 사용하는 일례가 늘어나고 있다.

대표적인 생체유래 고분자로서, 하기 화학식 1로 표시되는 히알루론산(hyaluronic acid)은 동물 피부에 많이 존재하는 생체합성 천연물질로서, 우수한 생체 적합성과 생분해성을 가지는 특성으로 인하여 조직배양을 위한 지지체의 재료로 널리 사용되는 천연고분자이다.

그러나, 히알루론산은 분자 내 수산화기(-OH)가 많은 친수성 고분자로서, 가교하는 경우에도 물과 접촉시 다량의 물을 함유하고 기계적 강도가 약하게 되어 취급이 용이하지 않다는 단점이 있다.

또한, 분해기간을 조절하기 위하여 이를 화학적으로 가교하는 기술이 다수 공개되었으나, 이와 같은 가교 히알루론산은 본질적으로 히알루론산 그 자체가 아닐 뿐 아니라, 가교제를 제거하기 위한 별도의 조작이 필요하고, 가교제의 잔류를 완전히 부정하는 것이 어려운 것이므로, 생체 내에 적용되는 물질에 요망되는 특성 중 무독성, 무항원성을 보증할 수는 없다.

따라서, 히알루론산은 분자 내 수산화기(-OH)가 많아 친수성을 띠고, 고분자 자체의 양전하성으로 인하여, 히알루론산 단독소재로 전기방사하는 데 제약이 있으며, 그로 인해 전기방사법에 의한 나노섬유 제조에 관한 보고는 아직까지 없었다.

이에, 본 발명자들은 가교제 등을 사용하지 않고 히알루론산 단일소재를 전기방사법에 의해 나노섬유 시트를 제조하기 위하여, 히알루론산 함유방사용액의 최적 제조조건 및 전기방사성을 개선하기 위한 최적공정을 안출함으로써, 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 히알루론산 함유 방사용액으로부터 전기방사에 의해 집적된 히알루론산 단일소재로 이루어진 나노섬유 시트를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 히알루론산의 친수성과 양전하성을 제어할 수 있도록 최적의 방사용액 및 그 방사용액의 전기전도도를 개선으로부터 구현한 히알루론산 나노섬유 시트의 제조방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 히알루론산 단일소재로 이루어진 나노섬유 시트를 이용한 조직배양용 나노섬유 지지체를 제공하는 것이다.

본 발명은 스트렙토코커스 주에피데미커스(Streptococcus zooepidemicus)에서 추출된 생체유래 히알루론산 단일소재가 전기방사에 의해 집적된 히알루론산 나노섬유 시트를 제공한다. 이때, 100 내지 1,000nm 직경을 가지는 히알루론산 나노섬유 시트인 것을 특징으로 한다.

본 발명의 히알루론산 나노섬유 시트는 스트렙토코커스 주에피데미커스(Streptococcus zooepidemicus)에서 추출된 무게평균분자량 100,000 내지 1,600,000 달턴(Da)에서 선택되며, 용해성을 높이기 위해 말단기가 Na로 치환된 히알루론산을 사용한다.

본 발명은 스트렙토코커스 주에피데미커스(Streptococcus zooepidemicus)로부터 추출한 히알루론산 12 내지 20중량%를 0.2 내지 1.0N의 수산화나트륨 또는 수산화칼륨에서 선택되는 알칼리용매에 용해시켜 방사용액을 준비하고, 상기 방사용액을 전기방사하는 공정으로 수행되는 제1실시형태의 히알루론산 나노섬유 시트의 제조방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 스트렙토코커스 주에피데미커스(Streptococcus zooepidemicus)로부터 추출한 히알루론산 12 내지 20중량%를 0.2 내지 1.0N의 수산화나트륨 또는 수산화칼륨에서 선택되는 알칼리용매에 용해시켜 수용액을 준비하고, 상기 수용액 중 상기 히알루론산 중량대비, 알칼리 염 0.5 내지 3중량%를 더 첨가하여 방사용액을 준비하고, 상기 방사용액을 전기방사하는 공정으로 수행되는 제2실시형태의 히알루론산 나노섬유 시트의 제조방법을 제공한다.

이때, 본 발명의 제1실시형태 및 제2실시형태의 제조방법에서, 히알루론산은 스트렙토코커스 주에피데미커스(Streptococcus zooepidemicus)로부터 추출한 무게평균분자량 100,000 내지 1,600,000 달턴(Da)에서 선택되며, 더욱 바람직하게는 156,000 내지 1,590,000 달턴(Da)내에서 선택되는 것을 사용한다.

또한, 제1실시형태 및 제2실시형태의 제조방법에서 히알루론산 함유 방사용액의 점도는 2000 내지 3500cP이 바람직하다.

특히, 제2실시형태의 제조방법에서 사용되는 알칼리 염은 염화나트륨 또는 염화칼슘이며, 알칼리 염을 더 첨가함으로써, 제2실시형태의 히알루론산 함유 방사용액의 전기전도도가 800mS 이상, 더욱 바람직하게는 800 내지 1000mS로 향상된다.

본 발명의 제1실시형태 및 제2실시형태의 제조방법에서 전기방사는 전압이 1∼60kV이며, 집적거리가 1∼60㎝이며, 유속이 1 내지 80㎖/min인 조건에서 수행된다.

나아가, 본 발명은 제2실시형태의 제조방법에서 제조된 히알루론산 나노섬유 시트는 의료용 재료로서 요구되는 물성을 충족하므로, 그를 이용한 조직배양용 나노섬유 지지체를 제공한다.

본 발명에 따라, 히알루론산의 친수성 및 양친화성으로 인해 전기방사 적용에 어려운 문제점을 히알루론산 함유방사용액의 최적 제조조건 및 전기방사성을 개선하여, 히알루론산 단일소재로 이루어진 나노섬유상의 시트를 제공할 수 있다.

또한, 히알루론산 함유 방사용액에 알칼리 염을 추가 첨가하여 전기전도도를 개선하여 의료용 재료로서의 사용 가능한 정도의 물성을 충족시킬 수 있는 히알루론산 나노섬유 시트를 제공할 수 있다.

나아가, 본 발명의 히알루론산 나노섬유 시트는 조직배양용 나노섬유 지지체로 유용하게 활용될 수 있다.

도 1은 본 발명의 실시예 1에서 제조된 히알루론산 나노섬유 시트를 주사전자현미경으로 관찰한 표면결과이고,
도 2는 본 발명의 실시예 2에서 제조된 히알루론산 나노섬유 시트를 주사전자현미경으로 관찰한 표면결과이고,
도 3은 본 발명의 비교예 1에서 제조된 히알루론산 시트를 주사전자현미경으로 관찰한 표면결과이고,
도 4는 본 발명의 비교예 2에서 제조된 히알루론산 시트를 주사전자현미경으로 관찰한 표면결과이고,
도 5는 본 발명의 히알루론산 나노섬유 시트 제조시, 히알루론산 농도에 따른 히알루론산 함유방사용액의 점도변화를 관찰한 결과이고,
도 6은 본 발명의 실시예 4에서 제조된 히알루론산 나노섬유 시트의 표면결과이고,
도 7은 본 발명의 실시예 5에서 제조된 히알루론산 나노섬유 시트의 표면결과이고,
도 8은 본 발명의 히알루론산 나노섬유 시트 제조시, 염 첨가에 따른 히알루론산 함유방사용액의 전기전도도변화를 관찰한 결과이고,
도 9는 본 발명의 히알루론산 나노섬유 시트에 세포배양 3일 경과 후, 세포증식을 관찰한 사진이다.

이하, 본 발명을 상세히 설명하고자 한다.

본 발명은 스트렙토코커스 주에피데미커스(Streptococcus zooepidemicus)에서 추출된 생체유래 히알루론산 단일소재가 전기방사에 의해 집적된 100 내지 1,000nm 직경을 가지는 히알루론산 나노섬유 시트를 제공한다.

본 발명의 히알루론산은 스트렙토코커스 주에피데미커스(Streptococcus zooepidemicus)에서 추출된 무게평균분자량 100,000 내지 1,600,000 달턴(Da), 더욱 바람직하게는 156,000 내지 1,590,000 달턴(Da)내에서 선택 사용하며, 용해성을 높이기 위해 말단기가 Na로 치환된 것을 사용한다. 이때, 히알루론산의 무게평균분자량 100,000 달턴(Da)미만이면, 가수분해가 너무 빠르고 최종 제조된 시트의 안정성이 떨어지고, 1,600,000 달턴(Da)을 초과하면, 나노섬유 제조 수율이 떨어져 바람직하지 않다.

본 발명의 나노섬유 시트는 100 내지 1,000nm의 직경을 가지는 히알루론산 단일소재로 이루어진 것이다.

이하, 본 발명의 히알루론산 단일소재로 이루어진 나노섬유 시트의 제조방법을 설명하면, 1)스트렙토코커스 주에피데미커스(Streptococcus zooepidemicus)로부터 추출한 히알루론산 12 내지 20중량%를 0.2 내지 1.0N의 수산화나트륨 또는 수산화칼륨에서 선택되는 알칼리용매에 용해시켜 방사용액을 준비하고, 2)상기 방사용액을 전기방사하는 공정으로 수행되는 제1실시형태의 히알루론산 나노섬유 시트의 제조방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 1) 스트렙토코커스 주에피데미커스(Streptococcus zooepidemicus)로부터 추출한 히알루론산 12 내지 20중량%를 0.2 내지 1.0N의 수산화나트륨 또는 수산화칼륨에서 선택되는 알칼리용매에 용해시켜 수용액을 준비하고, 2) 상기 수용액 중 상기 히알루론산 중량대비, 알칼리 염 0.5 내지 3중량%를 더 첨가하여 방사용액을 준비하고, 3) 상기 방사용액을 전기방사하는 공정으로 수행되는 제2실시형태의 히알루론산 나노섬유 시트의 제조방법을 제공한다.

이때, 본 발명의 제1실시형태 및 제2실시형태의 제조방법의 제1단계에서 사용되는 히알루론산은 스트렙토코커스 주에피데미커스(Streptococcus zooepidemicus)로부터 추출한 생체유래 히알루론산으로서, 무게평균분자량 100,000 내지 1,600,000 달턴(Da)에서 선택되며, 더욱 바람직하게는 156,000 내지 1,590,000 달턴(Da)내에서 선택되는 것을 사용한다.

또한, 전기방사법으로 나노섬유 시트를 제조하기 위한 히알루론산은 N,N-디메틸포름알데히드(DMF) 또는 1,1,1,3,3,3-헥사플로오르-2-프로판올(HFIP), 에탄올, 메탄올과 같은 극성용매에는 불용성이며, 순수한 물이나 수산화나트륨(NaOH) 수용액 또는 수산화칼륨(KOH) 수용액과 같이 물이 함유된 수용액에는 용해되는 특징이다.

이에, 본 발명에서 히알루론산을 용해시킬 수 있는 바람직한 용매는 수산화나트륨 수용액 또는 수산화칼륨 수용액에서 선택되는 알칼리용매를 사용한다. 본 발명의 실시예에서는 가장 바람직한 일례로 0.5N의 수산화나트륨 수용액을 사용하나 이에 한정되는 것은 아니며 바람직한 알칼리용매의 농도는 0.2 내지 1.0N에 히알루론산을 용해시켜 전기방사하는 것이다. 이때, 알칼리용매의 농도가 0.2N 미만이면, 방사용액의 전기전도도가 너무 낮아 전기방사방법을 사용하여 나노섬유를 제조하는데 바람직하지 않고, 알칼리용매의 농도가 1.0N 초과범위에서는 방사용액 자체에 생체독성이 증가하여 조직공학 지지체로 사용하는데 적합하지 않다.

본 발명의 제1실시형태 및 제2실시형태의 제조방법에서 히알루론산이 알칼리용매에 용해된 방사용액의 점도는 2000 내지 3500cP이 바람직하다.

구체적으로 설명하면, 본 발명의 히알루론산 함유 방사용액에서, 히알루론산의 함량농도가 12중량%일 때, 방사용액의 점도가 2000cP이상으로 증가하고, 14중량%이면 방사용액의 점도가 3500cP로서, 히알루론산 단일소재의 전기방사로 나노섬유를 제조할 수 있다[도 1 및 도 2]. 따라서, 본 발명의 히알루론산 함유 방사용액에서 히알루론산의 함량농도는 12중량% 이상을 함유할 때, 나노섬유형성이 관찰된다. 이때, 히알루론산의 농도가 12중량% 미만이면, 전기방사에 의해 집적된 시트표면에 비드가 발견되므로 바람직하지 않다[도 3 및 도 4]. 이에, 히알루론산 함유 방사용액의 점도가 2000cP 이상이면, 나노섬유가 형성되므로 적용가능하며, 더욱 바람직한 방사용액의 점도로는 2000 내지 3500cP 범위 내에서 나노섬유 형성을 구현할 수 있다[도 5]. 또한, 본 발명의 히알루론산 함유 방사용액에서 히알루론산의 함량이 20중량%를 초과하면, 용해가 어렵고, 용해를 위하여 온도를 올려야 하는데, 고온에서 생체고분자가 파괴되거나 분해되므로 바람직하지 않다.

본 발명의 제2실시형태의 히알루론산 나노섬유 시트의 제조방법에서 제2단계는 히알루론산 함유 방사용액에, 염화나트륨 또는 염화칼슘에서 선택되는 알칼리 염을 더 함유함으로써, 방사용액의 전기전도도가 800 mS이상, 더욱 바람직하게는 알칼리 염의 함량이 증가할수록 800 내지 1000mS 범위로 증가함으로써[도 8], 전기방사성이 향상된다. 따라서 염을 첨가하기 이전의 순수한 히알루론산 함유용액보다 넓게 퍼지고, 용액이 튀는 현상도 완화된다. 따라서, 염화나트륨 또는 염화칼슘에서 선택되는 알칼리 염을 더 함유함으로써, 전기방사에 의한 나노섬유 형성이 더욱 유리하다.

이에, 제2실시형태의 히알루론산 나노섬유 시트의 제조방법을 통해 제조된 히알루론산 나노섬유 시트의 표면은 염을 첨가하기 이전의 시트표면[도 1]보다 균일한 크기의 나노섬유상 분포를 확인할 수 있다[도 6]. 특히 염화나트륨의 염을 3중량%로 첨가한 경우, 평균직경은 141 nm이고 표준편차는 31 nm인 히알루론산 나노섬유상의 시트를 관찰할 수 있다[도 7].

이때, 염화나트륨 또는 염화칼슘에서 선택되는 알칼리 염의 첨가량은 히알루론산 함유 방사용액에 사용되는 히알루론산 중량대비, 0.5 내지 3중량%의 알칼리 염을 첨가하는 것이다. 상기 함량범위보다 미만이면, 전기방사성 개선효과가 미비하거나, 3중량%를 초과하면, 과도한 염사용으로 인하여 최종 제조된 나노섬유의 물성을 오히려 저하시키므로 바람직하지 않다.

본 발명의 제1실시형태 및 제2실시형태의 제조방법에서 수행되는 제2단계 또는 제3단계의 전기방사는 전압이 1∼60kV이며, 집적거리가 1∼60㎝이며, 유속이 1 내지 80㎖/min인 조건에서 수행한다.

나아가, 전기방사성이 향상되어 제조된 본 발명의 제2실시형태의 히알루론산 나노섬유 시트는 생체적합성 및 세포친화성이 우수하여 의료용 재료로서의 유용하게 활용할 수 있으며, 특히, 본 발명의 히알루론산 단일소재로 이루어진 나노섬유 시트는 생체유래 고분자인 히알루론산만으로 이루어지므로 생체적합성이 우수하고, 가교제없이 전기방사법에 의해 제조됨으로써, 가교제로 잔류에 따른 독성의 문제가 없고, 나노섬유상의 시트로 제공됨으로써, 나노섬유 고유의 강도 및 유연성을 부여하므로 조직배양용 나노섬유 지지체로서 유용하다.

도 9는 본 발명의 히알루론산 나노섬유 시트에 세포배양 3일 경과 후, 세포증식을 관찰한 사진으로서, 세포가 나노섬유 시트 상에서 고르게 잘 퍼져 증식한 결과를 확인할 수 있다. 이에, 본 발명의 히알루론산 나노섬유 시트는 세포의 성장에 치명적인 영향을 끼치지 않는 생체적합성 및 세포친화성이 우수한 소재로서 의료용 재료로 활용될 수 있다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다.

본 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것이며, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1> 히알루론산 나노섬유 시트 제조

스트렙토코커스 주에피데미커스(Streptococcus zooepidemicus)에서 추출한 히알루론산을 0.5N의 수산화나트륨(NaOH) 수용액에 12중량% 농도로 용해되도록 방사용액을 준비하였다. 이때, 히알루론산은 무게평균분자량 156,000 달턴(Da)이고, 용해성을 높이기 위하여, 말단기가 Na로 치환된 형태를 사용하였다. 상기 방사용액을 금속실린지에 충진하고, 전기방사 장치를 이용하여 방사구 선단부에서 집적판까지의 거리는 12 cm로 고정하고, 분사되는 용액에 48 kV(4 kV/cm)의 고전압을 설정한 후, 1.2㎖/h의 토출량으로 밀어주면서 전기 방사하여 히알루론산 나노섬유 시트를 제조하였다. 이때, 사용한 주사기 바늘은 26 게이지(ID=0.241 mm)였다.

<실시예 2> 히알루론산 나노섬유 시트 제조

방사용액 제조 시, 0.5N의 수산화나트륨 수용액에 히알루론산나트륨 14중량% 농도로 제조하는 것을 제외하고는, 상기 실시예 1과 동일한 방법으로 전기 방사하여 히알루론산 나노섬유 시트를 제조하였다.

<비교예 1> 히알루론산 시트 제조

방사용액 제조 시, 0.5N의 수산화나트륨 수용액에 히알루론산나트륨 6중량% 농도로 제조하는 것을 제외하고는, 상기 실시예 1과 동일한 방법으로 전기 방사하여 히알루론산 시트를 제조하였다.

<비교예 2> 히알루론산 시트 제조

방사용액 제조 시, 0.5N의 수산화나트륨 수용액에 히알루론산나트륨 8중량% 농도로 제조하는 것을 제외하고는, 상기 실시예 1과 동일한 방법으로 전기 방사하여 히알루론산 시트를 제조하였다.

<비교예 3> 히알루론산 시트 제조

방사용액 제조 시, 0.5N의 수산화나트륨 수용액에 히알루론산나트륨 10중량% 농도로 제조하는 것을 제외하고는, 상기 실시예 1과 동일한 방법으로 전기 방사하여 히알루론산 시트를 제조하였다.

<실험예 1> 시트의 표면관찰

실시예 1 내지 2 및 비교예 1 내지 3에서 전기방사에 의해 제조된 히알루론산 시트에 대하여, 주사전자현미경(JSM 5510)으로 1,500배 및 10,000배 확대하여 시트 표면을 관찰하였다.

도 1은 실시예 1에서 제조된 시트를 1,500배로 표면을 관찰한 결과 섬유웹 형태로 관찰되었고, 동일표면을 10,000배의 고배율로 확대하면 섬유웹간에 미세한 비드형상이 관찰되었다.

도 2는 실시예 2에서 제조된 시트를 1,500배 및 10,000배 확대하여 표면을 관찰한 결과로서, 비드형상없이 균일한 크기의 나노섬유상으로 관찰되었다.

반면에, 도 3 및 도 4는 비교예 1 및 비교예 2에서 제조된 시트 표면에 대한 주사전자현미경 측정결과로서, 시트 표면상에 비드형상이 관찰되었으며, 히알루론산 농도가 낮을수록 표면상에 형성된 비드의 크기 및 개수가 증가함을 관찰하였다.

<실험예 2> 히알루론산 농도에 따른 점도변화

실시예 1 내지 2 및 비교예 1 내지 3에서 전기방사에 의해 히알루론산 시트 제조시, 0.5N의 수산화나트륨 수용액에 히알루론산나트륨의 농도변화에 따른 방사용액의 점도를 측정하였다. 그 결과를 하기 표 1 및 도 5에 기재하였다.

상기 표 1 및 도 5에서 보이는 바와 같이, 히알루론산나트륨의 함량이 증가할수록 방사용액의 점도가 증가하며, 그 농도가 12중량% 이상일 때, 방사용액의 점도가 2000cP이상으로 급격히 증가하였다. 그 결과로부터, 방사용액이 점도가 2,000cP 이상을 충촉하는 히알루론산 농도범위에서 전기방사시, 나노섬유가 생성됨을 확인하였다.

<실시예 3> 히알루론산 나노섬유 시트 제조

스트렙토코커스 주에피데미커스(Streptococcus zooepidemicus)에서 추출한 무게평균분자량 156,000 달턴(Da)이고, 히알루론산나트륨을 0.5N의 수산화나트륨 수용액에 12중량% 농도로 용해되도록 방사용액을 준비하고[방사용액의 점도 3500cP], 상기 방사용액 내 히알루론산나트륨 함량 대비 염화나트륨(NaCl) 1중량%를 첨가한 방사용액을 금속실린지에 충진하였다. 이후, 전기방사 장치를 이용하여 방사구 선단부에서 집적판까지의 거리는 12 cm로 고정하고, 분사되는 용액에 48 kV(4 kV/cm)의 고전압을 설정한 후, 1.2㎖/h의 토출량으로 밀어주면서 전기 방사하여 히알루론산 나노섬유 시트를 제조하였다. 이때, 사용한 주사기 바늘은 26 게이지(ID=0.241 mm)를 사용하였다.

<실시예 4> 히알루론산 나노섬유 시트 제조

방사용액 제조 시, 방사용액 내 히알루론산나트륨 함량 대비 염화나트륨(NaCl) 2중량%를 첨가하는 것을 제외하고는, 상기 실시예 3과 동일한 방법으로 전기 방사하여 히알루론산 나노섬유 시트를 제조하였다.

<실시예 5> 히알루론산 나노섬유 시트 제조

방사용액 제조 시, 방사용액 내 히알루론산나트륨 함량 대비 염화나트륨(NaCl) 3중량%를 첨가하는 것을 제외하고는, 상기 실시예 3과 동일한 방법으로 전기 방사하여 히알루론산 나노섬유 시트를 제조하였다.

<실험예 3> 염 첨가에 따라 제조된 시트의 표면관찰

상기 실시예 1에서 사용된 0.5N의 수산화나트륨에 히알루론산나트륨이 함유된 방사용액에 염화나트륨(NaCl)의 염을 농도별로 첨가하여 제조된 실시예 3 내지 실시예 5의 히알루론산 나노섬유 시트 표면을 주사전자현미경(JSM 5510)으로 10,000배 확대하여 관찰하였다.

도 6은 실시예 4에서 제조된 히알루론산 나노섬유 시트의 표면결과로서, 실시예 1에서 제조된 시트표면보다 균일한 섬유상을 확인하였다.

도 7은 실시예 5에서 제조된 시트 표면으로서, 평균직경 141nm이고 표준편차가 31nm로 균일하게 분포된 나노섬유웹을 확인하였다. 특히, 실시예 5에서는 히알루론산 함유용액에 염화나트륨(NaCl) 3중량%를 첨가한 방사용액을 이용함으로써, 염 첨가이전의 방사용액보다 전기방사 결과 넓게 퍼지고, 용액이 튀는 현상도 급격히 감소하였다.

<실험예 4> 염 첨가에 따른 방사용액의 전기전도도 측정

실시예 3 내지 실시예 5에서 제조된 히알루론산 나노섬유 시트 제조시 사용된 방사용액의 전기전도도(mS)를 측정하였다. 구체적으로, 실시예 1에서 0.5N의 수산화나트륨 수용액에 히알루론산나트륨 12중량% 농도로 제조된 방사용액에 염화나트륨(NaCl)의 염 첨가량에 따른 방사용액의 전기전도도(mS) 변화를 측정하였다. 그 결과를 하기 표 2 및 도 8에 기재하였다.

상기 표 2 및 도 8에서는 확인되는 바와 같이, 전기방사에 의해 나노섬유 형성 가능한 히알루론산 방사용액에 염화나트륨(NaCl)의 염을 첨가하면 그 농도에 비례하여, 전기전도도가 증가함을 확인하였다. 따라서, 히알루론산 방사용액의 전기전도도를 제어함으로써, 전기방사성을 향상시킨 히알루론산 단독소재로 이루어진 나노섬유 시트를 제공할 수 있다.

<실험예 5> 세포증식 및 점착 확인실험

상기 실시예 5에서 제조된 나노섬유 시트를 택하여, 실험 하루 전에 시트표면이 일정한 부분을 절단하여 샘플로 취한 후, 24 웰에 넣은 후 자외선으로 멸균을 하였다. 섬유아세포인 L-929 세포를 배양 전, PBS(Welgene, Daegu, South Korea)를 사용한 세척을 통해, 예비 적시기(pre wetting)을 유도한 후, 2㎖의 매개체(complete media, RPMI, FBS10%, PS 1%, Gibco, USA)와 함께 10⁴개 세포를 넣어주었다. 3일 경과 후, PBS로 세척한 후 2.5% 글루타알데히드(glutaraldehyde)로 시트 위의 세포(cell)를 고정하였다. 정제이온수로 20배 희석된 염색용액(Gimesa's solution)을 사용하여 염색한 후, 그 배양결과를 광학현미경으로 1,000배 관찰하였다. 도 9의 결과, 본 발명에서 제조된 히알루론산으로 이루어진 나노섬유 시트 상에서 세포가 고르게 잘 퍼져 자라있는 것을 확인하였다.

상기 결과로부터, 본 발명의 히알루론산으로 이루어진 나노섬유 시트는 세포의 성장에 치명적인 영향을 끼치지 않으므로, 생체적합성 및 세포친화성이 우수한 의료용 재료로서 활용가능함을 확인하였다.

상기에서 살펴본 바와 같이,

본 발명은 전기방법에 의해 히알루론산 단일소재로 이루어진 나노섬유상의 시트를 제공하였다.

또한, 본 발명은 친수성 및 양친화성의 히알루론산을 전기방사법에 의해 나노섬유 시트를 제조하기 위하여 히알루론산 함유방사용액의 최적의 제조조건 및 전기방사성을 개선하기 위한 최적공정을 제공하였다.

나아가, 본 발명은 생체유래의 히알루론산을 가교제없이 전기방사법에 의해 히알루론산 단일소재로 이루어진 나노섬유상의 시트를 제공함으로써, 가교제로 잔류에 따른 독성의 문제가 없고 생체 내에 적용하기에 유리하며, 나노섬유 고유의 강도 및 유연성을 부여하므로, 조직배양용 지지체, 유착방지제 등의 의료용 재료로서 유용하다.

이상에서 본 발명은 기재된 구체예에 대해서만 상세히 설명되었지만 본 발명의 기술사상 범위 내에서 다양한 변형 및 수정이 가능함은 당업자에게 있어서 명백한 것이며, 이러한 변형 및 수정이 첨부된 특허청구범위에 속함은 당연한 것이다.

Claims

삭제
삭제
스트렙토코커스 주에피데미커스(Streptococcus zooepidemicus)로부터 추출한 히알루론산 12 내지 20중량%를 0.2 내지 1.0N의 수산화나트륨 또는 수산화칼륨에서 선택되는 알칼리용매에 용해시켜 방사용액을 준비하고,
상기 방사용액을 전기방사하는 공정으로 수행되는 히알루론산 나노섬유 시트의 제조방법.
스트렙토코커스 주에피데미커스(Streptococcus zooepidemicus)로부터 추출한 히알루론산 12 내지 20중량%를 0.2 내지 1.0N의 수산화나트륨 또는 수산화칼륨에서 선택되는 알칼리용매에 용해시켜 수용액을 준비하고,
상기 수용액 중 상기 히알루론산 중량대비, 알칼리 염 0.5 내지 3중량%를 더 첨가하여 방사용액을 준비하고,
상기 방사용액을 전기방사하는 공정으로 수행되는 히알루론산 나노섬유 시트의 제조방법.
제3항 또는 제4항에 있어서, 상기 히알루론산이 무게평균분자량 100,000 내지 1,600,000 달턴(Da)에서 선택되는 것을 특징으로 하는 상기 히알루론산 나노섬유 시트의 제조방법.
제3항 또는 제4항에 있어서, 상기 히알루론산이 말단에 나트륨이 치환된 형태인 것을 특징으로 하는 상기 히알루론산 나노섬유 시트의 제조방법.
제3항 또는 제4항에 있어서, 히알루론산 함유 방사용액의 점도가 2000 내지 3500cP인 것을 특징으로 하는 상기 히알루론산 나노섬유 시트의 제조방법.
제4항에 있어서, 상기 알칼리 염이 염화나트륨 또는 염화칼슘에서 선택되는 것을 특징으로 하는 상기 히알루론산 나노섬유 시트의 제조방법.
제4항에 있어서, 히알루론산 함유 방사용액의 전기전도도가 800mS 내지 1000mS인 것을 특징으로 하는 상기 히알루론산 나노섬유 시트의 제조방법.
제4항의 제조방법으로부터 제조된 히알루론산 나노섬유 시트로 이루어진 조직배양용 나노섬유 지지체.