WO2012175164A1

WO2012175164A1 - Stabile, wässrige protein-lösung oder protein-dispersion, verfahren zur herstellung der stabilen, wässrigen lösung oder dispersion und verfahren zur herstellung von form- oder flächengebilden, imprägnierungen oder beschichtungen aus der stabilen, wässrigen protein-lösung oder protein-dispersion sowie deren verwendung

Info

Publication number: WO2012175164A1
Application number: PCT/EP2012/002034
Authority: WO
Inventors: Wiebke SCHMITZ; Gunter Scharfenberger; Ulrike Herrlich
Original assignee: Carl Freudenberg Kg
Priority date: 2011-06-20
Filing date: 2012-04-20
Publication date: 2012-12-27
Also published as: DE102011105369A1

Abstract

Es soll eine gesundheitlich unbedenkliche und/oder eine besonders umweltfreundliche und besonders stabile sowie hochkonzentrierte Lösung oder Dispersion aus zumindest einem selbstassemblierenden Protein bereitgestellt werden, die eine effiziente bzw. verbesserte Herstellung von reinen Protein-Formgebilden oder -Flächengebilden, Protein-Imprägnierungen oder -Beschichtungen mit einem breiten Anwendungsfeld ermöglicht. Erfindungsgemäß umfasst die stabile Protein-Lösung oder Protein-Dispersion in einer wässrigen Lösung wenigstens ein selbstassemblierendes Protein und wenigstens ein Stabilisierungsmittel für das selbstassemblierende Protein, wobei das Stabilisierungsmittel wenigstens eine Aminosäure umfasst.

Description

Stabile, wässrige Protein-Lösung oder Protein-Dispersion, Verfahren zur Herstellung der stabilen, wässrigen Lösung oder Dispersion und

Verfahren zur Herstellung von Form- oder Flächengebilden, Imprägnierungen oder Beschichtungen aus der stabilen, wässrigen

Protein-Lösung oder Protein-Dispersion sowie deren Verwendung

Beschreibung

Die vorliegende Erfindung betrifft eine stabile, wässrige Lösung oder eine stabile, wässrige Dispersion mit zumindest einem selbstassemblierenden Protein. Des Weiteren betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung der stabilen, wässrigen Protein-Lösung oder Protein-Dispersion, ein Verfahren zur Elektro- oder Rotorverspinnung von selbstassemblierendem Protein unter

Verwendung der stabilen, wässrigen Protein-Lösung oder Protein-Dispersion, Verfahren zur Herstellung von Form- oder Flächengebilden, von

Imprägnierungen oder von Beschichtungen aus der stabilen, wässrigen Protein- Lösung oder Protein-Dispersion sowie die Verwendung der stabilen, wässrigen Protein-Lösung oder Protein-Dispersion bzw. der daraus hergestellten Formoder Flächengebilde, Imprägnierungen oder Beschichtungen.

Unter Form- oder Flächengebilden werden hier insbesondere Fasern,

Fasergebilde, Gele, Folien, Filme, Schäume oder Kombinationen daraus verstanden.

BESTÄTIGUNGSKOPIE Unter einem Fasergebilde wird hier insbesondere eine geordnete oder ungeordnete ein- oder mehrlagige Zusammenlagerung einer Vielzahl von Fasern verstanden oder auch dreidimensionale Anordnungen der Fasern oder eine Kombination mit Trägern. Bevorzugte Fasergebilde sind hier Vliesstoffe.

Die selbstassemblierenden Proteine sind aus Polypeptiden aufgebaut. Diese setzen sich aus Aminosäuren, insbesondere aus den 20 natürlich

vorkommenden Aminosäuren, zusammen. Die Aminosäuren können dabei modifiziert sein, zum Beispiel acetyliert sein. Die selbstassemblierenden Proteine sind insbesondere intrinsisch entfaltete Proteine oder Microbead- bildende Proteine. Beispielhafte Proteine sind seidenähnliche Proteine, Seidenproteine oder Spinnenseidenproteine. Die Proteine können natürlichen Ursprungs oder synthetisch, zum Beispiel durch rekombinante Herstellung, sein.

Die selbstassemblierenden Proteine besitzen die Eigenschaft, dass sie in konzentrierten, wässrigen Lösungen oder Dispersionen instabil sind. Durch die hydrophoben Anteile fällt das Protein aus oder die Lösung geliert. Dadurch lassen sich die Proteine normalerweise nicht ohne weitere Zusätze, wie zum Beispiel Polymere oder Spinnhilfsmittel, aus wässriger Lösung oder Dispersion zu Fasergebilden verarbeiten.

Stand der Technik

Aus dem Patent US 6110590 ist das Elektrospinnen von synthetisch

hergestellter Seide aus Hexafluoroisopropanol bekannt.

In der JP 2010 270426 A wird ein Verfahren beschrieben, in denen

Seidenproteine aus konzentrierter Ameisensäure, aus Hexafluoroacetonhydrat oder aus Hexafluoroisopropanol, versponnen werden. Das Elektrospinnen erfolgt dabei bei erhöhter Temperatur, um das Gelieren der Spinnlösung zu verhindern. Dies kann allerdings bei längerer, kontinuierlicher Verarbeitung eine Schädigung des Proteins bedingen.

Der Einsatz von organischen Lösungsmitteln ist aus Aspekten des

Arbeitsschutzes und/oder des Umweltschutzes ebenfalls häufig nicht wünschenswert. Die JP 2010-150712 beschreibt das Elektrospinnen einer wässrigen,

Seidenproteinlösung der Seidenraupe unter Zusatz eines nichtionischen Tensids und eines wasserlöslichen Polymers. Der Zusatz von nichtionischem Tensid kann jedoch im Hinblick auf Anwendungen im medizinischen Bereich gesundheitlich bedenklich sein.

Darstellung der Erfindung

Die vorliegende Erfindung hat sich die Aufgabe gestellt, eine gesundheitlich unbedenkliche und/oder eine besonders umweltfreundliche und besonders stabile sowie hochkonzentrierte Lösung oder Dispersion aus zumindest einem selbstassemblierenden Protein anzugeben bzw. herzustellen, die eine effiziente bzw. verbesserte Herstellung von reinen Protein-Formgebilden oder - Flächengebilden, Protein-Imprägnierungen oder -Beschichtungen mit einem breiten Anwendungsfeld ermöglicht.

Die konzentrierte Protein-Lösung oder Dispersion soll sich daher durch eine besonders hohe Konzentration und Stabilität auszeichnen.

So soll insbesondere die Herstellung von Protein-Fasern oder -Fasergebilden, insbesondere von Vliesstoffen, mittels Elektro- oder Rotorspinnverfahren ermöglicht bzw. verbessert werden. Zudem sollen sich Protein-Schäume, -Gele, -Filme, -Folien oder Protein-Imprägnierungen oder -Beschichtungen aus konzentrierter, wässriger Protein-Lösung oder -Dispersion herstellen lassen. Des Weiteren soll die stabile Protein-Lösung oder -Dispersion bzw. sollen die daraus hergestellten Form- oder Flächengebilde, Beschichtungen oder

Imprägnierungen besonders geeignet für den medizinischen Bereich sein, bevorzugt für oder als Wundauflagen, Operationsnahtmaterialien oder als biokompatible Beschichtung von Oberflächen, insbesondere Fasern,

Fasergebilden, wie Garnen oder Vliesstoffen, Gewebekonstruktionen bzw.

Gewebezüchtungen (Tissue Engineering Scaffolds), medizinische Textilien, Schläuche, Implantate oder Schäume, als hypoallergene Oberflächen, für Kosmetikprodukte, für Hygieneprodukte, für Haushaltsprodukte und/oder für Filteranwendungen, zum Beispiel Tabak- und Motorenfilter.

Erfindungsgemäß umfasst die stabile Protein-Lösung oder Protein-Dispersion in einer wässrigen Lösung oder Dispersion wenigstens ein selbstassemblierendes Protein und wenigstens ein Stabilisierungsmittel für das selbstassemblierende Protein, wobei das Stabilisierungsmittel wenigstens eine Aminosäure umfasst, bevorzugt eine oder mehrere monomere Aminosäure(n).

Durch die Wasserbasis liegt eine besonders umweltfreundliche Lösung vor.

Stark hydrophobe Proteine weisen in wässriger Lösung eine sehr schlechte Löslichkeit auf. Ohne Stabilisierung können nur verdünnte, wässrige Protein- Lösungen hergestellt werden. Durch die geringe Konzentration lassen sich diese Lösungen oder Dispersionen beispielsweise nicht ohne weitere Zusätze, wie beispielsweise Polymere oder Spinnhilfsmittel, zu Fasergebilden

verarbeiten. Zudem werden in diesen verdünnten Lösungen größere Mengen an Zusätzen benötigt. Durch die Erfindung können hingegen auch reine, wässrige Protein-Lösungen oder -Dispersionen in sehr hoher Konzentration und mit hoher Stabilität hergestellt werden.

Unter der erfindungsgemäßen stabilen Protein-Lösung oder Protein-Dispersion wird hier eine Stabilität von mindestens 5 Stunden, bevorzugt von mehr als 12 Stunden, besonders bevorzugt von mehr als 20 Stunden oder sogar von mehr als 48 Stunden verstanden.

Diese können mittels Spinnverfahren zu Fasern oder Fasergebilden,

beispielsweise zu Vliesstoffen, verarbeitet werden, insbesondere mittels

Elektro- oder Rotorspinnen. Vorzugsweise liegt das Stabilisierungsmittel in einem Konzentrationsbereich von 0,01 Gew.-% bis 10 Gew.-% vor, bevorzugt in einem Konzentrationsbereich von 0,01 Gew.-% bis 5 Gew.-%, ganz besonderes bevorzugt in einer

Konzentration von 0,01 Gew.-% bis 4 Gew.-%. Durch die Auswahl einer Aminosäure als Stabilisierungsmittel wird eine besonders hohe Stabilität bei hoher Proteinkonzentration erreicht. Aminosäuren sind toxikologisch unbedenklich. Dies ist besonders bedeutsam für die

Anwendung im oben genannten medizinischen Bereich sowie deren Einsatz für Kosmetik-, Hygiene- und/oder Haushaltsprodukte.

Das selbstassemblierende Protein der stabilen, wässrigen Protein-Lösung oder Protein-Dispersion kann natürlichen Ursprungs oder synthetisch sein, insbesondere durch rekombinante Herstellung, aufgebaut aus repetitiven Einheiten eines Strukturproteins, insbesondere eines Insektenproteins, bevorzugt Resilin, und/oder eines Spinnenseidenproteins oder eines ähnlichen oder davon abgeleiteten Proteins, insbesondere mit Insertion oder Anhängung von Oligoaminosäure-Blöcken und/oder ein intrinsisch entfaltetes Protein oder ein Microbead-bildendes Protein. Das Protein kann somit auch eine Kombination aus den Sequenzen von natürlichen Strukturproteinen abgeleiteten Proteinen sein, insbesondere eine Kombination aus der Sequenz von einem Protein mit der Sequenz eines anderen Strukturproteins, besonders bevorzugt eine Kombination aus der Sequenz einer Spinnenseide mit der Sequenz des Resilins.

Das selbstassemblierende Protein der stabilen, wässrigen Protein-Lösung oder Protein-Dispersion ist bevorzugt ein R16-, R16Args- (R16-Protein mit angehängtem Oligoarginin-Block mit 8 Aminosäuren), S16- oder C16-Protein oder das natürliche Seidenprotein der Seidenraupe Bombyx mori oder ein von den vorgenannten Proteinen abgeleitetes natürliches oder synthetisches Protein.

Die selbstassemblierenden Proteine mit der Bezeichnung R16 und S16 und deren Herstellung sind beispielsweise ausführlich in der WO 2008/155304 beschrieben. Das Protein und dessen Herstellung mit der Bezeichnung C16 sind beispielsweise ausführlich in der WO 2007/082936 beschrieben.

Durch das Aminosäure-Stabilisierungsmittel können besonders

hochkonzentrierte Protein-Lösungen erreicht werden. Bevorzugt liegt das selbstassemblierende Protein in einer Konzentration vor von 4 Gew.-% bis 35 Gew.-%, besonders bevorzugt in einer Konzentration von 5 Gew.-% bis 30 Gew.-%, ganz besonders bevorzugt in einer Konzentration von 10 Gew.-% bis 25 Gew.-% bezogen auf das Gesamtgewicht der stabilen Lösung vor. Das Aminosäure-Stabilisierungsmittel für das selbstassemblierende Protein ist vorteilhafterweise ausgewählt aus Arginin, Lysin, Histidin, Phenylalanin,

Asparagin, Glutamin, Tryptophan, Leucin, Glutaminsäure und/oder

Asparaginsäure. Besonderes bevorzugt sind Arginin, Lysin, Histidin,

Phenylalanin oder Glutamin eingesetzt.

Insbesondere Arginin wirkt zudem wundheilungsfördernd und stellt somit einen idealen Stabilisator beispielsweise für die spätere Verwendung der Proteine in Wundauflagen dar.

Durch die alleinige Verwendung von Aminosäure als Stabilisierungsmittel können aus der stabilen Protein-Lösung oder -Dispersion Proteinfasern gesponnen werden, ohne dass ein zusätzlicher Einsatz beispielsweise von Polymeren als Spinnhilfsmittel erforderlich ist. Dadurch können Fasern mit besonders hohem Proteinanteil oder auch reine Proteinfasern erreicht werden.

Selbstverständlich können jedoch der Protein-Lösung oder -Dispersion optional auch Additive zugesetzt werden. Die stabile, wässrige Protein-Lösung oder Protein-Dispersion umfasst dabei vorzugsweise zumindest ein Additiv, ausgewählt aus

- Mitteln zur Einstellung der Viskosität, insbesondere wasserunlösliche

Polymere, zum Beispiel in Form von Dispersionen, oder bevorzugt wasserlösliche Polymere, wie Polyalkylenoxide, wie Polyethylenoxide, Polyethylenglykole oder Polypropylenglykole, Polyvinylalkohole,

Polyethylenimine, Polyvinylpyrrolidone, Polyvinylamine, Polyvinylacetate, Polyacrylate, Polyalkylacrylate, wie Polymethacrylate,

Polyhydroxyalkylacrylate, wie Poly(2-hydroxymethacrylate) oder Poly(2- hydroxyethacrylate), Polyvinyformamide, Polyacrylamide,

Polycarbonsäuren, wie Polyacrylsäuren oder Polymethacrylsäuren, natürliche Polymere, wie Galaktomannan, Chitosan, Kollagen, Albumin, Xanthan, Alginate, Gelatine, Cellulose oder Stärke, insbesondere deren wasserlösliche Derivate, wie zum Beispiel Hydroxypropylcellulose, Carboxymethylstärke, oxidierte Stärke, Carboxymethylcellulose,

- Träger-bildenden Polymeren, bevorzugt Kombinationen aus zwei oder

mehreren Polymeren, Homo- und Copolymeren,

- Verarbeitungshilfsmitteln, wie Spinnhilfsmitteln, bevorzugt organische

Lösungsmittel, wie Alkohole, zum Beispiel Ethanol oder Butanol, und/oder oberflächenaktive Agentien, wie Tenside zur Einstellung der Oberflächenspannung bzw. des Dampfdruckes der Lösung oder Leitsalze zur Einstellung der Leitfähigkeit,

- Vernetzungsmitteln, beispielsweise als Zugabe zur Spinnlösung oder zur nachträglichen Vernetzung von Fasern,

- pharmakologischen Wirkstoffen oder Medikamenten, wie Antibiotika,

Antiinfektiva, Analgetika oder antivirale Additive, Antiseptika,

entzündungshemmende Mittel, wundheilungsfördernde Mittel, blutstillende Mittel, Proteine, Proteinfragmente, Peptide und/oder Peptidsequenzen, Polysaccharide, zum Beispiel Chitosan,

Wachstumsfaktoren, wie Purine oder Pyrimidine, lebende Zellen, ß- Tricalciumphosphat, Hydroxyapatit, insbesondere speziell

Hydroxyapatitnanopartikel, antimikrobielle Agentien, Aminosäuren, Enzyme, Vitamine, Antioxidantien,

- Haut- oder haarkosmetischen Wirkstoffen, zum Beispiel Effektpigmente, und/oder

- geruchsadsorbierenden Additiven, wie Aktivkohle oder Cyclodextrine,

Kronenether, biologisch aktive Metalle oder Metalllegierungen, proteinadsorptionsvermeidende Substanzen, wie zum Beispiel

Polyethylenoxid. Die oben genannten Polymere können dabei als Homopolymere, als

Copolymere, zum Beispiel als Blockcopolymere, Pfropfcopolymere, Kammoder Bürstencopolymere, Sternpolymere, statistische oder alternierende

Systeme, oder in jeglicher Mischung untereinander eingesetzt werden.

Die oben genannten Additive können in reiner Form, in jeglicher Mischung untereinander und/oder in verkapselter Form zugesetzt bzw. adsorbiert werden.

Besonders bevorzugt als Mittel zur Einstellung der Viskosität sind

Polyethylenoxid, Polyethylenglykol, Polyvinylalkohol und/oder

Polyvinylpyrrolidon, die als wasserlösliche Polymere direkt in der Protein- Lösung gelöst werden und toxikologisch unbedenklich sind. Ferner sind im Hinblick auf eine Verwendung im medizinischen Bereich als Additive

vorzugsweise Medikamente sowie wundheilungsfördernde Mittel eingesetzt.

Vorteilhafterweise liegen die Additive in einem Konzentrationsbereich von 0,01 Gew.-% bis 40 Gew.-% vor, bevorzugt in einem Konzentrationsbereich von 0,01 Gew.-% bis 30 Gew.-% und besonders bevorzugt in einem

Konzentrationsbereich von 2 Gew.-% bis 25 Gew.-%.

Die als Additive eingesetzten pharmakologischen Wirkstoffe oder Medikamente werden abhängig von der Applikation bevorzugt auch in geringeren

Konzentrationen als den oben genannten eingesetzt. Für das erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung der stabilen, wässrigen Protein-Lösung oder -Dispersion wird das wenigstens eine

selbstassemblierende Protein in einer wässrigen Lösung vor der Zugabe der Aminosäure als Stabilisierungsmittel bevorzugt in einem chaotropen Salz als Lösungsvermittler gelöst. Als chaotropes Salz wird vorzugsweise Guanidiniumthiocyanat, Calciumchlorid, Lithiumbromid, Harnstoff oder eine ionische Flüssigkeit eingesetzt.

Die selbstassemblierenden Proteine können vor der Zugabe wenigstens eines Aminosäure-Stabilisierungsmittels in dem chaotropen Salz gelöst werden und direkt, das heißt insbesondere bei Einsatz von Calciumchlorid oder einer ionischen Flüssigkeit beispielsweise ohne anschließende Dialyse, zu Protein- Fasern versponnen werden, da Calciumchlorid, beispielsweise im Gegensatz zu Guanidiniumthiocyanat, gesundheitlich unbedenklich ist.

Bei der Variante ohne Dialyse können sich die Protein-Fasern durch den

Salzgehalt möglicherweise nicht vollständig verfestigen. In diesem Fall wird vorteilhafterweise ein Waschschritt durchgeführt. Optional kann beispielsweise bei dem Einsatz von Calciumchlorid das Salz durch Ausfällen, zum Beispiel durch pH-Wert-Erhöhung, in Form eines

Calciumhydroxid-Niederschlags oder lonentauschers oder andere Verfahren vor dem Spinnprozess entfernt werden. Hierbei wird der Calciumchlorid-Lösung vor dem Ausfällprozess eine Aminosäure zur Stabilisierung der Proteine zugegeben. Dadurch erhält man ebenfalls eine wässrige Protein-Lösung mit dem Stabilisator.

Bei dem verbesserten Verfahren zur Herstellung einer stabilen, wässrigen Protein-Lösung oder -Dispersion wird die Protein-Lösung oder -Dispersion vorzugsweise unter Bewegung, insbesondere durch Rühren, und bevorzugt sogar bei Raumtemperatur, gegen einen wässrigen Puffer dialysiert oder ultrafiltriert, gelfiltriert oder durch andere osmotische Verfahren behandelt, oder das chaotrope Salz wird durch Fällung abgetrennt. Die Dialyse erfolgt zur Entfernung des chaotropen Salzes aus der Proteinlösung bevorzugt gegen einen wässrigen Puffer mit einem pH-Wert im Bereich von 4 bis 14, besonders bevorzugt im pH-Bereich von 6 bis 14, ganz besonders bevorzugt im pH-Bereich von 7 bis 12, der das Stabilisierungsmittel enthält.

Bei der Variante mit Dialyse wird das chaoptrope Salz, zum Beispiel

Guanidiniumthiocyanat, aus der wässrigen Protein-Lösung nahezu vollständig entfernt. Dadurch erhält man eine wässrige Lösung aus Protein, Wasser und dem Stabilisator, beispielsweise L-Arginin. Das Salz, zum Beispiel

Guanidiniumthiodyanat, in der Spinnlösung könnte den Spinnprozess, insbesondere das Elektrospinnen wegen seines Einflusses auf die Leitfähigkeit der Spinnlösung stören. Das Salz könnte auch die Ausbildung und Verfestigung der Fasern beim Spinnprozess stören. Als Alternative zur Dialyse der Protein-Lösung oder -Dispersion kommt insbesondere für größere Ansätze eine Gelfiltration oder eine Ultrafiltration in Betracht.

Aus der erfindungsgemäßen stabilen, wässrigen Protein-Lösung oder - Dispersion bzw. der erfindungsgemäß hergestellten stabilen, wässrigen Protein- Lösung können ohne oder auf einen Flächengebilde-Träger direkt besonders reine Protein-Flächengebilde, das heißt Protein-Fasern, -Fasergebilde, Gele, - Folien, -Filme oder -Schäume, oder besonders reine Protein-Imprägnierungen oder Protein-Beschichtungen hergestellt werden.

Die Fasern oder Fasergebilde, insbesondere Vliesstoffe, werden dabei bevorzugt hergestellt durch das Verspinnen der erfindungsgemäßen bzw.

erfindungsgemäß hergestellten stabilen, wässrigen Protein-Lösung oder - Dispersion ohne oder auf einen Form- oder Flächengebilde-Träger zu den entsprechenden Protein-Fasern oder -Fasergebilden. Unter Form- oder Flächengebilden werden hier insbesondere Fasern,

Die Protein-Lösung oder Protein-Dispersion kann somit direkt auf einen Träger, insbesondere auf ein Form- oder Flächengebilde, beispielsweise auf einen Vliesstoff oder ein sonstiges Fasergebilde, welcher bzw. welches

beispielsweise in Wundabdeckungssystemen eingesetzt werden kann, auf ein Gel, einen Film, eine Folie oder auf einen Schaum, zum Beispiel im Falle der Anwendung in Wundauflagen auf einen Polyurethan-Schaum, versponnen werden.

Das Verspinnen der stabilen, wässrigen Lösung oder Dispersion mit

selbstassemblierendem Protein erfolgt vorteilhafterweise durch Elektro- oder Rotorspinnen.

Gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren kann die Stabilisierung der Protein- Lösung oder Protein-Dispersion vor dem Spinnen mit einem gesundheitlich unbedenklichen und/oder einem Protein-schonenden Stabilisierungsverfahren erfolgen. Ein nachfolgendes Spinnen ist bevorzugt bei Raumtemperatur in einem kontinuierlichen Prozess über einen längeren Zeitraum möglich, ohne dass die Protein-Lösung oder Protein-Dispersion ausfällt bzw. geliert oder einem schädlichen Temperatureinfluss ausgesetzt ist.

Die elektroversponnenen Fasern weisen bevorzugt einen Faserdurchmesser von 1 nm bis zu mehreren Mikrometern auf, bevorzugt von 10 nm bis 2000 nm, besonders bevorzugt einen Faserdurchmesser von 10 nm bis 1000 nm und ganz besonders bevorzugt einen Faserdurchmesser von 10 nm bis 800 nm. Die erfindungsgemäße oder erfindungsgemäß hergestellte Protein-Lösung oder -Dispersion kann auch als Imprägnierung oder Beschichtung, insbesondere durch Sprüh-, Tauch- oder Rotationsbeschichtung (spincoating), ohne oder auf einen Flächengebilde-Träger eingesetzt werden, beispielsweise von Fasern oder Fasergebilden, insbesondere Vliesstoffen.

Ferner kann die erfindungsgemäße oder erfindungsgemäß hergestellte stabile, wässrige Protein-Lösung oder -Dispersion ohne oder auf einen Flächengebilde- Träger vorzugsweise als Beschichtung in Gel-, Folien- oder Filmform oder in Form von Mustern, wie zum Beispiel Punkt- oder Streifenmustern,

insbesondere durch einen Druck-, Rakel-, Walzen- oder Gießprozess, eingesetzt oder verarbeitet werden.

Des Weiteren kann die erfindungsgemäße oder erfindungsgemäß hergestellte Protein-Lösung oder -Dispersion ohne oder auf einen Flächengebilde-Träger zu Protein-Schäumen verarbeitet werden.

In dem Verfahren zur Herstellung von Flächengebilden, Imprägnierungen oder Beschichtungen aus der erfindungsgemäßen oder erfindungsgemäß

hergestellten stabilen, wässrigen Protein-Lösung oder -Dispersion können selbstverständlich die oben genannten Additive, beispielsweise ausgewählt aus Mitteln zur Einstellung der Viskosität, Träger-bildenden Polymeren,

Spinnhilfsmitteln, Vernetzungsmitteln, oberflächenaktiven Agentien,

pharmakologischen Wirkstoffen, Medikamenten, wundheilungsfördernden Mitteln, Haut- oder haarkosmetischen Wirkstoffen und/oder

geruchsadsorbierenden Additiven, zugesetzt werden.

Des Weiteren findet die erfindungsgemäße stabile, wässrige Protein-Lösung oder -Dispersion bzw. finden die daraus hergestellten Flächengebilde,

Imprägnierungen oder Beschichtungen vorteilhafterweise Verwendung für Kosmetikprodukte, beispielsweise für Cremes, Schwämme, Pads, Strips oder Masken, für Hygieneprodukte, wie Damenhygiene, Inkontinenzprodukte, Windeln, für Haushaltsprodukte, wie Reinigungsutensilien, insbesondere Tücher oder Schwämme und/oder für Filteranwendungen, wie zum Beispiel für Tabakfilter oder Motorenfilter.

Eine besonders bevorzugte Verwendung findet die erfindungsgemäße stabile, wässrige Protein-Lösung oder Protein-Dispersion bzw. finden die daraus hergestellten Form- oder Flächengebilde, Imprägnierungen oder

Beschichtungen für medizinische Produkte, vorzugsweise für oder als

Wundauflagen, andere Textilen, Schläuche, Gewebekonstruktionen bzw.

Gewebezüchtungen (Tissue Engineering Scaffolds) oder Implantate.

So können die medizinischen Produkte beispielsweise zumindest eine

Wundkontaktschicht, hergestellt nach einem beschriebenen Verfahren, aufweisen, die den Wundheilungsprozess positiv beeinflusst oder als

biokompatible oder hypoallergene Beschichtung von Oberflächen ausgestaltet ist. Möglicherweise kann sich die Wundkontaktschicht in Kontakt mit der Wunde vom Körper resorbiert und abgebaut werden. Zudem könnte sie ein Verkleben mit der Wunde verhindern. Dadurch werden schmerzhafte Verbandwechsel vermieden und die neu ausgebildeten Gewebeschichten in der Wunde werden durch den Wechsel nicht zerstört.

Durch die oben genannten Additive wird für die Form- oder Flächengebilde, insbesondere die Fasern, Fasergebilde, insbesondere Vliesstoffe, wie beispielsweise auch 3D-modellierte Vliesstoffe, Gele, Folien, Filme oder Schäume, oder für die Imprägnierungen oder Beschichtungen, die nach einem der beschriebenen Verfahren hergestellt sind, somit ein besonders vielfältiger Anwendungsbereich eröffnet. Zur Stabilisierung gegenüber wässrigen Lösungen können die hergestellten Protein-Formgebilde oder -Flächengebilde nachbehandelt werden,

beispielsweise durch Tauchen in Ethanol oder Methanol bzw. in

Kaliumhydrogenphosphat-Puffer und Waschen mit destilliertem Wasser sowie anschließendes Trocknen.

Ausführung der Erfindung Der Gegenstand der Erfindung wird nachfolgend anhand von Beispielen näher erläutert.

Es werden folgende Materialien verwendet: - R16-Protein als rekombinantes, selbstassemblierendes Protein gemäß WO 2008/155304

- R16Args-Protein (R16-Protein mit angehängtem Oligoarginin-Block mit 8 Aminosäuren)

- L-Arginin

- Natriumhydrogencarbonat-Puffer (10 mM; pH 10 bis 12)

- Guanidiniumthiocyanat-Lösung (6M); GuaSCN als chaotropes Salz

- Calciumchlorid-Lösung (CaCal₂ : Wasser : Ethanol = 1 :8:2 molares Verhältnis) als chaotropes Salz

- Polyethylenoxid (MG 900000 g/mol) als Additiv zur Einstellung der Viskosität - Polyvinylpyrrolidon (MG 90000 g/mol) als Additiv zur Einstellung der Viskosität

- Dialyseschlauch (regenerierte Cellulose: MWCO (Molecular Weight Cut Off) von 10000-12000)

- Dialyseschlauchklammern Beispiele zur Herstellung von Fasern aus rekombinanten, selbstassemblierenden Proteinen mittels Elektrospinnen

Beispiel 1

R16-Protein (15 g bis 20 g) als rekombinantes, selbstassemblierendes Protein wird in einem chaotropen Salz, insbesondere Guanidiniumthiocyanat-Lösung (80 g bis 85 g 6M GuaSCN), unter Rühren gelöst.

In einem Becherglas werden 10 I Natriumhydrogencarbonat-Puffer vorgelegt und 10 g L-Arginih (c(Arginin)= 0,1 % (w/v)) darin gelöst.

Die Protein-Lösung wird in einen Dialyseschlauch überführt, und dieser wird in die Pufferlösung gelegt. Während der Dialyse wird die Lösung gerührt. Die Dialyse wird bevorzugt für 8 bis 14 Stunden laufen gelassen, und der Puffer wird gegebenenfalls ausgetauscht.

Anschließend wird die Protein-Lösung aus dem Dialyseschlauch

herausgenommen und mittels Elektrospinnen bei Raumtemperatur zu Fasern verarbeitet (Hochspannung 35 kV, Elektrodenabstand 10 cm).

Beispiel 2

R16Arge-Protein (10 g bis 15 g) als rekombinantes, selbstassemblierendes Protein wird in einem chaotropen Salz, insbesondere Guanidiniumthiocyanat- Lösung (85 g 6M GuaSCN), unter Rühren gelöst.

In einem Becherglas werden 10 I Natriumhydrogencarbonat-Puffer vorgelegt und 10 g L-Arginin (c(Arginin)= 0,1 % (w/v)) darin gelöst.

Anschließend wird die Protein-Lösung aus dem Dialyseschlauch

herausgenommen, und 0,5 Gew.-% bis 3 Gew.-% Polyethylenoxid (MG 900000 g/mol) werden zugegeben und gelöst.

Die Lösung wird mittels Elektrospinnen bei Raumtemperatur zu Fasern verarbeitet (Hochspannung 35 kV, Elektrodenabstand 10 cm).

Beispiel 3

R16-Protein (10 g bis 15 g) als rekombinantes, selbstassemblierendes Protein wird in einem chaotropen Salz, insbesondere Calciumchlorid-Lösung (85 g), unter Rühren bei 50°C bis 70°C gelöst.

0,1 g L-Arginin werden zugegeben und unter Rühren gelöst.

Beispiel 4

R16-Protein (10 g bis 15 g) als rekombinantes, selbstassemblierendes Protein wird in einem chaotropen Salz, insbesondere Calciumchlorid-Lösung (85 g), unter Rühren bei 70°C gelöst.

0,1 g L-Arginin werden zugegeben und unter Rühren gelöst.

Das Salz wird durch Erhöhung des pH-Wertes (mit Zugabe von Natronlauge) in den alkalischen Bereich als Calciumhydroxid ausgefällt. Nach Abtrennen des Niederschlags, beispielsweise mittels Filtration oder Zentrifuge, wird eine klare gelbe Lösung erhalten.

Die Lösung wird mit oder ohne Zusatz von Viskositätserhöhenden Mitteln mittels Elektrospinnen bei Raumtemperatur zu Fasern verarbeitet (Hochspannung 35 kV, Elektrodenabstand 10 cm).

Beispiel 5

Die Herstellung der Protein-Lösung wird wie in Beispiel 2 durchgeführt. Nur die Dialyse wird bei ca. 50°C durchgeführt. Die Dialyse bei ca. 50°C hat einen zusätzlichen stabilisierenden Effekt auf das Protein.

Anschließend wird die Lösung wie in den vorgenannten Beispielen mit oder ohne Zusatz von Viskositätserhöhenden Mitteln mittels Elektrospinnen bei Raumtemperatur zu Fasern weiter verarbeitet.

Die elektroversponnenen R16-Fasern der vorgenannten Beispiele weisen bevorzugt einen Faserdurchmesser von 10 nm bis 2000 nm auf, besonders bevorzugt einen Faserdurchmesser von 10 nm bis 1000 nm und ganz besonders bevorzugt einen Faserdurchmesser von 10 nm bis 800 nm.

Beispiele zur Herstellung von Fasern aus rekombinanten,

selbstassemblierenden Proteinen mittels Rotorspinnen Beispiel 6

R16-Protein (15 g bis 20 g) als rekombinantes, selbstassemblierendes Protein wird in einem chaotropen Salz, insbesondere Guanidiniumthiocyanat-Lösung (80 g 6M GuaSCN), unter Rühren gelöst. In einem Becherglas werden 10 I Natriumhydrogencarbonat-Puffer vorgelegt und 10 g L-Arginin (c(Arginin)= 0,1 % (w/v)) darin gelöst.

Anschließend wird die Protein-Lösung aus dem Dialyseschlauch

herausgenommen, und 4 Gew.-% Polyethylenoxid (MG 900000 g/mol) als Additiv zur Einstellung der Viskosität werden zugegeben und gelöst.

Die Lösung wird mittels Rotorspinnen zu Fasern verarbeitet. Beispiel 7

R16Arge-Protein (15 g bis 20 g) als rekombinantes, selbstassemblierendes Protein wird in einem chaotropen Salz, insbesondere Guanidiniumthiocyanat- Lösung (85 g 6M GuaSCN), unter Rühren gelöst. In einem Becherglas werden 10 I Natriumhydrogencarbonat-Puffer vorgelegt und 10 g L-Arginin (c(Arginin)= 0,1 % (w/v)) darin gelöst.

Anschließend wird die Protein-Lösung aus dem Dialyseschlauch

herausgenommen, und 15 Gew.- % Polyvinylpyrrolidon (MG 90000 g/mol) als Additiv zur Einstellung der Viskosität werden zugegeben und gelöst. Die Lösung wird mittels Rotorspinnen zu Fasern verarbeitet.

Beispiel zur Film- oder Folienherstellung aus rekombinanten,

selbstassemblierenden Proteinen

Beispiel 8

Die Herstellung der Protein-Lösung wird wie in Beispiel 1 oder 2 durchgeführt mit optionaler Zugabe von Additiven oder Viskositätserhöhenden Mitteln.

Danach wird der Film oder die Folie aus der Protein-Lösung zum Beispiel durch Rotationsbeschichtung (spin coating) oder durch Rakeln hergestellt.

Beispiele zur Herstellung von mit rekombinanten, selbstassemblierenden Proteinen sprühbeschichteten Vliesstoffen Beispiel 9

R16-Protein (5 g) als rekombinantes, selbstassemblierendes Protein wird in einem chaotropen Salz, insbesondere Guanidiniumthiocyanat-Lösung (95 g 6M GuaSCN), unter Rühren gelöst. In einem Becherglas werden 10 I Natriumhydrogencarbonat-Puffer vorgelegt und 10 g L-Arginin (c(Arginin)= 0,1 % (w/v)) darin gelöst.

Anschließend wird die Protein-Lösung aus dem Dialyseschlauch

herausgenommen. Die Protein-Lösung wird auf einen Viskose-Vliesstoff gleichmäßig aufgesprüht (Sprühpistole mit Druckluft).

Beispiele zur Herstellung von mit rekombinanten, selbstassemblierenden Proteinen tauchbeschichteten Vliesstoffen

Beispiel 10

R16-Protein (5 g) als rekombinantes, selbstassemblierendes Protein wird in einem chaotropen Salz, insbesondere Guanidiniumthiocyanat-Lösung (95 g 6M GuaSCN), unter Rühren gelöst.

In einem Becherglas werden 10 I Natriumhydrogencarbonat-Puffer vorgelegt und 10 g L-Arginin (c(Arginin)= 0,1 % (w/v)) darin gelöst. Die Protein-Lösung wird in einen Dialyseschlauch überführt, und dieser wird in die Pufferlösung gelegt. Während der Dialyse wird die Lösung gerührt. Die Dialyse wird bevorzugt für 8 bis 14 Stunden laufen gelassen, und der Puffer wird gegebenenfalls ausgetauscht. Anschließend wird die Protein-Lösung aus dem Dialyseschlauch

herausgenommen.

Ein Viskose-Vliesstoff wird in die Protein-Lösung getaucht und anschließend bei Raumtemperatur getrocknet.

Alle Versuche können mit R16-Protein oder R16Arge-Protein (R16-Protein mit angehängtem Oligoarginin-Block) durchgeführt werden. Dem R16Arg₈-Protein werden bezüglich der Wundheilung besondere Eigenschaften zugeschrieben. Alternativ kann auch das S16-Protein oder das C16-Protein eingesetzt werden. Optionale Nachbehandlung der hergestellten Protein-Fasern, Protein- Filme, Protein-Folien oder Protein-Beschichtungen zur Stabilisierung gegenüber wässrigen Lösungen

1. Nachbehandlungsvariante

Die Protein-Fasern, -Filme, -Folien oder -Beschichtungen werden für ca. 0,5 bis 1 Minute in Ethanol oder Methanol getaucht und danach bei Raumtemperatur und zur Entfernung der Lösungsmittelreste im Vakuumschrank getrocknet.

2. Nachbehandlungsvariante

Die Protein-Fasern, -Filme, -Folien oder -Beschichtungen werden für ca. 2 Stunden in Kaliumhydrogenphosphat-Puffer getaucht und danach mit destilliertem Wasser gewaschen und bei Raumtemperatur getrocknet.

Claims

Patentansprüche

1. Stabile, wässrige Protein-Lösung oder Protein-Dispersion, umfassend in einer wässrigen Lösung oder Dispersion wenigstens ein

selbstassemblierendes Protein und wenigstens Stabilisierungsmittel für das selbstassemblierende Protein, wobei das Stabilisierungsmittel wenigstens eine Aminosäure umfasst.

2. Stabile, wässrige Protein-Lösung oder Protein-Dispersion nach Anspruch 1 , wobei das selbstassemblierende Protein natürlichen Ursprungs oder synthetisch ist, insbesondere durch rekombinante Herstellung, aufgebaut aus repetitiven Einheiten eines Strukturproteins, insbesondere eines Insektenproteins und/oder eines Spinnenseidenproteins oder eines ähnlichen oder davon abgeleiteten Proteins, insbesondere mit Insertion oder Anhängung von Oligoaminosäure-Blöcken und/oder ein intrinsisch entfaltetes Protein oder ein Microbead-bildendes Protein.

3. Stabile, wässrige Protein-Lösung oder Protein-Dispersion nach Anspruch 1 oder 2, wobei das selbstassemblierende Protein ein R16-, R16Arge-, S16- oder C16-Protein oder ein davon abgeleitetes Protein ist.

4. Stabile, wässrige Protein-Lösung oder Protein-Dispersion nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das zumindest eine

selbstassemblierende Protein in einer Konzentration von 4 Gew.-% bis 35 Gew.-% vorliegt, bevorzugt in einer Konzentration von 5 Gew.-% bis 30 Gew.-% und besonders bevorzugt in einer Konzentration von 10 Gew.-% bis 25 Gew.-% bezogen auf das Gesamtgewicht der stabilen Lösung. Stabile, wässrige Protein-Lösung oder Protein-Dispersion nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Stabilisierungsmittel ausgewählt ist aus Arginin, Lysin, Histidin, Phenylalanin und/oder Glutamin, bevorzugt aus Arginin.

Stabile, wässrige Protein-Lösung oder Protein-Dispersion nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Stabilisierungsmittel in einer Konzentration von 0,01 Gew.-% bis 10 Gew.-% vorliegt, bevorzugt in einer Konzentration von 0,01 Gew.-% bis 5 Gew.-% und besonders bevorzugt in einer Konzentration von 0,01 Gew.-% bis 4 Gew.-%.

Stabile, wässrige Protein-Lösung oder Protein-Dispersion nach einem der vorhergehenden Ansprüche, umfassend zumindest ein Additiv, ausgewählt aus Mitteln zur Einstellung der Viskosität, Träger-bildenden Polymeren, Spinnhilfsmitteln, Vernetzungsmitteln, oberflächenaktiven Agentien, pharmakologischen Wirkstoffen, Medikamenten,

wundheilungsfördernden Mitteln, Haut- oder haarkosmetischen

Wirkstoffen und/oder geruchsadsorbierenden Additiven.

Stabile, wässrige Protein-Lösung oder Protein-Dispersion nach Anspruch 7, wobei das Additiv bzw. die Additive in einer Konzentration von 0,01 Gew.-% bis 40 Gew.-% vorliegt bzw. vorliegen, bevorzugt in einer Konzentration von 0,01 Gew.-% bis 30 Gew.-%, besonders bevorzugt in einer Konzentration von 2 Gew.-% bis 25 Gew.-%.

Verfahren zur Herstellung einer stabilen, wässrigen Protein-Lösung oder Protein-Dispersion nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das wenigstens eine selbstassemblierende Protein in einer wässrigen Lösung vor der Zugabe der Aminosäure in einem chaotropen Salz gelöst wird.

10. Verfahren zur Herstellung einer stabilen, wässrigen Protein-Lösung oder Protein-Dispersion nach Anspruch 9, wobei als chaotropes Salz

Guanidiniumthiocyanat, Calciumchlorid, Lithiumbromid, Harnstoff oder eine ionische Flüssigkeit eingesetzt wird.

11. Verfahren zur Herstellung einer stabilen, wässrigen Protein-Lösung oder Protein-Dispersion nach Anspruch 9 oder 10, wobei die Protein-Lösung unter Bewegung gegen einen wässrigen Puffer dialysiert, ultrafiltriert oder gelfiltriert wird oder durch andere osmotische Verfahren behandelt wird oder das chaotrope Salz durch Fällung abgetrennt wird.

12. Verfahren zur Herstellung von Fasern oder Fasergebilden, insbesondere Vliesstoffen, wobei eine stabile, wässrige Protein-Lösung oder Protein- Dispersion nach einem der Ansprüche 1 bis 8 eingesetzt bzw. nach einem Verfahren nach einem der Ansprüche 9 bis 11 hergestellt wird, und anschließend die Protein-Lösung oder -Dispersion zu Protein-Fasern oder -Fasergebilden, insbesondere Vliesstoffen, versponnen wird.

13. Verfahren zur Elektro- oder Rotorverspinnung von

selbstassemblierendem Protein, wobei eine stabile, wässrige Lösung oder Dispersion nach einem der Ansprüche 1 bis 8 eingesetzt bzw. nach einem Verfahren nach einem der Ansprüche 9 bis 11 hergestellt wird, und anschließend die Protein-Lösung oder Protein-Dispersion elektro- oder rotorversponnen wird.

14. Verfahren zur Herstellung von Imprägnierungen, Beschichtungen, Gelen, Folien oder Filmen, wobei eine stabile, wässrige Protein-Lösung oder Protein-Dispersion nach einem der Ansprüche 1 bis 8 eingesetzt bzw. nach einem Verfahren nach einem der Ansprüche 9 bis 11 hergestellt wird, und anschließend die Protein-Lösung oder Protein-Dispersion als Protein-Imprägnierung oder Protein-Beschichtung, insbesondere durch Sprüh-, Tauch- oder Rotationsbeschichtung, von Form- oder

Flächengebilde-Trägern eingesetzt wird oder als Protein-Beschichtung in Gel-, Folien- oder Filmform, insbesondere durch einen Druck-, Rakel-, Walzen- oder Gießprozess, von Form- oder Flächengebilde-Trägern verarbeitet oder eingesetzt wird.

Verfahren zur Herstellung von Form- oder Flächengebilden,

insbesondere Fasern, Fasergebilden, Gelen, Folien, Filmen oder

Schäumen, oder von Imprägnierungen oder von Beschichtungen nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei der Protein-Lösung oder Protein-Dispersion vor dem Verspinnen oder Verarbeiten zumindest ein Additiv nach Anspruch 7 oder 8 zugesetzt wird. 16. Verwendung der stabilen, wässrigen Protein-Lösung oder Protein- Dispersion bzw. der daraus hergestellten Form- oder Flächengebilde, insbesondere Fasern, Fasergebilde, Gele, Folien, Filme oder Schäume, oder der daraus hergestellten Imprägnierungen oder Beschichtungen nach einem vorhergehenden Ansprüche für medizinische Produkte, bevorzugt für oder als Wundauflagen, Schläuche, Gewebekonstruktionen bzw. Gewebezüchtungen (Tissue Engineering) oder Implantate, für Kosmetikprodukte, für Hygieneprodukte, für Haushaltsprodukte und/oder für Filteranwendungen.

Form- oder Flächengebilde, insbesondere Fasern, Fasergebilde, Gele, Folien, Filme oder Schäume, oder Imprägnierungen oder

Beschichtungen, hergestellt nach einem Verfahren nach einem der Ansprüche 9 bis 15.