KR20070083570A

KR20070083570A - 가교 히알루론산 겔의 제조 방법

Info

Publication number: KR20070083570A
Application number: KR1020077006232A
Authority: KR
Inventors: 요시히로 요코카와; 다카시 오카; 유이치로 모리; 노리오 우에노
Original assignee: 가부시키가이샤 시세이도
Priority date: 2004-11-15
Filing date: 2005-11-14
Publication date: 2007-08-24
Also published as: CN101056891A; JP4875988B2; EP1818344A1; KR101239037B1; CN101056891B; EP1818344A4; WO2006051950A1; JPWO2006051950A1

Abstract

본 발명은 가교제 함량이 적고 또한 우수한 점탄성을 나타내는 가교 히알루론산 겔을 간편하게 제조할 수 있는 신규의 제조 방법을 제공하는 것으로서, 상기 가교 히알루론산 겔의 제조 방법은 히알루론산 10 W/V% 이상, 가교제 및 물을 포함하는 혼합물을 산 또는 알칼리 조건하에서 교반 혼합하는 것을 특징으로 한다.

Description

가교 히알루론산 겔의 제조 방법{METHOD FOR PRODUCING CROSSLINKED HYALURONIC ACID GEL}

본 발명은 가교 히알루론산 겔의 제조 방법, 특히 낮은 가교율과 우수한 점탄성(粘彈性)을 갖는 가교 히알루론산 겔을 보다 간편하게 제조하는 방법에 관한 것이다.

히알루론산을 가교한 가교 히알루론산 겔은 생체 적합성이 우수함과 동시에, 생체 내에서 경시적으로 분해가 진행되고, 최종적으로는 소멸되는 생분해성도 겸비하고 있다. 종래, 가교 히알루론산 겔의 이와 같은 성질을 이용하여, 유착방지제, 골 수복제, 약물 서방성 조성물 및 조직 증대 물질 등으로의 응용에 관한 연구·개발이 활발하게 이루어지고 있다. 이 중, 조직 증대 물질에 대한 대표적인 응용예로서 미용 형성의 분야에서의 주름 제거 주입제가 알려져 있다.

가교 히알루론산 겔은 일반적으로 히알루론산과 가교제를 수용액 중에서 교반 혼합하고, 히알루론산 고분자 사슬간을 가교제에 의해 화학적으로 결합시킴으로써 조제되어 있다. 여기에서 이와 같은 가교 히알루론산 겔을 생체내에 투여하는 경우에는 생체내에서 겔이 분해된 후, 잔존하는 가교제 성분이 생체에서 이물질로서 인식되어, 염증 반응을 일으키는 등의 악영향을 미치는 점이 염려된다. 이 때 문에, 생체 적합성의 유지를 목적으로 한 경우에는 가능한 한 낮은 가교율로 가교 히알루론산 겔을 조제하는 것이 요망된다.

그러나, 종래의 일반적인 가교 방법에서는 가교제의 첨가량을 적게 하면, 수득되는 가교 히알루론산 겔의 점탄성이 저하되어 부드러워지고, 예를 들어 주름 제거 주입제로서 사용한 경우에, 주입 부위에서 일정한 체적을 확보할 수 없다. 또한, 약물 서방 제제로서 가교 히알루론산 겔을 사용하는 경우에도, 약제의 적정한 효과를 일정 기간 유지하기 위해서는 생체 내에 장기간 체류시킬 필요가 있고, 보다 농밀한 고점탄성의 가교 겔이 요구되지만, 가교제량을 감소시킨 경우에 이와 같은 고점탄성의 가교 겔을 수득하기 어렵다. 이와 같이, 낮은 가교율과 우수한 점탄성의 양자를 겸비한 가교 히알루론산 겔을 조제하는 것은 매우 곤란한 과제였다.

이와 같은 문제점에 대해서 일본 특허 제3094074호에는 비교적 낮은 가교율과 우수한 점탄성을 갖는 가교 히알루론산 겔의 제조 방법이 보고되어 있다. 그러나, 상기 제조 방법은 구체적으로는 히알루론산과 가교제를 수용액 중에서 혼합하여 가교 반응을 개시하게 하고, 겔화가 일어나기 전에 물을 가하여 혼합 용액을 희석함으로써 일단 가교 반응의 진행을 방지하고, 또한 상기 혼합 용액으로부터 물을 휘발시켜 다시 가교 반응을 진행시키는 2단계의 가교 반응 공정을 거치는 것이므로, 조작이 매우 번잡하고 반응의 제어가 어려워, 대량 생산에는 적합하지 않다는 문제점이 있었다.

(발명이 해결하고자 하는 과제)

본 발명은 전술한 바와 같은 종래 기술의 과제를 감안하여 이루어진 것으로, 그 목적은 가교율이 낮고 또한 우수한 점탄성을 나타내는 가교 히알루론산 겔을 간편하게 제조할 수 있는 신규의 제조 방법을 제공하는 데에 있다.

(과제를 해결하기 위한 수단)

상기 목적을 달성하기 위해 본 발명자 등이 예의 연구를 실시한 결과, 가교 반응에 제공하는 혼합물 중의 히알루론산을 10 W/V% 이상의 고농도 조건으로 함으로써, 가교제의 첨가량을 감소시킨 경우에도 우수한 점탄성을 갖는 가교 히알루론산 겔이 수득되는 것이 밝혀졌다. 또한, 일반적인 히알루론산을 사용한 경우, 10 W/V% 이상이라는 고농도의 히알루론산 수용액은 용액상(狀)이라고는 도저히 부를 수 없는 고체 분말상 또는 매우 고점도의 겔상을 나타내고 있다. 즉, 본 발명자들은 통상, 당업자가 사용하지 않는 매우 높은 농도 조건에서 히알루론산을 반응시킴으로써, 가교율이 낮음에도 불구하고 우수한 점탄성을 나타내는 가교 히알루론산 겔을 간편하게 제조할 수 있는 것을 발견하여, 본 발명을 완성하기에 이른 것이다.

본 발명에 관한 가교 히알루론산 겔의 제조 방법은 히알루론산 10 W/V% 이상, 가교제, 및 물을 포함하는 혼합물을, 산 또는 알칼리 조건하에서 교반 혼합하는 것을 특징으로 하는 것이다. 또한, 상기 가교 히알루론산 겔의 제조 방법에서, 가교 반응에 제공하기 전의 상기 혼합물의 저장 탄성률(G’)(주파수 1 ㎐)이 15000 Pa 이상인 것이 바람직하다.

또한, 상기 가교 히알루론산 겔의 제조 방법에서 상기 혼합물 중의 히알루론산 고분자 사슬을 물리적으로 절단하지 않고 교반 혼합하는 것이 바람직하다. 또한, 상기 가교 히알루론산 겔의 제조 방법에서, 상기 혼합물을 자전-공전식 혼합 장치에 의해 교반 혼합하는 것이 바람직하다. 또한, 상기 가교 히알루론산 겔의 제조 방법에서, 빵 생지(生地) 반죽 장치 또는 떡 제조 장치에 의해, 상기 혼합물을 교반 혼합하는 것이 바람직하다. 또한, 상기 가교 히알루론산 겔의 제조 방법에서 사람의 손으로 주무름으로써 상기 혼합물을 교반 혼합하는 것이 바람직하다. 또한, 상기 가교 히알루론산 겔의 제조 방법에서 상기 혼합물 중의 가교제 농도가 0.02 W/V% 내지 1 W/V% 인 것이 바람직하다. 또한, 상기 가교 히알루론산 겔의 제조 방법에서, 상기 혼합물 중의 가교제 농도가 히알루론산 구성 단위에 대해서 0.02 W/W% 내지 2 W/W%인 것이 바람직하다. 또한, 상기 가교 히알루론산 겔의 제조 방법에서 가교제가 디비닐설폰, 1,4-부탄디올·디글리시딜에테르, 및 에틸렌글리콜·디글리시딜에테르로 이루어진 군으로부터 선택되는 것이 바람직하다.

도 1은 본 발명의 일 실시예에서 사용되는 자전-공전식 혼합 장치의 전체도,

도 2는 본 발명의 일 실시예에서 사용되는 빵 생지 반죽 장치의 전체도,

도 3은 본 발명의 실시예 1-1에 의해 수득된 가교 히알루론산 겔(히알루론산 41 W/V%, 히알루론산 구성 단위 당 디비닐설폰 가교율 0.8 %)의 점탄성 측정 결과를 도시한 도면,

도 4는 시판되는 가교 히알루론산 겔(Restylane:Q-MED사 제조)의 점탄성 측정 결과를 도시한 도면,

도 5는 본 발명의 실시예 1-2에 의해 수득된 가교 히알루론산 겔(히알루론산 33 W/V%, 히알루론산 구성 단위에 대해서, 1,4-부탄디올·디글리시딜에테르 가교율 1 %)의 점탄성 측정 결과를 도시한 도면,

도 6은 본 발명의 실시예 1-3에 의해 수득된 가교 히알루론산 겔(히알루론산 26 W/V%, 히알루론산 구성 단위에 대해서 디비닐설폰 가교율 0.8 %)의 점탄성 측정 결과를 도시한 도면,

도 7은 본 발명의 실시예 1-4에 의해 수득된 가교 히알루론산 겔(히알루론산 26 W/V%, 히알루론산 구성 단위에 대해서 1,4-부탄디올·디글리시딜에테르 가교율 1 %)의 점탄성 측정 결과를 도시한 도면,

도 8은 본 발명의 실시예 1-5에 의해 수득된 가교 히알루론산 겔(히알루론산 13 W/V%, 히알루론산 구성 단위에 대해서 1,4-부탄디올·디글리시딜에테르 가교율 2.8 %)의 점탄성 측정 결과를 도시한 도면, 및

도 9는 본 발명의 제조 방법에 의해 수득된 가교 히알루론산 겔 슬러리 및 1.2 % 히알루론산 수용액에 효소 용액을 첨가한 시험품(및 대조품)의 효소 반응 후의 샘플 중량을, 이론 잔존 샘플 백분율(%)로서 정리한 도면이다.

이하, 본 발명의 실시 형태에 대해서 상세하게 설명하지만, 본 발명은 이에 한정되는 것은 아니다.

또한, 본 발명에 관한 가교 히알루론산 겔의 제조 방법은 히알루론산 10 W/V% 이상, 가교제 및 물을 포함하는 혼합물을, 산 또는 알칼리 조건하에서 교반 혼합하는 것을 특징으로 하는 것이고, 이에 의해, 가교율이 낮음에도 불구하고 우 수한 점탄성을 갖는 가교 히알루론산 겔을 간편하게 제조할 수 있는 것이다.

본 발명에서 「가교율」이라는 것은 히알루론산 구성 단위 당의 가교제의 수를 나타낸다. 예를 들어, 가교율 100 %에서는 1개의 히알루론산 구성 단위에 대해서 1 개의 가교제가 결합되어 있는 것을 나타낸다.

본 발명에 사용하는 히알루론산은 하기 화학식으로 표시되는 바와 같이 N-아세틸-D-글루코사민 잔기와, D-글루쿠론산 잔기가 번갈아 결합된 직쇄상 고분자이고, 이와 같은 것이면 특별히 한정되지 않고 사용할 수 있다.

히알루론산은 예를 들어 계관(鷄冠)이나 다른 동물 조직으로부터의 단리 추출, 또는 스트렙토코커스속 등의 미생물을 사용한 발효법에 의해 수득할 수 있다. 또한, 본 발명에서는 예를 들어 히알루론산의 유도체로서 히알루론산 나트륨염, 히알루론산 칼륨염 등의 히알루론산 금속염이나, 히알루론산의 히드록실기, 카르복실기 등을 에테르화, 에스테르화, 아미드화, 아세탈화, 케탈화시켜 수득되는 히알루론산 유도체 등을 사용해도 상관없다.

또한, 본 발명의 히알루론산으로서는 시판품을 사용할 수도 있다. 시판의 히알루론산으로서는, 예를 들어 바이오히알로12(시세이도샤 제조), 히알루론산(기분샤 제조) 등을 들 수 있다.

본 발명에서는 가교 반응에 제공하는 혼합물 중, 상기 히알루론산을 10 W/V% 이상 포함하고 있는 것이 필요로 된다. 이와 같이 히알루론산을 고농도로 함유하는 혼합물 중에서는 히알루론산 분자사슬이 매우 복잡하게 얽힌 상태로 존재하고 있으므로, 히알루론산 사슬 끼리 부분적으로 가교됨으로써, 분자 사슬 끼리 입체적으로 서로 속박하게 되고, 네트워크 구조를 강하게 안정화시킬 수 있다. 그리고, 이 때문에, 히알루론산을 10 W/V% 이상 포함하는 혼합물을 가교 반응에 사용함으로써, 가교율이 낮음에도 불구하고 우수한 점탄성을 나타내는 가교 히알루론산 겔을 제조할 수 있는 것이라 생각된다. 한편, 히알루론산 농도 10 W/V% 미만의 경우에는 가교율이 낮으면 히알루론산 분자 사슬의 자유도가 높아서, 그 결과 가교 겔이 부드러워져, 우수한 점탄성이 수득되지 않는다. 또한, 본 발명에서는 가교 반응에 제공하는 혼합물 중, 상기 히알루론산을 10 W/V% 내지 20 W/V% 포함하고 있는 것이 보다 바람직하다.

또한, 통상, 일반적으로 사용되고 있는 분자량 10 만 이상의 히알루론산을 사용하여, 전술한 바와 같은 10 W/V% 이상의 고농도 히알루론산 수용액으로 한 경우에는 고체 분말상 또는 매우 고점도의 겔상을 나타내고 있고, 주파수 1 ㎐에서의 저장 탄성률(G’)이 15000 Pa 이상이 된다. 본 발명에서는 가교 반응에 제공하는 혼합물이 이와 같은 고체 분말상 또는 고점도 겔상을 나타내는 상태에서 반응을 실시하는 것이 바람직하다. 즉, 본 발명에서는 상기 히알루론산 분자가 매우 복잡하 게 얽힌 상태에서 가교 반응을 실시할 필요가 있고, 히알루론산 농도가 10 W/V% 이상이었다고 해도, 히알루론산이 수중에 분산된 소위 용액상에서 반응을 실시하면, 원하는 점탄성을 갖는 가교 히알루론산 겔을 수득할 수 없는 경우가 있다. 이 때문에, 본 발명에서는 가교 반응에 제공하기 전의 혼합물의 저장 탄성율(G’)(주파수 1 ㎐)이 15000 Pa 이상인 것이 바람직하다.

본 발명에 사용되는 히알루론산의 분자량은 특별히 한정되는 것은 아니지만, 분자량 10 만 이상, 또한 분자량이 50 만 내지 300 만 정도인 것이 바람직하다. 통상, 일반적으로 사용되는 히알루론산은 그 대부분이 분자량 10 만 이상이지만, 특별히 저분자화된 분자량 1 만 정도의 히알루론산도 존재한다. 본 발명에서 이와 같은 분자량 1 만 정도의 저분자화 히알루론산을 사용하면, 히알루론산 농도를 10 W/V% 이상으로 해도, 히알루론산이 수중에 균일하게 분산된 용액상이 되는 경우가 있고, 가교율을 저하시킨 경우에 부드러워지고, 원하는 점탄성을 수득할 수 없는 경우가 있으므로 바람직하지 않다.

본 발명에 사용하는 가교제는 상기 히알루론산의 고분자 사슬간을 화학 결합에 의해 가교할 수 있는 것이면, 어떤 것을 사용해도 상관없다. 히알루론산의 가교제로서는 히알루론산 분자가 갖는 카르복실기, 수산기, 아세트아미드기라는 반응성 관능기와 반응하여 공유 결합을 형성할 수 있는 관능기를 2 이상 갖는 다관능성 화합물을 사용할 수 있다. 본 발명에 사용하는 가교제로서는 구체적으로는 1,3-부타디엔디에폭시드, 1,2,7,8-디에폭시옥탄, 1,5-헥사디엔디에폭시드 등의 알킬디에폭시체, 에틸렌글리콜디글리시딜에테르, 1,4-부탄디올디글리시딜에테르, 비스페놀 A 디글리시딜에테르 등의 디글리시딜에테르체, 디비닐설폰, 에피클로르히드린 등을 들 수 있다. 이들 중에서도 특히 디비닐설폰, 1,4-부탄디올·디글리시딜에테르, 및 에틸렌글리콜·디글리시딜에테르를 바람직하게 사용할 수 있다. 또한, 본 발명에서는 2 종 이상의 가교제를 적절하게 조합시켜 사용해도 상관없다.

본 발명에서는 가교 반응에 제공하는 혼합물 중, 상기 가교제의 배합량은 특별히 한정되는 것은 아니지만, 수득되는 가교 히알루론산 겔의 생체 적합성의 관점에서, 가능한 소량의 가교제에 의해 가교 반응을 실시하는 것이 바람직하다. 구체적으로는 가교 반응에 제공하는 혼합물 중, 상기 가교제 농도가 0.02 W/V% 내지 1 W/V%인 것이 바람직하고, 또한 보다 바람직하게는 0.05 W/V% 내지 0.5 W/V%이다. 또는, 혼합물 중의 가교제 농도가 히알루론산 구성 단위에 대해서 0.02 W/W% 내지 2 W/W%인 것이 바람직하다. 본 발명에 의하면, 가교제 농도를 혼합물 중 1 W/V% 이하로 한 경우에도, 우수한 점탄성을 갖는 가교 히알루론산 겔을 제조할 수 있다. 또한, 본 발명에서 일반적인 저분자의 가교제를 사용하여, 가교제 농도를 0.066 W/V%, 히알루론산 농도를 14 W/V%로 하여 가교 반응을 실시한 경우, 가교제의 전량이 히알루론산의 반응성기와 반응한 것으로 가정하면, 수득되는 가교 히알루론산 겔의 가교율은 통상, 히알루론산 구성 단위 1 유닛 당 약 1.67 % 이하가 된다. 다시 말하면 64 개의 히알루론산 구성 단위 당 1개의 가교제가 결합하고 있는 것이 된다.

본 발명에 관한 가교 히알루론산 겔의 제조 방법에서는 상기 히알루론산 10 W/V% 이상, 상기 가교제 및 물을 포함하는 혼합물을, 산 또는 알칼리 조건 하에서 교반 혼합하고, 상기 히알루론산이 갖는 반응성 관능기와 상기 가교제를 반응시킴으로써, 히알루론산 고분자 사슬 사이를 화학 결합에 의해 가교하고, 가교 히알루론산 겔을 생성한다.

또한, 본 발명에서는 가교 반응시의 히알루론산의 반응성을 높일 목적으로, 염산, 황산 등의 산, 수산화나트륨, 수산화칼륨 등의 염기, 또는 인산염, 4급 암모늄염 등의 적당한 완충액에 의해 혼합물의 pH를 적절하게 조정하고, 산 또는 알칼리 조건하에서 교반 혼합을 실시한다. 구체적으로는 예를 들어, 산 조건 하에서는 pH 1 내지 pH 5, 알칼리 조건하에서는 pH 10 내지 pH 14가 되도록 혼합물의 pH를 조정하는 것이 바람직하다.

또한, 본 발명에서는 가교 반응에 제공하는 혼합물 중, 상기 필수 성분 이외에도 미리 통상, 의약품, 화장료 등에 사용되는 성분을, 본 발명의 목적 및 효과에 영향이 없는 범위에서 배합해도 상관없다. 배합 가능한 성분으로서는 예를 들어, 아스코르빈산 및 그 유도체, 글리세린 등의 보습제, 레티놀 및 그 유도체, 살리실산 등의 항염증제 등을 들 수 있다.

본 발명에서 상기 혼합물을 교반 혼합하는 방법은 특별히 한정되는 것은 아니지만, 혼합물 중의 히알루론산 고분자 사슬을 물리적으로 절단하지 않고 교반 혼합하는 것이 바람직하다. 히알루론산은 매우 높은 수팽윤성을 갖고 있고, 예를 들어 약 10 W/V% 정도의 히알루론산 수용액에서는 매우 고점도의 겔상을 나타내고 있다. 이 때문에, 예를 들어 일반적으로 널리 사용되고 있는 프로펠라 믹서나 디스퍼 등의 회전형의 교반 혼합 장치에서는 교반 날개나 장치벽 등에 부착되고, 계 (系) 전체를 균일하게 교반 혼합하기 어렵다. 또한, 이와 같은 교반 혼합 장치를 사용하여, 무리하게 교반날개를 회전시켜 교반 혼합한 경우에는 예리한 교반 날개에 의해 히알루론산 고분자의 분자 사슬을 물리적으로 절단하게 되어, 목적으로 하는 가교 히알루론산 겔(3차원 네트워크상 구조를 갖는 가교 겔)은 수득되지 않는다. 이와 같이, 통상의 교반 혼합 장치를 사용하여, 고농도 조건의 히알루론산 수용액에서 균일한 가교 반응을 실시하는 것은 매우 곤란했으므로, 종래 가교 히알루론산 겔의 제조시에는 일반적으로 0.1 W/V% 내지 3 W/V% 정도의 저점도의 히알루론산 수용액 중에서 가교 반응이 실시되어 왔다.

이에 대해서, 본 발명의 가교 히알루론산 겔의 제조 방법에서는 예를 들어, 자전-공전식 혼합장치를 사용한 교반 혼합, 빵 생지 반죽 장치(또는 떡 제조 장치)를 사용한 교반 혼합, 또는 사람 손의 주무름에 의한 교반 혼합과 같이, 혼합물 중의 히알루론산 고분자 사슬을 물리적으로 절단하지 않고 교반 혼합함으로써 10 W/V% 이상이라는 매우 높은 히알루론산 농도 조건에서도 용이하게 균일한 가교 구조를 형성시키는 것이 가능해진다. 즉, 이들의 교반 혼합 방법에 의하면, 히알루론산 고농도 조건하에서도 히알루론산 고분자의 분자 사슬을 물리적으로 절단하지 않고, 계 전체를 균일하게 교반 혼합할 수 있고, 균일하게 가교된 가교 히알루론산 겔을 조제하는 것이 가능해진다.

이하, 본 발명에 관한 가교 히알루론산 겔의 제조 방법에 대해서, 교반 혼합 방법의 구체예를 들어, 본 발명에 대해서 더욱 상세하게 설명한다.

1. 자전-공전식 혼합 장치에 의한 교반 혼합

본 발명에서의 상기 혼합물을 교반 혼합하는 방법으로서는 자전-공전식 혼합장치에 의한 교반혼합을 사용할 수 있다.

본 발명에 사용되는 자전-공전식 혼합장치는 당업자에서 공지이고, 예를 들어 일본 공개특허공보 소61-290946호, 일본 실용신안공보 평5-32110호, 일본 공개특허공보 평10-43568호 공보, 일본 공개특허공보 평11-226376호, 및 일본 공개특허공보 2000-271465호 등에 기재되어 있는 혼합 장치를 본 발명에 사용할 수 있다.

도 1에 본 발명의 일 실시예에 관한 자전-공전식 혼합장치를 나타낸다.

본 발명의 일 실시예에 관한 자전-공전식 혼합장치(10)는 시료를 수용하는 용기 본체(14) 및 그 용기 덮개(12)와, 용기 본체(14)를 고정 유지하는 용기 홀더(16)와, 용기 홀더(16)를 자전축(18)을 따라서 회전시키는 자전 기구(20)와, 자전 기구(20)를 지지하는 지지부(22)와, 지지부(22)를 공전축(24)을 따라서 회전시키는 공전 기구(26)를 구비하고 있다.

(제조예 1)

1) 자전-공전식 혼합장치(10)의 용기 본체(14)에 히알루론산 10 W/V% 이상, 가교제 및 물을 포함하는 혼합물(30)을 수용하고, 용기 덮개(12)를 끼워 용기 홀더(16)에 장착한다.

2) 자전-공전식 혼합장치(10)를 운전하고, 자전기구(20) 및 공전기구(26)를 회전시킨다.

또한, 상기 혼합물(30)은 히알루론산을 10 W/V% 이상이라는 매우 높은 농도로 포함하고 있고, 고체 분말상 또는 매우 고점도의 겔상을 나타내고 있는 것이다.

상기 제조예에서 용기 홀더(16)는 자전 기구(20)에 의해 자전축(18)을 따라서 회전되고, 또한 자전 기구(20)를 지지하는 지지부(22)는 공전 기구(26)에 의해 공전축(24)을 따라서 회전된다. 그리고, 용기 홀더(16)에 수용되는 혼합물(30)은 자전축(18)을 따라서 자전함과 동시에, 공전축(24)을 따라서 공전하게 된다.

이상과 같이 하여, 히알루론산 10 W/V% 이상, 가교제 및 물을 포함하는 혼합물(30)을 자전기구(20) 및 공전기구(26)를 갖는 자전-공전식 혼합장치(10)에 제공하고, 자전시키면서 공전시켜 교반 혼합을 실시함으로써, 혼합물(30)은 고체 분말상 또는 매우 고점도의 겔상임에도 불구하고, 히알루론산 고분자의 분자사슬을 물리적으로 절단하지 않고, 계 전체가 균일하게 교반 혼합되므로, 용이하게 히알루론산 분자 간에 균일한 가교 구조를 형성시키는 것이 가능해진다.

또한, 용기 홀더(16)는 자전 기구(20) 및 공전 기구(26)에 의해, 자전과 공전을 동시에 실시할 수 있고, 그 회전 속도는 자유롭게 설정할 수 있다. 용기 홀더(16)의 회전 속도는 조제되는 가교 히알루론산 겔의 성질이나 용량, 또는 용기 홀더(16)나 자전-공전식 혼합장치(10)의 규모에 따라 다르지만, 통상의 경우, 자전 속도는 60 회전/분 내지 1000 회전/분, 공전속도는 300 회전/분 내지 3000 회전/분 정도이다. 또한, 자전-공전식 혼합 장치(10)에 의해 혼합물(30)을 교반 혼합하는 시간도, 전술한 회전 속도의 경우와 동일하게 조제되는 가교 히알루론산 겔의 성질이나 용량 및 장치의 규모 등의 여러 조건에 따라서 다르지만, 통상의 경우, 10 초 내지 30 분 정도이다.

2. 빵 생지 반죽 장치에 의한 교반 혼합

본 발명에서의 상기 혼합물을 교반 혼합하는 방법으로서는 빵 생지 반죽 장치에 의한 교반 혼합을 사용할 수 있다.

본 발명에 사용하는 빵 생지 반죽 장치는 당업자에게 공지이고, 각종 시판의 장치를 본 발명에 사용할 수 있다.

도 2에 본 발명의 일 실시예에 관한 빵 생지 반죽 장치를 도시한다.

본 발명의 일 실시예에 관한 빵 생지 반죽 장치(40)는, 시료를 수용하는 용기 본체(44), 그 용기 덮개(42) 및 용기 본체(44) 중의 빵 생지 반죽용 날개(46)와, 용기 본체(44)를 회전축(48)을 따라서 회전시키는 회전 기구(50)를 구비하고 있다. 여기에서, 빵 생지 반죽용 날개(46)는 통상의 믹서 또는 푸드 프로세서용의 예리한 교반 날개와는 달리, 빵 생지를 반죽하는 목적에 맞추어 설계되어 있는 것이다. 또한, 통상의 빵 생지는 반죽함으로써 글루텐의 가교 구조를 형성하여, 독특한 점탄성을 얻는 것이고, 본 발명과 거의 동일하게 글루텐의 분자 사슬을 물리적으로 절단하지 않고 교반 혼합할 필요가 있다(아밀로펙틴의 얽힘에 의해 점탄성을 얻는 떡 제조의 경우에서도 동일하다).

(제조예 2)

1) 빵 생지 반죽 장치(40)의 용기 본체(44)에 빵 생지 반죽용 날개(46)를 장착하고, 상기 용기 본체(44) 중에 히알루론산 10 W/V% 이상, 가교제 및 물을 포함하는 혼합물(60)을 수용하고 용기 덮개(42)를 끼운다.

2) 빵 생지 반죽 장치(40)를 운전하고, 회전 기구(50)를 회전시킨다.

상기 제조예에서, 용기 본체(44) 중의 빵 생지 반죽용 날개(46)는 회전 기 구(50)에 의해 회전축(48)을 따라서 회전된다. 그리고, 빵 생지 반죽용 날개(46)의 회전에 의해, 용기 본체(44)에 수용되는 혼합물(60)이 교반 혼합된다. 여기에서, 빵 생지 반죽용 날개(46)는 종래, 빵 생지 중의 글루텐의 분자 사슬을 물리적으로 절단하지 않고 교반 혼합을 실시할 수 있도록 설계되어 있는 것이다. 이 때문에, 상기 제조예에서도 혼합물(60) 중의 히알루론산 고분자의 분자 사슬을 물리적으로 절단하지 않고 계 전체가 균일하게 교반 혼합된다.

이상과 같이, 히알루론산 10 W/V% 이상, 가교제와 물을 포함하는 혼합물(60)을, 빵 생지 반죽 장치(40)에 제공하고, 빵 생지 반죽 날개(46)의 회전에 의해 교반 혼합을 실시함으로써, 혼합물(60)은 고체 분말상 또는 매우 고점도의 겔상임에도 불구하고, 히알루론산 고분자의 분자 사슬을 물리적으로 절단하지 않고, 계 전체가 균일하게 교반 혼합되므로, 용이하게 히알루론산 분자간에 균일한 가교 구조를 형성시키는 것이 가능해진다.

또한, 빵 생지 반죽용 날개(46)의 회전 속도는 자유롭게 설정할 수 있고, 조제되는 가교 히알루론산 겔의 성질이나 용량, 빵 생지 반죽용 날개(46)의 형상, 또한 용기 본체(44)나 빵 생지 반죽 장치(40)의 규모에 따라서도 다르지만, 통상의 경우 회전 속도는 1000~2000 회전/분 정도이다. 또한, 빵 생지 반죽 장치(40)에 의해 혼합물(60)을 교반 혼합하는 시간도, 전술한 회전 속도의 경우와 동일하게, 조제되는 가교 히알루론산 겔의 성질이나 용량, 날개의 형상 및 장치의 규모 등의 여러 조건에 따라 다르지만, 통상의 경우 2 분 내지 6 분 정도이다.

또한, 본 발명에서의 상기 혼합물을 교반 혼합하는 방법으로서는 상기 빵 생 지 반죽 장치와 동일하게 하여 떡 제조 장치에 의한 교반 혼합을 이용할 수도 있다.

본 발명에 사용하는 떡 제조 장치는 당업자에게 공지이고, 각종 시판의 장치를 본 발명에 사용할 수 있다.

3. 사람 손의 주무름에 의한 교반 혼합

본 발명에서 상기 혼합물을 교반 혼합하는 방법으로서는 사람손의 주무름에 의한 교반 혼합을 사용할 수 있다.

(제조예 3)

1) 히알루론산 10 W/V% 이상, 가교제와 물을 포함하는 혼합물을, 밀폐 가능한 플라스틱제의 봉지에 넣어 봉한다.

2) 양쪽 손가락 2개에 의해, 상기 봉지 중의 혼합물을 주무르도록 하여 잘 혼합시킨다.

이상과 같이, 히알루론산 10 W/V% 이상, 가교제와 물을 포함하는 혼합물에 대해서 사람 손의 주무름에 의해 교반 혼합을 실시함으로써, 혼합물이 고체 분말상 또는 매우 고점도의 겔상임에도 불구하고, 히알루론산 고분자의 분자 사슬을 물리적으로 절단하지 않고, 계 전체가 균일하게 교반 혼합되므로, 히알루론산 분자간에 균일한 가교 구조를 형성시키는 것이 가능해진다.

또한, 사람 손의 주무름에 의해 상기 혼합물을 혼합시키는 시간은 조제되는 가교 히알루론산 겔의 성질이나 용량 및 봉지의 크기 등의 여러 조건에 따라서도 다르지만, 통상의 경우, 5 분 내지 10 분 정도이다.

이상 설명한 본 발명에 관한 가교 히알루론산 겔의 제조 방법에 의하면, 구체적으로는 가교율이 히알루론산 구성 단위 1 유닛 당 2 % 이하의 낮은 가교율임에도 불구하고, 예를 들어 생리 식염수 중에서 팽윤 평형에 도달한 상기 가교 히알루론산 겔의 주파수 1 ㎐에서의 저장 탄성율(G’)이 100 Pa 이상, 보다 바람직하게는 1000 Pa 이상의 매우 우수한 점탄성을 갖는 가교 히알루론산 겔을 간편하게 제조하는 것이 가능해진다.

본 발명의 제조 방법에 의해 수득되는 가교 히알루론산 겔은 그대로, 또는 적당한 처방 중에 배합함으로써 의약품, 화장료 등에 사용하는 것이 가능하다. 특히 본 발명의 제조 방법에 의하면, 가교율이 낮음에도 불구하고 우수한 점탄성을 나타내는 가교 히알루론산 겔을 간편하게 제조할 수 있으므로, 생체 중에 적용하는 물질로의 응용, 예를 들어 주름 제거 주입제 등의 조직 증대 물질, 약물 서방성 조성물, 유착 방지제, 골수복제 등에 적합하게 응용하는 것이 가능하다.

또한, 본 발명의 제조 방법에 의해 수득된 가교 히알루론산 겔은 효소 소화 내성(히알루로니다아제 내성)이 높고, 생체 내에서 장기간 겔 구조를 유지할 수 있으므로, 예를 들어 관절 주입제, 안내 유리체 치환제, 안과용 수술 보조제로서 특히 바람직하게 응용하는 것이 기대된다.

현재, 변형성 무릎 관절증, 견관절주위염, 만성 관절 류머티즘에서의 무릎관절통 등의 증상을 개선할 목적으로, 히알루론산이 관절 주입제로서 사용되고 있다. 본 발명에 의해 수득되는 가교 히알루론산 겔은 효소 소화 내성이 높으므로, 관절 주입제로서 사용함으로써, 종래품보다도 증상 개선의 효과를 장기간 지속하는 것을 기대할 수 있다. 또한, 박리된 망막을 복위시키기 위한 안내 유리체 치환물로서 현재는 실리콘 오일이 널리 사용되고 있다. 이와 같은 안내 유리체 치환물로서는 생체내 성분인 히알루론산이 적합한 것으로 생각되지만, 히알루론산은 눈 내에서 효소에 의해 분해되기 쉬우므로, 현재 유리체 치환물로서의 히알루론산은 시판되고 있지 않다. 본 발명에 의해 수득되는 가교 히알루론산 겔은 효소 소화 내성이 높으므로, 유리체 치환물로서 사용함으로써, 장기간에 걸쳐 눈 내에 머물고, 망막을 맥락막에 부착시켜, 망막을 복위시키는 효과를 기대할 수 있다. 또한, 최근 안과 수술 보조제로서 히알루론산을 사용함으로써, 백내장의 수술을 안전하고 용이하게 실시할 수 있게 되었다. 그리고, 본 발명에 의해 수득되는 가교 히알루론산 겔은 가교 겔이지만, 매우 적은 미립자가 되어 있고, 고점탄성 히알루론산 용액은 동등한 점탄성을 나타낸다. 이 때문에, 시판의 히알루론산 안과 수술 보조제와 동일하게 안과 수술시의 보조제 등으로서 사용하는 것을 기대할 수 있다. 또한, 시판품의 히알루론산 제제는 모두 여과 멸균이지만, 본 발명에 의해 수득되는 가교 히알루론산 겔은 고압 증기 멸균을 실시할 수 있으므로, 최종 제품의 미생물 오염의 위험성을 최소한으로 하는 것이 가능하다.

이하, 본 발명의 실시예에 의해 본 발명에 대해서 더욱 상세하게 설명하지만, 본 발명은 이에 한정되는 것은 아니다.

히알루론산 고농도 조건에 의한 가교 히알루론산 겔의 조제(자전-공전식 혼합 장치)

본 발명자들은 우선 최초로 자전-공전식 혼합장치를 사용하여 50 W/V% 라는 매우 높은 히알루론산 농도 조건에서 소량의 가교제에 의한 가교 반응을 시도하고, 수득된 가교 히알루론산 겔에 대해서 점탄성을 측정하여 시판의 가교 히알루론산 겔의 점탄성과의 비교를 실시했다. 또한, 본 발명에서는 히알루론산 수용액의 용적을 측정하고 W/V%의 계산을 실시했다.

실시예 1-1: 히알루론산 41 W/V%, 디비닐설폰 가교율 0.8 %

정제수 1800 ㎕에, 2N NaOH 수용액 200 ㎕, 및 디비닐설폰 2 ㎕를 가하고, 또한 히알루론산(바이오히알로 12: 시세이도샤 제조) 1.0 g을 첨가했다. 상기 혼합물[주파수 1 ㎐에서의 저장 탄성률(G’):300000 Pa]을, 자전-공전식 혼합장치(AR-250: THINKY사 제조)에 의해, 실온에서 5분간 교반 혼합했다. 생성물을 생리 식염수 중에서 1 주간 팽윤 평형에 도달할 때까지 정치하고, 팽윤한 가교 히알루론산 겔을 샘플 밀(SK-M2형: 교리츠 리코샤 제조)로 파쇄하고, 목적으로 하는 가교 히알루론산 겔 슬러리를 수득했다. 수득된 가교 히알루론산 겔 슬러리에 대해서, 레오미터(Rheolyst AR1000-N:TA인스트루먼트사 제조)를 사용하여, 25 ℃, 주파수 0.1 ㎐ 내지 10 ㎐의 조건에서 저장 탄성율(G’) 및 손실 탄성율(G”)을 측정했다. 또한, 첨가한 가교제의 전량이 히알루론산의 반응성기와 반응한 것으로 가정하면, 수득된 가교 히알루론 겔의 가교율은 히알루론산 구성 단위 1 유닛 당 0.8 %이다. 측정 결과를 도 3에 나타낸다.

비교예 1-1: 시판되는 가교 히알루론산 겔(Restylane: Q-MED사 제조) 가교율 1 %

본 발명과의 비교 목적에서, 종래 주름 제거 주입제로서 널리 사용되고 있는 시판의 가교 히알루론산 겔(Restylane: Q-MED사 제조)에 대해서, 상기 실시예 1-1과 동일하게 하여, 저장 탄성율(G’) 및 손실 탄성율(G”)을 측정한다. 또한, 상기 시판되는 가교 히알루론산 겔은 일본 특허 제3094074호 공보에 기재되는 방법에 의해 제조된 것이고, 가교율은 히알루론산 구성 단위 1유닛 당 1 %로 추측된다. 측정 결과를 도 4에 도시한다.

도 3에 도시한 바와 같이, 상기 실시예 1-1에 의해 수득된 가교 히알루론산 겔 슬러리는 가교율이 0.8 %로 낮음에도 불구하고, 생리 식염수에서 팽윤 평형에 도달한 경우에, 주파수 0.1 ㎐ 내지 10 ㎐의 범위에서 저장 탄성율(G’)이 약 20000 Pa, 손실 탄성율(G”)이 약 5000 Pa로 우수한 점탄성을 나타내는 것이 밝혀졌다. 이는 가교 반응에 제공하는 혼합물 중의 히알루론산 농도가 41 W/V%로 현저하게 높으므로, 소량의 가교제에 의해 가교되는 것만으로, 히알루론산 분자 사슬 끼리가 입체적으로 서로 속박하고, 네트워크 구조가 단단하게 안정화되어 있기 때문으로 생각된다. 한편, 도 4에 도시한 바와 같이, 종래, 주름 제거 주입제로서 널리 사용되고 있는 비교예 1-1의 시판 가교 히알루론산 겔 슬러리에서는 가교율 1 % 정도로, 생리 식염수에서 팽윤 평형에 도달했을 때의 저장 탄성율(G’)이 약 1000 Pa, 손실 탄성율(G”)이 약 200 Pa인 것을 알 수 있었다. 이점에서 상기 실시예 1-1에 의해 수득된 가교 히알루론산 겔 슬러리는 가교율이 낮음에도 불구하고, 주름 제거 주입제로서의 실사용에 충분한 정도의 우수한 점탄성을 갖고 있는 것을 알 수 있다.

또한, 상기 비교예 1-1로서 사용한 시판의 가교 히알루론산 겔 슬러리는 가 교율은 낮지만, 그 제조 방법은 일본 특허 제3094074호 공보에 기재되어 있는 바와 같이 히알루론산과 가교제를 수용액 중에서 혼합하여 가교 반응을 개시하게 하고, 겔화가 일어나기 전에 물을 가하여 혼합 용액을 희석함으로써 일단 가교 반응의 진행을 막고, 또한 상기 혼합 용액으로부터 물을 휘발시켜 다시 가교 반응을 진행시키는 것과 같은 2단계의 가교 반응 공정을 거치는 것으로, 매우 번잡한 조작이 필요로 된다. 이에 대해서, 상기 실시예 1-1의 제조 방법에 의하면, 41 W/V%라는 매우 높은 히알루론산 농도 조건에 의해 가교 반응을 실시함으로써, 낮은 가교율과 우수한 점탄성을 나타내는 가교 히알루론산 겔을, 보다 간이(簡易)하게 제조할 수 있는 것을 알았다.

계속해서, 본 발명자들은 가교제의 종류와 가교 반응에 제공하는 히알루론산 농도 조건을 적절하게 변화시켜 상기 실시예 1-1과 동일한 시험을 시도하고, 수득되는 가교 히알루론산 겔 슬러리의 점탄성과의 관계에 대해서 검토를 실시했다.

실시예 1-2: 33 W/V% 히알루론산, 1,4-부탄디올·디글리시딜에테르 가교율 1 %

정제수 2250 ㎕에, 2N NaOH 수용액 250 ㎕, 및 1,4-부탄디올·글리시딜에테르 5 ㎕를 가하고, 또한 히알루론산(바이오히알로 12: 시세이도샤 제조) 1.0 g을 첨가했다. 상기 혼합물[주파수 1 ㎐에서의 저장 탄성율(G’): 100000 Pa]을 자전-공전식 혼합장치(AR-250: THINKY샤 제조)에 의해 실온에서 5분간 교반 혼합한 후, 실온에서 24 시간 정치했다. 수득된 겔을 생리 식염수 중에서 1 주간 팽윤 평형에 도달할 때까지 정치하고, 팽윤한 가교 히알루론산 겔을 샘플밀(SK-M2형: 교리츠 리 코샤 제조)에서 파쇄하고, 목적으로 하는 가교 히알루론산 겔 슬러리를 수득했다. 수득된 가교 히알루론산 겔 슬러리에 대해서, 상기 실시예 1-1과 동일하게 하여 저장 탄성율(G’) 및 손실 탄성율(G”)의 측정을 실시했다. 또한, 첨가한 가교제의 전량이 히알루론산의 반응성기와 반응한 것으로 가정하면, 수득된 가교 히알루론 겔의 가교율은 히알루론산 구성 단위 1 유닛 당 1 %이다. 측정 결과를 도 5에 나타낸다.

도 5에 도시한 바와 같이, 가교제로서 1,4-부탄디올·디글리시딜에테르를 사용하여, 히알루론산 농도 33 W/V%의 조건에서 수득된 실시예 1-2의 가교 히알루론산 겔은 가교율이 1 %로 낮음에도 불구하고, 생리 식염수에서 팽윤 평형에 도달한 경우에, 주파수 0.1 ㎐ 내지 10 ㎐의 범위에서 저장 탄성율(G’)이 약 1500 Pa, 손실 탄성율(G”)이 약 300 Pa 내지 400 Pa였다. 이점에서, 상기 실시예 1-1과는 다른 가교제를 사용한 경우에도 히알루론산 고농도 조건에서 가교 반응을 실시함으로써, 저(低)가교율이고 우수한 점탄성을 나타내는 가교 히알루론산 겔이 수득되는 것을 알았다.

실시예 1-3: 26 W/V% 히알루론산, 디비닐설폰 가교율 0.8 %

정제수 3000 ㎕에, 2N NaOH 수용액 333 ㎕, 및 디비닐설폰 2 ㎕을 가하고, 또한 히알루론산(바이오히알로9: 시세이도샤 제조) 1.0 g을 첨가했다. 상기 혼합물[주파수 1 ㎐에서의 저장 탄성율(G’): 60000 Pa]을 자전-공전식 혼합 장치(AR-250:THINKY샤 제조)에 의해, 실온에서 5 분간 교반 혼합했다. 생성물을 생리 식염수 중에서 1 주간 팽윤 평형에 도달할 때까지 정치하고, 팽윤한 가교 히알루론산 겔을 샘플밀(SK-M2형: 교리츠 리코샤 제조)에서 파쇄하고, 목적으로 하는 가교 히알루론산 겔 슬러리를 수득했다. 수득된 가교 히알루론산 겔 슬러리에 대해서, 상기 실시예 1-1과 동일하게 하여 저장 탄성율(G’) 및 손실 탄성율(G”)의 측정을 실시했다. 또한, 첨가한 가교제의 전량이 히알루론산의 반응성기와 반응한 것으로 가정하면, 수득된 가교 히알루론 겔의 가교율은 히알루론산 구성 단위 1 유닛 당 0.8 %이다. 측정 결과를 도 6에 나타낸다.

실시예 1-4: 26 W/V% 히알루론산, 1,4-부탄디올·디글리시딜에테르 가교율 1 %

정제수 3000 ㎕에, 2N NaOH 수용액 333 ㎕ 및 1,4-부탄디올·디글리시딜에테르 5 ㎕을 가하고, 또한 히알루론산(바이오히알로 12: 시세이도샤 제조) 1.0 g을 첨가했다. 상기 혼합물(주파수 1 ㎐에서의 저장 탄성율(G’): 60000 Pa)을 자전-공전식 혼합장치(AR-250: THINKY샤 제조)에 의해, 실온에서 5 분간 교반 혼합한 후, 실온에서 24 시간 정치했다. 수득된 겔을 생리 식염수 중에서 1 주간 팽윤 평형에 도달할 때가지 정치하고, 팽윤한 가교 히알루론산 겔을 샘플밀(SK-M2형: 교리츠 리코샤 제조)에서 파쇄하고, 목적으로 하는 가교 히알루론산 겔 슬러리를 수득했다. 수득된 가교 히알루론산 겔 슬러리에 대해서 상기 실시예 1-1과 동일하게 하여 저장 탄성율(G’) 및 손실 탄성율(G”)의 측정을 실시했다. 또한, 첨가한 가교제의 전량이 히알루론산의 반응성기와 반응한 것으로 가정하면, 수득된 가교 히알루론 겔의 가교율은 히알루론산 구성 단위 1 유닛 당 1 % 정도이다. 측정 결과를 도 7에 나타낸다.

실시예 1-5: 13 W/V% 히알루론산, 1,4-부탄디올·디글리시딜에테르 가교율 2.8 %

정제수 2250 ㎕에, 2N NaOH 수용액 250 ㎕, 및 1,4-부탄디올·글리시딜에테르 5 ㎕를 첨가하고, 또한 히알루론산(바이오히알로 12: 시세이도샤 제조) 0.375 g을 첨가했다. 상기 혼합물(주파수 1 ㎐에서의 저장 탄성율(G’): 20000 Pa)을 자전-공전식 혼합장치(AR-250: THINKY샤 제조)에 의해, 실온에서 5 분간 교반 혼합한 후, 실온에서 24 시간 정치했다. 수득된 겔을 생리 식염수 중에서 1 주간 팽윤 평형에 도달할 때까지 정치하고, 팽윤한 가교 히알루론산 겔을 샘플밀(SK-M2형: 교리츠 리코샤 제조)에서 파쇄하고, 목적으로 하는 가교 히알루론산 겔 슬러리를 수득했다. 수득된 가교 히알루론산 겔 슬러리에 대해서, 상기 실시예 1-1과 동일하게 하여 저장 탄성율(G’) 및 손실 탄성율(G”)의 측정을 실시했다. 또한, 첨가한 가교제의 전량이 히알루론산의 반응성기와 반응한 것으로 가정하면, 수득된 가교 히알루론겔의 가교율은 히알루론산 구성 단위 1 유닛 당 2.8 %이다. 측정 결과를 도 8에 나타낸다.

도 6에 도시한 바와 같이, 히알루론산 농도 26 W/V%의 조건에서, 가교제로서 디비닐설폰을 사용한 실시예 1-3의 경우에는 가교율 0.8 % 정도이고, 생리 식염수에서 팽윤 평형에 도달했을 때의 상기 저장 탄성율(G’)이 약 300 Pa 내지 700 Pa, 손실 탄성율(G”)이 약 100 Pa 내지 200 Pa였다. 또한, 도 7에 도시한 바와 같이, 1,4-부탄디올디글리시딜에테르를 사용한 실시예 1-4의 경우에는 가교율 1 % 정도이고, 생리식염수에서 팽윤 평형에 도달했을 때의 저장 탄성율(G’)이 약 200 Pa, 손 실 탄성율(G”)이 약 30 Pa 내지 50 Pa였다. 또한, 도 8에 도시한 바와 같이, 가교제로서 1,4-부탄디올·디글리시딜에테르를 사용하여, 히알루론산 농도 13 W/V%의 조건에서 수득된 실시예 1-5의 가교 히알루론산 겔은 가교율 2.8 % 정도이고, 생리 식염수에서 팽윤 평형에 도달했을 때의 저장 탄성율(G’)이 약 150 Pa, 손실 탄성율(G”)이 약 20 Pa였다.

이들 결과로부터 히알루론산 고농도 조건하에서 가교 반응을 실시함으로써, 0.8 % 내지 2.8 % 정도 낮은 가교율임에도 불구하고, 우수한 점탄성을 갖는 가교 히알루론산 겔이 수득되는 것이 밝혀졌다.

히알루론산 농도 조건의 검토

계속해서, 본 발명자들은 가교 반응에 제공하는 히알루론산의 농도 조건에 대해서 보다 상세하게 검토하기 위해, 히알루론산 농도 조건을 각종 변화시켜 상기 실시예 1-1과 동일한 시험을 시도하고, 가교 히알루론산 겔의 점탄성과의 관계에 대해서 검토를 실시했다.

실시예 2-1, 2-2, 비교예 2-1 내지 비교예 2-5

정제수 4.7 ㎖에, 2N NaOH 수용액 0.25 ㎖, 및 디메틸설폭시드에서 13.3 배로 희석한 디비닐설폰 50 ㎕(디비닐설폰으로서 3 ㎕)를 가하고, 또한 각종 농도의 히알루론산(바이오히알로 12: 시세이도샤 제조)을 첨가한다[실시예 2-1: 1 g(18.2 W/V%), 실시예 2-2: 0.75 g(13.9 W/V%), 비교예 2-1: 0.5 g(9.4 W/V%), 비교예 2-2: 0.25 g(5.0 W/V%), 비교예 2-3: 0.15 g(3.0 W/V%), 비교예 2-4: 0.1 g(2.0 W/V%), 비교예 2-5: 0.05 g(1.0 W/V%)]. 이 혼합물을 자전-공전식 혼합장치(AR- 250: THINKY샤 제조)에 의해, 실온에서 5분간 교반 혼합했다. 생성물을 생리 식염수 중에서 1 주간 팽윤 평형에 도달할 때까지 정치하고, 팽윤한 가교 히알루론산 겔을 샘플밀(SK-M2형: 교리츠 리코샤 제조)에서 파쇄하고, 목적으로 하는 가교 히알루론산 겔 슬러리를 수득했다. 수득된 가교 히알루론산 겔 슬러리에 대해서 레오메타(Rheolyst AR 1000-N: TA 인스트루먼트샤 제조)를 사용하여, 25 ℃, 주파수 1 ㎐의 조건에서, 저장 탄성율(G’)의 측정을 실시했다. 결과를 하기 표 1에 나타낸다.

	혼합물 중 히알루론산 농도 (W/V%)	저장 탄성율(G’)(주파수 1 ㎐)
실시예 2-1	18.2	627.7
실시예 2-2	13.9	204.1
비교예 2-1	9.4	0.17
비교예 2-2	5.0	측정 불능(일부 가교겔)
비교예 2-3	3.0	측정 불능(일부 가교겔)
비교예 2-4	2.0	측정 불능(극히 일부 가교겔)
비교예 2-5	1.0	측정 불능(극히 일부 가교겔)

표 1에 표시되는 바와 같이, 혼합물 중의 히알루론산 농도가 13.9 % 내지 18.2 %인 실시예 2-1, 실시예 2-2에서는 생리 식염수에서 팽윤 평형에 도달했을 때의 저장 탄성율(G’)이, 각각 627.7 Pa, 204.1 Pa이고, 우수한 점탄성을 갖는 가교 히알루론산 겔이 수득되는 것이 밝혀졌다. 이에 대해서, 혼합물 중의 히알루론산 농도가 9.4 W/V%인 비교예 2-1에서는 저장 탄성율(G’)이 0.17 Pa이고, 극히 낮은 점탄성을 나타내고 있었다. 또한, 혼합물 중 히알루론산 농도가 5.0 W/V% 이하인 비교예 2-2 내지 비교예 2-5에서는 부분적으로 가교 겔의 형성은 보였지만, 대부분이 고농도 히알루론산 용액이고 점탄성을 나타내는 겔은 수득되지 않았다.

빵 생지 반죽 장치에 의한 가교 히알루론산 겔의 조제

계속해서, 본 발명자들은 시판의 빵 생지 반죽 장치를 사용하여, 고농도의 히알루론산과 소량의 가교제에 의한 가교 반응을 시도하고, 수득된 가교 히알루론산 겔에 대해서 점탄성을 측정했다.

실시예 3-1

정제수 190 ㎖에, 디메틸설폭시드에서 16.7 배로 희석한 디비닐설폰 용액 2 ㎖(디비닐설폰으로서 120 ㎕)를 가하여 가볍게 교반하고, 또한 히알루론산(바이오히알로 12: 시세이도샤 제조) 28.0 g을 첨가했다(히알루론산 농도 13.0 W/V%). 상기 혼합물을 시판의 빵 생지 반죽 장치[내쇼널 푸드 프로세서 MK-K58: 마츠시타 덴키샤 제조, 별매의 빵 날개(AUF 84-137)를 장착]에 의해 실온에서 2 분간 교반 혼합한 후, 2 N NaOH 수용액 10 ㎖를 첨가하고, 또한 5 분간 교반 혼합했다. 생성물을 밀봉 가능한 폴리에틸렌 봉지에 봉입하고, 실온에서 18 시간 정치하여 200 g의 가교 히알루론산 겔을 수득했다. 상기 가교 히알루론산 겔 약 7.2 g을 생리 식염수 중에서 1 주간 팽윤 평형에 도달할 때까지 정치하여 팽윤 겔을 수득했다. 또한, 상기 팽윤 겔을 밀로 파쇄하여 슬러리화하고, 이를 소형의 주사통에 약 1 ㎖ 충전하여 고압 증기 멸균을 실시했다. 상기 고압 증기 멸균 후에, 레오메타(Rheolyst AR1000-N:TA 인스트루먼트샤 제조)를 사용하여 25 ℃, 주파수 1 ㎐의 조건에서, 저장 탄성율(G’)의 측정을 실시한 바 577 Pa이었다.

손 주무름에 의한 가교 히알루론산 겔의 조제

계속해서, 본 발명자들은 사람의 손 주무름에 의한 교반 혼합에 의해, 고농도의 히알루론산과 소량의 가교제에 의한 가교 반응을 시도하고, 수득된 가교 히알루론산 겔에 대해서 점탄성을 측정했다.

실시예 4-1,4-2, 비교예 4-1

미리 에탄올로 소독한 폴리에틸렌 봉지(길이 100 ㎜, 폭 70 ㎜)에, 0.1 N NaOH 수용액 4.95 ㎖, 및 디메틸설폭시드로 13.3 배로 희석한 디비닐설폰 용액 50 ㎕(디비닐설폰으로서 3 ㎕)을 가하여 잘 교반하고, 또한 각종 농도의 히알루론산(바이오히알로 12: 시세이도샤 제조)을 첨가한다[실시예 4-1:0.7 g(13 W/V%), 실시예 4-2: 0.6 g(11 W/V%), 비교예 4-1:0.5 g(9.4 W/V%)]. 히알루론산 첨가후, 빠르게 봉지의 시일을 실시하고, 양쪽 손가락 2개로 봉지 중의 혼합물을 주무르도록 하여 잘 혼합했다. 약 5 분간 혼합한 후, 봉지를 흔들어 겔상의 혼합물을 봉지 바닥으로 모으고, 이를 봉형상으로 성형했다. 봉지를 클린 벤치 내에 4 시간 정치한 후 봉지를 뜯어 생성물을 취출하고, 가교 히알루론산 겔을 수득했다. 상기 가교 히알루론산 겔을 생리 식염수 중에서 1 주간 팽윤 평형에 도달할 때까지 정치하여 팽윤 겔을 수득했다. 또한, 상기 팽윤 겔을 밀에서 파쇄하여 슬러리화하고, 이를 소형의 주사통에 약 1 ㎖ 충전하여, 고압 증기 멸균을 실시했다. 상기 고압 증기 멸균 후에, 레오메타(Rheolyst AR 1000-N: TA 인스트루먼트샤 제조)를 사용하여 25 ℃, 주파수 1 ㎐의 조건에서, 저장 탄성율(G’)의 측정을 실시한 바, 각각 181 Pa(실시예 4-1), 61.5 Pa(실시예 4-2), 10.5 Pa(비교예 4-1)이었다.

또한, 이상의 각 실시예에 의해 수득된 가교 히알루론산 겔의 슬러리를 손가락 위에서 문질러 본 바, 기계(자전-공전식 혼합장치 또는 빵 생지 반죽 장치)에 의한 교반 혼합으로 조제한 히알루론산 겔 슬러리에서는 매우 소량의 단단한 겔 미립자의 존재가 확인되었지만, 사람의 손 주무름에 의한 교반 혼합으로 조제한 히알루론산 겔 슬러리에서는 이와 같은 단단한 미립자의 존재는 확인되지 않았다. 이것으로부터 본 발명에 관한 가교 히알루론 겔의 제조 방법에서는 사람의 손 주무름에 의한 교반 혼합이 보다 적합한 것으로 생각된다.

가교 히알루론산 겔의 효소 소화 내성

계속해서, 본 발명자들은 예를 들어 주름 제거 주입제와 같이 생체 내에 주입하여 사용하는 가교 히알루론산 겔 슬러리의 응용을 고려하여 본 발명에 의해 수득된 가교 히알루론산 겔 슬러리의 효소 소화 내성에 대한 검토를 실시했다.

효소 소화 내성 시험

본 발명의 제조 방법에 의해 수득된 가교 히알루론산 겔 슬러리 1 내지 5 및 1.2 % 히알루론산 수용액의 각각 1 g을 무균 에펜도르프 튜브(2 ㎖)에 넣고, 튜브 내의 메니스커스를 수평으로 하기 위해, 각각의 튜브를 스윙 버킷의 원심기에 넣어 원심했다(8300 xg, 2000 rpm, 10 분간). 그 후, 각각의 튜브 내의 히알루론산 표면에 0.112 ㎖의 히알루로니다아제 용액(소 고환 추출 히알루로니다아제, 2000 unit/㎖, 0.1 mol/L, 인산 완충액 pH 7.4)을 가만히 넣은 것을 시험품으로 했다. 또한, 히알루로니다아제를 포함하지 않는 이외에는 동일한 조건으로 한 것을 대조품으로 했다. 각각의 튜브를 37 ℃의 항온조에 넣고, 16 시간 효소 반응을 실시했다. 효소 용액 첨가후의 시험품의 최종 효소 활성은 201 unit/㎖가 되었다. 반응후, 각각의 튜브를 도립(倒立)시키고, 액상화된 샘플을 종이 타올로 흡수하고 튜브의 저부(底部)에 잔존한 샘플 중량을 측정했다. 각 시료에서의 시험품 및 대조품의 샘플 중량의 측정 결과를, 이론 잔존 샘플 백분율(%)로서 정리한 것을 도 9에 나타낸다. 또한, 이론 잔존 샘플 백분율(%)은 액화한 샘플 중량을 이론 초기 샘플 중량(1 g)으로부터 뺀 것을 잔존 샘플 중량으로 하고, 잔존 샘플 중량을 이론 초기량(1 g)과의 백분율로 나타낸 것이다.

도 9에 도시한 바와 같이 효소를 함유하고 있지 않은 첨가액(0.112 ㎖)를 가한 대조품에서는 첨가액분의 중량이 증가하고 있지만, 1.2 % 히알루론산 수용액 또는 가교 히알루론산 겔의 액화는 전혀 보이지 않았다. 한편, 효소를 첨가한 시험품 중 1.2 % 히알루론산 수용액에서는 약 80 %가 액상화하고 있는 것을 알 수 있었다. 이에 대해서, 본 발명의 제조 방법에 의해 수득된 가교 히알루론산 겔 1 내지 5에서는 겔의 액화가 35 % 내지 25 %에 그치고 있었다. 이점에서, 본 발명에 의해 수득되는 가교 히알루론산 겔 슬러리는 효소 소화 내성(히알루로니다아제 내성)이 높고, 생체내에서도 장기간 겔 구조를 유지할 수 있는 것으로 생각된다.

Claims

히알루론산 10 W/V% 이상, 가교제 및 물을 포함하는 혼합물을 산 또는 알칼리 조건하에서 교반 혼합하는 것을 특징으로 하는 가교 히알루론산 겔의 제조 방법.
제 1 항에 있어서,

가교 반응에 제공하기 전의 상기 혼합물의 저장 탄성율(G’)(주파수 1 ㎐)이 15000 Pa 이상인 것을 특징으로 하는 가교 히알루론산 겔의 제조 방법.
제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,

상기 혼합물 중의 히알루론산 고분자 사슬을 물리적으로 절단하지 않고 교반 혼합하는 것을 특징으로 하는 가교 히알루론산 겔의 제조 방법.
제 3 항에 있어서,

자전-공전식 혼합장치에 의해 상기 혼합물을 교반 혼합하는 것을 특징으로 하는 가교 히알루론산 겔의 제조 방법.
제 3 항에 있어서,

빵 생지 반죽 장치 또는 떡 제조 장치에 의해 상기 혼합물을 교반 혼합하는 것을 특징으로 하는 가교 히알루론산 겔의 제조 방법.
제 3 항에 있어서,

사람의 손으로 주무름으로써 상기 혼합물을 교반 혼합하는 것을 특징으로 하는 가교 히알루론산 겔의 제조 방법.
제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서,

상기 혼합물 중의 가교제 농도가 0.02 W/V% 내지 1 W/V%인 것을 특징으로 하는 가교 히알루론산 겔의 제조 방법.
제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서,

상기 혼합물 중의 가교제 농도가 히알루론산 구성 단위에 대해서 0.02 W/W% 내지 2 W/W%인 것을 특징으로 하는 가교 히알루론산 겔의 제조 방법.
제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 있어서,

가교제가 디비닐설폰, 1,4-부탄디올·디글리시딜에테르, 및 에틸렌글리콜·디글리시딜에테르로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 가교 히알루론산 겔의 제조 방법.