KR102176486B1 - 히알루론산 기반의 안과용 약물전달체의 제조방법 - Google Patents
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Abstract
히알루론산 및 물을 포함하는 제 1 용액을 제조하는 단계, BDDE(1,4-Butanediol diglycidyl ether) 및 물을 포함하는 제 2 용액을 제조하는 단계, 상기 제 1 용액 및 상기 제 2 용액을 각각 멸균하는 단계, 상기 멸균한 제 1 용액 및 제 2 용액을 혼합하여 제 3 용액을 제조하는 단계, 및 상기 제 3 용액을 인큐베이팅하여 히알루론산을 중합하는 단계를 포함하는 안과용 약물전달체 제조방법이 개시된다.
Description
본 발명은 히알루론산 기반의 안과용 약물전달체의 제조방법에 관한 것이다.
고령화에 따라 녹내장 또는 백내장 환자가 증가하고 있으며, 이에 대한 안구 수술도 증가하고 있다. 안구 수술 후에는 세균 감염을 방지하기 위해 점안제 형태의 항세균제를 안구에 투여하는데, 수술 직후 7일 내지 14일간 꾸준하고 정확한 용량으로 투여하는 것이 중요하다. 항세균제는 세균 감염을 효율적으로 방지하기 위한 총 투여량이 정해져 있으며, 생체내 반감기를 고려하여 투여량과 투여 횟수가 결정되어야 한다.
목시플록사신(Moxifloxacin, MXF)은 안과 수술에서 주로 사용되는 항세균제로서, 녹내장 또는 백내장과 같은 수술 후에 세균감염을 방지하기 위해 점안하는 방식으로 투여되고 있다. 목시플록사신의 일주일 기준 총 투여량은 약 3.5 mg이고, 점안액에 함유된 목시플록사신은 약 0.5 중량%인 점, 목시플록사신의 체내 반감기가 약 12.7h인 점을 고려하여 하루에 최소 두 회 이상 1회당 약 50 μL를 점안하도록 하고 있다. 그러나 수술 후에는 시야가 제한되므로 스스로 점안하기 어렵고, 점안액이 흘러내리거나 점안시기를 지키지 않아 정확한 양이 투여되지 않는 경우가 많다. 또한 안과 수술을 받는 대상 연령이 고령인 경우가 많아 스스로 정확한 안약 점안이 어려운 경우도 많다.
히알루론산(HA)은 베타-D-N-아세틸글루코사민과 베타-D-글루쿠론산이 반복된 이당류 단위로 구성되는 선형 다당류이다. 히알루론산은 생체 내에서 발견되는 세포외 조직의 성분으로서 생체적합적이며, 생체 내에서 생분해되는 것으로 알려져 있다. 하지만 히알루론산은 생체 내에서 신속히 분해되므로 서방성 약물 방출을 위한 용도로 이용하는 것은 어렵다.
목시플록사신을 점안하는 불편함을 해결하기 위해 목시플록사신이 담지된 약물전달체가 연구되고 있으며, 키토산 및 덱스트란을 이용한 약물담지체가 연구되고 있으나(Kaskoos, R.A. Investigation of moxifloxacin loaded chitosan-dextran nanoparticles for topical instillation into eye: In-vitro and ex-vivo evaluation. Int. J. Pharm. Investig. 2014, 4, 164-173), 히알루론산을 주성분으로 하는 안과용 약물전달체는 알려진 바가 없다.
또한 안구 삽입용 히알루론산 기반 약물전달체 제조에 있어서 멸균 공정이 필요하나, 멸균 공정을 거치면 히알루론산의 중합이 유지되는 시간이 급격히 단축되어 이에 담지된 약물을 일정기간 동안 지속적으로 방출시키기 어려운 문제가 있었다.
일 구체예는 멸균 공정을 거친 후에도 일정 기간 동안 물성이 유지되어 안정적으로 항생제를 방출할 수 있는 히알루론산 기반의 안과용 약물전달체의 제조방법을 제공한다.
일 양상은, 히알루론산 및 물을 포함하는 제 1 용액을 제조하는 단계; BDDE(1,4-Butanediol diglycidyl ether) 및 물을 포함하는 제 2 용액을 제조하는 단계; 상기 제 1 용액 및 상기 제 2 용액을 각각 멸균하는 단계; 상기 멸균한 제 1 용액 및 제 2 용액을 혼합하여 제 3 용액을 제조하는 단계; 및 상기 제 3 용액을 인큐베이팅하여 히알루론산을 중합하는 단계를 포함하는 안과용 약물전달체 제조방법을 제공한다.
본 발명자는 히알루론산 및 BDDE으로 약물전달체를 제조하는 과정에서, 별도의 멸균 공정을 거치지 않고 제조된 약물전달체는 수화 후 세균이 번식할 수 있음을 확인하고 이를 개선하기 위해 예의 연구를 거듭한 결과, 히알루론산의 높은 가교결합도를 달성함으로서 수화 후에도 일주일 이상 형태를 유지함과 동시에, 멸균 공정을 포함함으로써 수화 후 세균 번식을 방지할 수 있는 히알루론산 복합체 제조 공정을 확립하였다.
상기 안과용 약물전달체는 약물을 담지할 수 있고, 생체 내에서 일정기간 동안 서서히 분해되면서 담지된 약물을 일정하게 방출함으로서 수술 후 점안액 투여를 대체할 수 있다.
상기 약물은 스테로이드, 산화질소 방출 제제, 또는 항세균제일 수 있다. 상기 항세균제는 플루오로퀴놀린계(Fluoroquinolon) 항생제일 수 있다. 상기 플루오로퀴놀린계 항생제는 퀴놀린의 6번 탄소 위치에 불소를 첨가한 구조를 가지고 있으며 그람 양성 및 음성 세균 모두에 항균력을 발휘함으로서 항균력의 범위가 넓은 특징이 있다. 플루오로퀴놀린계 항생제의 종류로는 시프로플록사신(Ciprofloxacin), 오플록사신(Ofloxacin), 레보플록사신(Levofloxacin), 목시플록사신(Moxifloxacin) 등이 있다. 상기 산화질소 방출 제제는 산화질소가 아민기와 반응하여 생성된 디아제늄디올레이트(NONOate)기를 가진 물질인 것일 수 있다. 상기 산화질소 방출 제제는 산화질소를 처리한 PEI(Polyethylenimine)일 수 있고, 보다 상세하게는 산화질소를 처리한 bPEI(Branched PEI)일 수 있다.
일 구체예에서, 상기 제 1 용액은 상기 히알루론산을 4 내지 8 중량%, 5 내지 8 중량%, 6 내지 8 중량%, 4 내지 7 중량%, 5 내지 7 중량%, 또는 6 내지 7 중량% 만큼 포함할 수 있고, 바람직하게는 6 중량%를 포함할 수 있다.
일 구체예에서, 상기 제 2 용액은 상기 BDDE를 0.015 내지 0.025 중량%, 0.018 내지 0.025 중량%, 0.019 내지 0.025 중량%, 0.015 내지 0.022 중량%, 0.018 내지 0.022 중량%, 0.019 내지 0.022 중량%, 0.015 내지 0.021 중량%, 0.018 내지 0.021 중량%, 0.019 내지 0.021 중량%만큼 포함할 수 있고, 바람직하게는 0.02 중량%를 포함할 수 있다. 예를 들면, 제 2 용액의 양은 제 1 용액과 동일한 양으로 하고, 제 1 용액에 히알루론산을 6 중량% 포함하는 경우 BDDE를 0.02 중량% 함유할 수 있다. 상기 히알루론산 및 BDDE의 함량에 의하면 히알루론산 복합체의 체내 형태 유지 기간이 증가하고 BDDE에 의한 독성을 최소화할 수 있다. 상기 히알루론산 및 BDDE의 함량에 의하면 히알루론산 복합체의 체내 형태 유지 기간은 수술 후 항생제 점안이 필요한 기간만큼 유지될 수 있으며, 유지 기간은 약 5일 내지 10일, 6일 내지 10일, 7일 내지 10일, 8일 내지 10일, 5일 내지 9일, 6일 내지 9일, 7일 내지 9일, 8일 내지 9일, 5일 내지 8일, 6일 내지 8일, 7일 내지 8일, 5일 내지 7일, 또는 6일 내지 7일일 수 있으며, 바람직하게는 7일일 수 있다.
일 구체예에서, 상기 제 1 용액의 히알루론산과 상기 제 2 용액은 BDDE의 함량비는 중량을 기준으로 400:1, 390:1, 380:1, 370:1, 360:1, 350:1, 340:1, 330:1, 320:1, 310:1, 300:1, 290:1, 280:1, 270:1, 260:1 또는 250:1일 수 있으며, 바람직하게는 300:1일 수 있다.
일 구체예에서, 상기 제 1 용액, 상기 제 2 용액, 또는 상기 혼합된 용액은 목시플록사신을 히알루론산 함량의 1/600 내지 1/10만큼 포함할 수 있다.
일 구체예에서, 상기 제 3 용액의 히알루론산 함량은 2.5 내지 3.5 중량%, 또는 2.8 내지 3.2 중량%이고, BDDE의 함량은 0.008 내지 0.012 중량%, 또는 0.009 내지 0.011 중량%일 수 있으며, 바람직하게는 히알루론산 3 중량% 및 BDDE 0.01 중량%를 포함할 수 있다.
일 구체예에서, 상기 멸균하는 단계는 고압증기, 오토클레이브(autoclave), EO(ethylene oxide) 가스, 감마선, 전자빔, 또는 자외선으로 멸균하는 것일 수 있고, 바람직하게는 오토클레이브 멸균일 수 있다. 본 발명자는 히알루론산과 BDDE의 가교반응 후에 멸균 공정을 진행하여 히알루론산 중합체를 제조하면 수화 후 형태가 유지되는 시간이 지나치게 단축되어 약물전달체로서 사용하기 어렵다는 점을 발견하였으며, 히알루론산 및 BDDE를 각각 멸균처리한 후에 1차 가교결합 반응을 진행하면 수화 후 형태가 유지되는 시간이 최소 7일 이상이고, 수술 후 항생제 함유 점안액 투여기간만큼 유지될 수 있다는 것을 발견하였다.
일 구체예에서, 상기 중합하는 단계는 12 내지 30시간, 15 내지 30시간, 16 내지 30시간, 17 내지 30시간, 18 내지 30시간, 19 내지 30시간, 12 내지 27시간, 15 내지 27시간, 16 내지 27시간, 17 내지 27시간, 18 내지 27시간, 19 내지 27시간, 12 내지 24시간, 15 내지 24시간, 16 내지 24시간, 17 내지 24시간, 18 내지 24시간, 19 내지 24시간, 12 내지 21시간, 15 내지 21시간, 16 내지 21시간, 17 내지 21시간, 18 내지 21시간, 19 내지 21시간 동안 실시하는 것일 수 있고, 바람직하게는 19시간 실시하는 것일 수 있다.
일 구체예에서, 상기 중합하는 단계는 혼합된 용액을 성형용 몰드에 주입하고 인큐베이팅하는 것일 수 있다.
일 구체예에서, 상기 제 3 용액을 제조하는 단계는 무균시설에서 진행할 수 있으며, 예를 들면 무균대(clean bench)에서 진행하는 것일 수 있다.
상기 안과용 약물전달체는 항생제가 담지된 것으로서, 안구 수술 후 항생제 투여 용도일 수 있다. 상기 제조방법으로 제조한 안과용 약물전달체는 수술 후 항생제 점안이 필요한 기간과 거의 일치하는 기간 동안 체내에 잔류할 수 있으므로, 안구 수술 과정에서 안구에 삽입됨으로서 수술 후 항생제 점안을 대체하는 용도로 사용될 수 있다.
일 구체예에 따른 안과용 약물전달체는 약물을 담지할 수 있다.
일 구체예에 따른 안과용 약물전달체는 생체적합성 및 생분해성이 뛰어나므로 안구 내에 삽입할 수 있다.
일 구체예에 따른 약물을 담지한 안과용 약물전달체는 안구 내에서 일주일 이상 수화가 지연되며, 담지된 약물을 일정 기간 동안 방출할 수 있다.
일 구체예에 따른 약물을 담지한 안과용 약물전달체는 안구 수술 중 삽입되어 안구내에서 약물을 방출함으로서 점안액에 의한 약물 투여를 대체할 수 있다.
도 1은 안구의 해부학적 구조를 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명의 실시예에 따라 제조된 건조형태의 HA 복합막을 나타낸 것이다.
도 3은 본 발명의 실시예에 따라 제조된 HA 복합막의 건조상태에서의 두께를 나타낸 것이다.
도 4는 본 발명의 실시예에 따라 제조된 HA 복합막에 식염수를 흡수시켜 팽윤(swelling)시키고, 손등에 위치시켜 형태 유지를 확인한 결과이다.
도 5은 본 발명의 실시예에 따라 제조된 건조상태의 HA 복합막을 다양한 형태로 재단하고 또한 수화시켰을 때 형태 유지를 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 6은 본 발명의 실시예에 따라 제조된 HA 복합막을 PVDF 막 위에서 수화 후 건조시켜 형태 유지력을 최대 3주까지 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 7은 히알루론산 및 BDDE에 목시플록사신을 혼합하여 제조한 혼합액을 나타낸 것이다.
도 8는 상기 도 9의 혼합액으로 제조한 HA 복합막의 건조상태의 물성을 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 9은 본 발명의 실시예에 따라 제조한 HA 복합막을 실험동물의 안구 내에 삽입하여 생체적합성 및 생분해성을 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 10는 1차 가교결합 후 멸균처리하여 제조한 HA 복합막을 수화시켜 형태 유지 여부를 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 11은 HA 복합막을 수화시킨 결과로서 A는 1차 가교결합 후 멸균처리하여 제조한 HA 복합막이고, B는 히알루론산 용액 및 BDDE를 각각 멸균처리하고 1차 가교결합하여 제조한 HA 복합막이다.
도 12는 서로 다른 제조방법으로 제조한 HA 복합막의 SEM 촬영 사진으로서, A는 멸균처리없이 제조한 HA 복합막이고, B는 1차 가교결합 반응 후 오토클레이브 멸균처리한 HA 복합막이고, C는 히알루론산 용액 및 BDDE 용액을 각각 멸균처리하고 1차 가교결합시켜 제조한 HA 복합막이다.
도 13은 상기 도 12의 SEM 촬영 사진에 기초하여 기공의 지름을 측정한 결과이다. CTL(control)은 상기 도 12의 A에 대한 것이고, autoclaved는 상기 도 12의 B, separately autoclaved는 상기 도 12의 C에 대한 것이다.
도 2는 본 발명의 실시예에 따라 제조된 건조형태의 HA 복합막을 나타낸 것이다.
도 3은 본 발명의 실시예에 따라 제조된 HA 복합막의 건조상태에서의 두께를 나타낸 것이다.
도 4는 본 발명의 실시예에 따라 제조된 HA 복합막에 식염수를 흡수시켜 팽윤(swelling)시키고, 손등에 위치시켜 형태 유지를 확인한 결과이다.
도 5은 본 발명의 실시예에 따라 제조된 건조상태의 HA 복합막을 다양한 형태로 재단하고 또한 수화시켰을 때 형태 유지를 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 6은 본 발명의 실시예에 따라 제조된 HA 복합막을 PVDF 막 위에서 수화 후 건조시켜 형태 유지력을 최대 3주까지 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 7은 히알루론산 및 BDDE에 목시플록사신을 혼합하여 제조한 혼합액을 나타낸 것이다.
도 8는 상기 도 9의 혼합액으로 제조한 HA 복합막의 건조상태의 물성을 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 9은 본 발명의 실시예에 따라 제조한 HA 복합막을 실험동물의 안구 내에 삽입하여 생체적합성 및 생분해성을 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 10는 1차 가교결합 후 멸균처리하여 제조한 HA 복합막을 수화시켜 형태 유지 여부를 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 11은 HA 복합막을 수화시킨 결과로서 A는 1차 가교결합 후 멸균처리하여 제조한 HA 복합막이고, B는 히알루론산 용액 및 BDDE를 각각 멸균처리하고 1차 가교결합하여 제조한 HA 복합막이다.
도 12는 서로 다른 제조방법으로 제조한 HA 복합막의 SEM 촬영 사진으로서, A는 멸균처리없이 제조한 HA 복합막이고, B는 1차 가교결합 반응 후 오토클레이브 멸균처리한 HA 복합막이고, C는 히알루론산 용액 및 BDDE 용액을 각각 멸균처리하고 1차 가교결합시켜 제조한 HA 복합막이다.
도 13은 상기 도 12의 SEM 촬영 사진에 기초하여 기공의 지름을 측정한 결과이다. CTL(control)은 상기 도 12의 A에 대한 것이고, autoclaved는 상기 도 12의 B, separately autoclaved는 상기 도 12의 C에 대한 것이다.
이하 하나 이상의 구체예를 실시예를 통해 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 하나 이상의 구체예를 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 가교결합된 히알루론산 제조
히알루론산과 BDDE를 pH 8.0 조건에서 물과 혼합하여 용액을 제조하였다. 용액 전체 중량을 기준으로 히알루론산은 3 %, BDDE는 0.01%를 혼합하였다. 제조된 용액 전체의 부피는 30 내지 40 ml였다.
제조한 용액을 상온에서 19시간 이상 로테이터(bio RS-24 mini rotator, biosan)로 360°회전 혼합하여 1 차 가교결합 반응을 진행하였다. 1 차 가교결합 반응한 용액을 성형을 위해 Culture Plate Lid에 담았다. 용액이 담긴 Culture Plate Lid를 쉐이커(CR300 rocker, FINEPCR)로 밤새(overnight) 인큐베이션하여 2 차 가교결합 반응을 진행하였다.
2 차 가교결합 반응이 끝난 평면의 히알루론산 막을 테이블 상에서 3일 이상 건조시켰다. 건조된 히알루론산 막을 펀칭하여 지름이 약 5 mm인 원형의 평면 형태로 절단(trimming)하고 실험에 사용하였다(도 2 참조). 절단한 히알루론산 막은 HA 복합막으로 명명하였다. HA 복합막의 두께는 약 100 내지 125 μm 였다(도 3 참조).
실시예 2: HA 평면복합막의 물성 확인
2-1. 손등 부착을 통한 물성 확인
상기 실시예 1에서 제조한 HA 복합막을 식염수(normal saline)에 15분간 흡수시켜 팽윤시키고(swelling) 손의 등면(dorsal surface)에 부착하였다(도 4 참조). 그 결과, HA 복합막은 수분을 흡수하여 지름이 5 mm에서 약 8 mm 정도로 팽창된 평면 형태가 되었으며, 곡면 부착력이 뛰어난 것을 확인할 수 있었다.
실시예 2-1 결과를 통해 실시예 1의 조성에 의해 제조한 히알루론산 막은 수화되면 생체조직에 부착력이 뛰어나며, 수화 후 재건조시에도 중합 상태 및 형태를 유지할 수 있음을 확인할 수 있었다.
2-2. 다양한 형태를 가진 HA 복합막의 물성 확인
HA 복합막을 원형이 아닌 각진 형태로 절단하여(도 5의 A) 동일한 방법으로 팽윤시킨 결과, 피부에 밀착이 가능하며 수화후에도 형태를 유지함을 확인하였다(도 5의 B).
2-3. PVDF 필름에 위치시켜 물성 확인
HA 복합막의 식염수 흡수 시간을 달리하여 건조시 형태 변화를 관찰하였다. 도 6의 A는 HA 복합막을 PVDF막 위에 위치시켜 식염수를 흡수시킨 후 1시간 동안 건조시킨 결과를 나타낸 것으로, 3주, 2주, 1주, 24h, 5 min은 식염수를 흡수하여 팽윤(swelling)한 시간을 의미한다. 도 6의 B를 참조하면 건조된 HA 복합막은 PVDF 막에 밀착되어 균열이 발생하였다. 이는 PVDF 막에서 건조한 차이 때문인 것으로 생각된다. 그러나 도 6의 A에서 점선으로 표시된 원 부분 및 도 6의 C를 참조하면, 1주일 동안 식염수를 흡수시키고 건조한 경우에도 컨택트 렌즈 형태로 온전히 건조되며, 이에 다시 식염수를 흡수시키면 팽윤되어 평면 형태로 복원됨을 확인하였다(도 6의 D). 따라서 상기 조성에 따라 제조한 HA 복합막은 안구내 환경에서 일주일 이상 형태를 유지할 수 있음을 확인하였다.
실시예 3: 목시플록사신을 담지한 HA 복합막 제조 및 물성 확인
히알루론산과 BDDE를 혼합하는 단계에서 목시플록사신을 더 혼합하는 것을 제외하고 상기 실시예 1과 동일한 방법으로 HA 복합막을 제조하였다. 도 7를 참조하면, 목시프록사신을 혼합한 질량%가 증가함에 따라 혼합액의 노란색이 더 진해지는 것을 확인할 수 있었다.
히알루론산, BDDE, 및 목시플록사신을 포함하는 혼합액을 지름 약 5cm의 패트리디쉬에 담아 평면처리하고 충분히 가교결합 반응을 진행한 다음 4일간 건조시켰다(도 8의 A 참조). 건조된 목시플록사신을 담지한 HA 복합막을 패트리디쉬에서 분리한 결과, 목시플록사신을 최대 3 중량%를 포함하더라도 형태가 유지될 수 있음을 확인할 수 있었다(도 8의 B 참조).
실시예 5: HA 복합막의 생체적합성, 생분해성, 및 지속기간 확인
상기 실시예 1에서 제조한 HA 복합막을 토끼 안구의 전방(anterior chamber) 내에 삽입하고 생체적합성 및 생분해성을 시험하였다. 도 9의 A는 결막과 각막(cornea)을 절개하고 HA 복합막의 전방 내에 삽입한 것을 나타낸 것으로서, 삽입한 HA 복합막을 점선으로 표시하였다. 도 9의 B는 각막 및 결막을 봉합(suture)한 것을 나타낸 것이다.
도 9의 C는 각막을 봉합한 후 일주일이 경과한 토끼의 눈을 확인한 결과이다. HA 복합막은 안구 삽입 후 7일이 경과하였을 때 생분해되어 관찰되지 않았으며, 이를 통해 생체내 환경에서 적어도 7일 이상 지속될 수 있음을 확인하였다. 또한 생체적합성 측면에서, HA 복합체를 안구에 삽입한 후 약간의 붓기가 있었으나 이는 수술의 후유증에 의한 것으로 생각되며, 그 외 HA 복합막에 의한 부작용은 관찰되지 않았으므로 생체적합성이 뛰어난 것으로 확인되었다. 이를 기초로 판단하건데, 약물이 담지된 HA 복합막을 동일한 방법으로 사용하면 담지된 약물이 삽입 위치에서 일주일 동안 지속적으로 방출될 수 있고, 특별한 부작용이 없이 사용할 수 있을 것으로 예상된다.
실시예 6: HA 복합막 제조의 멸균공정 확립
6-1. 1차 가교결합 후 멸균 진행
상기 실시예 1의 방법에서 로테이터에 의한 1차 가교결합 반응까지 동일하게 진행한 후, 121℃에서 20분간 오토클레이브 멸균을 진행하였다. 멸균한 1 차 가교결합 반응 용액을 성형을 위해 Culture Plate Lid에 담았다. 용액이 담긴 Culture Plate Lid를 쉐이커(CR300 rocker, FINEPCR)로 밤새(overnight) 인큐베이션하여 2 차 가교결합 반응을 진행하였다. 멸균 후의 모든 공정은 클린 벤치에서 진행하였다. 2 차 가교결합 반응이 후 평면의 HA 복합막을 테이블 상에서 3일 이상 건조시켰다. 건조한 HA 복합막을 수화시키면 수분 이내로 분해되어 형태를 유지하지 못하는 것을 확인하였다(도 10 참조).
멸균 공정을 오토클레이브보다 저온인 EO 가스 멸균(55℃, 1내지 2 시간), 감마 멸균(각각 25 kgy, 40 kgy로 진행), 전자빔 멸균(각각 25 kgy, 40 kgy로 진행)으로 변경하여 진행하는 것을 제외하고 동일한 과정으로 HA 복합막을 제조하였다. 그러나, 상기 다양한 방법으로 멸균을 진행한 HA 복합막 또한 수화시키면 수분 이내로 분해되어 형태를 유지하지 못하는 것을 확인하였다. 멸균 공정을 UV 살균공정으로 변경하여 제작한 HA 복합막 역시 수화시킨 경우에도 수화 후 44시간 내지 51시간 이내에 형태가 사라지는 것을 확인하였다(도 11의 A 참조).
이를 통해 1차 가교결합 반응 후 멸균처리를 진행하면 안구 내에서 지속적인 약물 방출이 어렵다는 점을 확인하였다.
6-2. 히알루론산 용액 및 가교제 용액을 각각 멸균처리
제 1 용액으로서 6중량%의 히알루론산 용액(pH 8.0) 20ml 및 제 2 용액으로서 0.02 중량%의 BDDE 용액(pH 8.0) 20ml를 각각 준비하였다. 제 1 용액 및 제 2 용액을 각각 상기 실시예 6-1과 동일한 조건으로 오토클레이브 멸균하고, 멸균한 제 1 용액 및 제 2 용액을 혼합하여 제 3 용액을 제조한 후 19시간 동안 로테이터로 1차 가교반응을 진행하였다. 1 차 가교결합한 제3용액을 Culture Plate Lid에 담았다. 용액이 담긴 Culture Plate Lid를 쉐이커(CR300 rocker, FINEPCR)로 밤새(overnight) 인큐베이션하여 2 차 가교결합 반응을 진행하였다. 멸균 후의 모든 공정은 클린 벤치에서 진행하였다. 2 차 가교결합 반응이 후 평면의 HA 복합막을 테이블 상에서 3일 이상 건조시켰다.
각각 멸균처리한 용액으로 제조한 HA 복합막을 수화시키고 지속적으로 수분을 공급하며 관찰한 결과, 96시간 이상 형태를 유지하는 것을 확인하였다(도 11의 B 참조).
실시예 7: 6-2에서 제조한 HA 복합막 제조의 주사전자현미경 분석 결과
도 12에서 A는 상기 실시예 1의 방법으로 멸균 공정없이 제조한 HA 복합막이고, B는 상기 실시예 6-1의 방법으로 1차 가교반응 후 오토클레이브로 멸균처리한 HA 복합막이며, C는 상기 실시예 6-2의 방법으로 히알루론산 용액 및 BDDE 용액을 각각 멸균처리하고 1차 가교반응하여 제조한 HA 복합막을 SEM(Scanning Electron Microscope) 전자현미경으로 관찰한 것이다. 전자현미경 촬영 조건은 SED 15.0kV, WD 9.7mm이며, 바는 500 μm길이를 나타낸다.
도 12의 A, B, C는 가교결합 기공(cross linking pore)의 형태 및 크기가 차이가 있음을 확인하였다. A와 C는 기공의 형태 및 크기가 유사하였으나, B는 상대적으로 크기가 더 큰 기공이 다수 관찰되었고 기공의 간격이 촘촘하지 못하여 가교결합이 제대로 이루어지지 않은 것을 확인할 수 있었다. 기공의 평균 지름을 측정한 결과, 도 12의 A는 평균 154.62 μm(도 13의 CTL), 도 12의 B는 평균 251.47 μm(도 13의 autoclaved), 도 12의 C는 평균 144.13 μm(도 13의 separately autoclaved)로 확인되었다. 1차 가교반응 후 오토클레이브로 오토클레이브로 멸균처리한 경우 기공의 크기가 유의하게 증가한 것으로 보아, 히알루론산 복합체 제조과정에서 고온고압멸균과정이 가교를 손상시키는 것을 확인할 수 있었다. 또한, 히알루론산 용액과 BDDE 용액을 각각 멸균처리하고 1차 가교반응시킨 경우 BDDE에 의한 화학적 가교가 멸균과정 이후에 진행됨으로서 히알루론산의 가교가 손상되지 않는 것을 확인할 수 있었다.
또한 종래 멸균처리없이 제조한 히알루론산 복합체는 종종 세균이 번식하는 문제점이 있었으나, 각각 멸균처리하고 1차 가교반응시킨 경우에는 앞서 살펴본 바와 같이 수화시킨 경우 일주일 이상 형태를 유지하면서도 세균의 번식이 일어나지 않았다.
따라서 히알루론산 용액 및 가교결합제 용액을 각각 멸균처리한 후에 1차 가교결합 반응을 진행하여 제조한 HA 복합체는 안구 내 환경에서 더 장시간 형태를 유지할 수 있으므로 지속적인 약물 방출이 가능한 약물전달체를 제조하는데 유리하다는 것을 확인하였다.
Claims (8)
- 히알루론산 및 물을 포함하는 제 1 용액을 제조하는 단계;
BDDE(1,4-Butanediol diglycidyl ether) 및 물을 포함하는 제 2 용액을 제조하는 단계;
상기 제 1 용액 및 상기 제 2 용액을 각각 멸균하는 단계;
상기 멸균한 제 1 용액 및 제 2 용액을 혼합하여 제 3 용액을 제조하는 단계; 및
상기 제 3 용액을 인큐베이팅하여 히알루론산을 중합하는 단계를 포함하는,
안과용 약물전달체 제조방법. - 제 1 항에 있어서,
상기 제 1 용액은 히알루론산을 4 내지 8 중량% 포함하는,
안과용 약물전달체 제조방법. - 제 1 항에 있어서,
상기 제 2 용액은 BDDE를 0.015 내지 0.025 중량% 포함하는,
안과용 약물전달체 제조방법. - 제 1 항에 있어서,
상기 제 1 용액의 히알루론산과 상기 제 2 용액은 BDDE의 함량비는 중량을 기준으로 300:1인,
안과용 약물전달체 제조방법. - 제 1 항에 있어서,
상기 제 3 용액의 히알루론산 함량은 2.5 내지 3.5 중량%이고, BDDE의 함량은 0.008 내지 0.012 중량%인,
안과용 약물전달체 제조방법. - 제 1 항에 있어서,
상기 멸균은 오토클레이브(autoclave)로 멸균하는 것인,
안과용 약물전달체 제조방법. - 제 1 항에 있어서,
상기 중합하는 단계는 17 내지 21시간 동안 실시하는 것인,
안과용 약물전달체 제조방법. - 제 1 항에 있어서,
상기 중합하는 단계는 혼합된 용액을 성형용 몰드에 주입하고 인큐베이팅하는 것인,
안과용 약물전달체 제조방법.
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