CN110446500A - 用于基质制备的方法和组合物 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及制备基质的方法和用于这些方法的组合物。具体地，本发明涉及制备胶原基质的方法和用于这些方法的组合物，包括试剂盒和移植物组合物。

Description

用于基质制备的方法和组合物
相关申请的交叉引用
本申请根据35 U.S.C.§119(e)要求2017年1月31日提交的美国临时申请序列号62/452,564的优先权，其全部披露内容通过援引并入本文。
技术领域
本发明涉及制备基质的方法和用于这些方法的组合物。具体地，本发明涉及制备胶原基质的方法和用于这些方法的组合物，包括试剂盒和移植物组合物。
背景技术和发明内容
细胞外基质在组织和器官的功能中起关键作用，诸如细胞间通讯、胚胎形成期间的分化、伤口愈合、粘附以及细胞迁移和增殖。从天然来源获得的或以合成方式制备的细胞外基质移植物构建体可以作为固体和可注射这两种形式的组织移植物组合物用于体内组织重塑或用于体外应用，例如用于研究目的。细胞外基质的主要组分是胶原。一些溶解的胶原组合物(包括纯化的胶原组合物)具有基质形成能力，并且也可以作为固体和可注射这两种形式的组织移植物组合物用于体内组织重塑或用于体外用途。实际上，这种基于胶原的基质具有广泛的研究和医学应用，包括伤口和止血敷料、用作外科植入物、用作用于组织工程医疗产品的基材、用作治疗性细胞或分子的递送载体、以及用作用于基础研究(包括药物开发和毒性测试)的三维体外组织系统。
为了针对医疗和研究应用确保基于胶原的基质的高度生产一致性和用于制备基于胶原的基质的胶原的功能特性的低批次间差异，需要标准化过程和试剂以用于诱导胶原自组装和用于定制基于胶原的基质。
因此，本发明人开发了一种稳健的方法，该方法使用用于胶原聚合的单个混合步骤，采用模拟生理条件的试剂，以支持如在体内观察到的胶原的超分子自组装。此外，本文所述的方法和方法中用到的试剂基于生理反应，诸如自组装基质随聚合反应中的胶原浓度而变化的粘弹性(例如，在振荡剪切和基质刚度中测得的剪切储能模量)。本文所述的方法和组合物产生基于胶原的基质，这些基质具有与涉及用于胶原聚合的多个混合步骤的常规多步骤聚合方法类似的性质，这些常规多步骤聚合方法包括将胶原组合物与缓冲溶液混合，然后与例如碱(诸如NaOH)混合以诱导聚合，然后任选地与其他试剂混合。本发明人开发的方法和组合物已经产生了对自组装胶原基质的高度可预测且可再现的体外细胞和体内宿主反应。另一方面，本发明人开发了通过使用紫外线辐射对本文所述的胶原、胶原组合物、胶原基质、胶原溶液和冻干胶原进行灭菌同时保持聚合能力(例如，剪切储能模量)的方法。聚合能力的保持与报道紫外线辐射会对胶原原纤维形成造成负面影响的先前研究相反(Mentor等人，Photodermatology,Photoimmunology&Photomedicine[光学皮肤病学、光学免疫学和光学医学]，2001；Miyata等人，Biochem.Biophys.Acta[生物化学与生物物理学学报]，1971；Sudoh和Noda，Connect.Tissue Res.[结缔组织研究]，1972)。在一个实施例中，提供了一种制备基质的方法。该方法包括使用单个混合步骤聚合胶原，包括将胶原组合物与缓冲溶液混合以形成胶原溶液，以及聚合该胶原溶液中的胶原以形成该基质。
在另一个实施例中，提供了一种制备基质的方法。该方法包括通过以下方式聚合胶原：将胶原组合物与缓冲溶液混合以形成胶原溶液，以及聚合该胶原溶液中的胶原以形成该基质，其中该缓冲溶液不含镁离子或锰离子。
在又一个实施例中，提供了一种制备基质的方法。该方法包括使用单个混合步骤聚合胶原，该单个混合步骤包括将胶原组合物与缓冲溶液混合以形成胶原溶液，其中该胶原溶液中的胶原聚合以形成该基质。
在另外其他实施例中，提供了根据前述方法中的任一种制备的胶原基质。在又一个实施例中，提供了包含胶原组合物和缓冲溶液的试剂盒。在另一个实施例中，提供了包含冻干胶原、盐酸溶液和缓冲溶液的试剂盒。
通过以下列举的条款描述了若干另外的实施例。还设想了这些实施例的任何适用的组合。
1.一种制备基质的方法，所述方法包括使用单个混合步骤聚合胶原，包括将胶原组合物与缓冲溶液混合以形成胶原溶液，以及聚合该胶原溶液中的胶原以形成该基质。
2.如条款1所述的方法，包括在大于约25℃下温育该胶原溶液以促进该胶原溶液中胶原的聚合。
3.如条款1或2所述的方法，包括在约37℃下温育该胶原溶液以促进该胶原溶液中胶原的聚合。
4.如条款1至3中任一项所述的方法，其中，该胶原包含胶原低聚物。
5.如条款1至4中任一项所述的方法，其中，该胶原由胶原低聚物组成。
6.如条款4所述的方法，其中，该胶原进一步包含端胶原(telocollagen)。
7.如条款4所述的方法，其中，该胶原进一步包含缺端胶原(atelocollagen)。
8.如条款4所述的方法，其中，包含胶原低聚物的该胶原从含有胶原低聚物的组织中获得、从产生胶原低聚物的细胞中获得、或通过化学交联胶原来获得该胶原低聚物而获得。
9.如条款1至8中任一项所述的方法，其中，该胶原来源于猪皮肤组织。
10.如条款1至9中任一项所述的方法，其中，该胶原组合物进一步包含酸。
11.如条款10所述的方法，其中，该酸选自由盐酸、乙酸、乳酸、甲酸、柠檬酸、硫酸和磷酸组成的组。
12.如条款11所述的方法，其中，该酸是盐酸。
13.如条款12所述的方法，其中，该盐酸为约0.005N至约0.1N的盐酸。
14.如条款12或13所述的方法，其中，该盐酸为约0.01N的盐酸。
15.如条款1至14中任一项所述的方法，其中，该胶原在该胶原溶液中的浓度为约0.1mg/ml至约40mg/ml。
16.如条款1至15中任一项所述的方法，其中，该胶原在该胶原溶液中的浓度为约0.1mg/ml至约5mg/ml。
17.如条款1至16中任一项所述的方法，其中，该胶原在该胶原溶液中的浓度为约0.5mg/ml至约4mg/ml。
18.如条款1至13中任一项所述的方法，其中，对该胶原组合物进行灭菌。
19.如条款1至18中任一项所述的方法，其中，该胶原组合物、该胶原溶液或该胶原基质通过选自由暴露于氯仿、病毒过滤、无菌过滤、紫外线辐射、γ辐照、电子束及其组合组成的组的方法进行灭菌。
20.如条款1至19中任一项所述的方法，其中，该胶原组合物通过过滤灭菌。
21.如条款1至20中任一项所述的方法，其中，该缓冲溶液包含约0.03mM至约0.2mM的MgCl2。
22.如条款1至20中任一项所述的方法，其中，该缓冲溶液包含约0.002mM至约0.02mM的MgCl2。
23.如条款1至20中任一项所述的方法，其中，该缓冲溶液包含小于约0.02mM的MgCl2。
24.如条款1至20中任一项所述的方法，其中，该缓冲溶液不包含MgCl2。
25.如条款1至24中任一项所述的方法，其中，该缓冲溶液进一步包含约0.3mM至约3mM的KH2PO4。
26.如条款1至25中任一项所述的方法，其中，该缓冲溶液进一步包含约1mM至约10M的Na2HPO4。
27.如条款1至26中任一项所述的方法，其中，该缓冲溶液进一步包含约0.1mM至约4mM的KCl。
28.如条款1至27中任一项所述的方法，其中，该缓冲溶液进一步包含约0.02M至约0.3M的NaCl。
29.如条款1至28中任一项所述的方法，其中，该缓冲溶液进一步包含约0.002N至约0.02N的NaOH。
30.如条款1至29中任一项所述的方法，其中，该缓冲溶液进一步包含约0.5重量％至约5重量％的葡萄糖。
31.如条款1至29中任一项所述的方法，其中，该缓冲溶液包含约0.5重量％或更少的葡萄糖。
32.如条款1至31中任一项所述的方法，进一步包括将细胞添加到该胶原溶液中。
33.如条款1至32中任一项所述的方法，其中，该基质包含胶原原纤维。
34.一种胶原基质，其根据如条款1至33中任一项所述的方法制备。
35.如条款34所述的胶原基质，其中，该胶原基质是医疗移植物。
36.如条款35所述的胶原基质，其中，该医疗移植物具有选自由以下项组成的组的用途：组织移植物材料、可注射移植物材料、伤口敷料、止血敷料、治疗性细胞的递送载体和治疗剂的递送载体。
37.如条款35所述的胶原基质，其中，该胶原基质用于研究目的。
38.如条款37所述的胶原基质，其中，该胶原基质用于药物毒性测试或药物开发。
39.一种试剂盒，包含胶原组合物和缓冲溶液。
40.如条款39所述的试剂盒，其中，该缓冲溶液包含约0.03mM至约0.2mM的MgCl2。
41.如条款39所述的试剂盒，其中，该缓冲溶液包含约0.002mM至约0.02mM的MgCl2。
42.如条款39所述的试剂盒，其中，该缓冲溶液包含小于约0.02mM的MgCl2。
43.如条款39所述的试剂盒，其中，该缓冲溶液不包含MgCl2。
44.如条款39至43中任一项所述的试剂盒，其中，该缓冲溶液进一步包含约0.003M至约0.03M的KH2PO4。
45.如条款39至44中任一项所述的试剂盒，其中，该缓冲溶液进一步包含约0.01M至约0.1M的Na2HPO4。
46.如条款39至45中任一项所述的试剂盒，其中，该缓冲溶液进一步包含约0.001M至约0.04M的KCl。
47.如条款39至46中任一项所述的试剂盒，其中，该缓冲溶液进一步包含约0.2M至约3.0M的NaCl。
48.如条款39至47中任一项所述的试剂盒，其中，该缓冲溶液进一步包含约0.02N至约0.2N的NaOH。
49.如条款39至48中任一项所述的试剂盒，其中，该缓冲溶液进一步包含约0.2重量％至约5重量％的葡萄糖。
50.如条款39至48中任一项所述的试剂盒，其中，该缓冲溶液包含约0.5重量％或更少的葡萄糖。
51.如条款39至50中任一项所述的试剂盒，其中，该胶原溶液中该胶原的浓度为约0.1mg/ml至约40mg/ml。
52.如条款39至51中任一项所述的试剂盒，其中，该胶原溶液中该胶原的浓度为约0.1mg/ml至约5mg/ml。
53.如条款39至52中任一项所述的试剂盒，其中，该胶原溶液包含约0.005N的盐酸至约0.1N的盐酸。
54.如条款39至53中任一项所述的试剂盒，其中，该缓冲溶液能够使用单个混合步骤聚合该胶原，该单个混合步骤包括将该胶原组合物与该缓冲溶液混合。
55.如条款39至54中任一项所述的试剂盒，其中，该胶原组合物和该缓冲溶液在单独的容器中。
56.如条款55所述的试剂盒，其中，该容器是经过灭菌的小瓶。
57.如条款55所述的试剂盒，其中，该容器包括双筒注射器(dual syringe)的单独隔室。
58.如条款57所述的试剂盒，其中，该双筒注射器包括混合元件。
59.如条款57所述的试剂盒，其中，对该双筒注射器进行灭菌。
60.如条款39至59中任一项所述的试剂盒，进一步包括该试剂盒的组成部分的使用说明。
61.一种制备基质的方法，所述方法包括通过以下方式聚合胶原：将胶原组合物与缓冲溶液混合以形成胶原溶液，以及聚合该胶原溶液中的胶原以形成该基质，其中该缓冲溶液不含镁离子或锰离子。
62.如条款61所述的方法，包括在大于约25℃下温育该胶原溶液以促进该胶原溶液中胶原的聚合。
63.如条款61或62所述的方法，包括在约37℃下温育该胶原溶液以促进该胶原溶液中胶原的聚合。
64.如条款61至63中任一项所述的方法，其中，该胶原包含胶原低聚物。
65.如条款61至63中任一项所述的方法，其中，该胶原由胶原低聚物组成。
66.如条款64所述的方法，其中，该胶原进一步包含端胶原。
67.如条款64所述的方法，其中，该胶原进一步包含缺端胶原。
68.如条款64所述的方法，其中，包含胶原低聚物的该胶原从含有胶原低聚物的组织中获得、从产生胶原低聚物的细胞中获得、或通过化学交联该胶原来获得该胶原低聚物而获得。
69.如条款61至68中任一项所述的方法，其中，该胶原来源于猪皮肤组织。
70.如条款61至69中任一项所述的方法，其中，该胶原组合物进一步包含酸。
71.如条款70所述的方法，其中，该酸选自由盐酸、乙酸、乳酸、甲酸、柠檬酸、硫酸和磷酸组成的组。
72.如条款71所述的方法，其中，该酸是盐酸。
73.如条款72所述的方法，其中，该盐酸为约0.005N至约0.1N的盐酸。
74.如条款72或73所述的方法，其中，该盐酸为约0.01N的盐酸。
75.如条款61至74中任一项所述的方法，其中，该胶原在该胶原溶液中的浓度为约0.1mg/ml至约40mg/ml。
76.如条款61至75中任一项所述的方法，其中，该胶原在该胶原溶液中的浓度为约0.1mg/ml至约5mg/ml。
77.如条款61至76中任一项所述的方法，其中，该胶原在该胶原溶液中的浓度为约0.5mg/ml至约4mg/ml。
78.如条款61至77中任一项所述的方法，其中，对该胶原组合物进行灭菌。
79.如条款61至78中任一项所述的方法，其中，该胶原组合物、该胶原溶液或该胶原基质通过选自由暴露于氯仿、病毒过滤、无菌过滤、紫外线辐射、γ辐照、电子束及其组合组成的组的方法进行灭菌。
80.如条款61至79中任一项所述的方法，其中，该胶原组合物通过过滤灭菌。
81.如条款61至80中任一项所述的方法，其中，该缓冲溶液进一步包含约0.3mM至约3mM的KH2PO4。
82.如条款61至81中任一项所述的方法，其中，该缓冲溶液进一步包含约1mM至约10M的Na2HPO4。
83.如条款61至82中任一项所述的方法，其中，该缓冲溶液进一步包含约0.1mM至约4mM的KCl。
84.如条款61至83中任一项所述的方法，其中，该缓冲溶液进一步包含约0.02M至约0.3M的NaCl。
85.如条款61至84中任一项所述的方法，其中，该缓冲溶液进一步包含约0.002N至约0.02N的NaOH。
86.如条款61至85中任一项所述的方法，其中，该缓冲溶液进一步包含约0.5重量％至约5重量％的葡萄糖。
87.如条款61至85中任一项所述的方法，其中，该缓冲溶液包含约0.5重量％或更少的葡萄糖。
88.如条款61至87中任一项所述的方法，进一步包括将细胞添加到该胶原溶液中。
89.如条款61至88中任一项所述的方法，其中，该基质包含胶原原纤维。
90.一种胶原基质，其根据如条款61至89中任一项所述的方法制备。
91.如条款90所述的胶原基质，其中，该胶原基质是医疗移植物。
92.如条款91所述的胶原基质，其中，该医疗移植物具有选自由以下项组成的组的用途：组织移植物材料、可注射移植物材料、伤口敷料、止血敷料、治疗性细胞的递送载体和治疗剂的递送载体。
93.如条款90所述的胶原基质，其中，该胶原基质用于研究目的。
94.如条款93所述的胶原基质，其中，该胶原基质用于药物毒性测试或药物开发。
95.一种试剂盒，包含冻干胶原、盐酸溶液和缓冲溶液。
96.如条款95所述的试剂盒，其中，该缓冲溶液包含约0.03mM至约0.2mM的MgCl2。
97.如条款95所述的试剂盒，其中，该缓冲溶液包含约0.002mM至约0.02mM的MgCl2。
98.如条款95所述的试剂盒，其中，该缓冲溶液包含小于约0.02mM的MgCl2。
99.如条款95所述的试剂盒，其中，该缓冲溶液不包含MgCl2。
100.如条款95至99中任一项所述的试剂盒，其中，该缓冲溶液进一步包含约0.003M至约0.03M的KH2PO4。
101.如条款95至100中任一项所述的试剂盒，其中，该缓冲溶液进一步包含约0.01M至约0.1M的Na2HPO4。
102.如条款95至101中任一项所述的试剂盒，其中，该缓冲溶液进一步包含约0.001M至约0.04M的KCl。
103.如条款95至102中任一项所述的试剂盒，其中，该缓冲溶液进一步包含约0.2M至约3.0M的NaCl。
104.如条款95至103中任一项所述的试剂盒，其中，该缓冲溶液进一步包含约0.02N至约0.2N的NaOH。
105.如条款95至104中任一项所述的试剂盒，其中，该缓冲溶液进一步包含约0.2重量％至约5重量％的葡萄糖。
106.如条款95至105中任一项所述的试剂盒，其中，该缓冲溶液包含约0.5重量％或更少的葡萄糖。
107.如条款95至106中任一项所述的试剂盒，其中，该盐酸溶液包含约0.005N的盐酸至约0.1N的盐酸。
108.如条款95至107中任一项所述的试剂盒，其中，该缓冲溶液能够使用单个混合步骤聚合胶原，该单个混合步骤包括将该缓冲溶液与在该盐酸溶液中重构的该冻干胶原混合。
109.如条款95至108中任一项所述的试剂盒，其中，该冻干胶原、该盐酸溶液和该缓冲溶液在单独的容器中。
110.如条款95至109中任一项所述的试剂盒，进一步包括该试剂盒的组成部分的使用说明。
111.一种制备基质的方法，所述方法包括使用单个混合步骤聚合胶原，该单个混合步骤包括将胶原组合物与缓冲溶液混合以形成胶原溶液，其中该胶原溶液中的胶原聚合以形成该基质。
112.如条款1至33、61至89或111中任一项所述的方法，其中，该胶原是可溶性胶原。
113.如条款1至19、21至33、61至79、81至89或111至112中任一项所述的方法，其中，使用紫外线辐射对该胶原组合物、该胶原溶液和/或该胶原基质进行灭菌。
114.如条款113所述的方法，其中，由胶原聚合产生的该胶原基质分别相对于未经辐照的胶原组合物、未经辐照的胶原溶液、或未经辐照的胶原基质保持聚合特性。
115.如条款114所述的方法，其中，该聚合特性是剪切储能模量。
116.如条款113至115中任一项所述的方法，其中，辐射剂量范围为从约5mJ/cm2至约800mJ/cm2。
117.如条款113至115中任一项所述的方法，其中，辐射剂量范围为从约30mJ/cm2至约300mJ/cm2。
118.如条款113至117中任一项所述的方法，其中，该灭菌使病毒失活。
119.如条款34至38或90至94中任一项所述的胶原基质，其中，使用紫外线辐射对该胶原基质进行灭菌。
120.如条款119所述的胶原基质，其中，该胶原基质相对于未经辐照的胶原基质保持聚合特性。
121.如条款120所述的胶原基质，其中，该聚合特性是剪切储能模量。
122.如条款119至121中任一项所述的胶原基质，其中，辐射剂量范围为从约5mJ/cm2至约800mJ/cm2。
123.如条款119至121中任一项所述的胶原基质，其中，辐射剂量范围为从约30mJ/cm2至约300mJ/cm2。
124.如条款119至123中任一项所述的胶原基质，其中，该灭菌使病毒失活。
125.如条款39至60或95至110中任一项所述的试剂盒，其中，使用紫外线辐射对该胶原组合物或冻干胶原进行灭菌。
126.如条款125所述的试剂盒，其中，由胶原聚合产生的该胶原基质分别相对于未经辐照的胶原组合物或未经辐照的冻干胶原保持聚合特性。
127.如条款126所述的试剂盒，其中，该聚合特性是剪切储能模量。
128.如条款125至127中任一项所述的试剂盒，其中，辐射剂量范围为从约5mJ/cm2至约800mJ/cm2。
129.如条款125至127中任一项所述的试剂盒，其中，辐射剂量范围为从约30mJ/cm2至约300mJ/cm2。
130.如条款125至129中任一项所述的试剂盒，其中，该灭菌使病毒失活。
131.如条款1至19、21至33、61至79、81至89或111至118中任一项所述的方法，其中，使用UVC辐照对该胶原组合物、该胶原溶液和/或该胶原基质进行灭菌。
132.如条款1至19、21至33、61至79、81至89或111至118中任一项所述的方法，其中，使用UVC辐照和无菌过滤对该胶原组合物、该胶原溶液和/或该胶原基质进行灭菌。
133.如条款34至38、90至94或119至124中任一项所述的胶原基质，其中，使用UVC辐照对该胶原基质进行灭菌。
134.如条款34至38、90至94或119至124中任一项所述的胶原基质，其中，使用UVC辐照和无菌过滤对该胶原基质进行灭菌。
135.如条款39至60、95至110或125至130中任一项所述的试剂盒，其中，使用UVC辐照对该胶原组合物或该冻干胶原进行灭菌。
136.如条款39至60、95至110或125至130中任一项所述的试剂盒，其中，使用UVC辐照和无菌过滤对该胶原组合物或该冻干胶原进行灭菌。
附图说明
图1示出了在不同低聚物浓度下聚合的基于胶原的基质的剪切储能模量。单步骤组装的聚合能力与用常规多步骤过程获得的聚合能力相似。
图2示出了用多步骤和单步骤过程制备的自组装基质显示出相似的生物相容性和细胞反应。使用多步骤(图2a)或单步骤(图2b)过程，将人脂肪来源的干细胞用于形成三维胶原-原纤维组织构建体。4天后，固定构建体，用鬼笔环肽对构建体进行染色，并使用共聚焦显微镜法使其可视化。
图3示出了多步骤过程。
图4示出了单步骤过程。
图5示出了基于起始胶原低聚物浓度使用单步骤过程支持用户定制自组装胶原基质的配方。
图6示出了低聚物的研究级和医用级制剂在小鼠中皮下注射后显示出相似的非炎性组织再生反应。在小鼠中皮下注射(200μl)研究级低聚物、医用级低聚物和IntegraFlowable。4周后，收获植入部位、将其固定并准备用于组织病理学分析。图像示出了未经处理的皮肤(对照；A)、Integra Flowable(B)、研究级低聚物(C)和医用级低聚物(D)的截面。
图7示出了由胶原聚合的胶原基质的剪切储能模量，该胶原经过0(未经处理的对照)、30mJ/cm2(辐照1分钟)和300mJ/cm2(辐照10分钟)的剂量的UVC辐照处理。
具体实施方式
如本文所用，“灭菌”是指除去污染物，包括但不限于传染剂。例如，可以通过使污染剂(无论是否具有传染性)失活、减少污染剂的数量或量、或通过抑制污染剂的活性来去除污染物(例如，病毒)。
如本文所用，“纯化”是指除去污染物，包括但不限于细胞污染物、核苷酸污染物和内毒素。
是指使所有病毒(无论是否具有传染性)失活、减少传染性病毒的数量、或抑制病毒(无论是否具有传染性)的活性。
如本文所用，与胶原相关的“一种低聚物”或“多种低聚物”是指彼此共价连接的胶原单体(也称为端胶原)(例如，彼此连接以形成二聚体、三聚体等的胶原单体)。
在一个实施例中，提供了一种制备基质的方法。该方法包括使用单个混合步骤聚合胶原，包括将胶原组合物与缓冲溶液混合以形成胶原溶液，以及聚合该胶原溶液中的胶原以形成该基质。
在另一个实施例中，提供了一种制备基质的方法。该方法包括通过以下方式聚合胶原：将胶原组合物与缓冲溶液混合以形成胶原溶液，以及聚合该胶原溶液中的胶原以形成该基质，其中该缓冲溶液不含镁离子或锰离子。
在又一个实施例中，提供了一种制备基质的方法。该方法包括使用单个混合步骤聚合胶原，该单个混合步骤包括将胶原组合物与缓冲溶液混合以形成胶原溶液，其中该胶原溶液中的胶原聚合以形成该基质。
在另外其他实施例中，提供了根据前述方法中的任一种制备的胶原基质。在又一个实施例中，提供了包含胶原组合物和缓冲溶液的试剂盒。在另一个实施例中，提供了包含冻干胶原、盐酸溶液和缓冲溶液的试剂盒。
通过以下列举的条款描述了若干另外的实施例。还设想了这些实施例的任何适用的组合，并且还设想了这些实施例与在本申请的该“具体实施方式”中描述的实施例的任何适用的组合。
1.一种制备基质的方法，所述方法包括使用单个混合步骤聚合胶原，包括将胶原组合物与缓冲溶液混合以形成胶原溶液，以及聚合该胶原溶液中的胶原以形成该基质。
2.如条款1所述的方法，包括在大于约25℃下温育该胶原溶液以促进该胶原溶液中胶原的聚合。
3.如条款1或2所述的方法，包括在约37℃下温育该胶原溶液以促进该胶原溶液中胶原的聚合。
4.如条款1至3中任一项所述的方法，其中，该胶原包含胶原低聚物。
5.如条款1至4中任一项所述的方法，其中，该胶原由胶原低聚物组成。
6.如条款4所述的方法，其中，该胶原进一步包含端胶原。
7.如条款4所述的方法，其中，该胶原进一步包含缺端胶原。
8.如条款4所述的方法，其中，包含胶原低聚物的该胶原从含有胶原低聚物的组织中获得、从产生胶原低聚物的细胞中获得、或通过化学交联胶原来获得该胶原低聚物而获得。
9.如条款1至8中任一项所述的方法，其中，该胶原来源于猪皮肤组织。
10.如条款1至9中任一项所述的方法，其中，该胶原组合物进一步包含酸。
11.如条款10所述的方法，其中，该酸选自由盐酸、乙酸、乳酸、甲酸、柠檬酸、硫酸和磷酸组成的组。
12.如条款11所述的方法，其中，该酸是盐酸。
13.如条款12所述的方法，其中，该盐酸为约0.005N至约0.1N的盐酸。
14.如条款12或13所述的方法，其中，该盐酸为约0.01N的盐酸。
15.如条款1至14中任一项所述的方法，其中，该胶原在该胶原溶液中的浓度为约0.1mg/ml至约40mg/ml。
16.如条款1至15中任一项所述的方法，其中，该胶原在该胶原溶液中的浓度为约0.1mg/ml至约5mg/ml。
17.如条款1至16中任一项所述的方法，其中，该胶原在该胶原溶液中的浓度为约0.5mg/ml至约4mg/ml。
18.如条款1至13中任一项所述的方法，其中，对该胶原组合物进行灭菌。
19.如条款1至18中任一项所述的方法，其中，该胶原组合物、该胶原溶液或该胶原基质通过选自由暴露于氯仿、病毒过滤、无菌过滤、γ辐照、紫外线辐射、电子束及其组合组成的组的方法进行灭菌。
20.如条款1至19中任一项所述的方法，其中，该胶原组合物通过过滤灭菌。
21.如条款1至20中任一项所述的方法，其中，该缓冲溶液包含约0.03mM至约0.2mM的MgCl2。
22.如条款1至20中任一项所述的方法，其中，该缓冲溶液包含约0.002mM至约0.02mM的MgCl2。
23.如条款1至20中任一项所述的方法，其中，该缓冲溶液包含小于约0.02mM的MgCl2。
24.如条款1至20中任一项所述的方法，其中，该缓冲溶液不包含MgCl2。
25.如条款1至24中任一项所述的方法，其中，该缓冲溶液进一步包含约0.3mM至约3mM的KH2PO4。
26.如条款1至25中任一项所述的方法，其中，该缓冲溶液进一步包含约1mM至约10M的Na2HPO4。
27.如条款1至26中任一项所述的方法，其中，该缓冲溶液进一步包含约0.1mM至约4mM的KCl。
28.如条款1至27中任一项所述的方法，其中，该缓冲溶液进一步包含约0.02M至约0.3M的NaCl。
29.如条款1至28中任一项所述的方法，其中，该缓冲溶液进一步包含约0.002N至约0.02N的NaOH。
30.如条款1至29中任一项所述的方法，其中，该缓冲溶液进一步包含约0.5重量％至约5重量％的葡萄糖。
31.如条款1至29中任一项所述的方法，其中，该缓冲溶液包含约0.5重量％或更少的葡萄糖。
32.如条款1至31中任一项所述的方法，进一步包括将细胞添加到该胶原溶液中。
33.如条款1至32中任一项所述的方法，其中，该基质包含胶原原纤维。
34.一种胶原基质，其根据如条款1至33中任一项所述的方法制备。
35.如条款34所述的胶原基质，其中，该胶原基质是医疗移植物。
36.如条款35所述的胶原基质，其中，该医疗移植物具有选自由以下项组成的组的用途：组织移植物材料、可注射移植物材料、伤口敷料、止血敷料、治疗性细胞的递送载体和治疗剂的递送载体。
37.如条款35所述的胶原基质，其中，该胶原基质用于研究目的。
38.如条款37所述的胶原基质，其中，该胶原基质用于药物毒性测试或药物开发。
39.一种试剂盒，包含胶原组合物和缓冲溶液。
40.如条款39所述的试剂盒，其中，该缓冲溶液包含约0.03mM至约0.2mM的MgCl2。
41.如条款39所述的试剂盒，其中，该缓冲溶液包含约0.002mM至约0.02mM的MgCl2。
42.如条款39所述的试剂盒，其中，该缓冲溶液包含小于约0.02mM的MgCl2。
43.如条款39所述的试剂盒，其中，该缓冲溶液不包含MgCl2。
44.如条款39至43中任一项所述的试剂盒，其中，该缓冲溶液进一步包含约0.003M至约0.03M的KH2PO4。
45.如条款39至44中任一项所述的试剂盒，其中，该缓冲溶液进一步包含约0.01M至约0.1M的Na2HPO4。
46.如条款39至45中任一项所述的试剂盒，其中，该缓冲溶液进一步包含约0.001M至约0.04M的KCl。
47.如条款39至46中任一项所述的试剂盒，其中，该缓冲溶液进一步包含约0.2M至约3.0M的NaCl。
48.如条款39至47中任一项所述的试剂盒，其中，该缓冲溶液进一步包含约0.02N至约0.2N的NaOH。
49.如条款39至48中任一项所述的试剂盒，其中，该缓冲溶液进一步包含约0.2重量％至约5重量％的葡萄糖。
50.如条款39至48中任一项所述的试剂盒，其中，该缓冲溶液包含约0.5重量％或更少的葡萄糖。
51.如条款39至50中任一项所述的试剂盒，其中，该胶原溶液中该胶原的浓度为约0.1mg/ml至约40mg/ml。
52.如条款39至51中任一项所述的试剂盒，其中，该胶原溶液中该胶原的浓度为约0.1mg/ml至约5mg/ml。
53.如条款39至52中任一项所述的试剂盒，其中，该胶原溶液包含约0.005N的盐酸至约0.1N的盐酸。
54.如条款39至53中任一项所述的试剂盒，其中，该缓冲溶液能够使用单个混合步骤聚合该胶原，该单个混合步骤包括将该胶原组合物与该缓冲溶液混合。
55.如条款39至54中任一项所述的试剂盒，其中，该胶原组合物和该缓冲溶液在单独的容器中。
56.如条款55所述的试剂盒，其中，该容器是经过灭菌的小瓶。
57.如条款55所述的试剂盒，其中，该容器包括双筒注射器的单独隔室。
58.如条款57所述的试剂盒，其中，该双筒注射器包括混合元件。
59.如条款57所述的试剂盒，其中，对该双筒注射器进行灭菌。
60.如条款39至59中任一项所述的试剂盒，进一步包括该试剂盒的组成部分的使用说明。
61.一种制备基质的方法，所述方法包括通过以下方式聚合胶原：将胶原组合物与缓冲溶液混合以形成胶原溶液，以及聚合该胶原溶液中的胶原以形成该基质，其中该缓冲溶液不含镁离子或锰离子。
62.如条款61所述的方法，包括在大于约25℃下温育该胶原溶液以促进该胶原溶液中胶原的聚合。
63.如条款61或62所述的方法，包括在约37℃下温育该胶原溶液以促进该胶原溶液中胶原的聚合。
64.如条款61至63中任一项所述的方法，其中，该胶原包含胶原低聚物。
65.如条款61至63中任一项所述的方法，其中，该胶原由胶原低聚物组成。
66.如条款64所述的方法，其中，该胶原进一步包含端胶原。
67.如条款64所述的方法，其中，该胶原进一步包含缺端胶原。
68.如条款64所述的方法，其中，包含胶原低聚物的该胶原从含有胶原低聚物的组织中获得、从产生胶原低聚物的细胞中获得、或通过化学交联该胶原来获得该胶原低聚物而获得。
69.如条款61至68中任一项所述的方法，其中，该胶原来源于猪皮肤组织。
70.如条款61至69中任一项所述的方法，其中，该胶原组合物进一步包含酸。
71.如条款70所述的方法，其中，该酸选自由盐酸、乙酸、乳酸、甲酸、柠檬酸、硫酸和磷酸组成的组。
72.如条款71所述的方法，其中，该酸是盐酸。
73.如条款72所述的方法，其中，该盐酸为约0.005N至约0.1N的盐酸。
74.如条款72或73所述的方法，其中，该盐酸为约0.01N的盐酸。
75.如条款61至74中任一项所述的方法，其中，该胶原在该胶原溶液中的浓度为约0.1mg/ml至约40mg/ml。
76.如条款61至75中任一项所述的方法，其中，该胶原在该胶原溶液中的浓度为约0.1mg/ml至约5mg/ml。
77.如条款61至76中任一项所述的方法，其中，该胶原在该胶原溶液中的浓度为约0.5mg/ml至约4mg/ml。
78.如条款61至77中任一项所述的方法，其中，对该胶原组合物进行灭菌。
79.如条款61至78中任一项所述的方法，其中，该胶原组合物、该胶原溶液或该胶原基质通过选自由暴露于氯仿、病毒过滤、无菌过滤、γ辐照、紫外线辐射、电子束及其组合组成的组的方法进行灭菌。
80.如条款61至79中任一项所述的方法，其中，该胶原组合物通过过滤灭菌。
81.如条款61至80中任一项所述的方法，其中，该缓冲溶液进一步包含约0.3mM至约3mM的KH2PO4。
82.如条款61至81中任一项所述的方法，其中，该缓冲溶液进一步包含约1mM至约10M的Na2HPO4。
83.如条款61至82中任一项所述的方法，其中，该缓冲溶液进一步包含约0.1mM至约4mM的KCl。
84.如条款61至83中任一项所述的方法，其中，该缓冲溶液进一步包含约0.02M至约0.3M的NaCl。
85.如条款61至84中任一项所述的方法，其中，该缓冲溶液进一步包含约0.002N至约0.02N的NaOH。
86.如条款61至85中任一项所述的方法，其中，该缓冲溶液进一步包含约0.5重量％至约5重量％的葡萄糖。
87.如条款61至85中任一项所述的方法，其中，该缓冲溶液包含约0.5重量％或更少的葡萄糖。
88.如条款61至87中任一项所述的方法，进一步包括将细胞添加到该胶原溶液中。
89.如条款61至88中任一项所述的方法，其中，该基质包含胶原原纤维。
90.一种胶原基质，其根据如条款61至89中任一项所述的方法制备。
91.如条款90所述的胶原基质，其中，该胶原基质是医疗移植物。
92.如条款91所述的胶原基质，其中，该医疗移植物具有选自由以下项组成的组的用途：组织移植物材料、可注射移植物材料、伤口敷料、止血敷料、治疗性细胞的递送载体和治疗剂的递送载体。
93.如条款90所述的胶原基质，其中，该胶原基质用于研究目的。
94.如条款93所述的胶原基质，其中，该胶原基质用于药物毒性测试或药物开发。
95.一种试剂盒，包含冻干胶原、盐酸溶液和缓冲溶液。
96.如条款95所述的试剂盒，其中，该缓冲溶液包含约0.03mM至约0.2mM的MgCl2。
97.如条款95所述的试剂盒，其中，该缓冲溶液包含约0.002mM至约0.02mM的MgCl2。
98.如条款95所述的试剂盒，其中，该缓冲溶液包含小于约0.02mM的MgCl2。
99.如条款95所述的试剂盒，其中，该缓冲溶液不包含MgCl2。
100.如条款95至99中任一项所述的试剂盒，其中，该缓冲溶液进一步包含约0.003M至约0.03M的KH2PO4。
101.如条款95至100中任一项所述的试剂盒，其中，该缓冲溶液进一步包含约0.01M至约0.1M的Na2HPO4。
102.如条款95至101中任一项所述的试剂盒，其中，该缓冲溶液进一步包含约0.001M至约0.04M的KCl。
103.如条款95至102中任一项所述的试剂盒，其中，该缓冲溶液进一步包含约0.2M至约3.0M的NaCl。
104.如条款95至103中任一项所述的试剂盒，其中，该缓冲溶液进一步包含约0.02N至约0.2N的NaOH。
105.如条款95至104中任一项所述的试剂盒，其中，该缓冲溶液进一步包含约0.2重量％至约5重量％的葡萄糖。
106.如条款95至105中任一项所述的试剂盒，其中，该缓冲溶液包含约0.5重量％或更少的葡萄糖。
107.如条款95至106中任一项所述的试剂盒，其中，该盐酸溶液包含约0.005N的盐酸至约0.1N的盐酸。
108.如条款95至107中任一项所述的试剂盒，其中，该缓冲溶液能够使用单个混合步骤聚合胶原，该单个混合步骤包括将该缓冲溶液与在该盐酸溶液中重构的该冻干胶原混合。
109.如条款95至108中任一项所述的试剂盒，其中，该冻干胶原、该盐酸溶液和该缓冲溶液在单独的容器中。
110.如条款95至109中任一项所述的试剂盒，进一步包括该试剂盒的组成部分的使用说明。
111.一种制备基质的方法，所述方法包括使用单个混合步骤聚合胶原，该单个混合步骤包括将胶原组合物与缓冲溶液混合以形成胶原溶液，其中该胶原溶液中的胶原聚合以形成该基质。
112.如条款1至33、61至89或111中任一项所述的方法，其中，该胶原是可溶性胶原。
113.如条款1至19、21至33、61至79、81至89或111至112中任一项所述的方法，其中，使用紫外线辐射对该胶原组合物、该胶原溶液和/或该胶原基质进行灭菌。
114.如条款113所述的方法，其中，由胶原聚合产生的该胶原基质分别相对于未经辐照的胶原组合物、未经辐照的胶原溶液、或未经辐照的胶原基质保持聚合特性。
115.如条款114所述的方法，其中，该聚合特性是剪切储能模量。
116.如条款113至115中任一项所述的方法，其中，辐射剂量范围为从约5mJ/cm2至约800mJ/cm2。
117.如条款113至115中任一项所述的方法，其中，辐射剂量范围为从约30mJ/cm2至约300mJ/cm2。
118.如条款113至117中任一项所述的方法，其中，该灭菌使病毒失活。
119.如条款34至38或90至94中任一项所述的胶原基质，其中，使用紫外线辐射对该胶原基质进行灭菌。
120.如条款119所述的胶原基质，其中，该胶原基质相对于未经辐照的胶原基质保持聚合特性。
121.如条款120所述的胶原基质，其中，该聚合特性是剪切储能模量。
122.如条款119至121中任一项所述的胶原基质，其中，辐射剂量范围为从约5mJ/cm2至约800mJ/cm2。
123.如条款119至121中任一项所述的胶原基质，其中，辐射剂量范围为从约30mJ/cm2至约300mJ/cm2。
124.如条款119至123中任一项所述的胶原基质，其中，该灭菌使病毒失活。
125.如条款39至60或95至110中任一项所述的试剂盒，其中，使用紫外线辐射对该胶原组合物或冻干胶原进行灭菌。
126.如条款125所述的试剂盒，其中，由胶原聚合产生的该胶原基质分别相对于未经辐照的胶原组合物或未经辐照的冻干胶原保持聚合特性。
127.如条款126所述的试剂盒，其中，该聚合特性是剪切储能模量。
128.如条款125至127中任一项所述的试剂盒，其中，辐射剂量范围为从约5mJ/cm2至约800mJ/cm2。
129.如条款125至127中任一项所述的试剂盒，其中，辐射剂量范围为从约30mJ/cm2至约300mJ/cm2。
130.如条款125至129中任一项所述的试剂盒，其中，该灭菌使病毒失活。
131.如条款1至19、21至33、61至79、81至89或111至118中任一项所述的方法，其中，使用UVC辐照对该胶原组合物、该胶原溶液和/或该胶原基质进行灭菌。
132.如条款1至19、21至33、61至79、81至89或111至118中任一项所述的方法，其中，使用UVC辐照和无菌过滤对该胶原组合物、该胶原溶液和/或该胶原基质进行灭菌。
133.如条款34至38、90至94或119至124中任一项所述的胶原基质，其中，使用UVC辐照对该胶原基质进行灭菌。
134.如条款34至38、90至94或119至124中任一项所述的胶原基质，其中，使用UVC辐照和无菌过滤对该胶原基质进行灭菌。
135.如条款39至60、95至110或125至130中任一项所述的试剂盒，其中，使用UVC辐照对该胶原组合物或该冻干胶原进行灭菌。
136.如条款39至60、95至110或125至130中任一项所述的试剂盒，其中，使用UVC辐照和无菌过滤对该胶原组合物或该冻干胶原进行灭菌。
如本领域技术人员将理解的，聚合、自组装、自组装的、原纤维形成和基质形成能力具有相同的含义，并且如本领域技术人员将理解的，基质可以呈原纤维形式。为了制备用于本文所述的方法和组合物的胶原，可以使用本领域已知的任何制备胶原的方法。在说明性实施例中，胶原可以通过以下文献中描述的方法制备：Bailey JL、Critser PJ、Whittington C、Kuske JL、Yoder MC、Voytik-Harbin SL；Collagen oligomers modulatephysical and biological properties of three-dimensional self-assembledmatrices[胶原低聚物调节三维自组装基质的物理和生物学特性]，Biopolymers[生物聚合物](2011)95(2):77-93；Kreger ST、Bell BJ、Bailey J、Stites E、Kuske J、Waisner B、Voytik-Harbin SL；Polymerization and matrix physical properties as importantdesign considerations for soluble collagen formulations[作为可溶性胶原制剂的重要设计考虑因素的聚合和基质物理特性]，Biopolymers[生物聚合物](2010)93(8):690-707；美国专利申请公布号20080268052；或美国专利申请公布号20120027732，每篇文献都通过援引并入本文。
在各种说明性实施例中，用于本文所述的方法和组合物的胶原可以从本领域已知的胶原的任何合适的来源获得。示例性胶原来源通常包括粘膜下层组织(美国专利号4,902,508、5,281,422和5,275,826)、心包组织、膀胱粘膜下层组织、胃粘膜下层组织、肝基底膜组织、胎盘组织、卵巢组织、动物尾巴组织、皮肤组织(例如，Gallop等人，Preparationand Properties of Soluble Collagens[可溶性胶原的制备及性质]，Meth.Enzymol.[酶学方法]，6:635-641(1963)，通过援引并入本文)和细胞外基质组织。在各种实施例中，用于本文所述的方法和组合物的胶原的类型可以是任何合适的胶原类型，包括但不限于I型胶原、II型胶原、III型胶原或IV型胶原或其组合。
在一个实施例中，富含胶原低聚物的组织(例如，猪皮肤组织)也可用于获得用于本文所述的方法和组合物的胶原，或者胶原可以从产生胶原低聚物的细胞(例如，通过重组技术改变以表达胶原低聚物的细胞)中获得，或通过化学交联胶原来获得胶原低聚物而获得(例如，使用本领域已知的交联剂)。在各种实施例中，用于本文所述的方法和组合物的胶原可包含低聚物或可由低聚物组成。在另一个实施例中，胶原可包含低聚物和其他形式的胶原，诸如单体、端胶原和/或缺端胶原。
在另一个实施例中，胶原可以是可溶性胶原或已溶解的胶原。在胶原是可溶性胶原或已溶解的胶原的实施例中，胶原基本上不含不溶性胶原，但可能含有一些不溶性胶原。在另一个实施例中，胶原由可溶性胶原或已溶解的胶原组成。
在各种说明性实施例中，可使用本领域已知的灭菌技术对胶原、胶原组合物、胶原基质、胶原溶液、冻干胶原和/或缓冲溶液进行灭菌，这些技术包括但不限于环氧丙烷或环氧乙烷处理、气体等离子体灭菌、γ辐射(例如，1-4兆拉德)、紫外线辐射(例如，UVC辐照)、电子束、病毒过滤、无菌过滤(例如，使用0.22μm过滤器)、氯仿暴露和/或过乙酸灭菌及其组合。在该实施例中，灭菌过程不应对进行灭菌的胶原的结构、胶原的聚合特性或胶原的生物学特性产生不利影响。在各种实施例中，可以在冻干(冻干过程如下所述)之前或之后对胶原进行灭菌。
在紫外线辐射(例如，UVC辐照)实施例中，由胶原聚合产生的胶原基质可以相对于未经辐照的胶原、未经辐照的胶原组合物、未经辐照的胶原基质、未经辐照的胶原溶液或未经辐照的冻干胶原保持聚合特性。在该实施例中，聚合特性可选自剪切储能模量、弹性模量(杨氏模量)、拉伸模量、压缩模量、原纤维结构、蛋白质水解降解、细胞信号传导及其组合。在各种实施例中，紫外线辐射剂量(例如，UVC辐照)的范围可以为约5mJ/cm2至约800mJ/cm2、约5mJ/cm2至约700mJ/cm2、约5mJ/cm2至约600mJ/cm2、约5mJ/cm2至约500mJ/cm2、约5mJ/cm2至约400mJ/cm2、约5mJ/cm2至约300mJ/cm2、5mJ/cm2至约200mJ/cm2、5mJ/cm2至约100mJ/cm2、5mJ/cm2至约50mJ/cm2、约30mJ/cm2至约800mJ/cm2、约30mJ/cm2至约700mJ/cm2、约30mJ/cm2至约600mJ/cm2、约30mJ/cm2至约500mJ/cm2、约30mJ/cm2至约400mJ/cm2、约30mJ/cm2至约300mJ/cm2、约30mJ/cm2至约200mJ/cm2、约30mJ/cm2至约100mJ/cm2、约30mJ/cm2至约50mJ/cm2、约200mJ/cm2至约800mJ/cm2、约300mJ/cm2至约800mJ/cm2、约400mJ/cm2至约800mJ/cm2、约500mJ/cm2至约800mJ/cm2、约600mJ/cm2至约800mJ/cm2、约50mJ/cm2至约300mJ/cm2、约100mJ/cm2至约300mJ/cm2、或约200mJ/cm2至约300mJ/cm2。在本文所述的所有紫外线辐射实施例(例如，UVC辐照)中，灭菌使病毒失活。在该实施例中，“使病毒失活”是指使所有病毒(无论是否具有传染性)失活、减少传染性病毒的数量、或抑制病毒(无论是否具有传染性)的活性。
在一个方面，可以通过本领域已知的用于纯化胶原的方法纯化用于本文所述的方法和组合物的胶原。如本文所用，“纯化”是指除去污染物，包括但不限于细胞污染物、核苷酸污染物和内毒素。在各种实施例中，可通过除去污染物使得胶原的纯度为至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％、或至少约99.5％来纯化胶原。在另一个实施例中，胶原可以是分离的。如本文所用，“分离的”是指基本上不含污染物，包括但不限于细胞污染物、核苷酸污染物和内毒素。
在一个说明性实施例中，可以将用于本文所述的方法和组合物的胶原冻干，然后将其重构以形成胶原组合物，以用于与如本文所述的缓冲溶液混合。在该实施例中，冻干胶原的重构不是用于胶原聚合的混合步骤。如本文所用，术语“冻干”是指通过例如在真空下冷冻干燥而从蛋白质、化合物或组合物中除去水。可以使用技术人员已知的任何冻干方法。在一个方面，胶原可以在酸例如乙酸、盐酸、甲酸、乳酸、柠檬酸、硫酸或磷酸中冻干。在另一个实施例中，胶原可以在水中冻干。在其他说明性实施例中，可以在冻干过程中使用冷冻保护剂或冻干保护剂或其组合。
在一个说明性方面，可以重构冻干胶原以形成本文所述的胶原组合物，以用于与缓冲溶液混合以聚合胶原。在各种说明性实施例中，胶原可以在酸性溶液或水中重构。在各种实施例中，酸性溶液可包含乙酸、盐酸、甲酸、乳酸、柠檬酸、硫酸或磷酸。在说明性实施例中，用于重构的酸性溶液可具有约0.005N至约0.1N、约0.005N至约0.08N、约0.005N至约0.06N、约0.005N至约0.04N、约0.005N至约0.02N、约0.005N至约0.01N、或约0.01N的酸浓度。在一个实施例中，酸可以是盐酸，并且盐酸可以是约0.005N至约0.1N的盐酸。在另一个实施例中，酸可以是盐酸，并且盐酸可以是约0.01N的盐酸。
在一个说明性方面，胶原组合物或胶原溶液中的胶原浓度可以为约0.1mg/ml至约40mg/ml、约0.1mg/ml至约5mg/ml或约0.5mg/ml至约4mg/ml。在其他实施例中，胶原组合物或胶原溶液中的胶原浓度可以为约0.05至约5.0mg/ml、约1.0mg/ml至约3.0mg/ml、约0.05mg/ml至约10mg/ml、约0.05至约20mg/ml、约0.05至约30mg/ml、约0.05至约40mg/ml、约0.05至约50mg/ml、约0.05至约60mg/ml、约0.05至约80mg/ml、约5mg/ml至10mg/ml、约5mg/ml至20mg/ml、约5mg/ml至约40mg/ml、约5mg/ml至60mg/ml、约5mg/ml至约100mg/ml、约20mg/ml至约40mg/ml、约20mg/ml至60mg/ml、或约20mg/ml至约100mg/ml。
在一个说明性实施例中，在单个步骤中将胶原组合物与缓冲溶液混合以聚合胶原。在另一个实施例中，在不存在镁离子或锰离子的情况下将胶原组合物与缓冲溶液混合以聚合胶原。在一个实施例中，将胶原组合物与缓冲溶液混合以形成胶原溶液，并将胶原溶液在大于约25℃的温度下温育，以促进胶原溶液中胶原的聚合。在另一个实施例中，可以将胶原溶液在约37℃下温育，以促进胶原溶液中胶原的聚合。在各种其他实施例中，可以将胶原溶液在约25℃、26℃、27℃、28℃、29℃、30℃、31℃、32℃、33℃、34℃、35℃、36℃、38℃、39℃或40℃下温育，以促进胶原溶液中胶原的聚合。在另一个实施例中，可以将胶原溶液在约25℃至约40℃下温育，以促进胶原溶液中胶原的聚合。在其他实施例中，聚合可以在高于20℃的温度下进行，或在选自约20℃至约40℃范围内的温度下进行。在这些实施例中，胶原可以聚合以形成原纤维，这些原纤维类似于在体内发现的那些。
在一个实施例中，待与胶原组合物混合以形成胶原溶液的缓冲溶液可包含约0.03mM至约0.2mM的MgCl2、约0.002mM至约0.02mM的MgCl2、小于约0.02mM的MgCl2或不含MgCl2。在其他实施例中，待与胶原组合物混合以形成胶原溶液的缓冲溶液可包含约0.3mM至约3mM的KH2PO4、约1mM至约10M的Na2HPO4、约0.1mM至约4mM的KCl、约0.02M至约0.3M的NaCl和约0.002N至约0.02N的NaOH。在另一个实施例中，待与胶原组合物混合以形成胶原溶液的缓冲溶液可包含约0.5重量％至约5重量％的葡萄糖、约0.5重量％的葡萄糖或更少的葡萄糖、或不含葡萄糖。
在一个方面，缓冲溶液可以从10X、5X、2X或任何合适的起始浓度稀释，以制备具有前一段中的组分浓度中的任一种的1X缓冲溶液。在一个方面，本文所述的试剂盒可包含具有10X、5X或2X的浓度、或任何合适的起始浓度的缓冲溶液，以供稀释从而制备1X缓冲溶液。根据一个实施例，10X缓冲溶液可包含以下浓度的以下成分：
1.37M的NaCl
0.027M的KCl
0.081M的Na2HPO4
0.015M的KH2PO4
0.1N的NaOH
以及任选的55.5mM的葡萄糖
在另一个实施例中，1X缓冲溶液可包含以下浓度的以下成分：
0.137M的NaCl
0.0027M的KCl
0.0081M的Na2HPO4
0.0015M的KH2PO4
0.01N的NaOH
以及任选的5.55mM的葡萄糖
在这些实施例中，NaOH存在于缓冲溶液中。在用于聚合胶原的先前已知的常规方法中，在胶原聚合方法中作为另外的混合步骤单独添加NaOH。在另一个说明性实施例中，氯化钙可以以约0.4mM至约2.0mM的浓度存在于缓冲溶液中。
在各种实施例中，缓冲溶液中的缓冲液可选自由磷酸缓冲盐溶液(PBS)、三(羟甲基)氨基甲烷盐酸盐(Tris-HCl)、3-(N-吗啉)丙磺酸(MOPS)、哌嗪-N,N'-二(2-乙磺酸)(PIPES)、N-(2-乙酰氨基)-2-氨基乙磺酸(ACES)、N-(2-羟乙基)哌嗪-N'-(2-乙磺酸)(HEPES)和1,3-双((三羟甲基)甲基氨基)丙烷(Bis-Tris丙烷)组成的组。在一个实施例中，缓冲液是PBS。
在各种说明性实施例中，用于胶原聚合的胶原溶液的pH选自约5.0至约11、约6.0至约9.0、约6.5至约8.5的范围，并且在另一个实施例中，pH为约7.3至约7.4。
在各种实施例中，可以在胶原聚合完成之前或之后或在胶原聚合过程中向胶原溶液添加营养物，包括矿物质、氨基酸、糖、肽、蛋白质、维生素、或促进细胞增殖的糖蛋白(诸如层连蛋白和纤连蛋白)、透明质酸、或生长因子(诸如表皮生长因子、血小板衍生生长因子、转化生长因子β或成纤维细胞生长因子)和糖皮质激素(诸如地塞米松)。根据另一个实施例，可以在胶原聚合完成之前或之后或在胶原聚合过程中将细胞添加到胶原溶液中。在各种实施例中，细胞可选自由上皮细胞、内皮细胞、中胚层来源的细胞、间皮细胞、滑膜细胞、神经细胞、神经胶质细胞、成骨细胞、成纤维细胞、软骨细胞、腱细胞、平滑肌细胞、骨骼肌细胞、心肌细胞、多能祖细胞(例如，干细胞，包括骨髓祖细胞)、脂肪细胞和骨原细胞组成的组。
在一个实施例中，提供了根据本文所述方法中的任一种制备的胶原基质。在一个方面，胶原基质可以是医疗移植物。在一个实施例中，该医疗移植物具有选自由以下项组成的组的用途：组织移植物材料、可注射移植物材料、伤口敷料、止血敷料、治疗性细胞的递送载体和治疗剂的递送载体。在另一个实施例中，本文所述的方法可用于制备用于打印组织或器官的生物墨水配方。在另一个实施例中，胶原基质用于研究目的，诸如药物毒性测试或药物开发。在一个实施例中，通过本文所述的方法制备的基质可以用作在植入部位供内源组织再生(例如，重塑)的底物，并且这些基质可以具有它们在植入或注射部位所取代的受损或患病组织的特征。
在一个说明性实施例中，本文所述的基质可含有原纤维，这些原纤维的原纤维面积分数(定义为在基质横截面中原纤维所占据的总面积的面积百分比)或原纤维体积分数(原纤维在3个维度上所占据的总面积的面积百分比)为约0.1％至约100％、约0.5％至约100％、约0.5％至约26％、约1％至约100％、约1％至约26％、约1％至约7％、约1％至约15％、约7％至约26％、约20％至约30％、约20％至约50％、约20％至约70％、约20％至约100％、约30％至约50％、约30％至约70％、或约30％至约100％，和/或模量(例如，弹性或线性模量(由使用常规机械测试方案获得的应力-应变曲线的线性区域的斜率定义；即，刚度)、压缩模量或剪切储能模量)为约0.5kPa至约40kPa、约30kPa至100kPa、约30kPa至约1000kPa、约30kPa至约10000kPa、约30kPa至约70000kPa、约100kPa至1000kPa、约100kPa至约10000kPa、或约100kPa至约70000kPa。
在另一个实施例中，描述了包含冻干胶原、盐酸溶液和缓冲溶液的试剂盒。在又一个实施例中，提供了包含胶原组合物和缓冲溶液的试剂盒。在这些试剂盒实施例中，缓冲溶液可以包含约0.03mM至约0.2mM的MgCl2、约0.002mM至约0.02mM的MgCl2、小于约0.02mM的MgCl2，或者缓冲溶液不含MgCl2。在各种实施例中，缓冲溶液进一步包含约0.003M至约0.03M的KH2PO4、约0.01M至约0.1M的Na2HPO4、约0.001M至约0.04M的KCl、约0.2M至约3.0M的NaCl和约0.02N至约0.2N的NaOH。在另一个方面，缓冲溶液可包含约0.2重量％至约5重量％的葡萄糖、约0.5重量％的葡萄糖或更少的葡萄糖、或不含葡萄糖。
在一个方面，在具有盐酸溶液的试剂盒实施例中，盐酸溶液可包含约0.005N的盐酸至约0.1N的盐酸。在一个方面，在具有冻干胶原、盐酸溶液和缓冲溶液的试剂盒实施例中，冻干胶原、盐酸溶液和缓冲溶液在单独的容器中。在具有胶原组合物和缓冲溶液的实施例的一个方面，胶原组合物中的胶原的浓度可以为约0.1mg/ml至约40mg/ml或约0.1mg/ml至约5mg/ml。在该实施例中，胶原组合物和缓冲溶液可以在单独的容器(诸如经灭菌的小瓶或包括混合元件的双筒注射器的单独隔室)中。在本文所述的试剂盒实施例的任一个中，试剂盒可包含试剂盒组成部分的使用说明。在本文所述的试剂盒实施例的任一个中，缓冲溶液能够使用单个混合步骤聚合胶原，该单个混合步骤包括将缓冲溶液与在盐酸溶液中重构的冻干胶原或与胶原组合物混合。
在另一个实施例中，试剂盒提供有冻干形式的胶原，并且该试剂盒进一步包含如本文所述的缓冲溶液和用于重构冻干胶原的酸(诸如乙酸或另一种稀酸，包括例如盐酸、甲酸、乳酸、柠檬酸、硫酸或磷酸)的溶液。
以下实例进一步详细说明具体实施例。这些实例仅为了说明性目的而提供，不应解释为以任何方式限制本发明。
实例1
胶原组合物的制备
I型胶原低聚物来源于圈养猪群的真皮，并如前所述制备(Bailey JL、CritserPJ、Whittington C、Kuske JL、Yoder MC、Voytik-Harbin SL，Collagen oligomersmodulate physical and biological properties of three-dimensional self-assembled matrices[胶原低聚物调节三维自组装基质的物理和生物学特性]，Biopolymers[生物聚合物](2011)95(2):77-93，以及Kreger ST、Bell BJ、Bailey J、Stites E、Kuske J、Waisner B、Voytik-Harbin SL，Polymerization and matrixphysical properties as important design considerations for soluble collagenformulations[作为可溶性胶原制剂的重要设计考虑因素的聚合和基质物理特性]，Biopolymers[生物聚合物](2010)93(8):690-707，这两篇文献均通过援引并入本文)。在使用之前，将冻干的胶原低聚物溶于0.01N的盐酸中。通过在4℃下暴露于氯仿使研究级低聚物无菌。使用0.22μm Millex-GP PES Express注射器式过滤器(密理博公司(Millipore)，SLGPO33RS)对医用级低聚物进行无菌过滤。使用天狼星红(直接红80)测定法确定胶原浓度。根据ASTM国际共识标准F3089-14(ASTM标准F3089，2014，“Standard Guide forCharacterization and Standardization of Polymerizable Collagen-Based Productsand Associated Collagen-Cell Interactions”[基于可聚合胶原的产品和相关胶原-细胞相互作用的表征及标准化的标准指南]，宾夕法尼亚州西康舍霍肯美国材料试验国际协会(ASTM International,West Conshohocken,PA)，F3089-14)，基于纯度和聚合能力将低聚物制剂标准化。聚合能力由随聚合反应的胶原浓度而变化的基质剪切储能模量(G’)来定义。进行多步骤自组装，并且该多步骤自组装涉及3种试剂，即10X聚合缓冲液PLUS(10XPolymerization Buffer PLUS)、0.1N的NaOH和聚合补充剂。在不存在MgCl2的情况下，使用根据以下配方制备的10X自组装试剂(以1:10稀释)进行单步骤自组装：
2g KH2PO4(FW 136.09)
11.5g Na2HPO4(FW 141.96)
2g KCl(FW 74.55)
10g葡萄糖
80g NaCl(FW 58.44)
20ml 5N的NaOH
将所有试剂添加到Milli-Q过滤水中以达到1升的最终体积并进行无菌过滤(0.22μm)。从新泽西州普莱恩斯伯勒的英特格拉生命科学公司(Life Sciences,Plainsboro,NJ)获得Integra Flowable并根据制造商的说明对其进行处理。
实例2
粘弹性测试
如前所述(Kreger等人，2010)，在AR2000流变仪(特拉华州纽卡斯尔的TA仪器公司(TA Instruments,New Castle,DE))上使用振荡剪切模式测定自组装胶原基质的粘弹性。样品在流变仪台上聚合30分钟，然后在1Hz下进行0.1％至4％应变的剪切应变扫描。使用1％应变下的剪切储能模量(G’)作为基质刚度的量度。
实例3
细胞培养和三维胶原-原纤维组织构建体的制备
从北卡罗来纳州三角研究园的正能生物公司(Zen-Bio,Research TrianglePark,NC)获得低传代人脂肪来源的干细胞(hASC)，并将其在由杜尔贝科改良伊格尔培养基(DMEM；加利福尼亚州卡尔斯巴德的生命科技公司(Life Technologies,Carlsbad,CA))、10％胎牛血清(FBS)、100U/mL青霉素和100U/mL streptomyosin(纽约州格兰德岛的英杰公司(Invitrogen,Grand Island,NY))组成的生长培养基中培养。使hASC生长并保持在37℃下的在空气中含有5％二氧化碳的潮湿环境中。将细胞保持低于80％汇合度并以第6至9代在实验中使用。
通过将hASC(300,000个细胞/ml)悬浮在中和的低聚物(200Pa)溶液中来制备细胞包封的胶原-原纤维组织构建体。使用多步骤或单步骤过程和试剂实现中和。培养3天后，将组织构建体在3％多聚甲醛中固定，并用鬼笔环肽对组织构建体染色，以可视化肌动蛋白细胞骨架。对于3D定性分析，使用适于倒置显微镜(IX81，日本东京的奥林巴斯公司(OlympusCorporation,Tokyo,Japan))的Olympus FluoView FV-1000共聚焦系统对组织构建体成像。
实例4
小鼠皮下注射
将得自印第安纳州印第安纳波利斯的哈兰实验室公司(Harlan Laboratories,Indianapolis,Indiana)的C57BL/6小鼠(n＝5)最初在1L诱导室中麻醉，然后用在1.5L/min的医用级空气中施用1％-3％异氟烷的同轴鼻锥非再呼吸系统使其保持昏迷。应用无菌眼睛润滑剂，将动物放置在设定为44℃的可调节加热台上，以保持内部体温接近37℃。分别用台电极和直肠探针每15分钟监测心率、呼吸率和体温。用剪刀和脱毛膏(Nair，新泽西州尤英的切迟杜威公司(Church&Dwight Co.,Inc.Ewing,NJ))除去背侧毛发。实验组包括1)研究级低聚物(500Pa)、2)医用级低聚物(500Pa)、3)Integra Flowable、4)磷酸缓冲盐溶液(PBS)、或5)无处理对照。将低聚物、Integra Flowable和PBS制剂在背部的两侧平行于矢状面皮下注射(200μl)。低聚物和PBS制剂使用27G、1/2英寸针头施用，而Integra Flowable需要18G、1/2英寸针头，因为考虑到材料一致性和较小的针头尺寸会造成堵塞。四周后，对动物实施安乐死并收获植入部位以及周围宿主组织的宽边缘。所有标本均用福尔马林固定、石蜡包埋、切成薄片，并用苏木精-伊红(H&E)和马森三色染色。
实例5
单步骤自组装过程与试剂的开发和验证
单步自组装过程和试剂包括维持i)生理学相关条件和试剂以及ii)用已建立的多步骤过程观察到的聚合能力。最初尝试组合多步骤过程中使用的所有试剂，包括10X聚合缓冲液PLUS、聚合补充剂和NaOH，产生了形成絮凝沉淀物的不稳定溶液。但是，当除去MgCl2时，即使在4℃下长时间储存，也没有发现沉淀。基于这些结果，进行了后续研究以评估聚合能力和体外细胞响应。与多步骤过程相比，单步骤过程产生了类似的聚合能力曲线和类似的体外细胞行为及形态，分别如图1和图2所示。还进行了初步研究以显示单步骤自组装用于三维生物打印应用的实用性。更具体地讲，采用低聚物、10X自组装试剂和稀释剂，使用定制设计的单喷嘴生物打印装置打印含有胶原-原纤维密度连续梯度的组织构建体。新的单步骤胶原自组装过程和相关的配方分别如图3和图4所示。
实例6
胶原聚合物灭菌的开发和验证
进行了另外的研究以评估将支持医用级低聚物产品的扩大生产和监管批准的灭菌方法。使用常规的0.22μm基于注射器的过滤装置进行无菌过滤。因为低聚物代表可溶性分子溶液，所以它适合于无菌过滤。低聚物制剂(500Pa)在无菌过滤之前(458±55Pa)和之后(434±49)显示出统计学上相似的(p>0.05)聚合动力学和能力。另外的研究证实，用研究级和医用级低聚物制剂获得了类似的体内组织响应。此外，使用研究级低聚物的单步骤聚合获得的体内组织响应与使用多步聚合过程获得的那些一致(参见图5)。
实例7
胶原紫外线辐照对胶原基质性质的影响
254nm(UVC)的单色紫外线辐照由采用低压汞灯源的平板准直光束系统产生。将薄层(1mm)胶原溶液置于培养皿中并用0(未经处理的对照)、30mJ/cm2(辐照1分钟)和300mJ/cm2(辐照10分钟)的UVC剂量对其进行处理。如实例2中所述测量经处理的样品的聚合能力和相关粘弹性，并与未经处理的对照进行比较。对于暴露于0、30和300mJ/cm2剂量的UVC辐照的低聚物溶液，剪切储能模量测量值在统计学上是相似的(图7)。

Claims (32)

1.一种制备基质的方法，所述方法包括使用单个混合步骤聚合胶原，包括将胶原组合物与缓冲溶液混合以形成胶原溶液，以及聚合该胶原溶液中的胶原以形成该基质。
2.如权利要求1所述的方法，其中，该胶原组合物、该胶原溶液或该胶原基质通过选自由暴露于氯仿、病毒过滤、无菌过滤、紫外线辐射、γ辐照、电子束及其组合组成的组的方法进行灭菌。
3.如权利要求1所述的方法，其中，该缓冲溶液包含小于约0.02mM的MgCl2。
4.如权利要求1所述的方法，其中，该缓冲溶液不包含MgCl2。
5.一种胶原基质，其根据如权利要求1所述的方法制备。
6.一种包含胶原组合物和缓冲溶液的试剂盒，其中，该缓冲溶液能够使用单个混合步骤聚合该胶原，该单个混合步骤包括将该胶原组合物与该缓冲溶液混合。
7.如权利要求6所述的试剂盒，其中，该缓冲溶液包含小于约0.02mM的MgCl2。
8.如权利要求6所述的试剂盒，其中，该缓冲溶液不包含MgCl2。
9.一种制备基质的方法，所述方法包括通过以下方式聚合胶原：将胶原组合物与缓冲溶液混合以形成胶原溶液，以及聚合该胶原溶液中的胶原以形成该基质，其中该缓冲溶液不含镁离子或锰离子。
10.如权利要求9所述的方法，其中，该胶原组合物、该胶原溶液或该胶原基质通过选自由暴露于氯仿、病毒过滤、无菌过滤、紫外线辐射、γ辐照、电子束及其组合组成的组的方法进行灭菌。
11.一种胶原基质，其根据如权利要求9所述的方法制备。
12.如权利要求2所述的方法，其中，使用紫外线辐射对该胶原组合物、该胶原溶液和/或该胶原基质进行灭菌。
13.如权利要求12所述的方法，其中，由胶原聚合产生的该胶原基质分别相对于未经辐照的胶原组合物、未经辐照的胶原溶液、或未经辐照的胶原基质保持聚合特性。
14.如权利要求13所述的方法，其中，该聚合特性是剪切储能模量。
15.如权利要求12所述的方法，其中，辐射剂量范围为从约30mJ/cm2至约300mJ/cm2。
16.如权利要求12所述的方法，其中，该灭菌使病毒失活。
17.如权利要求5所述的胶原基质，其中，使用紫外线辐射对该胶原基质进行灭菌。
18.如权利要求17所述的胶原基质，其中，该胶原基质相对于未经辐照的胶原基质保持聚合特性。
19.如权利要求18所述的胶原基质，其中，该聚合特性是剪切储能模量。
20.如权利要求17所述的胶原基质，其中，辐射剂量范围为从约30mJ/cm2至约300mJ/cm2。
21.如权利要求17所述的胶原基质，其中，该灭菌使病毒失活。
22.如权利要求6所述的试剂盒，其中，使用紫外线辐射对该胶原组合物或冻干胶原进行灭菌。
23.如权利要求22所述的试剂盒，其中，由胶原聚合产生的该胶原基质分别相对于未经辐照的胶原组合物或未经辐照的冻干胶原保持聚合特性。
24.如权利要求23所述的试剂盒，其中，该聚合特性是剪切储能模量。
25.如权利要求22所述的试剂盒，其中，辐射剂量范围为从约30mJ/cm2至约300mJ/cm2。
26.如权利要求22所述的试剂盒，其中，该灭菌使病毒失活。
27.如权利要求12所述的方法，其中，使用UVC辐照对该胶原组合物、该胶原溶液和/或该胶原基质进行灭菌。
28.如权利要求12所述的方法，其中，使用UVC辐照和无菌过滤对该胶原组合物、该胶原溶液和/或该胶原基质进行灭菌。
29.如权利要求17所述的胶原基质，其中，使用UVC辐照对该胶原基质进行灭菌。
30.如权利要求17所述的胶原基质，其中，使用UVC辐照和无菌过滤对该胶原基质进行灭菌。
31.如权利要求22所述的试剂盒，其中，使用UVC辐照对该胶原组合物或该冻干胶原进行灭菌。
32.如权利要求22所述的试剂盒，其中，使用UVC辐照和无菌过滤对该胶原组合物或该冻干胶原进行灭菌。
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