KR102266578B1 - 히알루론산 기반의 안과용 약물전달체 - Google Patents

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Abstract

가교결합된 히알루론산을 포함하는 담지체; 및 상기 담지체에 담지된 약물을 포함하고, 안구 내 삽입하기 위한 용도인 안과용 약물전달체가 개시된다.

Description

히알루론산 기반의 안과용 약물전달체{Hyaluronic acid-based ophthalmic drug carrier}
본 발명은 히알루론산 기반의 안과용 약물전달체에 관한 것이다.
고령화에 따라 녹내장 또는 백내장 환자가 증가하고 있으며, 이에 대한 안구 수술도 증가하고 있다. 안구 수술 후 성공적인 회복을 위해서는 그람양성균 및 그람음성균 등의 세균 감염 및 수술 후 이물질의 잔존으로 인한 안압 상승과 염증 반응등이 최소화되어야 한다.
안구 수술 후에는 세균 감염을 방지하기 위해 점안제 형태의 항세균제를 안구에 투여하는데, 수술 직후 7일 내지 14일, 환자에 따라서는 그 이상 꾸준하고 정확한 용량으로 투여하는 것이 중요하다. 항세균제는 세균 감염을 효율적으로 방지하기 위한 총 투여량이 정해져 있으며, 생체내 반감기를 고려하여 투여량과 투여 횟수가 결정되어야 한다. 목시플록사신(Moxifloxacin, MXF)은 안과 수술에서 주로 사용되는 항세균제로서, 녹내장 또는 백내장과 같은 수술 후에 세균감염을 방지하기 위해 점안하는 방식으로 투여되고 있다. 목시플록사신의 일주일 기준 총 투여량은 약 3.5 mg이고, 점안액에 함유된 목시플록사신은 약 0.5 중량%인 점, 목시플록사신의 체내 반감기가 약 12.7h인 점을 고려하여 하루에 최소 두 회 이상 1회당 약 50 μL를 점안하도록 하고 있다. 그러나 수술 후에는 시야가 제한되므로 스스로 점안하기 어렵고, 점안액이 흘러내리거나 점안시기를 지키지 않아 정확한 양이 투여되지 않는 경우가 많다. 또한 안과 수술을 받는 대상 연령이 고령인 경우가 많아 스스로 정확한 안약 점안이 어려운 경우도 많다.
따라서 점안의 불편함을 해소하기 위해 수술 과정에서 안구 내에 삽입되어 항생제 등을 필요한 기간만큼 방출함으로서 점안 없이도 세균 감염을 억제할 수 있는 약물전달체가 필요하다. 그러나 수술 후 안구 내 삽입되는 약물전달체는 단순히 서방성을 갖추는 것만으로는 부족하고 안압 상승 및 염증 반응 등의 부작용을 최소화하기 위해 매우 높은 생체적합성이 필요하므로 수술 후 안구 회복에 있어서 기존 약물전달체를 적용하기 어려운 문제가 있었다.
히알루론산(HA)은 베타-D-N-아세틸글루코사민과 베타-D-글루쿠론산이 반복된 이당류 단위로 구성되는 선형 다당류이다. 히알루론산은 생체 내에서 발견되는 세포외 조직의 성분으로서 생체적합성이 매우 높지만, 생체 내에서 신속히 분해되므로 서방성 약물 방출을 위한 약물전달체의 주성분으로 이용하는 것은 어렵다고 알려져 있다. 목시플록사신을 점안하는 불편함을 해결하기 위해 목시플록사신이 담지된 약물전달체가 연구되고 있으며, 키토산 및 덱스트란을 주성분으로 하는 약물담지체가 연구되고 있으나(Kaskoos, R.A. Investigation of moxifloxacin loaded chitosan-dextran nanoparticles for topical instillation into eye: In-vitro and ex-vivo evaluation. Int. J. Pharm. Investig. 2014, 4, 164-173), 히알루론산을 주성분으로 하는 안과용 약물전달체는 알려진 바가 없다.
대한민국 공개공보 제10-2017-0087427호(2017.07.28)
일 구체예는 안구 내에 삽입되어 사용되고, 일정 기간 동안 물성이 유지되어 안정적으로 항생제를 방출할 수 있는 히알루론산 기반의 안과용 약물전달체를 제공한다.
일 양상은, 가교결합된 히알루론산을 포함하는 담지체; 및 상기 담지체에 담지된 약물을 포함하고, 안구 내 삽입하기 위한 용도인 안과용 약물전달체를 제공한다.
상기 안과용 약물전달체는 안구에 삽입시 독성이 없으며, 안구 내에서 일정기간 동안 서서히 분해되면서 담지된 약물을 일정하게 방출함으로서 수술 후 점안액 투여를 대체할 수 있다.
상기 약물은 스테로이드, 산화질소 방출 제제, 또는 항세균제일 수 있다. 상기 항세균제는 플루오로퀴놀린계(Fluoroquinolon) 항생제일 수 있다. 상기 플루오로퀴놀린계 항생제는 퀴놀린의 6번 탄소 위치에 불소를 첨가한 구조를 가지고 있으며 그람 양성 및 음성 세균 모두에 항균력을 발휘함으로서 항균력의 범위가 넓은 특징이 있다. 플루오로퀴놀린계 항생제의 종류로는 시프로플록사신(Ciprofloxacin), 오플록사신(Ofloxacin), 레보플록사신(Levofloxacin), 목시플록사신(Moxifloxacin) 등이 있다. 상기 산화질소 방출 제제는 산화질소가 아민기와 반응하여 생성된 디아제늄디올레이트(NONOate)기를 가진 물질인 것일 수 있다. 상기 산화질소 방출 제제는 산화질소를 처리한 PEI(Polyethylenimine)일 수 있고, 보다 상세하게는 산화질소를 처리한 bPEI(Branched PEI)일 수 있다. 일 구체예에서, 상기 약물은 목시플록사신일 수 있다.
상기 목시플록사신(Moxifloxacin)의 IUPAC 명칭은 1-cyclopropyl-7-[(1S,6S)-2,8-diazabicyclo [4.3.0]non-8-yl]-6-fluoro-8-methoxy-4-oxo-quinoline-3-carboxylic acid이며, 화학 구조는 하기 화학식 1과 같다. 목시플록사신(Moxifloxacin)은 포도상구균속, 연쇄상구균속 등의 균종에 의한 세균성 결막염, 각막염 등의 치료 또는 안과 수술 전후의 무균화요법에 사용되고 있다.
[화학식 1]
Figure 112019108075780-pat00001
일 구체예에서, 상기 히알루론산과 약물의 함량비는 질량을 기준으로 1:1 내지 300:1, 2:1 내지 300:1, 5:1 내지 300:1, 10:1 내지 300:1, 20:1 내지 300:1, 30:1 내지 300:1, 60:1 내지 300:1, 90:1 내지 300:1, 120:1 내지 300:1, 150:1 내지 300:1, 180:1 내지 300:1, 210:1 내지 300:1, 240:1 내지 300:1, 270:1 내지 300:1, 1:1 내지 150:1, 2:1 내지 150:1, 5:1 내지 150:1, 10:1 내지 150:1, 20:1 내지 150:1, 30:1 내지 150:1, 60:1 내지 150:1, 90:1 내지 150:1, 120:1 내지 150:1, 1:1 내지 60:1, 2:1 내지 60:1, 5:1 내지 60:1, 10:1 내지 60:1, 20:1 내지 60:1, 또는 30:1 내지 60:1일 수 있으며, 바람직하게는 30:1일 수 있다.
일 구체예에서, 상기 히알루론산과 목시플록사신의 함량비는 질량을 기준으로 1:1 내지 300:1, 2:1 내지 300:1, 5:1 내지 300:1, 10:1 내지 300:1, 20:1 내지 300:1, 30:1 내지 300:1, 60:1 내지 300:1, 90:1 내지 300:1, 120:1 내지 300:1, 150:1 내지 300:1, 180:1 내지 300:1, 210:1 내지 300:1, 240:1 내지 300:1, 270:1 내지 300:1, 1:1 내지 150:1, 2:1 내지 150:1, 5:1 내지 150:1, 10:1 내지 150:1, 20:1 내지 150:1, 30:1 내지 150:1, 60:1 내지 150:1, 90:1 내지 150:1, 120:1 내지 150:1, 1:1 내지 60:1, 2:1 내지 60:1, 5:1 내지 60:1, 10:1 내지 60:1, 20:1 내지 60:1, 또는 30:1 내지 60:1일 수 있으며, 바람직하게는 30:1일 수 있다. 30:1의 비율은 약물전달체에 포함된 항생제가 안구 내 전방수에 의해 희석되는 경우 안구의 세균감염을 위해 일반적으로 필요한 항생제의 농도를 고려한 것이며, 증상, 세균감염 위험도 등을 고려하여 비율을 적절히 조절할 수 있다. 본 발명자는 히알루론산 3 중량%에 대해서 목시플록사신을 0.1 내지 3 중량% 함유하여 제조한 약물전달체를 안구 전방 내에 주입한 경우 전방수에 의해 수화되는 환경에서 일주일 이상 분해가 지연될 수 있으며, 부작용을 최소화할 수 있음을 확인하였다.
일 구체예에서, 상기 가교는 에폭사이드 가교제에 의해 가교된 것일 수 있다. 상기 에폭사이드 가교제는 1,4-부탄디올 디글리시딜 에테르 (1,4-butanediol diglycidyl ether, BDDE), 에틸렌 글리콜 디글리시딜 에테르 (ethylene glycol diglycidyl ether, EGDGE), 1,6-헥산디올 디글리시딜 에테르 (1,6-hexanediol diglycidyl ether), 프로필렌 글리콜 디글리시딜 에테르 (propylene glycol diglycidyl ether), 폴리프로필렌글리콜 디글리시딜 에테르 (poly(propylene glycol)diglycidyl ether), 폴리테트라메틸글리콜 디글리시딜 에테르 (poly(tetramethylene glycol)diglycidyl ether), 네오펜틸 글리콜 디글리시딜 에테르 (neopentyl glycol diglycidyl ether), 폴리글리세롤 폴리글리시딜 에테르 (polyglycerol polyglycidyl ether), 디글리세롤 폴리글리시딜 에테르 (diglycerol polyglycidyl ether), 글리세롤 폴리글리시딜 에테르 (glycerol polyglycidyl ether), 트리메틸프로판 폴리글리시딜 에테르 (trimethylpropane polyglycidyl ether), 1,2-(비스(2,3-에폭시프로폭시)에틸렌 (1,2-(bis(2,3-epoxypropoxy)ethylene), 펜타에리스리톨 폴리글리시딜 에테르 (pentaerythritol polyglycidyl ether) 또는 소르비톨 폴리글리시딜 에테르 (sorbitol polyglycidyl ether) 중에서 선택된 1종 이상인 것일 수 있다.
특히, 상기 약물전달체는 BDDE(1,4-Butanediol diglycidyl ether)를 가교제로 사용하여 가교된 것일 수 있다. BDDE를 가교제로 이용하여 히알루론산 복합체를 제조하면 잔존 BDDE의 농도를 위험 수준 이하로 제어가 용이하여 안구 내 삽입시 발생할 수 있는 부작용을 최소화할 수 있다.
일 구체예에서, 상기 안과용 약물전달체는 상기 히알루론산과 에폭사이드 가교제의 함량비를 질량을 기준으로 150:1 내지 600:1, 250:1 내지 600:1, 300:1 내지 600:1, 150:1 내지 500:1, 250:1 내지 500:1, 300:1 내지 500:1, 150:1 내지 400:1, 250:1 내지 400:1, 300:1 내지 400:1, 또는 300:1 비율로 혼합하여 가교시킨 것일 수 있다.
일 구체예에서, 상기 안과용 약물전달체는 히알루론산 및 BDDE를 질량을 기준으로 150:1 내지 600:1, 250:1 내지 600:1, 300:1 내지 600:1, 150:1 내지 500:1, 250:1 내지 500:1, 300:1 내지 500:1, 150:1 내지 400:1, 250:1 내지 400:1, 300:1 내지 400:1, 또는 300:1 비율로 혼합하여 가교시킨 것일 수 있다. BDDE의 함량비를 높이면 히알루론산의 가교결합 정도가 높아지고, 약물전달체의 안구 내 분해가 지연되어 약물 방출 기간을 증가시킬 수 있으나 잔존량이 증가하여 부작용이 증가할 염려가 있는 반면, BDDE의 함량비를 낮추면 충분한 약물 방출 기간을 확보하기 어렵다. 안구에 삽입되는 약물전달체의 적절한 약물 방출기간은 안구 내에서 최소 5일 이상, 바람직하게는 7 일 이상, 그리고 최대 10 일, 최대 11일, 최대 12일, 또는 최대 14일까지 약물이 방출되는 것일 수 있다. 본 발명의 실시예에 따를 때 히알루론산 및 BDDE의 함량을 300:1 질량비로 하면 히알루론산 복합체의 안구 내 분해가 적절히 지연되어 수술 후 항생제 점안이 필요한 기간인 7일 이상 유지될 수 있으며, 최대 10일까지 유지될 수 있고, 독성에 의한 부작용 위험이 낮은 것으로 확인되었다.
일 구체예에서, 상기 약물 전달체가 삽입되는 안구 내 위치는 전방(Anterior Chamber)내 또는 유리체강(Vitreous Body) 내인 것일 수 있다. 상기 전방 및 유리체강은 안구 내 위치를 의미하는 의학적 용어로서, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상기술자에게 의미가 잘 알려져 있으며 도 1을 참고하여 이해할 수 있다. 다. 본 발명자는 일 실시예에 따른 약물전달체를 토끼의 안구 전방 내에 삽입하여 유지 기간을 확인한 결과 약물전달체가 전방 내에서 수술 후 항생제 점안 투여가 필요한 7일 이상 유지될 수 있으며 독성을 나타내지 않음을 확인하였다.
일 구체예에서, 상기 삽입은 안과 수술 후 삽입일 수 있고, 구체적으로는 안구 수술과정에서 절개 후 봉합 전 삽입되는 것일 수 있다. 상기 수술은 수술 후 세균 감염을 방지하기 위한 항생제 투여가 필요한 수술로서 특정 수술로 한정되는 것은 아니다. 일 실시예에 따른 안과용 약물전달체는 수술 과정에서 봉합 전에 안구 내에 삽입됨으로서 점안 투여를 대체할 수 있으므로 수술 후 회복에 유용하게 이용될 수 있다.
일 구체예에서, 상기 안과용 약물 전달체는 히알루론산, BDDE, 및 목시플록사신을 포함하는 용액을 가교결합 반응시켜 제조한 것일 수 있다. 상기 용액의 함량은 히알루론산을 2.5 내지 3.5 중량%, 2.8 내지 3.2 중량%, 3 중량%를 포함할 수 있고, BDDE를 0.005 내지 0.015 중량%, 0.008 내지 0.012 중량%, 또는 0.009 내지 0.011 중량%를 포함할 수 있고, 약물은 0.01 내지 0.15 중량%, 0.03 내지 0.15 중량%, 0.05 내지 0.15 중량%, 0.08 내지 0.15 중량%, 0.01 내지 0.1 중량%, 0.03 내지 0.1 중량%, 0.05 내지 0.1 중량%, 0.08 내지 0.1 중량%, 0.01 내지 0.05 중량%, 또는 0.03 내지 0.05 중량%을 포함할 수 있다. 본 실시예에 따르면 히알루론산 3 중량%, BDDE 0.01 중량%, 약물 0.1중량%를 포함한 용액을 가교결합시켜 제조한 약물전달체는 안구 전방 내에 삽입하면 7일 이상 약물을 방출할 수 있고 부작용을 최소화 할 수 있다.
상기 가교결합은 1차 가교결합 및 1차 가교결합을 실시한 용액을 성형용 몰드에 주입하고 실시하는 2차 가교결합을 포함할 수 있다. 상기 1차 가교결합의 반응 시간은 12 내지 30시간, 15 내지 30시간, 16 내지 30시간, 17 내지 30시간, 18 내지 30시간, 19 내지 30시간, 12 내지 27시간, 15 내지 27시간, 16 내지 27시간, 17 내지 27시간, 18 내지 27시간, 19 내지 27시간, 12 내지 24시간, 15 내지 24시간, 16 내지 24시간, 17 내지 24시간, 18 내지 24시간, 19 내지 24시간, 12 내지 21시간, 15 내지 21시간, 16 내지 21시간, 17 내지 21시간, 18 내지 21시간, 19 내지 21시간 동안 실시하는 것일 수 있고, 바람직하게는 19시간 실시하는 것일 수 있다.
상기 안과용 약물전달체는 건조된 상태로 보관할 수 있으며, 투여 전에 수화시켜 사용할 수 있다.
건조된 안과용 약물전달체의 크기는 길이 및 형태는 다양하게 가공될 수 있고 특별히 제한되는 것은 아니며, 바람직하게는 투여횟수 및 안구 내 지속기간 동안 방출될 목시플록사신의 총 함량을 고려하여 적정한 크기 및 형태로 가공할 수 있다.
상기 안과용 약물전달체의 크기는 지름 또는 장축을 기준으로 0.1 μm 내지 5 mm 일 수 있다.
상기 안과용 약물전달체의 형태는 구형, 원통형, 각형, 필름형, 반구형, 무정형 또는 렌즈형, 나노캐리어, 과립, 세립 형태일 수 있다.
상기 안과용 약물전달체의 투여방법은 안구 내에 투여하기 위한 것이라면 특별히 제한되는 것은 아니며, 예를 들면 건조된 약물전달체를 수화시키고 겸자로 삽입할 수 있고, 필요한 경우에는 주사에 의해 투여될 수 있다.
상기 안과용 약물전달체의 투여시기는 수술 후 봉합 전일 수 있으며 투여횟수는 1회일 수 있다. 1회 투여에 사용되는 약물전달체에 포함된 목시플록사신의 총 함량은 환자의 상태, 체중, 및 회복 기간 등에 따라 달라질 수 있으며, 예를 들면 3 내지 4 mg, 또는 3.5 mg 일 수 있다.
상기 안과용 약물전달체의 1회 투여용량은 건조 중량으로서 2.5 내지 3.0 mg, 2.6 내지 3.0 mg, 2.7 내지 3.0 mg, 2.5 내지 2.9 mg, 2.6 내지 2.9 mg, 2.7 내지 2.9 mg, 2.5 내지 2.8 mg, 2.6 내지 2.8 mg, 2.7 내지 2.8 mg, 2.5 내지 2.7 mg, 또는 2.6 내지 2.7 mg일 수 있다. 본 발명자는 상기 1회 투여용량에 의할 때 수술 후 항생제 투여가 필요한 동안 안구 내에서 약물 전달체가 유지되면서 약물을 방출할 수 있음을 확인하였다. 상기 안과용 약물전달체는 수화시켜 투여될 수 있으며 수화시 질량은 55 내지 90mg, 60 내지 90 mg, 65 내지 90 mg, 55 내지 85 mg, 60 내지 85 mg, 65 내지 85 mg, 55 내지 80 mg, 60 내지 80 mg, 또는 65 내지 80 mg일 수 있다.
또 다른 양상은, 히알루론산, BDDE, 및 목시플록사신을 염기성 수용액에서 혼합하는 단계; 및 상기 혼합한 결과물을 가교결합하는 단계를 포함하는 안과용 약물전달체 제조방법을 제공한다.
상기 히알루론산, BDDE, 및 목시플록사신에 대한 설명 및 혼합 비율은 앞서 기재한 내용과 동일하다.
상기 가교결합하는 단계는 1차 가교결합 단계 및 몰드에 주입하고 성형하는 2차 가교결합 단계를 포함할 수 있다.
상기 제조방법은 약물전달체를 건조시키는 단계를 더 포함할 수 있다.
상기 제조방법은 히알루론산 용액을 제 1 용액으로, BDDE 용액을 제 2 용액으로 준비하고, 각각 멸균시키고 혼합하여 1차 가교결합 단계를 실시할 수 있다.
일 구체예에 따른 안과용 약물전달체는 생체적합성 및 생분해성이 뛰어나므로 안구 내에 삽입시에도 안압 상승 또는 염증반응 등의 부작용을 최소화 할 수 있다.
일 구체예에 따른 약물을 담지한 안과용 약물전달체는 안구 내에서 일주일 이상 분해가 지연되며, 담지된 약물을 수술 후 감염 방지가 필요한 기간 동안 방출할 수 있다.
일 구체예에 따른 약물을 담지한 안과용 약물전달체는 안구 수술 중 삽입되어 안구내에서 약물을 방출함으로서 점안액에 의한 약물 투여를 대체할 수 있다.
일 구체예에 따른 약물을 담지한 안과용 약물전달체는 기존 점안 투여보다 항생제의 사용량을 감소시킬 수 있다.
도 1은 안구의 해부학적 구조를 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명의 실시예에 따라 제조된 건조형태의 HA 복합막을 나타낸 것이다.
도 3은 본 발명의 실시예에 따라 제조된 HA 복합막의 건조상태에서의 두께를 나타낸 것이다.
도 4는 본 발명의 실시예에 따라 제조된 HA 복합막에 식염수를 흡수시켜 팽윤(swelling)시키고, 손등에 위치시켜 형태 유지를 확인한 결과이다.
도 5은 본 발명의 실시예에 따라 제조된 건조상태의 HA 복합막을 다양한 형태로 재단하고 또한 수화시켰을 때 형태 유지를 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 6은 본 발명의 실시예에 따라 제조된 HA 복합막을 PVDF 막 위에서 수화 후 건조시켜 형태 유지력을 최대 3주까지 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 7은 히알루론산 및 BDDE에 목시플록사신을 다양한 비율로 혼합하여 제조한 혼합액을 나타낸 것이다.
도 8는 상기 도 7의 용액으로 제조한 목시플록사신 함유 HA 복합막의 건조상태의 물성을 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 9는 상기 도 8의 목시플록사신 함유 HA 복합막을 수화시키고 일주일 후의 형태를 관찰한 것이다.
도 10은 목시플록사신을 함유한 약물전달체의 MIC 테스트를 실시한 결과를 나타낸 것이다.
도 11은 본 발명의 실시예에 따라 제조한 HA 복합막의 인간 각막상피세포에 대한 세포 독성을 확인한 결과이다.
도 12은 본 발명의 실시예에 따라 제조한 HA 복합막을 실험동물의 안구 내에 삽입하여 생체적합성 및 생분해성을 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 13는 본 발명의 실시예에 따라 제조한 HA 복합막을 상처입은 각막에 삽입하여 생체적합성 및 회복속도 증가를 확인한 결과를 나타낸 것이다.
이하 하나 이상의 구체예를 실시예를 통해 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 하나 이상의 구체예를 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 가교결합된 히알루론산 제조
히알루론산과 BDDE를 pH 8.0 조건에서 물과 혼합하여 용액을 제조하였다. 용액 전체 중량을 기준으로 히알루론산은 3 %, BDDE는 0.01%를 혼합하였다. 제조된 용액 전체의 부피는 30 내지 40 ml였다.
제조한 용액을 상온에서 19시간 이상 로테이터(bio RS-24 mini rotator, biosan)로 360°회전 혼합하여 1 차 가교결합 반응을 진행하였다. 1 차 가교결합 반응한 용액을 성형을 위해 Culture Plate Lid에 담았다. 용액이 담긴 Culture Plate Lid를 쉐이커(CR300 rocker, FINEPCR)로 밤새(overnight) 인큐베이션하여 2 차 가교결합 반응을 진행하였다.
2 차 가교결합 반응이 끝난 평면의 히알루론산 막을 테이블 상에서 3일 이상 건조시켰다. 건조된 히알루론산 막을 펀칭하여 지름이 약 5 mm인 원형의 평면 형태로 절단(trimming)하고 실험에 사용하였다(도 2 참조). 절단한 히알루론산 막은 HA 복합막으로 명명하였다. HA 복합막의 두께는 약 100 내지 125 μm 였다(도 3 참조).
실시예 2: HA 평면복합막의 물성 확인
2-1. 손등 부착을 통한 물성 확인
상기 실시예 1에서 제조한 HA 복합막을 식염수(normal saline)에 15분간 흡수시켜 팽윤시키고(swelling) 손의 등면(dorsal surface)에 부착하였다(도 4 참조). 그 결과, HA 복합막은 수분을 흡수하여 지름이 5 mm에서 약 8 mm 정도로 팽창된 평면 형태가 되었으며, 곡면 부착력이 뛰어난 것을 확인할 수 있었다.
실시예 2-1 결과를 통해 실시예 1의 조성에 의해 제조한 히알루론산 막은 수화되면 생체조직에 부착력이 뛰어나며, 수화 후 재건조시에도 중합 상태 및 형태를 유지할 수 있음을 확인할 수 있었다.
2-2. 다양한 형태를 가진 HA 복합막의 물성 확인
HA 복합막을 원형이 아닌 각진 형태로 절단하여(도 5의 A) 동일한 방법으로 팽윤시킨 결과, 피부에 밀착이 가능하며 수화후에도 형태를 유지함을 확인하였다(도 5의 B).
2-3. PVDF 필름에 위치시켜 물성 확인
HA 복합막의 식염수 흡수 시간을 달리하여 건조시 형태 변화를 관찰하였다. 도 6의 A는 HA 복합막을 PVDF막 위에 위치시켜 식염수를 흡수시킨 후 1시간 동안 건조시킨 결과를 나타낸 것으로, 3주, 2주, 1주, 24h, 5 min은 식염수를 흡수하여 팽윤(swelling)한 시간을 의미한다. 도 6의 B를 참조하면 건조된 HA 복합막은 PVDF 막에 밀착되어 균열이 발생하였다. 이는 PVDF 막에서 건조한 차이 때문인 것으로 생각된다. 그러나 도 6의 A에서 점선으로 표시된 원 부분 및 도 6의 C를 참조하면, 1주일 동안 식염수를 흡수시키고 건조한 경우에도 컨택트 렌즈 형태로 온전히 건조되며, 이에 다시 식염수를 흡수시키면 팽윤되어 평면 형태로 복원됨을 확인하였다(도 6의 D). 따라서 상기 조성에 따라 제조한 HA 복합막은 안구내 환경에서 일주일 이상 형태를 유지할 수 있음을 확인하였다.
실시예 3: 목시플록사신을 담지한 HA 복합막 제조 및 물성 확인
히알루론산과 BDDE를 혼합하는 단계에서 목시플록사신을 0.1, 0.5, 1, 및 3 중량%만큼 더 혼합하는 것을 제외하고 상기 실시예 1과 동일한 방법으로 HA 복합막을 제조하였다. 도 7를 참조하면, 목시프록사신을 혼합한 질량%가 증가함에 따라 혼합액의 노란색이 더 진해지는 것을 확인할 수 있었다.
히알루론산, BDDE, 및 목시플록사신을 포함하는 혼합액을 지름 약 5cm의 패트리디쉬에 담아 평면처리하고 충분히 가교결합 반응을 진행한 다음 4일간 건조시켰다(도 8의 A 참조). 건조된 목시플록사신을 담지한 HA 복합막을 패트리디쉬에서 분리한 결과, 목시플록사신을 최대 3 중량%를 포함하더라도 형태가 유지될 수 있음을 확인할 수 있었다(도 8의 B 참조).
목시플록사신을 함유한 HA 복합막의 안구 내 지속시간을 측정하기 위해 수화시키고 일주일 동안 분해 정도를 관찰하였다. 도 9를 참조하면, 목시플록사신을 3중량% 함유한 HA 복합막은 분해가 조금 더 진행되었으나, 목시플록사신의 함량 차이에 따른 분해 속도는 큰 차이를 나타내지 않는 것으로 평가되었다.
실시예 4: 목시플록사신 포함 HA 복합막의 세균 억제 확인
목시플록사신의 함량을 달리하여 HA 복합막을 제조하고 MIC(Minimum Inhibitory Concentration) 테스트를 수행하여 세균 성장을 억제하는 최소 농도를 측정하였다.
목시플록사신이 0, 0.1, 0.5, 1, 및 3% 포함된 히알루론산 복합막을 녹농균(Psudomonas aeruginosa)이 접종된 배지에 첨가하여 37℃ 진탕 배양(shaking incubation)하였다. 24시간 후, 분광측광계(spectrophotometer)로 600nm파장에서 흡광도 (Optical Density)를 측정 후, CTL값을 100%로 계산하여, 세균의 개수 증감을 %대비로 표시하였다.
도 10의 A 의 색변화 및 B의 흡광도 측정결과를 참조하면, 목시플록사신을 포함하지 않은 경우는 녹농균이 번식하여 색이 변하는 것을 확인할 수 있었으나, 목시플록사신을 0.1 중량% 이상 포함하여 제조한 히알루론산 복합막은 녹농균의 증식을 효과적으로 억제하였음을 알 수 있었다.
실시예 5: HA 복합막의 인간 각막 상피 세포에 대한 독성 실험(CCK test)
인간의 각막상피세포(Primary Human Corneal Epithelial(HCEpi))를 24 well에 4회 계대배양(4 phase)하였다. 배양된 세포수는 약 3×104 cells/well이었다. 세포배양액에 히알루론산 복합체를 첨가하고, 24에서 72시간 동안 세포 배양 이후 세포의 독성 여부를 CCK test로 시행하였다.
도 11은 히알루론산 복합체를 처리하고 세포 생존률을 비교한 CCK data를 나타낸 것이다. 실험 결과에 따르면 히알루론산 복합체를 처리한 군에서 미처리군보다 세포 생존도(cell viability)가 상승하였음을 확인하였다. 따라서 본 발명의 히알루론산 복합체는 안구 내 삽입시 독성 문제가 없으며 오히려 세포 생존에 도움을 준다는 것을 확인하였다.
실시예 6: HA 복합막의 생체적합성, 생분해성, 및 지속기간 확인
상기 실시예 1에서 제조한 HA 복합막을 토끼 안구의 전방(anterior chamber) 내에 겸자 (forceps)를 이용하여 삽입하고 생체적합성 및 생분해성을 시험하였다. 토끼 전방 내에 삽입된 히알루론산 복합체는 건조 중량이 평균 2.7 mg이고, 물 또는 식염수를 평균 200 μL 첨가하여 수화시킨 중량은 65 내지 80 mg이다. 도 12의 A는 결막과 각막(cornea)을 절개하고 HA 복합막의 전방 내에 삽입한 것을 나타낸 것으로서, 삽입한 HA 복합막을 점선으로 표시하였다. 도 12의 B는 각막 및 결막을 봉합(suture)한 것을 나타낸 것이다.
도 12의 C는 각막을 봉합한 후 일주일이 경과한 토끼의 눈을 확인한 결과이다. HA 복합막은 안구 삽입 후 7일이 경과하였을 때 생분해되어 관찰되지 않았으며, 이를 통해 생체내 환경에서 적어도 7일 이상 지속될 수 있음을 확인하였다. 또한 생체적합성 측면에서, HA 복합체를 안구에 삽입한 후 약간의 붓기가 있었으나 이는 수술의 후유증에 의한 것으로 생각되며, 그 외 HA 복합막에 의한 부작용은 관찰되지 않았으므로 생체적합성이 뛰어난 것으로 확인되었다. 이를 기초로 판단하건데, 약물이 담지된 HA 복합막을 동일한 방법으로 사용하면 담지된 약물이 삽입 위치에서 일주일 동안 지속적으로 방출될 수 있고, 특별한 부작용이 없이 사용할 수 있을 것으로 예상된다.
또한 대조군(control) 2 및 실험군 3, 총 5 마리의 토끼를 이용하여 눈에 지름 1cm의 원형으로 각막을 긁어내어 손상시킨 후, 플루오레세인(fluorescein)으로 염색하여 상처 부위의 크기를 시간대 별로 확인하였다. 실험군에는 지름 5 mm로 펀칭하고 수화시킨 HA 복합막을 이용하여 각막 상처를 덮어주었다.
도 13을 참조하면, 각막 손상 후 72시간 경과하였을 때 대조군은 염색 부위가 일부 감소한 반면, 실험군의 염색 부위는 완전히 사라졌으므로 HA 복합막이 손상된 각막의 회복을 촉진시킴을 확인할 수 있었다.

Claims (15)

  1. 히알루론산, 1,4-부탄디올 디글리시딜 에테르 및 목시플록사신을 포함하는 혼합물의 반응 생성물이고,
    상기 혼합물의 함량비는 히알루론산 3 중량%, 1,4-부탄디올 디글리시딜 에테르 0.01 중량%, 및 목시플록사신 0.1 내지 0.5 중량%이고,
    안구 내 삽입하기 위한 용도인,
    안과용 약물전달체.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. 삭제
  6. 삭제
  7. 삭제
  8. 삭제
  9. 삭제
  10. 삭제
  11. 제 1 항에 있어서,
    상기 약물전달체는 안구 내에서 7 일 내지 14 일 동안 목시플록사신을 방출되는 것인,
    안과용 약물전달체.
  12. 제 1 항에 있어서,
    상기 안구는 전방(Anterior Chamber) 또는 유리체(Vitreous Body)인 것인,
    안과용 약물전달체.
  13. 제 1 항에 있어서,
    상기 삽입은 안과 수술 후 삽입인,
    안과용 약물전달체.
  14. 삭제
  15. 제 1 항에 있어서,
    상기 안과용 약물전달체의 1회 투여용량은 건조 중량으로서 2.5 내지 3.0 mg인,
    안과용 약물전달체.
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