WO2020251241A1 - 히알루론산 기반의 안과용 약물전달체 및 이의 제조방법 - Google Patents

히알루론산 기반의 안과용 약물전달체 및 이의 제조방법 Download PDF

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WO2020251241A1
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WO
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delivery system
drug delivery
solution
hyaluronic acid
ophthalmic drug
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PCT/KR2020/007455
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박철용
정미영
박주희
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동국대학교 산학협력단
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Definitions

  • the present invention relates to a hyaluronic acid-based ophthalmic drug delivery system and a method of manufacturing the same.
  • antibacterial agents in the form of eye drops are administered to the eye in order to prevent bacterial infection, and it is important to administer them at a steady and accurate dose for 7 to 14 days immediately after surgery.
  • the total dosage of antibacterial agents has been determined to effectively prevent bacterial infection, and the dosage and frequency of administration should be determined in consideration of the half-life in vivo.
  • Moxifloxacin is an antibacterial agent mainly used in ophthalmic surgery, and is administered by instillation to prevent bacterial infection after surgery such as glaucoma or cataract.
  • the total dose of moxifloxacin per week is about 3.5 mg, and the amount of moxifloxacin in eye drops is about 0.5% by weight, and the half-life of moxifloxacin is about 12.7h at least twice a day. At least 50 ⁇ L is instilled per once.
  • the field of view is limited after surgery, it is difficult to instill on its own, and there are many cases where the correct amount is not administered because the eye drops flow down or the timing of instillation is not observed.
  • the target age for ophthalmic surgery is often elderly, it is often difficult to accurately instill eye drops on their own.
  • Hyaluronic acid is a linear polysaccharide composed of repeating disaccharide units of beta-D-N-acetylglucosamine and beta-D-glucuronic acid.
  • Hyaluronic acid is known to be biocompatible as a component of extracellular tissues found in vivo and biodegradable in vivo.
  • hyaluronic acid is rapidly decomposed in a living body, so it is difficult to use it for sustained-release drug release.
  • a hyaluronic acid-based ophthalmic drug delivery system capable of stably releasing antibiotics by maintaining physical properties for a certain period of time even after a sterilization process, and a manufacturing method thereof.
  • a carrier including crosslinked hyaluronic acid; And it provides an ophthalmic drug delivery system which is used for insertion into the eye, including a drug carried on the carrier.
  • the ophthalmic drug delivery system is not toxic when inserted into the eyeball, and it is slowly decomposed within the eyeball for a certain period of time and constantly releases the supported drug, thereby replacing the administration of eye drops after surgery.
  • the drug may be a steroid, a nitric oxide releasing agent, or an antibacterial agent.
  • the antibacterial agent may be a fluoroquinolon antibiotic.
  • the fluoroquinoline antibiotic has a structure in which fluorine is added to the position of carbon 6 of the quinoline, and exhibits antibacterial activity against both Gram-positive and negative bacteria, and thus has a wide range of antibacterial activity.
  • Types of fluoroquinoline antibiotics include Ciprofloxacin, Ofloxacin, Levofloxacin, and Moxifloxacin.
  • the nitric oxide releasing agent may be a material having a diazenium diolate (NONOate) group produced by reacting nitrogen oxide with an amine group.
  • the nitric oxide-releasing agent may be polyethylenimine (PEI) treated with nitric oxide, and more specifically, branched PEI (bPEI) treated with nitric oxide.
  • the drug may be moxifloxacin.
  • moxifloxacin is 1-cyclopropyl-7-[(1S,6S)-2,8-diazabicyclo [4.3.0]non-8-yl]-6-fluoro-8-methoxy-4 -oxo-quinoline-3-carboxylic acid.
  • Moxifloxacin is used in the treatment of bacterial conjunctivitis and keratitis caused by bacteria such as Staphylococcus aureus and Streptococcus, or aseptic therapy before and after ophthalmic surgery.
  • the content ratio of the hyaluronic acid and the drug is 1:1 to 300:1, 2:1 to 300:1, 5:1 to 300:1, 10:1 to 300:1, 20:1 to 300:1, 30:1 to 300:1, 60:1 to 300:1, 90:1 to 300:1, 120:1 to 300:1, 150:1 to 300:1, 180: 1 to 300:1, 210:1 to 300:1, 240:1 to 300:1, 270:1 to 300:1, 1:1 to 150:1, 2:1 to 150:1, 5:1 to 150:1, 10:1 to 150:1, 20:1 to 150:1, 30:1 to 150:1, 60:1 to 150:1, 90:1 to 150:1, 120:1 to 150: 1, 1:1 to 60:1, 2:1 to 60:1, 5:1 to 60:1, 10:1 to 60:1, 20:1 to 60:1, or 30:1 to 60:1 May be, preferably 30:1.
  • the content ratio of hyaluronic acid and moxifloxacin is 1:1 to 300:1, 2:1 to 300:1, 5:1 to 300:1, 10:1 to 300: 1, 20:1 to 300:1, 30:1 to 300:1, 60:1 to 300:1, 90:1 to 300:1, 120:1 to 300:1, 150:1 to 300:1, 180:1 to 300:1, 210:1 to 300:1, 240:1 to 300:1, 270:1 to 300:1, 1:1 to 150:1, 2:1 to 150:1, 5: 1 to 150:1, 10:1 to 150:1, 20:1 to 150:1, 30:1 to 150:1, 60:1 to 150:1, 90:1 to 150:1, 120:1 to 150:1, 1:1 to 60:1, 2:1 to 60:1, 5:1 to 60:1, 10:1 to 60:1, 20:1 to 60:1, or 30:1 to 60 It may be :1, preferably 30:1.
  • the ratio of 30:1 takes into account the concentration of antibiotics generally required for bacterial infection of the eye when the antibiotic contained in the drug delivery system is diluted by the intraocular water, and the ratio is appropriately taken in consideration of symptoms and risk of bacterial infection. Can be adjusted.
  • a drug delivery system prepared by containing 0.1 to 3% by weight of moxifloxacin to 3% by weight of hyaluronic acid into the front of the eyeball, decomposition may be delayed for more than one week in an environment hydrated by anterior water, and side effects It was confirmed that can be minimized.
  • the crosslinking may be crosslinked by an epoxide crosslinking agent.
  • the epoxide crosslinking agent is 1,4-butanediol diglycidyl ether (BDDE), ethylene glycol diglycidyl ether (EGDGE), 1,6-hexanediol di Glycidyl ether (1,6-hexanediol diglycidyl ether), propylene glycol diglycidyl ether, polypropylene glycol diglycidyl ether, polytetramethyl glycol Diglycidyl ether (poly(tetramethylene glycol) diglycidyl ether), neopentyl glycol diglycidyl ether, polyglycerol polyglycidyl ether, diglycerol polyglycidyl ether (diglycerol polyglycidyl ether), glycerol polyglycidyl ether, trimethylpropane polyglycidyl ether
  • the drug delivery system may be crosslinked using BDDE (1,4-Butanediol diglycidyl ether) as a crosslinking agent.
  • BDDE 1,4-Butanediol diglycidyl ether
  • the concentration of residual BDDE can be easily controlled to be below a dangerous level, thereby minimizing side effects that may occur during intraocular insertion.
  • the ophthalmic drug delivery system is 150:1 to 600:1, 250:1 to 600:1, 300:1 to 600:1, based on the mass of the content ratio of the hyaluronic acid and the epoxide crosslinking agent, 150:1 to 500:1, 250:1 to 500:1, 300:1 to 500:1, 150:1 to 400:1, 250:1 to 400:1, 300:1 to 400:1, or 300 It may be crosslinked by mixing in a :1 ratio.
  • the ophthalmic drug delivery system comprises hyaluronic acid and BDDE from 150:1 to 600:1, 250:1 to 600:1, 300:1 to 600:1, 150:1 to 500: 1, 250:1 to 500:1, 300:1 to 500:1, 150:1 to 400:1, 250:1 to 400:1, 300:1 to 400:1, or 300:1 It may be crosslinked. Increasing the content ratio of BDDE increases the degree of crosslinking of hyaluronic acid and delays the intraocular decomposition of the drug delivery system, which may increase the drug release period.However, there is a concern that side effects may increase due to an increase in the residual amount. If it is lowered, it is difficult to secure a sufficient drug release period.
  • the appropriate drug release period of the drug delivery system inserted into the eye is that the drug is released within the eye for at least 5 days, preferably at least 7 days, and up to 10 days, maximum 11 days, maximum 12 days, or maximum 14 days.
  • I can.
  • the content of hyaluronic acid and BDDE is set to a mass ratio of 300:1
  • the decomposition of the hyaluronic acid complex in the eye is appropriately delayed, so that it can be maintained for 7 days or longer, which is a period that requires instillation of antibiotics after surgery, and up to 10 It can be maintained up to days and has been found to have a low risk of side effects due to toxicity.
  • the intraocular position into which the drug delivery system is inserted may be within an anterior chamber or within a vitreous body.
  • the anterior and vitreous cavity is a medical term that refers to a position in the eyeball, and is well known to those skilled in the art to which the present invention belongs, and can be understood with reference to FIG. 1.
  • the present inventors confirmed the maintenance period by inserting the drug delivery system according to an embodiment into the front of the rabbit's eyeball, and as a result, it was confirmed that the drug delivery system can be maintained for 7 days or longer, which requires administration of antibiotics after surgery, and does not exhibit toxicity. .
  • the insertion may be after ophthalmic surgery, and specifically, may be inserted before suturing after incision in the ocular surgery process.
  • the surgery is a surgery requiring administration of antibiotics to prevent bacterial infection after surgery, and is not limited to a specific surgery.
  • the ophthalmic drug delivery system according to an embodiment can be used for recovery after surgery because it can replace eye drop administration by being inserted into the eyeball before suturing in the surgical process.
  • the ophthalmic drug delivery system may be prepared by crosslinking a solution containing hyaluronic acid, BDDE, and moxifloxacin.
  • the content of the solution may include 2.5 to 3.5% by weight, 2.8 to 3.2% by weight, and 3% by weight of hyaluronic acid, and 0.005 to 0.015% by weight, 0.008 to 0.012% by weight, or 0.009 to 0.011% by weight of BDDE.
  • the drug may contain, and the drug is 0.01 to 0.15% by weight, 0.03 to 0.15% by weight, 0.05 to 0.15% by weight, 0.08 to 0.15% by weight, 0.01 to 0.1% by weight, 0.03 to 0.1% by weight, 0.05 to 0.1% by weight, 0.08 To 0.1% by weight, 0.01 to 0.05% by weight, or 0.03 to 0.05% by weight.
  • the drug delivery system prepared by crosslinking a solution containing 3% by weight of hyaluronic acid, 0.01% by weight of BDDE, and 0.1% by weight of the drug can release the drug for 7 days or longer when inserted into the front of the eye and minimize side effects. I can.
  • the crosslinking may include primary crosslinking and secondary crosslinking performed by injecting a solution subjected to the first crosslinking to a molding mold.
  • the reaction time of the primary crosslinking is 12 to 30 hours, 15 to 30 hours, 16 to 30 hours, 17 to 30 hours, 18 to 30 hours, 19 to 30 hours, 12 to 27 hours, 15 to 27 hours, 16 To 27 hours, 17 to 27 hours, 18 to 27 hours, 19 to 27 hours, 12 to 24 hours, 15 to 24 hours, 16 to 24 hours, 17 to 24 hours, 18 to 24 hours, 19 to 24 hours, 12 To 21 hours, 15 to 21 hours, 16 to 21 hours, 17 to 21 hours, 18 to 21 hours, may be carried out for 19 to 21 hours, preferably 19 hours.
  • the ophthalmic drug delivery system may be stored in a dry state, and may be hydrated before administration.
  • the size of the dried ophthalmic drug delivery system may be variously processed in length and shape, and is not particularly limited, and is preferably an appropriate size in consideration of the total amount of moxifloxacin to be released during the number of administrations and the duration of the eyeball. Can be processed into shape.
  • the size of the ophthalmic drug delivery system may be 0.1 ⁇ m to 5 mm based on a diameter or long axis.
  • the form of the ophthalmic drug delivery system may be a spherical, cylindrical, angular, film-shaped, hemispherical, amorphous or lenticular, nanocarrier, granule, or fine-grained form.
  • the method of administering the ophthalmic drug delivery system is not particularly limited as long as it is intended for intraocular administration, and for example, the dried drug delivery system may be hydrated and inserted with forceps, and, if necessary, may be administered by injection.
  • the timing of administration of the ophthalmic drug delivery system may be after surgery and before suture, and the number of administration may be once.
  • the total content of moxifloxacin included in the drug delivery system used for single administration may vary depending on the patient's condition, weight, and recovery period, and may be, for example, 3 to 4 mg, or 3.5 mg.
  • One dose of the ophthalmic drug delivery system is 2.5 to 3.0 mg, 2.6 to 3.0 mg, 2.7 to 3.0 mg, 2.5 to 2.9 mg, 2.6 to 2.9 mg, 2.7 to 2.9 mg, 2.5 to 2.8 mg, 2.6 as dry weight. To 2.8 mg, 2.7 to 2.8 mg, 2.5 to 2.7 mg, or 2.6 to 2.7 mg. The present inventors have confirmed that the drug can be released while the drug delivery system is maintained in the eyeball while antibiotic administration is required after surgery by the single dose.
  • the ophthalmic drug delivery system may be administered by hydration, and the mass upon hydration is 55 to 90 mg, 60 to 90 mg, 65 to 90 mg, 55 to 85 mg, 60 to 85 mg, 65 to 85 mg, 55 to 80 mg, It may be 60 to 80 mg, or 65 to 80 mg.
  • mixing hyaluronic acid, BDDE, and moxifloxacin in an aqueous basic solution provides a method for producing an ophthalmic drug delivery system comprising the step of crosslinking the mixed product.
  • the crosslinking step may include a first crosslinking step and a second crosslinking step of injecting and molding into a mold.
  • the manufacturing method may further include drying the drug delivery system.
  • a hyaluronic acid solution as a first solution and a BDDE solution as a second solution may be prepared, sterilized and mixed, respectively, to perform a first crosslinking step.
  • preparing a first solution comprising hyaluronic acid and water; Preparing a second solution containing BDDE (1,4-Butanediol diglycidyl ether) and water; Sterilizing the first solution and the second solution, respectively; Preparing a third solution by mixing the sterilized first solution and the second solution; And it provides an ophthalmic drug delivery system manufacturing method comprising the step of polymerizing hyaluronic acid by incubating the third solution.
  • BDDE 1,4-Butanediol diglycidyl ether
  • a hyaluronic acid complex manufacturing process was established that can prevent bacterial growth after hydration by including a sterilization process while maintaining its shape for more than a week after hydration.
  • the ophthalmic drug delivery system may carry a drug, and may replace the administration of eye drops after surgery by releasing the supported drug constantly while being slowly decomposed for a certain period of time in vivo.
  • the drug may be a steroid, a nitric oxide releasing agent, or an antibacterial agent.
  • the antibacterial agent may be a fluoroquinolon antibiotic.
  • the fluoroquinoline antibiotic has a structure in which fluorine is added to the position of carbon 6 of the quinoline, and exhibits antibacterial activity against both Gram-positive and negative bacteria, and thus has a wide range of antibacterial activity. Types of fluoroquinoline antibiotics include Ciprofloxacin, Ofloxacin, Levofloxacin, and Moxifloxacin.
  • the nitric oxide releasing agent may be a material having a diazenium diolate (NONOate) group produced by reacting nitrogen oxide with an amine group.
  • the nitric oxide-releasing agent may be polyethylenimine (PEI) treated with nitric oxide, and more specifically, branched PEI (bPEI) treated with nitric oxide.
  • the first solution contains 4 to 8 wt%, 5 to 8 wt%, 6 to 8 wt%, 4 to 7 wt%, 5 to 7 wt%, or 6 to 7 wt% of the hyaluronic acid It may contain as much, preferably 6% by weight.
  • the second solution contains the BDDE from 0.015 to 0.025% by weight, 0.018 to 0.025% by weight, 0.019 to 0.025% by weight, 0.015 to 0.022% by weight, 0.018 to 0.022% by weight, 0.019 to 0.022% by weight, 0.015 To 0.021% by weight, 0.018 to 0.021% by weight, and 0.019 to 0.021% by weight, and preferably 0.02% by weight.
  • the amount of the second solution is the same as that of the first solution, and when 6% by weight of hyaluronic acid is included in the first solution, 0.02% by weight of BDDE may be contained.
  • the period of maintaining the body shape of the hyaluronic acid complex can be increased and toxicity due to BDDE can be minimized.
  • the period of maintaining the body shape of the hyaluronic acid complex can be maintained as long as the period required for instillation of antibiotics after surgery, and the maintenance period is about 5 to 10 days, 6 to 10 days, 7 days to 10th, 8th to 10th, 5th to 9th, 6th to 9th, 7th to 9th, 8th to 9th, 5th to 8th, 6th to 8th, 7th to 8th , 5 to 7 days, or 6 to 7 days, and preferably may be 7 days.
  • the content ratio of the hyaluronic acid of the first solution and the second solution of BDDE is 400:1, 390:1, 380:1, 370:1, 360:1, 350:1 based on weight , 340:1, 330:1, 320:1, 310:1, 300:1, 290:1, 280:1, 270:1, 260:1 or 250:1, preferably 300:1
  • 300:1 Can be
  • the first solution, the second solution, or the mixed solution may contain moxifloxacin as much as 1/600 to 1/10 of the hyaluronic acid content.
  • the hyaluronic acid content of the third solution is 2.5 to 3.5% by weight, or 2.8 to 3.2% by weight, and the content of BDDE may be 0.008 to 0.012% by weight, or 0.009 to 0.011% by weight, preferably May comprise 3% by weight of hyaluronic acid and 0.01% by weight of BDDE.
  • the step of sterilizing may be sterilization with high pressure steam, autoclave, ethylene oxide (EO) gas, gamma ray, electron beam, or ultraviolet light, and preferably autoclave sterilization.
  • EO ethylene oxide
  • the present inventors found that if hyaluronic acid and BDDE were crosslinked and then sterilized to produce a hyaluronic acid polymer, the time to maintain the form after hydration was too short, making it difficult to use as a drug delivery system. Hyaluronic acid and BDDE were used respectively. It was found that if the primary crosslinking reaction was carried out after sterilization, the time to maintain the shape after hydration was at least 7 days, and it could be maintained as long as the period of administration of antibiotic-containing eye drops after surgery.
  • the polymerization step is 12 to 30 hours, 15 to 30 hours, 16 to 30 hours, 17 to 30 hours, 18 to 30 hours, 19 to 30 hours, 12 to 27 hours, 15 to 27 hours, 16 to 27 hours, 17 to 27 hours, 18 to 27 hours, 19 to 27 hours, 12 to 24 hours, 15 to 24 hours, 16 to 24 hours, 17 to 24 hours, 18 to 24 hours, 19 to 24 hours, 12 to 24 hours, 15 to 24 hours, 16 to 24 hours, 17 to 24 hours, 18 to 24 hours, 19 to 24 hours, It may be carried out for 12 to 21 hours, 15 to 21 hours, 16 to 21 hours, 17 to 21 hours, 18 to 21 hours, 19 to 21 hours, preferably 19 hours.
  • the step of polymerization may include injecting the mixed solution into a molding mold and incubating.
  • the step of preparing the third solution may be performed in a sterile facility, for example, may be performed in a clean bench.
  • the ophthalmic drug delivery system is an antibiotic loaded, and may be used for administration of antibiotics after eye surgery. Since the ophthalmic drug delivery system manufactured by the above manufacturing method can remain in the body for a period approximately equal to the period in which antibiotic instillation is required after surgery, it can be used as a substitute for antibiotic instillation after surgery by being inserted into the eye during the ocular surgery process. have.
  • the ophthalmic drug delivery system according to an embodiment has excellent biocompatibility and biodegradability, even when inserted into the eye, side effects such as an increase in intraocular pressure or an inflammatory reaction can be minimized.
  • the ophthalmic drug delivery system carrying the drug according to an embodiment is delayed in decomposition for one week or more in the eye, and the supported drug can be released for a period of time required to prevent infection after surgery.
  • the ophthalmic drug delivery system carrying a drug may be inserted during eye surgery to release the drug in the eye, thereby replacing drug administration by eye drops.
  • the ophthalmic drug delivery system carrying the drug according to an embodiment may reduce the amount of antibiotics used compared to conventional eye drop administration.
  • FIG 1 shows the anatomical structure of the eyeball.
  • Figure 2 shows a dried HA composite membrane prepared according to an embodiment of the present invention.
  • Figure 3 shows the thickness in a dried state of the HA composite film prepared according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 6 shows the results of confirming the shape retention for up to 3 weeks by drying the HA composite membrane prepared according to the embodiment of the present invention after hydration on the PVDF membrane.
  • FIG. 8 shows the results of confirming the physical properties of the HA composite membrane prepared with the mixture of FIG. 7 in a dry state.
  • FIG. 9 shows the morphology of the HA composite membrane containing moxifloxacin of FIG. 8 being hydrated and a week later.
  • Figure 10 shows the results of the MIC test of the drug delivery system containing moxifloxacin.
  • FIG. 11 is a result of confirming the cytotoxicity of the HA composite membrane prepared according to an embodiment of the present invention to human corneal epithelial cells.
  • FIG. 13 shows the results of confirming the increase in biocompatibility and recovery rate by inserting the HA composite membrane prepared according to an embodiment of the present invention into the wounded cornea of an experimental animal.
  • A is an HA composite membrane prepared by sterilization after the first crosslinking
  • B is an HA composite membrane prepared by sterilizing a hyaluronic acid solution and BDDE, respectively, and first crosslinking.
  • A is an HA composite membrane prepared without sterilization
  • B is an autoclave sterilized HA composite membrane after the first crosslinking reaction
  • C is It is an HA composite membrane prepared by sterilizing hyaluronic acid solution and BDDE solution, respectively, and primary crosslinking.
  • the scale bar in the photo is 500 ⁇ m.
  • a solution was prepared by mixing hyaluronic acid and BDDE with water at pH 8.0. Based on the total weight of the solution, 3% of hyaluronic acid and 0.01% of BDDE were mixed. The total volume of the prepared solution was 30 to 40 ml.
  • the prepared solution was rotated 360° with a rotator (bio RS-24 mini rotator, biosan) at room temperature for 19 hours or longer to perform the first crosslinking reaction.
  • the solution subjected to the first crosslinking reaction was placed in a Culture Plate Lid for molding.
  • the Culture Plate Lid containing the solution was incubated overnight with a shaker (CR300 rocker, FINEPCR) to perform a secondary crosslinking reaction.
  • the planar hyaluronic acid membrane after the secondary crosslinking reaction was completed was dried on a table for at least 3 days.
  • the dried hyaluronic acid membrane was punched, trimmed into a circular plane shape having a diameter of about 5 mm, and used in the experiment (see FIG. 2).
  • the cut hyaluronic acid membrane was named HA composite membrane.
  • the thickness of the HA composite film was about 100 to 125 ⁇ m (see FIG. 3).
  • the HA composite membrane prepared in Example 1 was absorbed in normal saline for 15 minutes to swell and adhered to the dorsal surface of the hand (see FIG. 4). As a result, it was confirmed that the HA composite membrane absorbed moisture and expanded into a flat shape with a diameter of about 5 mm to about 8 mm, and excellent adhesion to the curved surface.
  • Example 2-1 From the results of Example 2-1, it was confirmed that the hyaluronic acid membrane prepared by the composition of Example 1, when hydrated, has excellent adhesion to living tissues, and can maintain a polymerization state and shape even when re-dried after hydration.
  • Example 3 Preparation of an HA composite membrane carrying moxifloxacin and confirmation of physical properties
  • an HA composite membrane was prepared in the same manner as in Example 1, except that moxifloxacin was further mixed. Referring to FIG. 7, it was confirmed that the yellow color of the mixed solution became darker as the mass% of the mixture of moxiproxacin increased.
  • a mixed solution containing hyaluronic acid, BDDE, and moxifloxacin was put in a patri dish having a diameter of about 5 cm, subjected to a planar treatment, sufficiently crosslinked, and dried for 4 days (see FIG. 8A).
  • BDDE hyaluronic acid
  • moxifloxacin was put in a patri dish having a diameter of about 5 cm, subjected to a planar treatment, sufficiently crosslinked, and dried for 4 days (see FIG. 8A).
  • the HA composite membrane containing moxifloxacin In order to measure the intraocular duration of the HA composite membrane containing moxifloxacin, it was hydrated and the degree of degradation was observed for a week. Referring to FIG. 9, the HA composite membrane containing 3% by weight of moxifloxacin undergoes a little more decomposition, but it was evaluated that the decomposition rate according to the difference in the content of moxifloxacin did not show a significant difference.
  • An HA composite membrane was prepared by varying the amount of moxifloxacin, and a minimum inhibitory concentration (MIC) test was performed to measure the minimum concentration for inhibiting bacterial growth.
  • MIC minimum inhibitory concentration
  • a hyaluronic acid composite membrane containing 0, 0.1, 0.5, 1, and 3% of moxifloxacin was added to the culture medium inoculated with Pseudomonas aeruginosa , followed by shaking incubation at 37°C. After 24 hours, after measuring the optical density at a wavelength of 600 nm with a spectrophotometer, the CTL value was calculated as 100%, and the increase or decrease in the number of bacteria was expressed as a percentage.
  • Example 6 Toxicity test of HA composite membrane to human corneal epithelial cells (CCK test)
  • Human corneal epithelial cells (Primary Human Corneal Epithelial (HCEpi)) were subcultured 4 times in 24 wells (4 phase). The number of cultured cells was about 3 ⁇ 10 4 cells/well. The hyaluronic acid complex was added to the cell culture solution, and after cell culture for 24 to 72 hours, the toxicity of cells was tested by CCK test.
  • HCEpi Primary Human Corneal Epithelial
  • FIG. 11 shows CCK data comparing the cell viability after treatment with the hyaluronic acid complex. According to the experimental results, it was confirmed that the cell viability was increased in the group treated with the hyaluronic acid complex than in the untreated group. Therefore, it was confirmed that the hyaluronic acid complex of the present invention does not have a toxicity problem when inserted into the eye, but rather aids in cell survival.
  • Example 7 Confirmation of biocompatibility, biodegradability, and duration of HA composite membrane
  • the HA composite membrane prepared in Example 1 was inserted into the anterior chamber of a rabbit eye, and biocompatibility and biodegradability were tested.
  • the hyaluronic acid complex inserted in the front of the rabbit has an average dry weight of 2.7 mg, and the weight obtained by adding an average of 200 ⁇ L of water or saline to hydrate is 65 to 80 mg.
  • 12A shows that the conjunctiva and the cornea were incised and inserted into the front of the HA composite membrane, and the inserted HA composite membrane was indicated by a dotted line.
  • 12B shows the cornea and the conjunctiva being sutured.
  • the HA composite membrane was not biodegraded 7 days after eye insertion, and was not observed, and it was confirmed that it can last for at least 7 days or more in an in vivo environment.
  • biocompatibility there was some swelling after inserting the HA complex into the eyeball, but this is thought to be due to the sequelae of the operation, and no other side effects caused by the HA complex membrane were observed, so it was confirmed that the biocompatibility was excellent. Based on this, it is expected that if the HA composite membrane loaded with the drug is used in the same way, the supported drug can be continuously released for a week at the insertion site, and can be used without any special side effects.
  • a total of 5 rabbits were used to scratch the cornea in a circular shape with a diameter of 1 cm on the eye, and then stained with fluorescein to check the size of the wound area by time. I did.
  • the corneal wound was covered with a punched and hydrated HA composite membrane with a diameter of 5 mm.
  • Example 8 Establishment of sterilization process for manufacturing HA composite membrane
  • Example 2 In the same manner as in Example 1, the first crosslinking reaction using a rotator was performed in the same manner, and then autoclave sterilization was performed at 121°C for 20 minutes.
  • the sterilized primary crosslinking reaction solution was placed on a Culture Plate Lid for molding.
  • the Culture Plate Lid containing the solution was incubated overnight with a shaker (CR300 rocker, FINEPCR) to perform a secondary crosslinking reaction. All processes after sterilization were performed on a clean bench.
  • the flat HA composite film was dried on the table for at least 3 days. It was confirmed that when the dried HA composite membrane was hydrated, it was decomposed within a few minutes, and the shape could not be maintained (see FIG. 14).
  • the sterilization process is changed to EO gas sterilization (55°C, 1 to 2 hours), gamma sterilization (25 kgy and 40 kgy, respectively), and electron beam sterilization (25 kgy and 40 kgy, respectively), which are lower than the autoclave. Except for that, an HA composite membrane was prepared by the same procedure. However, it was confirmed that the HA composite membrane, which had been sterilized by the above various methods, was also decomposed within a few minutes when hydrated, and thus could not maintain its shape. Even when the HA composite membrane produced by changing the sterilization process to the UV sterilization process was also hydrated, it was confirmed that the shape disappeared within 44 to 51 hours after hydration (see FIG. 15A).
  • Hyaluronic acid solution and crosslinking agent solution are each sterilized
  • Example 9 Scanning electron microscope analysis results of the production of the HA composite membrane prepared in 8-2
  • A is an HA composite film prepared without a sterilization process by the method of Example 1
  • B is an HA composite film sterilized by an autoclave after the first crosslinking reaction by the method of Example 6-1
  • C shows the HA composite film prepared by sterilizing the hyaluronic acid solution and the BDDE solution by the method of Example 6-2 and performing the first crosslinking reaction with a SEM (Scanning Electron Microscope) electron microscope.
  • the electron microscope photographing conditions are SED 15.0kV, WD 9.7mm, and the bar represents 500 ⁇ m length.
  • cross-linking pores differ from A, B, and C of FIG. 16.
  • a and C were similar in shape and size of the pores, but in B, a number of relatively larger pores were observed, and it was confirmed that crosslinking was not properly achieved due to the poor spacing of the pores.
  • Fig. 17 shows the results of measuring the average pore diameter.
  • CTL is a result corresponding to A of Fig. 16
  • autoclaved is B of Fig. 16
  • separately autoclaved is C of Fig. 16.
  • a of FIG. 16 was an average of 154.62 ⁇ m (CTL of FIG. 17)
  • B of FIG. 16 was an average of 251.47 ⁇ m (autoclaved of FIG. 17)
  • C of FIG. 16 was an average of 144.13 ⁇ m (separately autoclaved of FIG. 17).
  • the pore size increased significantly, and it was confirmed that the high temperature and high pressure sterilization process damaged the crosslinking in the hyaluronic acid composite manufacturing process.
  • the hyaluronic acid solution and the BDDE solution were each sterilized and subjected to a primary crosslinking reaction, it was confirmed that the crosslinking of hyaluronic acid was not damaged as chemical crosslinking by BDDE proceeded after the sterilization process.
  • hyaluronic acid complexes prepared without conventional sterilization often had a problem in that bacteria propagate, but in the case of sterilization and primary crosslinking reactions, respectively, when hydrated as described above, the growth of bacteria did not occur while maintaining the shape for more than a week. .
  • the HA complex prepared by performing the first crosslinking reaction after sterilizing the hyaluronic acid solution and the crosslinking agent solution, respectively can maintain its shape for a longer time in the intraocular environment, so it is advantageous to manufacture a drug delivery system capable of sustained drug release. Confirmed.

Abstract

가교결합된 히알루론산을 포함하는 담지체; 및 상기 담지체에 담지된 약물을 포함하고, 안구 내 삽입하기 위한 용도인 안과용 약물전달체, 및 히알루론산 및 물을 포함하는 제 1 용액을 제조하는 단계, BDDE(1,4-Butanediol diglycidyl ether) 및 물을 포함하는 제 2 용액을 제조하는 단계, 상기 제 1 용액 및 상기 제 2 용액을 각각 멸균하는 단계, 상기 멸균한 제 1 용액 및 제 2 용액을 혼합하여 제 3 용액을 제조하는 단계, 및 상기 제 3 용액을 인큐베이팅하여 히알루론산을 중합하는 단계를 포함하는 안과용 약물전달체 제조방법이 개시된다.

Description

히알루론산 기반의 안과용 약물전달체 및 이의 제조방법
본 발명은 히알루론산 기반의 안과용 약물전달체 및 이의 제조방법에 관한 것이다.
고령화에 따라 녹내장 또는 백내장 환자가 증가하고 있으며, 이에 대한 안구 수술도 증가하고 있다. 안구 수술 후에는 세균 감염을 방지하기 위해 점안제 형태의 항세균제를 안구에 투여하는데, 수술 직후 7일 내지 14일간 꾸준하고 정확한 용량으로 투여하는 것이 중요하다. 항세균제는 세균 감염을 효율적으로 방지하기 위한 총 투여량이 정해져 있으며, 생체내 반감기를 고려하여 투여량과 투여 횟수가 결정되어야 한다.
목시플록사신(Moxifloxacin, MXF)은 안과 수술에서 주로 사용되는 항세균제로서, 녹내장 또는 백내장과 같은 수술 후에 세균감염을 방지하기 위해 점안하는 방식으로 투여되고 있다. 목시플록사신의 일주일 기준 총 투여량은 약 3.5 mg이고, 점안액에 함유된 목시플록사신은 약 0.5 중량%인 점, 목시플록사신의 체내 반감기가 약 12.7h인 점을 고려하여 하루에 최소 두 회 이상 1회당 약 50 μL를 점안하도록 하고 있다. 그러나 수술 후에는 시야가 제한되므로 스스로 점안하기 어렵고, 점안액이 흘러내리거나 점안시기를 지키지 않아 정확한 양이 투여되지 않는 경우가 많다. 또한 안과 수술을 받는 대상 연령이 고령인 경우가 많아 스스로 정확한 안약 점안이 어려운 경우도 많다.
히알루론산(HA)은 베타-D-N-아세틸글루코사민과 베타-D-글루쿠론산이 반복된 이당류 단위로 구성되는 선형 다당류이다. 히알루론산은 생체 내에서 발견되는 세포외 조직의 성분으로서 생체적합적이며, 생체 내에서 생분해되는 것으로 알려져 있다. 하지만 히알루론산은 생체 내에서 신속히 분해되므로 서방성 약물 방출을 위한 용도로 이용하는 것은 어렵다.
목시플록사신을 점안하는 불편함을 해결하기 위해 목시플록사신이 담지된 약물전달체가 연구되고 있으며, 키토산 및 덱스트란을 이용한 약물담지체가 연구되고 있으나(Kaskoos, R.A. Investigation of moxifloxacin loaded chitosan-dextran nanoparticles for topical instillation into eye: In-vitro and ex-vivo evaluation. Int. J. Pharm. Investig. 2014, 4, 164-173), 히알루론산을 주성분으로 하는 안과용 약물전달체는 알려진 바가 없다.
또한 안구 삽입용 히알루론산 기반 약물전달체 제조에 있어서 멸균 공정이 필요하나, 멸균 공정을 거치면 히알루론산의 중합이 유지되는 시간이 급격히 단축되어 이에 담지된 약물을 일정기간 동안 지속적으로 방출시키기 어려운 문제가 있었다.
일 구체예에 따르면 멸균 공정을 거친 후에도 일정 기간 동안 물성이 유지되어 안정적으로 항생제를 방출할 수 있는 히알루론산 기반의 안과용 약물전달체 및 이의 제조방법을 제공한다.
일 양상은, 가교결합된 히알루론산을 포함하는 담지체; 및 상기 담지체에 담지된 약물을 포함하고, 안구 내 삽입하기 위한 용도인 안과용 약물전달체를 제공한다.
상기 안과용 약물전달체는 안구에 삽입시 독성이 없으며, 안구 내에서 일정기간 동안 서서히 분해되면서 담지된 약물을 일정하게 방출함으로서 수술 후 점안액 투여를 대체할 수 있다.
상기 약물은 스테로이드, 산화질소 방출 제제, 또는 항세균제일 수 있다. 상기 항세균제는 플루오로퀴놀린계(Fluoroquinolon) 항생제일 수 있다. 상기 플루오로퀴놀린계 항생제는 퀴놀린의 6번 탄소 위치에 불소를 첨가한 구조를 가지고 있으며 그람 양성 및 음성 세균 모두에 항균력을 발휘함으로서 항균력의 범위가 넓은 특징이 있다. 플루오로퀴놀린계 항생제의 종류로는 시프로플록사신(Ciprofloxacin), 오플록사신(Ofloxacin), 레보플록사신(Levofloxacin), 목시플록사신(Moxifloxacin) 등이 있다. 상기 산화질소 방출 제제는 산화질소가 아민기와 반응하여 생성된 디아제늄디올레이트(NONOate)기를 가진 물질인 것일 수 있다. 상기 산화질소 방출 제제는 산화질소를 처리한 PEI(Polyethylenimine)일 수 있고, 보다 상세하게는 산화질소를 처리한 bPEI(Branched PEI)일 수 있다. 일 구체예에서, 상기 약물은 목시플록사신일 수 있다.
상기 목시플록사신(Moxifloxacin)의 IUPAC 명칭은 1-cyclopropyl-7-[(1S,6S)-2,8-diazabicyclo [4.3.0]non-8-yl]-6-fluoro-8-methoxy-4-oxo-quinoline-3-carboxylic acid이다. 목시플록사신(Moxifloxacin)은 포도상구균속, 연쇄상구균속 등의 균종에 의한 세균성 결막염, 각막염 등의 치료 또는 안과 수술 전후의 무균화요법에 사용되고 있다.
일 구체예에서, 상기 히알루론산과 약물의 함량비는 질량을 기준으로 1:1 내지 300:1, 2:1 내지 300:1, 5:1 내지 300:1, 10:1 내지 300:1, 20:1 내지 300:1, 30:1 내지 300:1, 60:1 내지 300:1, 90:1 내지 300:1, 120:1 내지 300:1, 150:1 내지 300:1, 180:1 내지 300:1, 210:1 내지 300:1, 240:1 내지 300:1, 270:1 내지 300:1, 1:1 내지 150:1, 2:1 내지 150:1, 5:1 내지 150:1, 10:1 내지 150:1, 20:1 내지 150:1, 30:1 내지 150:1, 60:1 내지 150:1, 90:1 내지 150:1, 120:1 내지 150:1, 1:1 내지 60:1, 2:1 내지 60:1, 5:1 내지 60:1, 10:1 내지 60:1, 20:1 내지 60:1, 또는 30:1 내지 60:1일 수 있으며, 바람직하게는 30:1일 수 있다.
일 구체예에서, 상기 히알루론산과 목시플록사신의 함량비는 질량을 기준으로 1:1 내지 300:1, 2:1 내지 300:1, 5:1 내지 300:1, 10:1 내지 300:1, 20:1 내지 300:1, 30:1 내지 300:1, 60:1 내지 300:1, 90:1 내지 300:1, 120:1 내지 300:1, 150:1 내지 300:1, 180:1 내지 300:1, 210:1 내지 300:1, 240:1 내지 300:1, 270:1 내지 300:1, 1:1 내지 150:1, 2:1 내지 150:1, 5:1 내지 150:1, 10:1 내지 150:1, 20:1 내지 150:1, 30:1 내지 150:1, 60:1 내지 150:1, 90:1 내지 150:1, 120:1 내지 150:1, 1:1 내지 60:1, 2:1 내지 60:1, 5:1 내지 60:1, 10:1 내지 60:1, 20:1 내지 60:1, 또는 30:1 내지 60:1일 수 있으며, 바람직하게는 30:1일 수 있다. 30:1의 비율은 약물전달체에 포함된 항생제가 안구 내 전방수에 의해 희석되는 경우 안구의 세균감염을 위해 일반적으로 필요한 항생제의 농도를 고려한 것이며, 증상, 세균감염 위험도 등을 고려하여 비율을 적절히 조절할 수 있다. 본 발명자는 히알루론산 3 중량%에 대해서 목시플록사신을 0.1 내지 3 중량% 함유하여 제조한 약물전달체를 안구 전방 내에 주입한 경우 전방수에 의해 수화되는 환경에서 일주일 이상 분해가 지연될 수 있으며, 부작용을 최소화할 수 있음을 확인하였다.
일 구체예에서, 상기 가교는 에폭사이드 가교제에 의해 가교된 것일 수 있다. 상기 에폭사이드 가교제는 1,4-부탄디올 디글리시딜 에테르 (1,4-butanediol diglycidyl ether, BDDE), 에틸렌 글리콜 디글리시딜 에테르 (ethylene glycol diglycidyl ether, EGDGE), 1,6-헥산디올 디글리시딜 에테르 (1,6-hexanediol diglycidyl ether), 프로필렌 글리콜 디글리시딜 에테르 (propylene glycol diglycidyl ether), 폴리프로필렌글리콜 디글리시딜 에테르 (poly(propylene glycol)diglycidyl ether), 폴리테트라메틸글리콜 디글리시딜 에테르 (poly(tetramethylene glycol)diglycidyl ether), 네오펜틸 글리콜 디글리시딜 에테르 (neopentyl glycol diglycidyl ether), 폴리글리세롤 폴리글리시딜 에테르 (polyglycerol polyglycidyl ether), 디글리세롤 폴리글리시딜 에테르 (diglycerol polyglycidyl ether), 글리세롤 폴리글리시딜 에테르 (glycerol polyglycidyl ether), 트리메틸프로판 폴리글리시딜 에테르 (trimethylpropane polyglycidyl ether), 1,2-(비스(2,3-에폭시프로폭시)에틸렌 (1,2-(bis(2,3-epoxypropoxy)ethylene), 펜타에리스리톨 폴리글리시딜 에테르 (pentaerythritol polyglycidyl ether) 또는 소르비톨 폴리글리시딜 에테르 (sorbitol polyglycidyl ether) 중에서 선택된 1종 이상인 것일 수 있다.
특히, 상기 약물전달체는 BDDE(1,4-Butanediol diglycidyl ether)를 가교제로 사용하여 가교된 것일 수 있다. BDDE를 가교제로 이용하여 히알루론산 복합체를 제조하면 잔존 BDDE의 농도를 위험 수준 이하로 제어가 용이하여 안구 내 삽입시 발생할 수 있는 부작용을 최소화할 수 있다.
일 구체예에서, 상기 안과용 약물전달체는 상기 히알루론산과 에폭사이드 가교제의 함량비를 질량을 기준으로 150:1 내지 600:1, 250:1 내지 600:1, 300:1 내지 600:1, 150:1 내지 500:1, 250:1 내지 500:1, 300:1 내지 500:1, 150:1 내지 400:1, 250:1 내지 400:1, 300:1 내지 400:1, 또는 300:1 비율로 혼합하여 가교시킨 것일 수 있다.
일 구체예에서, 상기 안과용 약물전달체는 히알루론산 및 BDDE를 질량을 기준으로 150:1 내지 600:1, 250:1 내지 600:1, 300:1 내지 600:1, 150:1 내지 500:1, 250:1 내지 500:1, 300:1 내지 500:1, 150:1 내지 400:1, 250:1 내지 400:1, 300:1 내지 400:1, 또는 300:1 비율로 혼합하여 가교시킨 것일 수 있다. BDDE의 함량비를 높이면 히알루론산의 가교결합 정도가 높아지고, 약물전달체의 안구 내 분해가 지연되어 약물 방출 기간을 증가시킬 수 있으나 잔존량이 증가하여 부작용이 증가할 염려가 있는 반면, BDDE의 함량비를 낮추면 충분한 약물 방출 기간을 확보하기 어렵다. 안구에 삽입되는 약물전달체의 적절한 약물 방출기간은 안구 내에서 최소 5일 이상, 바람직하게는 7 일 이상, 그리고 최대 10 일, 최대 11일, 최대 12일, 또는 최대 14일까지 약물이 방출되는 것일 수 있다. 본 발명의 실시예에 따를 때 히알루론산 및 BDDE의 함량을 300:1 질량비로 하면 히알루론산 복합체의 안구 내 분해가 적절히 지연되어 수술 후 항생제 점안이 필요한 기간인 7일 이상 유지될 수 있으며, 최대 10일까지 유지될 수 있고, 독성에 의한 부작용 위험이 낮은 것으로 확인되었다.
일 구체예에서, 상기 약물 전달체가 삽입되는 안구 내 위치는 전방(Anterior Chamber)내 또는 유리체강(Vitreous Body) 내인 것일 수 있다. 상기 전방 및 유리체강은 안구 내 위치를 의미하는 의학적 용어로서, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상기술자에게 의미가 잘 알려져 있으며 도 1을 참고하여 이해할 수 있다. 본 발명자는 일 실시예에 따른 약물전달체를 토끼의 안구 전방 내에 삽입하여 유지 기간을 확인한 결과 약물전달체가 전방 내에서 수술 후 항생제 점안 투여가 필요한 7일 이상 유지될 수 있으며 독성을 나타내지 않음을 확인하였다.
일 구체예에서, 상기 삽입은 안과 수술 후 삽입일 수 있고, 구체적으로는 안구 수술과정에서 절개 후 봉합 전 삽입되는 것일 수 있다. 상기 수술은 수술 후 세균 감염을 방지하기 위한 항생제 투여가 필요한 수술로서 특정 수술로 한정되는 것은 아니다. 일 실시예에 따른 안과용 약물전달체는 수술 과정에서 봉합 전에 안구 내에 삽입됨으로서 점안 투여를 대체할 수 있으므로 수술 후 회복에 유용하게 이용될 수 있다.
일 구체예에서, 상기 안과용 약물 전달체는 히알루론산, BDDE, 및 목시플록사신을 포함하는 용액을 가교결합 반응시켜 제조한 것일 수 있다. 상기 용액의 함량은 히알루론산을 2.5 내지 3.5 중량%, 2.8 내지 3.2 중량%, 3 중량%를 포함할 수 있고, BDDE를 0.005 내지 0.015 중량%, 0.008 내지 0.012 중량%, 또는 0.009 내지 0.011 중량%를 포함할 수 있고, 약물은 0.01 내지 0.15 중량%, 0.03 내지 0.15 중량%, 0.05 내지 0.15 중량%, 0.08 내지 0.15 중량%, 0.01 내지 0.1 중량%, 0.03 내지 0.1 중량%, 0.05 내지 0.1 중량%, 0.08 내지 0.1 중량%, 0.01 내지 0.05 중량%, 또는 0.03 내지 0.05 중량%을 포함할 수 있다. 본 실시예에 따르면 히알루론산 3 중량%, BDDE 0.01 중량%, 약물 0.1중량%를 포함한 용액을 가교결합시켜 제조한 약물전달체는 안구 전방 내에 삽입하면 7일 이상 약물을 방출할 수 있고 부작용을 최소화 할 수 있다.
상기 가교결합은 1차 가교결합 및 1차 가교결합을 실시한 용액을 성형용 몰드에 주입하고 실시하는 2차 가교결합을 포함할 수 있다. 상기 1차 가교결합의 반응 시간은 12 내지 30시간, 15 내지 30시간, 16 내지 30시간, 17 내지 30시간, 18 내지 30시간, 19 내지 30시간, 12 내지 27시간, 15 내지 27시간, 16 내지 27시간, 17 내지 27시간, 18 내지 27시간, 19 내지 27시간, 12 내지 24시간, 15 내지 24시간, 16 내지 24시간, 17 내지 24시간, 18 내지 24시간, 19 내지 24시간, 12 내지 21시간, 15 내지 21시간, 16 내지 21시간, 17 내지 21시간, 18 내지 21시간, 19 내지 21시간 동안 실시하는 것일 수 있고, 바람직하게는 19시간 실시하는 것일 수 있다.
상기 안과용 약물전달체는 건조된 상태로 보관할 수 있으며, 투여 전에 수화시켜 사용할 수 있다.
건조된 안과용 약물전달체의 크기는 길이 및 형태는 다양하게 가공될 수 있고 특별히 제한되는 것은 아니며, 바람직하게는 투여횟수 및 안구 내 지속기간 동안 방출될 목시플록사신의 총 함량을 고려하여 적정한 크기 및 형태로 가공할 수 있다.
상기 안과용 약물전달체의 크기는 지름 또는 장축을 기준으로 0.1 μm 내지 5 mm 일 수 있다.
상기 안과용 약물전달체의 형태는 구형, 원통형, 각형, 필름형, 반구형, 무정형 또는 렌즈형, 나노캐리어, 과립, 세립 형태일 수 있다.
상기 안과용 약물전달체의 투여방법은 안구 내에 투여하기 위한 것이라면 특별히 제한되는 것은 아니며, 예를 들면 건조된 약물전달체를 수화시키고 겸자로 삽입할 수 있고, 필요한 경우에는 주사에 의해 투여될 수 있다.
상기 안과용 약물전달체의 투여시기는 수술 후 봉합 전일 수 있으며 투여횟수는 1회일 수 있다. 1회 투여에 사용되는 약물전달체에 포함된 목시플록사신의 총 함량은 환자의 상태, 체중, 및 회복 기간 등에 따라 달라질 수 있으며, 예를 들면 3 내지 4 mg, 또는 3.5 mg 일 수 있다.
상기 안과용 약물전달체의 1회 투여용량은 건조 중량으로서 2.5 내지 3.0 mg, 2.6 내지 3.0 mg, 2.7 내지 3.0 mg, 2.5 내지 2.9 mg, 2.6 내지 2.9 mg, 2.7 내지 2.9 mg, 2.5 내지 2.8 mg, 2.6 내지 2.8 mg, 2.7 내지 2.8 mg, 2.5 내지 2.7 mg, 또는 2.6 내지 2.7 mg일 수 있다. 본 발명자는 상기 1회 투여용량에 의할 때 수술 후 항생제 투여가 필요한 동안 안구 내에서 약물 전달체가 유지되면서 약물을 방출할 수 있음을 확인하였다. 상기 안과용 약물전달체는 수화시켜 투여될 수 있으며 수화시 질량은 55 내지 90mg, 60 내지 90 mg, 65 내지 90 mg, 55 내지 85 mg, 60 내지 85 mg, 65 내지 85 mg, 55 내지 80 mg, 60 내지 80 mg, 또는 65 내지 80 mg일 수 있다.
또 다른 양상은, 히알루론산, BDDE, 및 목시플록사신을 염기성 수용액에서 혼합하는 단계; 및 상기 혼합한 결과물을 가교결합하는 단계를 포함하는 안과용 약물전달체 제조방법을 제공한다.
상기 히알루론산, BDDE, 및 목시플록사신에 대한 설명 및 혼합 비율은 앞서 기재한 내용과 동일하다.
상기 가교결합하는 단계는 1차 가교결합 단계 및 몰드에 주입하고 성형하는 2차 가교결합 단계를 포함할 수 있다.
상기 제조방법은 약물전달체를 건조시키는 단계를 더 포함할 수 있다.
상기 제조방법은 히알루론산 용액을 제 1 용액으로, BDDE 용액을 제 2 용액으로 준비하고, 각각 멸균시키고 혼합하여 1차 가교결합 단계를 실시할 수 있다.
또 다른 양상은, 히알루론산 및 물을 포함하는 제 1 용액을 제조하는 단계; BDDE(1,4-Butanediol diglycidyl ether) 및 물을 포함하는 제 2 용액을 제조하는 단계; 상기 제 1 용액 및 상기 제 2 용액을 각각 멸균하는 단계; 상기 멸균한 제 1 용액 및 제 2 용액을 혼합하여 제 3 용액을 제조하는 단계; 및 상기 제 3 용액을 인큐베이팅하여 히알루론산을 중합하는 단계를 포함하는 안과용 약물전달체 제조방법을 제공한다.
본 발명자는 히알루론산 및 BDDE으로 약물전달체를 제조하는 과정에서, 별도의 멸균 공정을 거치지 않고 제조된 약물전달체는 수화 후 세균이 번식할 수 있음을 확인하고 이를 개선하기 위해 예의 연구를 거듭한 결과, 히알루론산의 높은 가교결합도를 달성함으로서 수화 후에도 일주일 이상 형태를 유지함과 동시에, 멸균 공정을 포함함으로써 수화 후 세균 번식을 방지할 수 있는 히알루론산 복합체 제조 공정을 확립하였다.
상기 안과용 약물전달체는 약물을 담지할 수 있고, 생체 내에서 일정기간 동안 서서히 분해되면서 담지된 약물을 일정하게 방출함으로서 수술 후 점안액 투여를 대체할 수 있다.
상기 약물은 스테로이드, 산화질소 방출 제제, 또는 항세균제일 수 있다. 상기 항세균제는 플루오로퀴놀린계(Fluoroquinolon) 항생제일 수 있다. 상기 플루오로퀴놀린계 항생제는 퀴놀린의 6번 탄소 위치에 불소를 첨가한 구조를 가지고 있으며 그람 양성 및 음성 세균 모두에 항균력을 발휘함으로서 항균력의 범위가 넓은 특징이 있다. 플루오로퀴놀린계 항생제의 종류로는 시프로플록사신(Ciprofloxacin), 오플록사신(Ofloxacin), 레보플록사신(Levofloxacin), 목시플록사신(Moxifloxacin) 등이 있다. 상기 산화질소 방출 제제는 산화질소가 아민기와 반응하여 생성된 디아제늄디올레이트(NONOate)기를 가진 물질인 것일 수 있다. 상기 산화질소 방출 제제는 산화질소를 처리한 PEI(Polyethylenimine)일 수 있고, 보다 상세하게는 산화질소를 처리한 bPEI(Branched PEI)일 수 있다.
일 구체예에서, 상기 제 1 용액은 상기 히알루론산을 4 내지 8 중량%, 5 내지 8 중량%, 6 내지 8 중량%, 4 내지 7 중량%, 5 내지 7 중량%, 또는 6 내지 7 중량% 만큼 포함할 수 있고, 바람직하게는 6 중량%를 포함할 수 있다.
일 구체예에서, 상기 제 2 용액은 상기 BDDE를 0.015 내지 0.025 중량%, 0.018 내지 0.025 중량%, 0.019 내지 0.025 중량%, 0.015 내지 0.022 중량%, 0.018 내지 0.022 중량%, 0.019 내지 0.022 중량%, 0.015 내지 0.021 중량%, 0.018 내지 0.021 중량%, 0.019 내지 0.021 중량%만큼 포함할 수 있고, 바람직하게는 0.02 중량%를 포함할 수 있다. 예를 들면, 제 2 용액의 양은 제 1 용액과 동일한 양으로 하고, 제 1 용액에 히알루론산을 6 중량% 포함하는 경우 BDDE를 0.02 중량% 함유할 수 있다. 상기 히알루론산 및 BDDE의 함량에 의하면 히알루론산 복합체의 체내 형태 유지 기간이 증가하고 BDDE에 의한 독성을 최소화할 수 있다. 상기 히알루론산 및 BDDE의 함량에 의하면 히알루론산 복합체의 체내 형태 유지 기간은 수술 후 항생제 점안이 필요한 기간만큼 유지될 수 있으며, 유지 기간은 약 5일 내지 10일, 6일 내지 10일, 7일 내지 10일, 8일 내지 10일, 5일 내지 9일, 6일 내지 9일, 7일 내지 9일, 8일 내지 9일, 5일 내지 8일, 6일 내지 8일, 7일 내지 8일, 5일 내지 7일, 또는 6일 내지 7일일 수 있으며, 바람직하게는 7일일 수 있다.
일 구체예에서, 상기 제 1 용액의 히알루론산과 상기 제 2 용액은 BDDE의 함량비는 중량을 기준으로 400:1, 390:1, 380:1, 370:1, 360:1, 350:1, 340:1, 330:1, 320:1, 310:1, 300:1, 290:1, 280:1, 270:1, 260:1 또는 250:1일 수 있으며, 바람직하게는 300:1일 수 있다.
일 구체예에서, 상기 제 1 용액, 상기 제 2 용액, 또는 상기 혼합된 용액은 목시플록사신을 히알루론산 함량의 1/600 내지 1/10만큼 포함할 수 있다.
일 구체예에서, 상기 제 3 용액의 히알루론산 함량은 2.5 내지 3.5 중량%, 또는 2.8 내지 3.2 중량%이고, BDDE의 함량은 0.008 내지 0.012 중량%, 또는 0.009 내지 0.011 중량%일 수 있으며, 바람직하게는 히알루론산 3 중량% 및 BDDE 0.01 중량%를 포함할 수 있다.
일 구체예에서, 상기 멸균하는 단계는 고압증기, 오토클레이브(autoclave), EO(ethylene oxide) 가스, 감마선, 전자빔, 또는 자외선으로 멸균하는 것일 수 있고, 바람직하게는 오토클레이브 멸균일 수 있다. 본 발명자는 히알루론산과 BDDE의 가교반응 후에 멸균 공정을 진행하여 히알루론산 중합체를 제조하면 수화 후 형태가 유지되는 시간이 지나치게 단축되어 약물전달체로서 사용하기 어렵다는 점을 발견하였으며, 히알루론산 및 BDDE를 각각 멸균처리한 후에 1차 가교결합 반응을 진행하면 수화 후 형태가 유지되는 시간이 최소 7일 이상이고, 수술 후 항생제 함유 점안액 투여기간만큼 유지될 수 있다는 것을 발견하였다.
일 구체예에서, 상기 중합하는 단계는 12 내지 30시간, 15 내지 30시간, 16 내지 30시간, 17 내지 30시간, 18 내지 30시간, 19 내지 30시간, 12 내지 27시간, 15 내지 27시간, 16 내지 27시간, 17 내지 27시간, 18 내지 27시간, 19 내지 27시간, 12 내지 24시간, 15 내지 24시간, 16 내지 24시간, 17 내지 24시간, 18 내지 24시간, 19 내지 24시간, 12 내지 21시간, 15 내지 21시간, 16 내지 21시간, 17 내지 21시간, 18 내지 21시간, 19 내지 21시간 동안 실시하는 것일 수 있고, 바람직하게는 19시간 실시하는 것일 수 있다.
일 구체예에서, 상기 중합하는 단계는 혼합된 용액을 성형용 몰드에 주입하고 인큐베이팅하는 것일 수 있다.
일 구체예에서, 상기 제 3 용액을 제조하는 단계는 무균시설에서 진행할 수 있으며, 예를 들면 무균대(clean bench)에서 진행하는 것일 수 있다.
상기 안과용 약물전달체는 항생제가 담지된 것으로서, 안구 수술 후 항생제 투여 용도일 수 있다. 상기 제조방법으로 제조한 안과용 약물전달체는 수술 후 항생제 점안이 필요한 기간과 거의 일치하는 기간 동안 체내에 잔류할 수 있으므로, 안구 수술 과정에서 안구에 삽입됨으로서 수술 후 항생제 점안을 대체하는 용도로 사용될 수 있다.
일 구체예에 따른 안과용 약물전달체는 생체적합성 및 생분해성이 뛰어나므로 안구 내에 삽입시에도 안압 상승 또는 염증반응 등의 부작용을 최소화 할 수 있다.
일 구체예에 따른 약물을 담지한 안과용 약물전달체는 안구 내에서 일주일 이상 분해가 지연되며, 담지된 약물을 수술 후 감염 방지가 필요한 기간 동안 방출할 수 있다.
일 구체예에 따른 약물을 담지한 안과용 약물전달체는 안구 수술 중 삽입되어 안구내에서 약물을 방출함으로서 점안액에 의한 약물 투여를 대체할 수 있다.
일 구체예에 따른 약물을 담지한 안과용 약물전달체는 기존 점안 투여보다 항생제의 사용량을 감소시킬 수 있다.
도 1은 안구의 해부학적 구조를 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명의 실시예에 따라 제조된 건조형태의 HA 복합막을 나타낸 것이다.
도 3은 본 발명의 실시예에 따라 제조된 HA 복합막의 건조상태에서의 두께를 나타낸 것이다.
도 4는 본 발명의 실시예에 따라 제조된 HA 복합막에 식염수를 흡수시켜 팽윤(swelling)시키고, 손등에 위치시켜 형태 유지를 확인한 결과이다.
도 5은 본 발명의 실시예에 따라 제조된 건조상태의 HA 복합막을 다양한 형태로 재단하고 또한 수화시켰을 때 형태 유지를 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 6은 본 발명의 실시예에 따라 제조된 HA 복합막을 PVDF 막 위에서 수화 후 건조시켜 형태 유지력을 최대 3주까지 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 7은 히알루론산 및 BDDE에 목시플록사신을 혼합하여 제조한 혼합액을 나타낸 것이다.
도 8는 상기 도 7의 혼합액으로 제조한 HA 복합막의 건조상태의 물성을 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 9는 상기 도 8의 목시플록사신 함유 HA 복합막을 수화시키고 일주일 후의 형태를 관찰한 것이다.
도 10은 목시플록사신을 함유한 약물전달체의 MIC 테스트를 실시한 결과를 나타낸 것이다.
도 11은 본 발명의 실시예에 따라 제조한 HA 복합막의 인간 각막상피세포에 대한 세포 독성을 확인한 결과이다.
도 12은 본 발명의 실시예에 따라 제조한 HA 복합막을 실험동물의 안구 내에 삽입하여 생체적합성 및 생분해성을 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 13은 본 발명의 실시예에 따라 제조한 HA 복합막을 실험동물의 상처입은 각막에 삽입하여 생체적합성 및 회복속도 증가를 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 14는 1차 가교결합 후 멸균처리하여 제조한 HA 복합막을 수화시켜 형태 유지 여부를 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 15는 HA 복합막을 수화시킨 결과로서 A는 1차 가교결합 후 멸균처리하여 제조한 HA 복합막이고, B는 히알루론산 용액 및 BDDE를 각각 멸균처리하고 1차 가교결합하여 제조한 HA 복합막이다.
도 16은 서로 다른 제조방법으로 제조한 HA 복합막의 SEM 촬영 사진으로서, A는 멸균처리없이 제조한 HA 복합막이고, B는 1차 가교결합 반응 후 오토클레이브 멸균처리한 HA 복합막이고, C는 히알루론산 용액 및 BDDE 용액을 각각 멸균처리하고 1차 가교결합시켜 제조한 HA 복합막이다. 사진의 스케일 바(Scale Bar)는 500μm이다.
도 17은 상기 도 16의 SEM 촬영 사진에 기초하여 기공의 지름을 측정한 결과이다. CTL(control)은 상기 도 16의 A에 대한 것이고, autoclaved는 상기 도 16의 B, separately autoclaved는 상기 도 16의 C에 대한 것이다.
이하 하나 이상의 구체예를 실시예를 통해 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 하나 이상의 구체예를 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 가교결합된 히알루론산 제조
히알루론산과 BDDE를 pH 8.0 조건에서 물과 혼합하여 용액을 제조하였다. 용액 전체 중량을 기준으로 히알루론산은 3 %, BDDE는 0.01%를 혼합하였다. 제조된 용액 전체의 부피는 30 내지 40 ml였다.
제조한 용액을 상온에서 19시간 이상 로테이터(bio RS-24 mini rotator, biosan)로 360°회전 혼합하여 1 차 가교결합 반응을 진행하였다. 1 차 가교결합 반응한 용액을 성형을 위해 Culture Plate Lid에 담았다. 용액이 담긴 Culture Plate Lid를 쉐이커(CR300 rocker, FINEPCR)로 밤새(overnight) 인큐베이션하여 2 차 가교결합 반응을 진행하였다.
2 차 가교결합 반응이 끝난 평면의 히알루론산 막을 테이블 상에서 3일 이상 건조시켰다. 건조된 히알루론산 막을 펀칭하여 지름이 약 5 mm인 원형의 평면 형태로 절단(trimming)하고 실험에 사용하였다(도 2 참조). 절단한 히알루론산 막은 HA 복합막으로 명명하였다. HA 복합막의 두께는 약 100 내지 125 μm 였다(도 3 참조).
실시예 2: HA 평면복합막의 물성 확인
2-1. 손등 부착을 통한 물성 확인
상기 실시예 1에서 제조한 HA 복합막을 식염수(normal saline)에 15분간 흡수시켜 팽윤시키고(swelling) 손의 등면(dorsal surface)에 부착하였다(도 4 참조). 그 결과, HA 복합막은 수분을 흡수하여 지름이 5 mm에서 약 8 mm 정도로 팽창된 평면 형태가 되었으며, 곡면 부착력이 뛰어난 것을 확인할 수 있었다.
실시예 2-1 결과를 통해 실시예 1의 조성에 의해 제조한 히알루론산 막은 수화되면 생체조직에 부착력이 뛰어나며, 수화 후 재건조시에도 중합 상태 및 형태를 유지할 수 있음을 확인할 수 있었다.
2-2. 다양한 형태를 가진 HA 복합막의 물성 확인
HA 복합막을 원형이 아닌 각진 형태로 절단하여(도 5의 A) 동일한 방법으로 팽윤시킨 결과, 피부에 밀착이 가능하며 수화후에도 형태를 유지함을 확인하였다(도 5의 B).
2-3. PVDF 필름에 위치시켜 물성 확인
HA 복합막의 식염수 흡수 시간을 달리하여 건조시 형태 변화를 관찰하였다. 도 6의 A는 HA 복합막을 PVDF막 위에 위치시켜 식염수를 흡수시킨 후 1시간 동안 건조시킨 결과를 나타낸 것으로, 3주, 2주, 1주, 24h, 5 min은 식염수를 흡수하여 팽윤(swelling)한 시간을 의미한다. 도 6의 B를 참조하면 건조된 HA 복합막은 PVDF 막에 밀착되어 균열이 발생하였다. 이는 PVDF 막에서 건조한 차이 때문인 것으로 생각된다. 그러나 도 6의 A에서 점선으로 표시된 원 부분 및 도 6의 C를 참조하면, 1주일 동안 식염수를 흡수시키고 건조한 경우에도 컨택트 렌즈 형태로 온전히 건조되며, 이에 다시 식염수를 흡수시키면 팽윤되어 평면 형태로 복원됨을 확인하였다(도 6의 D). 따라서 상기 조성에 따라 제조한 HA 복합막은 안구내 환경에서 일주일 이상 형태를 유지할 수 있음을 확인하였다.
실시예 3: 목시플록사신을 담지한 HA 복합막 제조 및 물성 확인
히알루론산과 BDDE를 혼합하는 단계에서 목시플록사신을 더 혼합하는 것을 제외하고 상기 실시예 1과 동일한 방법으로 HA 복합막을 제조하였다. 도 7를 참조하면, 목시프록사신을 혼합한 질량%가 증가함에 따라 혼합액의 노란색이 더 진해지는 것을 확인할 수 있었다.
히알루론산, BDDE, 및 목시플록사신을 포함하는 혼합액을 지름 약 5cm의 패트리디쉬에 담아 평면처리하고 충분히 가교결합 반응을 진행한 다음 4일간 건조시켰다(도 8의 A 참조). 건조된 목시플록사신을 담지한 HA 복합막을 패트리디쉬에서 분리한 결과, 목시플록사신을 최대 3 중량%를 포함하더라도 형태가 유지될 수 있음을 확인할 수 있었다(도 8의 B 참조).
목시플록사신을 함유한 HA 복합막의 안구 내 지속시간을 측정하기 위해 수화시키고 일주일 동안 분해 정도를 관찰하였다. 도 9를 참조하면, 목시플록사신을 3중량% 함유한 HA 복합막은 분해가 조금 더 진행되었으나, 목시플록사신의 함량 차이에 따른 분해 속도는 큰 차이를 나타내지 않는 것으로 평가되었다.
실시예 5: 목시플록사신 포함 HA 복합막의 세균 억제 확인
목시플록사신의 함량을 달리하여 HA 복합막을 제조하고 MIC(Minimum Inhibitory Concentration) 테스트를 수행하여 세균 성장을 억제하는 최소 농도를 측정하였다.
목시플록사신이 0, 0.1, 0.5, 1, 및 3% 포함된 히알루론산 복합막을 녹농균( Psudomonas aeruginosa)이 접종된 배지에 첨가하여 37℃ 진탕 배양(shaking incubation)하였다. 24시간 후, 분광측광계(spectrophotometer)로 600nm파장에서 흡광도 (Optical Density)를 측정 후, CTL값을 100%로 계산하여, 세균의 개수 증감을 %대비로 표시하였다.
도 10의 A 의 색변화 및 B의 흡광도 측정결과를 참조하면, 목시플록사신을 포함하지 않은 경우는 녹농균이 번식하여 색이 변하는 것을 확인할 수 있었으나, 목시플록사신을 0.1 중량% 이상 포함하여 제조한 히알루론산 복합막은 녹농균의 증식을 효과적으로 억제하였음을 알 수 있었다.
실시예 6: HA 복합막의 인간 각막 상피 세포에 대한 독성 실험(CCK test)
인간의 각막상피세포(Primary Human Corneal Epithelial(HCEpi))를 24 well에 4회 계대배양(4 phase)하였다. 배양된 세포수는 약 3×10 4 cells/well이었다. 세포배양액에 히알루론산 복합체를 첨가하고, 24에서 72시간 동안 세포 배양 이후 세포의 독성 여부를 CCK test로 시행하였다.
도 11은 히알루론산 복합체를 처리하고 세포 생존률을 비교한 CCK data를 나타낸 것이다. 실험 결과에 따르면 히알루론산 복합체를 처리한 군에서 미처리군보다 세포 생존도(cell viability)가 상승하였음을 확인하였다. 따라서 본 발명의 히알루론산 복합체는 안구 내 삽입시 독성 문제가 없으며 오히려 세포 생존에 도움을 준다는 것을 확인하였다.
실시예 7: HA 복합막의 생체적합성, 생분해성, 및 지속기간 확인
상기 실시예 1에서 제조한 HA 복합막을 토끼 안구의 전방(anterior chamber) 내에 삽입하고 생체적합성 및 생분해성을 시험하였다.
토끼 전방 내에 삽입된 히알루론산 복합체는 건조 중량이 평균 2.7 mg이고, 물 또는 식염수를 평균 200 μL 첨가하여 수화시킨 중량은 65 내지 80 mg이다. 도 12의 A는 결막과 각막(cornea)을 절개하고 HA 복합막의 전방 내에 삽입한 것을 나타낸 것으로서, 삽입한 HA 복합막을 점선으로 표시하였다. 도 12의 B는 각막 및 결막을 봉합(suture)한 것을 나타낸 것이다.
도 12의 C는 각막을 봉합한 후 일주일이 경과한 토끼의 눈을 확인한 결과이다. HA 복합막은 안구 삽입 후 7일이 경과하였을 때 생분해되어 관찰되지 않았으며, 이를 통해 생체내 환경에서 적어도 7일 이상 지속될 수 있음을 확인하였다. 또한 생체적합성 측면에서, HA 복합체를 안구에 삽입한 후 약간의 붓기가 있었으나 이는 수술의 후유증에 의한 것으로 생각되며, 그 외 HA 복합막에 의한 부작용은 관찰되지 않았으므로 생체적합성이 뛰어난 것으로 확인되었다. 이를 기초로 판단하건데, 약물이 담지된 HA 복합막을 동일한 방법으로 사용하면 담지된 약물이 삽입 위치에서 일주일 동안 지속적으로 방출될 수 있고, 특별한 부작용이 없이 사용할 수 있을 것으로 예상된다.
또한 대조군(control) 2 및 실험군 3, 총 5 마리의 토끼를 이용하여 눈에 지름 1cm의 원형으로 각막을 긁어내어 손상시킨 후, 플루오레세인(fluorescein)으로 염색하여 상처 부위의 크기를 시간대 별로 확인하였다. 실험군에는 지름 5 mm로 펀칭하고 수화시킨 HA 복합막을 이용하여 각막 상처를 덮어주었다.
도 13을 참조하면, 각막 손상 후 72시간 경과하였을 때 대조군은 염색 부위가 일부 감소한 반면, 실험군의 염색 부위는 완전히 사라졌으므로 HA 복합막이 손상된 각막의 회복을 촉진시킴을 확인할 수 있었다.
실시예 8: HA 복합막 제조의 멸균공정 확립
8-1. 1차 가교결합 후 멸균 진행
상기 실시예 1의 방법에서 로테이터에 의한 1차 가교결합 반응까지 동일하게 진행한 후, 121℃에서 20분간 오토클레이브 멸균을 진행하였다. 멸균한 1 차 가교결합 반응 용액을 성형을 위해 Culture Plate Lid에 담았다. 용액이 담긴 Culture Plate Lid를 쉐이커(CR300 rocker, FINEPCR)로 밤새(overnight) 인큐베이션하여 2 차 가교결합 반응을 진행하였다. 멸균 후의 모든 공정은 클린 벤치에서 진행하였다. 2 차 가교결합 반응이 후 평면의 HA 복합막을 테이블 상에서 3일 이상 건조시켰다. 건조한 HA 복합막을 수화시키면 수분 이내로 분해되어 형태를 유지하지 못하는 것을 확인하였다(도 14 참조).
멸균 공정을 오토클레이브보다 저온인 EO 가스 멸균(55℃, 1내지 2 시간), 감마 멸균(각각 25 kgy, 40 kgy로 진행), 전자빔 멸균(각각 25 kgy, 40 kgy로 진행)으로 변경하여 진행하는 것을 제외하고 동일한 과정으로 HA 복합막을 제조하였다. 그러나, 상기 다양한 방법으로 멸균을 진행한 HA 복합막 또한 수화시키면 수분 이내로 분해되어 형태를 유지하지 못하는 것을 확인하였다. 멸균 공정을 UV 살균공정으로 변경하여 제작한 HA 복합막 역시 수화시킨 경우에도 수화 후 44시간 내지 51시간 이내에 형태가 사라지는 것을 확인하였다(도 15의 A 참조).
이를 통해 1차 가교결합 반응 후 멸균처리를 진행하면 안구 내에서 지속적인 약물 방출이 어렵다는 점을 확인하였다.
8-2. 히알루론산 용액 및 가교제 용액을 각각 멸균처리
제 1 용액으로서 6중량%의 히알루론산 용액(pH 8.0) 20ml 및 제 2 용액으로서 0.02 중량%의 BDDE 용액(pH 8.0) 20ml를 각각 준비하였다. 제 1 용액 및 제 2 용액을 각각 상기 실시예 6-1과 동일한 조건으로 오토클레이브 멸균하고, 멸균한 제 1 용액 및 제 2 용액을 혼합하여 제 3 용액을 제조한 후 19시간 동안 로테이터로 1차 가교반응을 진행하였다. 1 차 가교결합한 제3용액을 Culture Plate Lid에 담았다. 용액이 담긴 Culture Plate Lid를 쉐이커(CR300 rocker, FINEPCR)로 밤새(overnight) 인큐베이션하여 2 차 가교결합 반응을 진행하였다. 멸균 후의 모든 공정은 클린 벤치에서 진행하였다. 2 차 가교결합 반응이 후 평면의 HA 복합막을 테이블 상에서 3일 이상 건조시켰다.
각각 멸균처리한 용액으로 제조한 HA 복합막을 수화시키고 지속적으로 수분을 공급하며 관찰한 결과, 96시간 이상 형태를 유지하는 것을 확인하였다(도 15의 B 참조).
실시예 9: 8-2에서 제조한 HA 복합막 제조의 주사전자현미경 분석 결과
도 16에서, A는 상기 실시예 1의 방법으로 멸균 공정없이 제조한 HA 복합막이고, B는 상기 실시예 6-1의 방법으로 1차 가교반응 후 오토클레이브로 멸균처리한 HA 복합막이며, C는 상기 실시예 6-2의 방법으로 히알루론산 용액 및 BDDE 용액을 각각 멸균처리하고 1차 가교반응하여 제조한 HA 복합막을 SEM(Scanning Electron Microscope) 전자현미경으로 관찰한 것이다. 전자현미경 촬영 조건은 SED 15.0kV, WD 9.7mm이며, 바는 500 μm길이를 나타낸다.
도 16의 A, B, C는 가교결합 기공(cross linking pore)의 형태 및 크기가 차이가 있음을 확인하였다. A와 C는 기공의 형태 및 크기가 유사하였으나, B는 상대적으로 크기가 더 큰 기공이 다수 관찰되었고 기공의 간격이 촘촘하지 못하여 가교결합이 제대로 이루어지지 않은 것을 확인할 수 있었다.
기공의 평균 지름을 측정한 결과를 도 17에 나타내었다. 도 17의 A, B에서, CTL은 도 16의 A, autoclaved는 도 16의 B, separately autoclaved는 도 16의 C에 대응하는 결과이다. 도 16의 A는 평균 154.62 μm(도 17의 CTL), 도 16의 B는 평균 251.47 μm(도 17의 autoclaved), 도 16의 C는 평균 144.13 μm(도 17의 separately autoclaved)로 확인되었다. 1차 가교반응 후 오토클레이브로 멸균처리한 경우 기공의 크기가 유의하게 증가한 것으로 보아, 히알루론산 복합체 제조과정에서 고온고압 멸균과정이 가교를 손상시키는 것을 확인할 수 있었다. 또한, 히알루론산 용액과 BDDE 용액을 각각 멸균처리하고 1차 가교반응시킨 경우 BDDE에 의한 화학적 가교가 멸균과정 이후에 진행됨으로서 히알루론산의 가교가 손상되지 않는 것을 확인할 수 있었다.
또한 종래 멸균처리없이 제조한 히알루론산 복합체는 종종 세균이 번식하는 문제점이 있었으나, 각각 멸균처리하고 1차 가교반응시킨 경우에는 앞서 살펴본 바와 같이 수화시킨 경우 일주일 이상 형태를 유지하면서도 세균의 번식이 일어나지 않았다.
따라서 히알루론산 용액 및 가교결합제 용액을 각각 멸균처리한 후에 1차 가교결합 반응을 진행하여 제조한 HA 복합체는 안구 내 환경에서 더 장시간 형태를 유지할 수 있으므로 지속적인 약물 방출이 가능한 약물전달체를 제조하는데 유리하다는 것을 확인하였다.

Claims (23)

  1. 가교결합된 히알루론산을 포함하는 담지체; 및
    상기 담지체에 담지된 약물을 포함하고,
    안구 내 삽입하기 위한 용도인,
    안과용 약물전달체.
  2. 제 1 항에 있어서,
    상기 약물은 스테로이드, 산화질소 방출 제제, 또는 항세균제인,
    안과용 약물전달체.
  3. 제 2 항에 있어서,
    상기 항세균제는 플루오로퀴놀린계 항생제인,
    안과용 약물전달체.
  4. 제 3 항에 있어서,
    상기 플루오로퀴놀린계 항생제는 목시플록사신인,
    안과용 약물전달체.
  5. 제 1 항에 있어서,
    상기 히알루론산과 약물의 함량비는 질량을 기준으로 30:1 내지 300:1인,
    안과용 약물전달체.
  6. 제 4 항에 있어서,
    상기 히알루론산과 목시플록사신의 함량비는 질량을 기준으로 30:1 내지 300:1인,
    안과용 약물전달체.
  7. 제 1 항에 있어서,
    상기 가교결합은 에폭사이드 가교제에 의해 가교된 것인,
    안과용 약물전달체.
  8. 제 7 항에 있어서,
    상기 안과용 약물전달체는 상기 히알루론산과 에폭사이드 가교제의 함량비를 질량을 기준으로 30:1 내지 300:1 혼합하여 가교시킨 것인,
    안과용 약물전달체.
  9. 제 7 항에 있어서,
    상기 에폭사이드 가교제는 1,4-부탄디올 디글리시딜 에테르 (1,4-butanediol diglycidyl ether, BDDE)인,
    안과용 약물전달체.
  10. 제 9 항에 있어서,
    상기 안과용 약물전달체는 상기 히알루론산 및 BDDE를 질량을 기준으로 150:1 내지 600:1 비율로 혼합하여 가교시킨 것인,
    안과용 약물전달체.
  11. 제 1 항에 있어서,
    상기 약물전달체는 안구 내에서 7 일 내지 10 일 동안 약물이 방출되는 것인,
    안과용 약물전달체.
  12. 제 1 항에 있어서,
    상기 안구는 전방(Anterior Chamber) 또는 유리체(Vitreous Body)인 것인,
    안과용 약물전달체.
  13. 제 1 항에 있어서,
    상기 삽입은 안과 수술 후 삽입인,
    안과용 약물전달체.
  14. 제 1 항에 있어서,
    상기 안과용 약물 전달체는 히알루론산 2.5 내지 3.5 중량%, BDDE 0.005 내지 0.015 중량%, 및 약물 0.05 내지 0.15 중량%로 혼합하고 히알루론산을 가교결합시켜 제조하는 것인,
    안과용 약물전달체.
  15. 제 1 항에 있어서,
    상기 안과용 약물전달체의 1회 투여용량은 건조 중량으로서 2.5 내지 3.0 mg인,
    안과용 약물전달체.
  16. 히알루론산 및 물을 포함하는 제 1 용액을 제조하는 단계;
    BDDE(1,4-Butanediol diglycidyl ether) 및 물을 포함하는 제 2 용액을 제조하는 단계;
    상기 제 1 용액 및 상기 제 2 용액을 각각 멸균하는 단계;
    상기 멸균한 제 1 용액 및 제 2 용액을 혼합하여 제 3 용액을 제조하는 단계; 및
    상기 제 3 용액을 인큐베이팅하여 히알루론산을 중합하는 단계를 포함하는,
    안과용 약물전달체 제조방법.
  17. 제 16 항에 있어서,
    상기 제 1 용액은 히알루론산을 4 내지 8 중량% 포함하는,
    안과용 약물전달체 제조방법.
  18. 제 16 항에 있어서,
    상기 제 2 용액은 BDDE를 0.015 내지 0.025 중량% 포함하는,
    안과용 약물전달체 제조방법.
  19. 제 16 항에 있어서,
    상기 제 1 용액의 히알루론산과 상기 제 2 용액은 BDDE의 함량비는 중량을 기준으로 300:1인,
    안과용 약물전달체 제조방법.
  20. 제 16 항에 있어서,
    상기 제 3 용액의 히알루론산 함량은 2.5 내지 3.5 중량%이고, BDDE의 함량은 0.008 내지 0.012 중량%인,
    안과용 약물전달체 제조방법.
  21. 제 16 항에 있어서,
    상기 멸균은 오토클레이브(autoclave)로 멸균하는 것인,
    안과용 약물전달체 제조방법.
  22. 제 16 항에 있어서,
    상기 중합하는 단계는 17 내지 21시간 동안 실시하는 것인,
    안과용 약물전달체 제조방법.
  23. 제 16 항에 있어서,
    상기 중합하는 단계는 혼합된 용액을 성형용 몰드에 주입하고 인큐베이팅하는 것인,
    안과용 약물전달체 제조방법.
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