KR20180034170A - 히알루론산 및 실크 단백질을 함유하는 투명 하이드로겔 막 및 이의 제조 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 히알루론산(hyaluronic acid) 및 실크 단백질, 구체적으로는 실크 피브로인(silk fibroin)이 링커(linker)에 의하여 공중합된 투명 하이드로겔 막 및 이의 제조 방법에 관한 것으로, 우수한 투명성, 유연성 및 약물서방성을 나타내는 투명 하이드로겔 막을 제공한다.

Description

히알루론산 및 실크 단백질을 함유하는 투명 하이드로겔 막 및 이의 제조 방법{TRANSPARENT HYDROGEL MEMBRANE CONTAINING HYALURONIC ACID AND SILK PROTEIN AND METHOD FOR PREPARING THEREOF}
본 발명은 히알루론산(hyaluronic acid) 및 실크 단백질, 구체적으로는 실크 피브로인(fibroin)이 링커(linker)에 의하여 공중합된 투명 하이드로겔 막(transparent hydrogel membrane) 및 이의 제조 방법에 관한 것이다.
히알루론산(hyaluronic acid, HA)은 두 개의 당, 글루크론산 및 N-아세틸 글루코사민으로 구성된 중합체이다. 조직 내의 간질에 광범위하게 분포되어 있는 천연 뮤코다당류로서, 인간의 관절액, 연골, 피부, 안구 등에 다량 존재하고 있으며, 세포간 분자의 3차원 가교 역할을 하고, 점도가 높아 연골 사이에서 연골을 보호한다. 친수성기인 카복실기를 다량 함유하고 있어 수분과 접촉시 기계적 강도가 약화되는 특징을 갖는다.
일반적으로, 히알루론산은 세포 배양에 긍정적 역할을 하고, 각막 상피세포의 재생을 촉진하며, 안과 분야에서 안구 표면 질환을 치료하는 인공눈물의 주재료로 사용되는 등 점성 보충, 약제 및 수술 보조제로서 이용되고 있다. 이러한 히알루론산의 오랜 시간의 임상 적용으로 안구에서의 안전성이 이미 확보되어 있다. 또한, 관절 내 주사로 투여되는 윤활제로서 상이한 성격의 골관절염에 의해 유발된 관절 통증을 완화하는 점성 보충에서 폭넓게 시험되고 있다.
누에고치에서 추출되는 실크 단백질은 구조상 바깥을 감싸고 있는 친수성 구조의 세리신(sericin)과 내부의 광택이 나는 소수성 구조의 피브로인으로 구성되며, 오랫동안 민간요법으로 활용되어 온 전통적인 의료용 고분자 소재 중의 하나이다. 2000년 이후 의료용 소재로서의 가능성이 제기된 후, 많은 연구자에 의하여 막, 스폰지, 하이드로겔, 섬유 등의 다양한 형태의 의료용 소재로서 연구되어 왔다. 이 중, 섬유로 이용되는 실크는 세리신이 제거된 피브로인 단백질로서, 습도 조절 기능이 탁월하고 항균 효과가 우수하며 인체에 해로운 자외선과 정전기로부터 피부를 보호하는 천연 단백질 소재 천연고분자이다.
피브로인 단백질이 피부 건강에 미치는 영향에 대한 많은 연구 결과가 보고되었는데, 특히 피브로인 단백질은 피부의 탄력을 유지시키는 콜라겐 생성을 촉진시키며, 상처 난 피부세포의 빠른 재생을 도와준다. 또한, 생체적합성, 생분해성, 통기성, 기계적 특성이 우수하여 조직 공학적 지지체와 의료용으로 이용되고 있다.
하이드로겔(hydrogel)은 3차원 네트워크 구조를 가지며, 다량의 물을 함유할 수 있고, 친수성이 뛰어나 생체 적합성을 갖는다. 특히, 천연고분자로 이루어진 하이드로겔은 자연에 매우 풍부하게 존재하기 때문에 값이 저렴하며 생체 적합하고 생분해성이 뛰어나 약물 전달체로 많이 이용되고 있다. 높은 흡습성과 안정성, 무독성을 가지고 있고 혈액, 체액 및 생체와 접촉하였을 때 우수한 생체 적합성을 보인다. 하이드로겔은 자연 중합체 또는 이들의 유도체, 합성 중합체 또는 자연 중합체와 합성 중합체의 조합으로 구성되는데, 정전력 또는 화학적 결합으로 상호작용하는 이들의 분자는 친수성 가교결합된 중합체를 형성하고, 건조중량의 10 내지 20%내지 수백 배 범위의 양으로 물을 흡수할 수 있다. 특히, 하이드로겔은 손상되거나 병든 또는 퇴행된 인간 조직이나 기관을 치유하거나 재구성하는 것을 목적으로 하는 조직 공학 기질의 제조에 이상적인 후보 소재이다.
이러한 우수한 가능성에 불구하고, 히알루론산 및 피브로인을 함유하는 하이드로겔 막은 그 불투명성에 의하여 안과에 적용되기에 어려움이 있었다.
본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허 문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명 의 내용이 보다 명확하게 설명된다.
대한민국 등록특허 제10-1154327호
본 발명은 히알루론산 및 실크 단백질, 구체적으로는 실크 피브로인이 링커에 의하여 공중합된 투명 하이드로겔 막 및 이의 제조 방법에 관한 것으로, 우수한 투명성, 유연성 및 약물서방성을 나타내는 투명 하이드로겔 막을 제공한다.
본 발명의 일 양상은 히알루론산 및 실크 단백질이 링커에 의하여 공중합된 투명 하이드로겔 막을 제공한다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 실크 단백질은 히알루론산 1중량부를 기준으로 1.25 내지 2중량부 함유되는 것인 투명 하이드로겔 막을 제공한다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 투명 하이드로겔 막은 상기 링커에 의하여 그물 구조를 형성하는 것일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 링커는 부탄디올디글리시딜에테르(BDDE), 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카보디이미드(EDC), 디에폭시옥탄, 1,2-비스-(2,3-에폭시프로필)-2,3-에틸렌 및 이들의 조합으로 구성되는 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 히알루론산의 분자량은 80만 내지 120만 달톤인 것일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 실크 단백질은 실크 피브로인일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 투명 하이드로겔은 소염제, 진통제, 상피재생 촉진제, 마취제, 지혈제, 항균제, 항세균제, 항바이러스제, 항진균제, 항염증제, 항산화제, 방부제, 항히스타민제, 진양제, 해열제, 면역자극제, 피부과용 제제, 항암제 및 이들의 조합으로 구성되는 군으로부터 선택되는 1 이상의 약물을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 투명 하이드로겔은 안과 질환의 예방 또는 치료용으로 사용될 수 있다.
본 발명은 투명성, 유연성 등이 개선된, 히알루론산과 실크 단백질, 구체적으로는 실크 피브로인이 함유된 하이드로겔 막을 제공하고, 이는 생체적합성이 우수하고 상처 치유와 염증 치료에 효과가 있으며, 각막 손상 등 안구표면 질환의 치료를 위한 양막 대체제로의 적용이 가능하다.
또한, 상기 하이드로겔 막에 담지된 다른 약물을 일정 속도 이하로 서서히 방출시킬 수 있으며, 이렇게 추가적으로 담지된 약물을 통하여, 염증 억제, 통증 조절, 상피재생 촉진 등의 부가적인 효과를 발휘할 수 있다.
도 1은 본 발명에 따른 히알루론산 및 실크 피브로인을 함유하는 투명 하이드로겔 막을 나타내며(도 1의 (a)), 및 이의 투명성을 확인할 수 있다(도 1의 (b)).
도 2는 히알루론산 하이드로겔(a) 및 본 발명에 따른 투명 하이드로겔 막(b)의 SEM 분석 결과를 나타낸다.
도 3은 링커 농도에 따른 히알루론산 하이드로겔의 독성 평가를 나타낸다.
도 4는 히알루론산과 실크피브로인의 혼합비율에 따른 히알루론산 하이드로겔의 독성평가를 나타낸다.
본 발명의 일 양상은 히알루론산 및 실크 단백질이 링커에 의하여 공중합된 투명 하이드로겔 막으로서, 상기 실크 단백질은 히알루론산 1중량부를 기준으로 1.25 내지 2중량부 함유되는 것인 투명 하이드로겔 막을 제공한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "히알루론산"은 인체 내에서는 눈의 초자체나 탯줄 등에 존재하며, 점성이 크고 세균의 침입이나 독물의 침투를 막는 데 중요한 역할을 한다. 본 발명에서 히알루론산은 저분자 히알루론산이 바람직하며, 보다 바람직하게는 80만 내지 120만 달톤이다.
본 명세서에서 사용되는 용어 “실크 단백질”은 세리신 및 실크 피브로인을 포함하며, 본 발명에서는 실크 피브로인이 사용되는 것이 바람직하다. 실크 피브로인은 누에고치로부터 당업계에 공지된 정련 과정을 통하여 세리신을 제거함으로써 수득될 수 있다.
본 발명의 투명 하이드로겔 막에서 상기 실크 단백질은 히알루론산 1중량부를 기준으로 1.25 내지 2중량부, 바람직하게는 1.25 내지 1.7 중량부, 보다 바람직하게는 1.4 내지 1.7 중량부 함유되는 것이 바람직하며, 실크 단백질이 2중량부 초과인 경우 막형성의 배합이 잘 이루어지지 않고, 1.25중량부 미만인 경우에는 불투명해지고 하이드로겔 막 내에 공기방울이 발생할 수 있다.
본 발명의 투명 하이드로겔 막에서 히알루론산과 실크 단백질의 함유비를 조절함으로써, 필요에 따른 팽윤도를 또한 조절할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 “링커”는 히알루론산 단량체와 실크 단백질 사이를 연결시켜 공중합시키는 역할을 하며, 이에 의하여 투명 하이드로겔 막의 내부 구조는 그물 구조를 형성할 수 있다. 상기 링커는 일반적으로 상이한 유형의 이중- 또는 다중-관능성　가교제일 수 있으며, 예컨대, 디비닐설폰, 이중 또는 다중 관능성 에폭사이드류, 카보디이미드류 및 포름알데하이드류로 구성되는 군으로부터 선택될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 링커는 이중- 또는 다중-관능성 에폭사이드류의 군으로부터 선택되는 제제인 것이 바람직하며, 보다 바람직하게는, 1,4-부탄디올디글리시딜에테르(1,4-Buthanediol diglycidyl ether, BDDE), 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카보디이미드(1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide, EDC), 디에폭시옥탄(Diepoxyoctane) 또는 1,2-비스-(2,3-에폭시프로필)-2,3-에틸렌(1,2-bis-(2,3-Epoxypropyl)-2,3-ethylene))이며, 더욱 바람직하게는 1,4-부탄디올디글리시딜에테르 또는 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카보디이미드일 수 있다. 1,4-부탄디올디글리시딜에테르는 분자량이 202.25으로, 자체의 반감기가 짧은 히알루론산을 가교결합시켜 겔을 형성하게 함으로써 분해가 빨리 진행되는 단점을 보완한다. 상기 링커의 농도는 0.1% 이하, 바람직하게는 0.01% 이하로 포함될 수 있다.
상기 투명 하이드로겔은, 예컨대, 소염제, 진통제, 상피재생 촉진제, 마취제, 지혈제, 항균제, 항세균제, 항바이러스제, 항진균제, 항염증제, 항산화제, 방부제, 항히스타민제, 진양제, 해열제, 면역자극제, 피부과용 제제, 항암제 및 이들의 조합으로 구성되는 군으로부터 선택되는 1 이상의 약물을 추가로 포함할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. 투명 하이드로겔 막에 추가적으로 포함된 상기 약물은 상처의 치유를 보조하거나 그 효과를 증대시킬 수 있다.
상기 투명 하이드로겔은 안과 질환, 예컨대, 안구건조증, 각막염, 녹내장, 포도막염, 안구의 염증, 알레르기, 안구의 감염, 암종, 각막에서 유래한 신생혈관 성장, 망막부종, 황반부종, 당뇨망막병증, 미숙아망막증, 망막의 퇴행성 질환(황반변성, 망막영양장애), 아교증식과 관련된 망막질환 등과 같은 다양한 안구 상태의 예방 또는 치료용으로 사용될 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 일 양상은 (a) 히알루론산을 수용액에 용해시켜 히알루론산 용액을 제조하는 단계; (b) 실크 단백질을 증류수에 용해시켜 실크 단백질 용액을 제조하는 단계; (c) 상기 히알루론산 용액과 실크 단백질 용액을 유기염 용액, 무기염 용액, 플르오르화 용매, 이온화 용액 및 강산으로 구성되는 군으로부터 선택되는 어느 하나에 혼합하는 단계; 및 (d) 상기 혼합된 용액에 링커를 혼합하고, 몰드(mold)에 부어 겔화시키는 단계를 포함하는 투명 하이드로겔 막의 제조 방법으로서, 상기 실크 단백질은 히알루론산 1 중량부를 기준으로 0.6 내지 1 중량부 함유되는 것인 투명 하이드로겔 막의 제조 방법을 제공한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "염기성 수용액"은 알칼리금속의 수산화물 또는 알칼리토금속의 수산화물의 수용액, 예컨대 수산화리튬, 수산화나트륨, 수산화칼륨, 수산화마그네슘, 수산화베릴륨, 수산화칼슘 또는 이들의 조합의 수용액일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. 수산화나트륨의 수용액인 것이 pH 조절 측면 및 농도 조절 측면에서 용이할 수 있다.
이하 하나 이상의 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
제조예 1. 히알루론산 하이드로겔 필름의 제조
가교가 되지 않은 히알루론산 원재료 0.75g을 증류수 10㎖에 용해시키고 BDDE 0.01중량%를 넣어 7.5중량%의 균일한 히알루론산 용액을 제조하였다. 상기 히알루론산 용액을 폴리에틸렌 몰드(PE mold)에 붓고, 상온에서 24시간 동안 겔화(gelation)시켰다. 겔화시켜 제조된 일정 크기의 히알루론산 필름을 24시간마다 증류수로 총 3번 세척하고, 상기 72시간의 세척 과정을 진행한 후 히알루론산 하이드로겔 필름을 수득하였다.
상기 히알루론산 하이드로겔 필름의 크기는 직경 3㎝, 두께 0.5㎝의 렌즈 크기였으며, 상기에 해당하는 히알루론산 용액은 1000㎕에 해당하였다.
실시예 1. 실크 피브로인의 추출
누에고치(cocoon) 5g을 8% 탄산나트륨 용액에 넣고 30분 동안 가열하여 세리신을 제거하였다. 상기 처리를 마친 고치를 클린 후드(clean hood)에서 얇게 펼친 후, 상온에서 24시간 동안 건조시켰다.
건조된 고치를 9.3M LiBr 용액에 넣고, 4 내지 48시간 동안 용해시킨 후, 그 용액을 여과지로 여과하였다. 불순물 또는 침전물을 선택적으로 여과한 후, 3 내지 12㎖ 용량의 투석 카세트(dialysis cassette)로 투석시키고, 48시간 동안 증류수로 총 6회 세척하여, 실크 피브로인을 수득하였다.
실시예 2. 히알루론산 및 실크 피브로인 막의 제조(1:10 하이드로겔 막)
먼저, 상기 실시예 1에서 추출된 실크 피브로인 5g을 증류수에 혼합하여, 8중량%의 실크 피브로인 용액을 제조하였다.
7.5중량% 히알루론산 용액 1㎖와 8중량% 실크 피브로인 용액 1㎖을 혼합하고 6시간 이상 교반시킨 후 건조시켰다.
실시예 3. 히알루론산 및 실크 피브로인 막의 제조
7.5중량% 히알루론산 용액과 8중량% 실크 피브로인 용액을 하기 표 1의 부피비로 혼합한 것을 제외하고는 상기 실시예 2와 동일한 방법으로 하이드로겔 막을 제조하였다.
Figure pat00001
실험예 1. 하이드로겔 막의 표면 관찰
하이드로겔 막의 크기 및 두께에 영향을 받지 않는 시료 표면의 정보를 얻기 위하여 주사전자현미경(JSM-7800F, JEOL사)으로 막의 표면을 관찰하였다.
관찰 결과, 규칙적인 그물 구조가 형성되었으며, 이에 따라 안구 등에 사용할 경우 미세한 상처도 내지 않을 정도로 매끄러운 표면을 형성하였음을 확인하였다(도 2 참조).
실험예 3. 히알루론산 하이드로겔의 독성 평가
3.1. 세포 배양
미국 미생물 보존 센터(American Type Culture Collection, ATCC, 미국 버지니아주 머내서스 소재)로부터 구입한 인간 각막 상피 세포(HCEC)(카탈로그 번호: PCS-700-010)를 ATCC로부터 제공된 증식 키트에 보충된 각막 상피 세포 기초 배지에 재현탁시켰다. 세포를 75cm2 조직 배양 플라스크에 접종한 후, 37℃, 5% CO2 및 95% 습도 공기에어 유지하였다. 배양 배지를 3일마다 교체하고, 세포를 0.05% 트립신-EDTA(Gibco BRL, 미국 캘리포니아주 소재)로 처리하여, 본 실험예에서는 계대배양 수 5 이하의 세포를 사용하였다.
3.2. BDDE 처리 및 세포생존률 분석
BDDE 처리에 대한 독성 평가를 위하여, 세포 생존률 분석을 세포 계수 키트(CCK-8) 시약(Dojindo Molecular Technologies, Inc., 일본 구마모토 소재)을 이용하여 제조자의 프로토콜에 따라 수행하였다. 간략하게는, BDDE(Sigma Aldrich)를 처리하기 24시간 전에, HCEC를 96-웰 플레이트에서 1?104개/웰의 농도로 배양하였다.
세포가 부착된 이후에 BDDE 용액을 배양 배지를 이용하여 0.01, 0.1, 1, 10%로 희석하고, 6, 24, 48시간 동안 처리하였다. 배양 후, CCK-8 용액 10㎕를 각각의 웰에 첨가하고, HCEC를 시약과 함께 배양한지 2시간 후에 450nm에서의 흡광도를 측정하였다.
실험 결과, 처리 6시간 이후에는 세포 생존률에 큰 차이가 존재하지 않으나, BDDE 처리 후 24시간이 경과한 경우 10%의 용액으로 처리한 군에서, 처리후 48시간이 경과한 경우 1% 이상의 용액으로 처리한 군에서 세포 생존률이 크게 감소하는 것을 확인하였다(도 3 참조).
3.3. 실크 하이드로겔 처리 및 세포생존률 분석
본 발명에 따른 실크 하이드로겔에서의 독성 평가를 위하여, 세포 생존률 분석을 세포 계수 키트(CCK-8) 시약(Dojindo Molecular Technologies, Inc., 일본 구마모토 소재)을 이용하여 제조자의 프로토콜에 따라 수행하였다. 간략하게는, 실크 하이드로겔로부터의 삼출액으로 처리하기 24시간 전에, HCEC를 96-웰 플레이트에서 1?104개/웰의 농도로 배양하였다.
상기 실시예 3에서 제조된 하이드로겔 막 중, 히알루론산과 실크 피브로인의 비율을 달리하는 하이드로겔 막(HA:실크 피브로인의 비율은 1:2, 1:1.67, 1:1.43 및 1:1.25, 대조군은 실크 피브로인 불포함임), 각 실크 하이드로겔을 배양 배지 1mL, 37℃에서 2시간 동안 배양하였다. 상기 삼출물을 HCEC에 6, 24, 48 및 72시간 동안 처리하였다. 배양 후, CCK-8 용액 10㎕를 각각의 웰에 첨가하고, HCEC를 시약과 함께 배양한지 2시간 후에 450nm에서의 흡광도를 측정하였다.
실험 결과, 실크 피브로인의 함유 여부 및 비율에 무관하게, 세포 생존률에 차이가 없이 모두 높게 유지됨을 확인하였다(도 4 참조).
실험예 4. 하이드로겔 막의 특성 평가
상기 실시예 3에서 제조된 하이드로겔 막에 대하여 거품 발생여부, 투명성 여부, 점성 여부, 분해도 여부 및 핸들링의 유용성에 대하여 평가하였으며, 그 평가 결과는 하기 표 2와 같다:
Figure pat00002
이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로, 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 상세한 설명보다는 후술하는 특허청구범위에 의하여 나타내어지며, 특허청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 균등 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

Claims (7)

  1. 히알루론산(hyaluronic acid) 및 실크 단백질이 링커(linker)에 의하여 공중합된 투명 하이드로겔 막(transparent hydrogel membrane).
  2. 제 1 항에 있어서,
    상기 실크 단백질은 히알루론산 1중량부를 기준으로 1.25 내지 2중량부 함유되는 것인 투명 하이드로겔 막.
  3. 제 1 항에 있어서,
    상기 링커는 부탄디올디글리시딜에테르(BDDE), 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카보디이미드(EDC), 디에폭시옥탄, 1,2-비스-(2,3-에폭시프로필)-2,3-에틸렌 및 이들의 조합으로 구성되는 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것인 투명 하이드로겔 막.
  4. 제 1 항에 있어서,
    상기 히알루론산의 분자량은 80만 내지 120만 달톤인 것인 투명 하이드로겔 막.
  5. 제 1 항에 있어서,
    상기 실크 단백질은 실크 피브로인(silk fibroin)인 것인 투명 하이드로겔 막.
  6. 제 1 항에 있어서,
    상기 투명 하이드로겔은 소염제, 진통제, 상피재생 촉진제, 마취제, 지혈제, 항균제, 항세균제, 항바이러스제, 항진균제, 항염증제, 항산화제, 방부제, 항히스타민제, 진양제, 해열제, 면역자극제, 피부과용 제제, 항암제 및 이들의 조합으로 구성되는 군으로부터 선택되는 1 이상의 약물을 추가로 포함하는 투명 하이드로겔 막.
  7. 제 1 항에 있어서,
    상기 투명 하이드로겔은 안과 질환의 예방 또는 치료용인 것인 투명 하이드로겔 막.
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