KR20160027095A - 성형된 가교 히알루론산 생성물의 제조 방법 - Google Patents

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Abstract

성형된 가교 히알루론산 생성물의 제조 방법은, 원하는 형상의 비-가교된 석출된 히알루론산 기질을, pH가 11.5 이상이며 하나 이상의 다관능성 가교제(들), 및 히알루론산에 대한 석출 조건을 제공하는 양의 하나 이상의 유기 용매(들)를 포함하는 액체 매질 중에서, 변형도가 이당류 1000 유닛 당 가교제 1 내지 40 유닛인, 석출된, 성형된 가교 히알루론산 생성물을 수득하기에 적절한 조건 하에, 단일 가교 반응시키는 단계를 포함한다.

Description

성형된 가교 히알루론산 생성물의 제조 방법{METHOD FOR MANUFACTURING A SHAPED CROSS-LINKED HYALURONIC ACID PRODUCT}
본 발명은 다당류 분야에 관한 것이다. 보다 상세하게는, 본 발명은 히알루론산을 가교시키는 새로운 방법 및 성형된 가교 히알루론산 생성물을 제조하는 새로운 방법에 관한 것이다.
의료용으로 가장 널리 사용되는 생체적합성 폴리머 중 하나가 히알루론산이다. 이는 글리코스아미노글리칸(GAG) 그룹에 속하는 자연적으로 존재하는 다당류이다. 히알루론산 및 그외 GAG는 다량의 물을 흡수하는 능력을 가진 음전하성 헤테로다당류 사슬이다. 히알루론산 및 히알루론산 유래의 생성물은 생체의학 분야 및 미용 분야에서, 예를 들어 점조수술(viscosurgery)시 그리고 피부 충진물로서, 널리 사용된다.
흡수성 겔 또는 하이드로겔이 생체의학 분야에서 널리 사용되고 있다. 이들은 일반적으로, 폴리머를 무한정 네트워크로 화학적으로 가교함으로써 제조된다. 천연 히알루론산과 일부 가교된 히알루론산 생성물은 완전히 용해될 때까지 물을 흡수하지만, 가교된 히알루론산 겔은 전형적으로, 포화될 때까지, 즉 한정된 액체 보유 용량 또는 팽윤도(swelling degree)를 가질 때까지, 소정량의 물을 흡수한다.
생체적합성 폴리머로부터 겔의 제조 시, 높은 생체적합성을 유지하기 위해 낮은 가교도를 보장하는 것이 유리하다. 그러나, 종종 보다 농후한 겔이 적절한 생체의학적 효과를 가지는 데 필요하며, 이러한 경우, 생체적합성은 종종 상실될 것이다.
히알루론산은 대부분의 살아 있는 유기체에서 분자량을 제외하고는 동일한 화학적 구조로 존재하기 때문에, 이는 최소한의 반응을 제공하며 진보된 의학적 용도를 허용한다. 생체 내에서 히알루론산 분자의 내분해성 또는 체류 기간을 개선하기 위해서는, 이의 가교 및/또는 다른 변형이 필요하다. 더욱이, 이러한 변형은 히알루론산 분자의 액체 보유 용량에 영향을 미친다. 그 결과, 히알루론산은 많은 변형 시도들의 대상이 되어 왔다.
가교된 히알루론산 겔 생성물들은 고도로 복잡한 화학적 구조이기 때문에, 이들은 전형적으로, 이들의 화학적 구조와 이들의 물리적 특성의 조합에 의해 특징화된다. 비변형된 히알루론산으로부터의 화학적 구조의 편향은 전형적으로 변형도, 변형율, 가교도, 가교 지수 또는 화학적 변형으로서 보고되며, 이들은 모두 히알루론산에 공유 결합된 가교제의 양에 관한 것이다. 본 내용 전체에서, 용어 변형도가 사용될 것이다. 가교된 히알루론산 겔 생성물의 가장 관련 있는 물리적 특성은, 겔이 흡수할 수 있는 액체의 부피 및 겔의 유동학적 특성이다. 두 특성 모두 겔의 구조적 안정성을 기술하며, 이는 종종 겔 강도 또는 단단성으로서 지칭되지만, 액체의 흡수가 건조 겔에 대해 확인될 수 있는 한편, 유동학적 특성은 원하는 농도로 팽윤되는 겔 상에서 측정되어야 한다. 액체 흡수에 대한 전형적인 표현은 팽윤, 팽윤 능력, 액체 보유 용량, 팽윤도, 팽윤 정도, 최대 액체 흡수율 및 최대 팽윤도이다. 본 내용 전체에서, 용어 팽윤도가 사용될 것이다. 가교된 히알루론산 겔 생성물의 유동학적 특성과 관련하여, 회전 유동측정(rotational rheometry)만이 액체의 유동성을 확인하는 데 유용한 반면, 진동 유동측정(oscillating rheometry)은 겔의 유동성을 확인하는 데 필수적이다. 이러한 측정은 탄성률 및 점성률의 유닛에서 변형에 대한 겔의 저항성을 제공한다. 높은 겔 강도는 원하는 농도로 팽윤된 겔 생성물의 변형에 대한 큰 저항성을 제공할 것이다.
US 2007/0066816은 2 단계에서 히알루론산 기질을 에폭사이드 및 카르보다이이미드 각각을 사용하여 가교하는 단계를 포함하는, 이중 가교된 히알루론산의 제조 방법을 개시하고 있다.
EP 2 199 308 A1은 에탄올을 함유하는 액체 매질 중에서 분산되는 히알루로난 분말의 가교를 개시하고 있다. 생성되는 생성물은 불량하게 조절된 형상을 가진다.
US 2012/0034462 A1은, 실험적 증거 없이, 가교된 HA 겔의 고형분 물질을 시브(sieve) 또는 메쉬(mesh)에 통과시킴으로써, 가교된 HA 겔이 얇은 가닥으로 제조될 수 있음을 제안하고 있다.
본 분야에서의 진전에도 불구하고, 생체적합성을 유지하지만 적절한 액체 보유 용량 및 분해 프로파일을 가진, 성형된 가교 히알루론산 생성물의 다른 제조 방법이 요구되고 있다. 특히, 예를 들어 액체 보유 용량으로서 측정될 수 있는 원하는 겔 강도를 가진 성형된 히알루론산 겔 생성물을 수득하는 데 필요한 변형도를 최소화하는 것이 바람직하다.
임플란트 등의 일부 알려진 연조직 증대 처치는 종종, 임플란트 또는 이의 일부가 원하는 처치 부위로부터 멀리 이동하는 단점을 겪게 된다. 임플란트 등의 일부 알려진 조직 증대 처치가 가진 또 다른 문제는, 임플란트가 원하는 처치 부위로부터 변위(displace)되는 것이다. 임플란트 이동 및 변위는 환자에게 불리한데, 왜냐하면 이들은 처치의 미용학적 결과 및/또는 치료학적 결과에 영향을 미칠 수 있으며, 임플란트의 제거가 요구되는 경우 이를 방해할 수 있기 때문이다. 임플란트의 온전성 및 위치를 원하는 시간 동안 유지시키는 것이 매우 유익하다. 상기 문제점들을 피하기 위해, 겔은 변형에 저항하도록 특정 겔 강도를 가질 필요가 있다. 이러한 특성은 유동측정을 진동 방식으로 사용함으로써 측정될 수 있다.
본 발명의 목적은, 원하는 형상을 가진 가교된 히알루론산 생성물의 제조 방법을 제공하는 것이다. 특정 목적은, 개체에의 이식 후, 생성물의 이동 가능성을 제한하는 형상을 가진 가교된 히알루론산 생성물의 제조 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은, 높은 생체적합성을 가진, 즉, 바람직하고 유용한 형상으로 고정되는 경우 히알루론산의 높은 생체적합성을 유지하는, 성형된 가교 히알루론산 생성물의 제조 방법을 제공하는 것이다.
본 명세서로부터 확인되는 이들 기본적인 목적 및/또는 다른 목적을 달성하기 위해, 본 발명의 기본적인 목적은 낮은 액체 보유 용량 내지 중간 정도의 액체 보유 용량 또는 팽윤도로 확인되는 바와 같이 높은 겔 강도를 가지는 것과 동시에, 낮은 변형도 내지 중간 정도의 변형도를 가진 성형된 가교 히알루론산 생성물의 제조 방법을 제공하는 것임이 현실화되었다.
본 발명의 추가적인 목적은 성형된 가교 히알루론산 생성물의 제조 방법을 제공하는 것이며, 여기서, 액체 보유 용량은 히알루론산의 변형도보다 다른 파라미터들에 의해 조절 또는 영향을 받을 수 있다.
본 발명의 목적은 성형된 가교 히알루론산 생성물의 제조 방법을 제공하는 것이며, 여기서, 결합된 가교제(들)의 많은 부분들이 (적어도) 2개의 말단에서 연결되며, 즉, 높은 가교 효율을 달성한다.
본 발명의 추가적인 목적은 낮은 변형도 내지 중간 정도의 변형도를 가지며 동시에 낮은 액체 보유 용량이나 팽윤도 또는 중간 정도의 액체 보유 용량이나 팽윤도를 가진, 성형된 가교 히알루론산 생성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 목적은 높은 변형저항성을 가진 성형된 가교 히알루론산 생성물을 제공하는 것이다.
본 개시내용으로부터 확인될 이들 목적 및 다른 목적들에 있어서, 본 발명은 제1 측면에 따라, 성형된 가교 히알루론산 생성물의 제조 방법을 제공하며,
(i) 가교 없이, 수용액인 제1 액체 매질에 용해된 히알루론산 기질을 제공하는 단계;
(ii) 히알루론산 기질을, 가교 없이, 하나 이상의 제1 수용성 유기 용매(들)를 히알루론산에 대한 석출 조건을 제공하는 양으로 포함하는 제2 액체 매질로 처리함으로써, 히알루론산 기질을 석출하는 단계; 및
(iii) 원하는 형상의 비-가교된 석출된 히알루론산 기질을, pH가 11.5 이상이며 하나 이상의 다관능성 가교제(들), 및 히알루론산에 대한 석출 조건을 제공하는 양의 하나 이상의 제2 유기 용매(들)를 포함하는 제3 액체 매질 중에서, 석출된, 성형된 가교 히알루론산 생성물을 수득하기에 적절한 조건 하에, 단일 가교 반응시키는 단계를 포함하며,
단계 (i) 및/또는 단계 (ii)는 히알루론산 기질을 원하는 형상으로 배열(arranging)하는 단계를 더 포함한다.
본 방법은 유리하게는, 매우 바람직한 특성을 가진 성형된 가교 히알루론산 생성물을 제조할 수 있게 하는 것으로 확인되었다. 본 방법은, 가교가 고체(석출된) 상태에서만 발생하고 용해된 상태 및/또는 방법 단계들 사이에서는 발생하지 않기 때문에, 가교의 양호한 조절을 제공한다. 생성되는 생성물은, 히알루론산의 낮은 변형도에도 불구하고 낮은 팽윤도를 가진 겔이라는 점에서 독특하다. 제한된 팽윤도를 가진 겔 생성물이 이러한 낮은 변형도에서 수득될 수 있다는 점은 매우 놀랍다. 또한, 단일 가교 반응을 가진 공정이 이러한 원하는 특성을 가진 생성물을 달성할 수 있다는 점 역시 놀랍다. 많은 적용들 중에서, 이러한 방법은, 제조 공정 동안에 유지되는 예정된 형상을 가진 가교된 히알루론산 생성물의 제조를 가능하게 한다. 본 방법은 또한, 생체적합성 성형된 가교 히알루론산 생성물의 제조를 가능하게 한다.
특정 구현예에서, 처음 두 단계 (i) 및 (ii)는 가교제의 부재 하에 이루어지고, 다관능성 가교제는 제3 가교 단계 (iii)에 첨가된다. 이는, 가교제가 이전의 단계들, 예를 들어 석출 단계 동안에 반응하거나 또는 상실되기 때문에, 가교제의 양이 고도로 조절되게 보장한다.
일 구현예에서, 단계 (i)은 히알루론산 기질 용액을 소수성 표면 상에 원하는 형상으로 배열하는 단계를 더 포함하고; 단계 (ii)에서 성형된 히알루론산 기질의 석출은 소수성 표면 상에서 발생한다. 이는 구조물의 엉김을 방지하고 이들의 형상을 유지하는 데 유리하다. 소수성 표면은 바람직하게는 플루오로카본, 폴리프로필렌(PP), 폴리에틸렌 테레프탈레이트 글리콜-변형물(PETG), 폴리에틸렌(PE) 및 폴리테트라플루오로에틸렌(PTFE)으로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 단계 (i)의 수용액은 물 40-100 부피% 및 저급 알킬 알코올(들) 0-60 부피%를 포함한다. 이로써, 꼬인(entangled) 구조가 달성될 수 있으며, 이는 아마도 원하는 특성을 가진 겔 생성물을 수득하는 데 유리할 것이다.
구체적인 구현예에서, 단계 (ii)의 제2 액체 매질은 물 0-30 부피% 및 제1 수용성 유기 용매(들) 70-100 부피%를 포함한다. 일부 구현예에서, 단계 (ii)의 제2 액체 매질은 물 0-10 부피% 물 및 제1 수용성 유기 용매(들) 90-100 부피%를 포함한다. 고 농도의 제1 수용성 유기 용매(들)는 신속한 석출을 달성하는 데 유리한 것으로 여겨진다. 이로써, 꼬인 구조가 달성될 수 있으며, 이는 아마도 원하는 특성을 가진 겔 생성물을 수득하는 데 유리할 것이다.
특정 구현예에서, 단계 (ii)의 제1 수용성 유기 용매(들)는 하나 이상의 저급 알킬 알코올(들)이다. 일부 구현예에서, 저급 알킬 알코올은 에탄올이다. 이들 유기 용매는 신속한 석출을 제공한다.
단계 (i) 및/또는 단계 (ii)는 히알루론산 기질을 원하는 형상으로 배열하는 단계를 더 포함한다. 용어 "성형된" 및 "원하는 형상"은, 최종 생성물에 유용한, 즉 단순히 동결 건조되거나 또는 석출된 히알루로난 분말이 아닌, 의도하는 디자인을 의미한다. 특정 구현예에서, 형상은, 바람직하게는 적어도 하나의 치수에서의 신장(extension)이 0.5 mm 이상, 바람직하게는 1 mm 초과, 보다 바람직하게는 5 mm 초과인, 입자, 섬유, 스트링, 가닥(strand), 네트, 필름, 디스크 및 비드로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 기질의 형상은 적어도 하나의 치수에서의 신장이 5 mm 미만, 바람직하게는 1 mm 미만이다. 이는, 후속적인 가교 단계에서, 석출된 히알루론산 생성물의 이용가능한 결합 부위 다수에 가교제(들)가 접근할 수 있도록 촉진한다. 특정 구현예에서, 기질의 형상은 길이방향으로 신장되며, 이의 길이방향 신장 : 이의 가장 긴 가로방향 신장의 비율은 5:1 이상, 예컨대 10:1 이상, 예를 들어 20:1 이상이며, 선택적으로 100　000:1 이하, 예컨대 25　000:1 이하, 예를 들어 100:1 이하이다. 길이방향으로 신장된 형상은 본 방법 전체 동안에, 생성되는 생성물에서 유지되기 때문에, 가교된 생성물은 생체 내에서 이동/변위를 방지하거나 감소시키지만, 쉽게 주입가능한 상태가 되도록 디자인될 수 있다. 구체적인 구현예에서, 형상은 섬유이며, 이의 길이와 이의 평균 직경 사이의 비율은 5:1 이상, 예컨대 10:1 이상, 예를 들어 20:1 이상이며, 선택적으로 100　000:1 이하, 예컨대 25　000:1 이하, 예를 들어 100:1 이하이다.
특정 구현예에서, 단계 (ii)는, 히알루론산 기질을, 히알루론산에 대한 석출 조건을 제공하는 양으로 제1 수용성 유기 용매(들)를 포함하는 제2 액체 매질 내로 압출시킴으로써, 압출된 히알루론산 기질이 제2 액체 매질 중에서 석출된 섬유를 형성하게 하는 것을 포함한다.
일부 구현예에서, 단계 (iii)의 제3 액체 매질은 물 0-35 부피%, 제2 유기 용매(들) 65-100 부피% 및 하나 이상의 다관능성 가교제(들)를 포함한다. 특정 구현예에서, 단계 (iii)의 제2 유기 용매(들)는 하나 이상의 저급 알킬 알코올(들)이다. 일부 구현예에서, 저급 알킬 알코올은 에탄올이다.
구체적인 구현예에서, 단계 (iii)의 제3 액체 매질은 pH가 13 이상이다. 상승된 pH에서 석출된, 성형 기질 상에서 가교를 수행하는 것은 효율적인 가교를 가진 성형된 겔 생성물을 제공한다는 것, 즉, 여기서, 낮은 변형도는 낮은 팽윤도를 가진 단단한 겔을 제공한다는 것이 놀랍게도 실현되었다.
구체적인 구현예에서, 다관능성 가교제(들)는 다이비닐 설폰, 멀티에폭사이드 및 다이에폭사이드로 이루어진 군으로부터 개별적으로 선택된다. 일부 구현예에서, 다관능성 가교제(들)는 1,4-부탄다이올 다이글리시딜 에테르(BDDE), 1,2-에탄다이올 다이글리시딜 에테르(EDDE) 및 다이에폭시옥탄으로 이루어진 군으로부터 개별적으로 선택된다. 특정 구현예에서, 다관능성 가교제는 1,4-부탄다이올 다이글리시딜 에테르(BDDE)이다.
특정 구현예에서, 하나 이상의 다관능성 가교제(들)는 단일 유형의 가교를 제공한다. 구체적인 구현예에서, 하나 이상의 다관능성 가교제(들)는 안정한 에테르 가교를 제공한다. 본 방법은 유리하게는, 안정하며 쉽게 멸균, 예를 들어 오토클레이브될 수 있는 단일 가교된 히알루론산 겔 생성물을 제공한다.
일부 구현예에서, 본 방법은,
(iv) 석출된, 가교된 히알루론산 생성물을 비-석출 조건으로 처리하는 단계; 및
(v) 가교된 히알루론산 생성물을 비-석출된 형태로 분리하는 단계를 더 포함한다.
특정 구현예에서, 단계 (v)는 가교된 히알루론산 생성물을 멸균하는 단계를 더 포함한다.
또 다른 측면에 따르면, 본 발명은, 변형도가 이당류 1000 유닛 당 가교제 1 내지 40 유닛이며, 팽윤도가 히알루론산 1 g 당 4 mL 내지 300 mL인, 성형된 가교 히알루론산 생성물을 제공한다. 이러한 성형된 가교 히알루론산 생성물은, 낮은 변형도 내지 중간 정도의 변형도와, 동시에 낮은 팽윤도 내지 중간 정도의 팽윤도 또는 액체 보유 용량의 독특한 조합을 포함하여 매우 유용한 특성을 가진다. 이로써, 본래의 히알루론산의 생체적합성을 유지하면서도, 원하는 형상을 가진 단단하며 가교된 히알루론산 생성물을 제공하는 것이 가능하다. 본 발명에 따른 가교된 히알루론산 생성물은 예정된 형상 또는 구조로 디자인된다.
특정 구현예에서, 팽윤도는 당 1 g 당 히알루론산 15-180 mL이다.
변형 효율(MoE)은, 겔의 최소 HA 농도(Cmin) 또는 강성도/강도와, 가교제(들)에 의한 화학적 변형도 사이의 비율의 측정값이다. 구체적인 구현예에서, 변형 효율은 10 이상이다. 일부 구현예에서, 변형 효율은 20-190 또는 20-150 범위이다. 변형 효율이 10 이상, 예컨대 20-190 또는 20-150 범위인 생성물은 처음에 낮은 변형도 내지 중간 정도의 변형도와 조합되며, 동시에 낮은 팽윤도 내지 중간 정도의 팽윤도 또는 액체 보유 용량과 조합된다. 이로써, 생체적합성이며 높은 변형저항성을 가진, 원하는 형상의 단단하며 가교된 히알루론산 생성물을 제공하는 것이 가능하다.
특정 구현예에서, 2개(또는 그 이상)의 이당류를 결합하고 있는 총 결합된 가교제의 비율을 기술하는 가교제 비율은 35% 이상이다. 구체적인 구현예에서, 가교제 비율은 40% 이상이며, 일부에서는 심지어 50% 이상이다. 이들 성형된 생성물은 결과적으로, 생성물에서 효과적인 가교를 제공하지 않는 낮은 수의 가교를 가진다. 높은 가교 비율은, 낮은 팽윤도 내지 중간 정도의 팽윤도와 관련하여 놀랍게도 낮은 총 변형도를 가능하게 하며, 이는 생체적합성의 면에서는 유리하지만 원하는 형상을 유지하는 데 충분한 조합이다.
일부 구현예에서, 성형된 히알루론산 생성물은 다이비닐 설폰, 멀티에폭사이드 및 다이에폭사이드로 이루어진 군으로부터 개별적으로 선택되는 하나 이상의 다관능성 가교제(들)로 가교된다. 특정 구현예에서, 다관능성 가교제(들)는 1,4-부탄다이올 다이글리시딜 에테르(BDDE), 1,2-에탄다이올 다이글리시딜 에테르(EDDE) 및 다이에폭시옥탄으로 이루어진 군으로부터 개별적으로 선택된다. 구체적인 구현예에서, 다관능성 가교제는 1,4-부탄다이올 다이글리시딜 에테르(BDDE)이다.
특정 구현예에서, 성형된 히알루론산 생성물은 단일 가교된다. 단일 가교된 생성물은 화학적으로 잘 정의된 이점을 가진다. 단일 유형의 가교를 가진 성형된 생성물은 이러한 바람직한 특성을 나타내는 것이 유리하다. 일부 구현예에서, 성형된 히알루론산 생성물은 다중 가교된다. 구체적인 구현예에서, 성형된 히알루론산 생성물은 에테르 가교에 의해 가교된다. 본 발명에 따른 성형된 에테르 가교된 히알루론산 겔 생성물은 안정하며, 쉽게 멸균, 예를 들어 오토클레이브될 수 있다.
특정 구현예에서, 히알루론산 생성물은 입자, 섬유, 스트링, 가닥, 네트, 필름, 디스크 및 비드로 이루어진 군으로부터 선택되는 형상을 가진다. 일부 구현예에서, 히알루론산 생성물은 중공성(hollow)이며, 몇 개의 층을 가진다. 특정 구현예에서, 형사은 길이방향으로 신장되어 있으며, 이의 길이방향 신장과 이의 가장 긴 가로방향 신장의 비율은 5:1 이상, 예컨대 10:1 이상, 예를 들어 20:1 이상이며, 선택적으로 100　000:1 이하, 예컨대 25　000:1 이하, 예를 들어 100:1 이하이다. 길이방향으로 신장된 가교 생성물은 생체 내에서 이동/변위를 방지하거나 감소시키지만, 쉽게 주입가능한 상태가 되도록 디자인될 수 있다. 구체적인 구현예에서, 히알루론산 생성물은 섬유이며, 이의 길이와 이의 폭, 예컨대 이의 평균 직경 사이의 비율은 5:1 이상, 예컨대 10:1 이상, 예를 들어 20:1 이상이며, 선택적으로 100　000:1 이하, 예컨대 25　000:1 이하, 예를 들어 100:1 이하이다.
일부 구현예에서, 성형된 히알루론산 생성물은 완전히 팽윤된 상태로 존재한다. 완전히 팽윤된 상태에서, 생성물은 길이방향으로 신장된 형상을 가지며, 이의 가장 긴 가로방향 신장은 5 mm 미만, 예컨대 1.5 mm 미만, 바람직하게는 0.2 mm 미만인 것이 바람직하다. 가장 긴 가로방향 신장이 5 mm 미만이거나 이보다 더 짧은, 길이방향으로 신장된 가교 생성물은 쉽게 주입가능하다. 더욱이, 완전히 팽윤된 상태에서, 생성물은 길이방향으로 신장된 형상을 가지고, 이의 길이방향 신장이 2 mm 초과, 예컨대 25 mm 초과, 예컨대 500 mm 초과인 것이 바람직하다. 길이방향 신장이 2 mm 이상인, 길이방향으로 신장된 가교 생성물은 생체 내에서 이동/변위를 방지하거나 감소시키기 때문에, 유리하다.
다른 구현예에서, 성형된 히알루론산 생성물은 부분적으로 팽윤된 상태 또는 비-팽윤된 상태로 존재한다.
구체적인 구현예에서, 성형된 히알루론산 생성물은 오토클레이브가능하다. 추가적인 특정 구현예에서, 성형된 히알루론산 생성물은 오토클레이브된다.
본 발명에 따른 성형된 가교 히알루론산 생성물의 바람직한 제조 방법들 중 하나는 본 발명에 따른 방법에 의해서이다.
보다 다른 측면에 따르면, 본 발명은 본 발명에 따른 성형된 가교 히알루론산 생성물, 및 선택적으로 완충제를 포함하는 수성 조성물을 제공한다.
특정 구현예에서, 본 발명에 따른 성형된 히알루론산 생성물 또는 본 발명에 따른 수성 조성물은 의학적 또는 수술적 방법에서 약제 또는 의료 기기로서 유용하다.
추가적인 측면에 따르면, 본 발명은 본 발명에 따른 성형된 가교 히알루론산 생성물 또는 본 발명에 따른 수성 조성물의, 미용학적 수술 또는 의학적 수술용으로서의 용도를 제공한다. 즉, 본 발명은 미용학적 수술 또는 의학적 수술에 사용하기 위한, 본 발명에 따른 성형된 가교 히알루론산 생성물 또는 본 발명에 따른 수성 조성물을 제공한다.
일부 구현예에서, 용도는 피부 충진술 및 인체 윤곽술로부터 선택되는 미용학적 수술이다. 일부 다른 구현예에서, 용도는 피부 충진술, 인체 윤곽술, 조직 접착의 예방, 채널 형성, 실금 치료 및 정형외과적 적용으로부터 선택되는 치료 및/또는 의학적 수술에서의 약제이다.
일 측면에 따르면, 본 발명은 약물 전달에서의, 본 발명에 따른 성형된 가교 히알루론산 생성물 또는 본 발명에 따른 수성 조성물의 용도를 제공한다. 다시 말하자면, 본 발명은 약물 전달에 사용하기 위한, 본 발명에 따른 성형된 가교 히알루론산 생성물 또는 본 발명에 따른 수성 조성물을 제공한다.
보다 다른 측면에 따르면, 본 발명은 본 발명에 따른 멸균된, 성형된 가교 히알루론산 생성물 또는 본 발명에 따른 멸균된 수성 조성물로 사전-충진된, 사전-충진된 주사기를 제공한다.
일 측면에 따르면, 본 발명은, 본 발명에 따른 성형된 가교 히알루론산 생성물 또는 본 발명에 따른 수성 조성물을 이를 필요로 하는 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 미용학적 수술 또는 의학적 수술을 받는 개체의 치료 방법을 제공한다.
특정 구현예에서, 개체는 피부 충진술 및 인체 윤곽술로부터 선택되는 미용학적 수술을 받는다. 특정 구현예에서에서, 개체는 피부 충진술, 인체 윤곽술, 조직 접착의 예방, 채널 형성, 실금 치료 및 정형외과적 적용으로부터 선택되는 병태를 위한 의학적 수술 또는 의학적 치료를 받는다.
도 1은 완전히 팽윤된 가교된 HA 네트를 도시한 것이다.
도 2는 2개의 효소적으로 분해된 HA 겔 제형의 400 MHz 1H NMR 스펙트럼을 도시한 것이다.
도 3은 가교된 HA 겔 섬유의 현미경 사진을 도시한 것이다.
도 4는 60℃에서 14일 동안 보관하는 동안, 팽윤도(SwD)의 변화를 g/g으로 도시한 그래프이다.
도 5는 가교된 HA 분말(비교예) 및 본 발명에 따른 생성물의 현미경 사진을 도시한 것이다.
도 6은 가교된 HA 겔 섬유의 현미경 사진을 도시한 것이다.
도 7은 메쉬 스크린을 1회 통과한 가교된 HA 겔(비교예)의 현미경 사진을 도시한 것이다.
일 측면에 따르면, 본 발명은 제조 방법을 제공한다. 본 방법은 히알루론산 기질로부터 성형된 가교 히알루론산 생성물을 제조하기 위한 것이다.
다르게 언급되지 않는 한, 용어 "히알루론산"은 다양한 사슬 길이 및 전하 상태뿐만 아니라 다양한 화학적 변형을 가진 히알루론산 또는 히알루로난의 모든 변이체 및 변이체들의 조합을 포함한다. 즉, 이 용어는 또한, 히알루론산의 다양한 히알루로네이트 염, 예컨대 소듐 히알루로네이트를 포함한다. 히알루론산의 다양한 변형, 예컨대 산화, 예를 들어 -CH2OH 기의 -COOH로의 산화; 비시날(vicinal) 하이드록시기의 퍼요오데이트 산화, 선택적으로 환원 또는 이민 형성 등; 예를 들어 -COOH의 -CH2OH로의 환원; 황화; 탈아미드화, 및 이어서 선택적으로 탈아민화 또는 새로운 산과의 아미드 형성; 에스테르화; 다양한 화합물을 사용한 치환, 예를 들어 가교제 또는 카르보이미드에 의한 치환; 상이한 분자, 예컨대 단백질, 펩타이드 및 활성 약물 성분의 히알루론산에의 커플링; 및 탈아세틸화 또한, 이 용어에 의해 포함된다. 당업자는, 다양한 형태의 히알루론산들이, 화학적 변형 및 분석 동안에 고려되어야 하는 서로 다른 화학적 특성들을 가짐을 잘 알고 있다. 예를 들어, 특정 pH를 가진 히알루론산 용액을 수득하는 것이 바람직한 경우, 용해될 물질의 산성도, 용해성 액체의 산성도 및 임의의 완충 용량 모두가 용액의 결과적인 pH에 영향을 미칠 것이다.
히알루론산 기질은 화학적 변형을 받지 않은, 즉, 본 제조 방법의 시행 전에 가교나 다른 변형을 받은 적이 없는 히알루론산 또는 히알루로네이트 염인 것이 바람직하다.
히알루론산은 동물 및 비-동물 기원의 다양한 공급원으로부터 수득될 수 있다. 비-동물 기원의 공급원으로는 효모, 바람직하게는 박테리아를 포함한다. 단일 히알루론산 분자의 분자량은 전형적으로 1.5 MDa 내지 3 MDa 범위이지만, 다른 분자량 범위들, 예를 들어 0.5 MDa 내지 10 MDa도 가능하다.
본 방법에 의해 제조되는 생성물은 성형된 가교 히알루론산이다. 본 방법은, 히알루론산 사슬이 바람직한 형상으로 배열되었을 때 이들 사슬 간에 가교를 제공하며, 이 가교는, 공유 결합, 히알루론산 사슬의 물리적인 꼬임 및 다양한 상호작용, 예컨대 수소 결합, 반데르발스 인력 및 정전기적 상호작용에 의해 함께 고정되는, 히알루론산 분자의 연속적인 성형된 네트워크를 형성한다. 본 발명에 따른 성형된 가교 히알루론산 생성물은 겔 또는 하이드로겔이다. 즉, 히알루론산 생성물은 수-불용성인 것으로 간주될 수 있지만, 액체, 전형적으로 수성 액체에 놓이는 경우, 히알루론산 분자의 실질적으로 희석된 가교 시스템인 것으로 간주될 수 있다.
생성되는 성형된 가교 히알루론산 생성물은 바람직하게는 생체적합성이다. 이는, 처치를 받은 개체에서 어떠한 면역 반응도 발생하지 않거나 또는 단지 매우 미미한 면역 반응이 발생함을 의미한다. 실시예에서, 히알루론산 생성물의 생체적합성을 확인하는 방법, 및 본 발명에 따른 가교된 히알루론산 생성물의 생체적합성을 랫에서 시험한 결과가 제공된다.
본 발명에 따른 방법은 3개 이상의 단계들: 제조 단계, 석출 단계 및 가교 단계를 포함한다. 특정 구현예에서, 본 방법은 이들 3개 단계로 이루어진다.
제1 방법 단계에서, 히알루론산 기질이 제공된다. 전술한 바와 같이, 용어 "히알루론산 기질"은 다양한 사슬 길이 및 전하 상태뿐만 아니라 다양한 화학적 변형을 가진 히알루론산 또는 히알루로난의 모든 변이체들 및 변이체들의 조합을 포함한다. 히알루론산 기질은, 평균 분자량의 범위가 0.5-10 MDa, 바람직하게는 0.8-5 MDa, 보다 바람직하게는 1.5-3 MDa 또는 2-3 MDa인, 화학적으로 비변형된 히알루론산 또는 히알루로네이트 염, 바람직하게는 소듐 히알루로네이트인 것이 바람직하다. 히알루론산은 비-동물 기원, 바람직하게는 박테리아로부터 수득되는 것이 바람직하다.
히알루론산 기질은 수용액인 제1 액체 매질에 용해된다. 용어 "용해된" 및 "용액"은, 히알루론산 기질이 액체와 균질한 혼합물로 존재하며, 이 혼합물에서 에너지적으로 바람직한 상호작용이 발생하는 것으로 이해된다. 액체의 용액에의 첨가는, 용해되는 히알루론산 기질의 농도를 낮춘다. 용액이 수성이며, 즉 용액은 물을 포함한다. 수용액은 단순히 물에 용해된 히알루론산 기질로 이루어질 수 있다. 수용액은 물 40-100 부피% 및 저급 알킬 알코올(들) 0-60 부피%를 포함하는 것이 바람직하다. 용어 "저급 알킬 알코올"은 탄소수 1 내지 6의 1차, 2차 및 3차 알킬 알코올, 즉, C1-6 알킬 알코올을 포함한다. 저급 알킬 알코올의 구체적인 예로는, 메탄올, 에탄올, 변성된 증류주(denatured spirit), n-프로판올, 이소프로판올, n-부탄올, 이소부탄올 및 t-부탄올을 포함한다. 바람직한 저급 알킬 알코올은, 가격, 입수가능성 및 용이한 취급으로 인해, 메탄올 및 에탄올, 특히 에탄올이다. 저급 알킬 알코올의 농도는 바람직하게는 0-40%, 예컨대 0-20%, 10-30% 또는 20-40% 에탄올 범위이며, 물 성분을 이용해 상응하게 조정된다. 이 수용액의 pH는 적절하게는 6 이상, 예컨대 9 이상이다.
선택적으로, 제1 방법 단계는, 히알루론산 기질을, 선택적으로 중공성이거나 서로 다른 물질 층들을 포함하는, 원하는 형상, 예컨대 입자, 섬유, 스트링, 가닥, 네트, 필름, 디스크 및 비드로 배열하는 단계를 더 포함한다. 이는 다양한 방식들, 예를 들어 성형 또는 압출에 의해 달성될 수 있다. 히알루론산 기질의 압출은 전형적으로, 히알루론산 기질 용액을 원하는 크기의 개구에 통과시키는 단계를 포함한다. 압출된 히알루론산 기질은 자발적으로, 석출된 섬유, 스트링 또는 가닥을 형성한다. 섬유, 스트링 또는 가닥의 치수, 예를 들어 두께는, 예를 들어, 0.1-2 mm 또는 14-30 G 범위의 다양한 개구 직경, 압출 압력, 압출 속도 및/또는 히알루론산 농도를 사용하여, 개구의 치수 또는 유형을 다양하게 함으로써 조절될 수 있다. 다른 유형의 구멍(orifice) 및 틈(chink)을 사용함으로써, 서로 다른 형상 또는 구조가 생성될 수 있다. 예를 들어, 히알루론산은 필름, 네트, 디스크 또는 비드로서 석출될 수 있다.
바람직한 구현예에서, 히알루론산 기질 용액을 소수성 표면 상에 원하는 형상으로 배열하고; 후속적으로, 성형된 히알루론산 기질의 석출은 소수성 표면 상에서 발생한다. 이는, 형상이 후속적인 가교 단계에 의해 고정될 때까지, 형상 구조물의 엉김을 방지하고 원하는 형상을 유지하는 데 유리하다. 적절한 소수성 표면은 당업자에게 잘 알려져 있으며, 예를 들어, 플루오로카본, 폴리프로필렌(PP), 폴리에틸렌 테레프탈레이트 글리콜-변형물(PETG), 폴리에틸렌(PE) 및 폴리테트라플루오로에틸렌(PTFE)을 포함한다.
이러한 형상은 제조 방법 전체 동안과 최종 생성물에서 유지될 수 있다. 히알루론산 기질이 석출된 형태로 존재하는 경우, 형상은 신장을 적어도 하나의 치수에서 5 mm 미만, 바람직하게는 1 mm 미만, 예컨대 0.5 mm 미만 또는 심지어 0.2 mm 미만으로 가지는 것이 바람직하다. 이는, 후속적인 가교 단계에서, 석출된 히알루론산 생성물의 이용가능한 결합 부위 다수에 가교제(들)가 접근할 수 있도록 촉진한다. 또한, 형상은 길이방향으로 신장되며, 이의 길이방향 신장 : 이의 가장 긴 가로방향 신장의 비율은 5:1 이상, 예컨대 10:1 이상, 예를 들어 20:1 이상이며, 선택적으로 100　000:1 이하, 예컨대 25　000:1 이하, 예를 들어 100:1 이하인 것이 바람직하다. 길이방향으로 신장된 형상은 본 방법 전체 동안에, 그리고 생성되는 생성물에서 유지되기 때문에, 가교된 생성물은 생체 내에서 이동/변위를 방지하거나 감소시키지만, 쉽게 주입가능한 상태가 되도록 디자인될 수 있다. 이러한 형상의 적절한 예는 섬유이며, 이의 길이와 이의 폭 사이의 비율은 5:1 이상, 예컨대 10:1 이상, 예를 들어 20:1 이상이며, 선택적으로 100　000:1 이하, 예컨대 25　000:1 이하, 예를 들어 100:1 이하이다. 바람직한 조성물은 본 발명에 따른 가교된 가닥/섬유-성형된 히알루론산 생성물을 포함하며, 여기서, 생성물 중 50% 초과는 이의 길이방향 신장 : 이의 가장 긴 가로방향 신장의 비율이 5:1 이상, 예컨대 10:1 이상, 예를 들어 20:1 이상이며, 선택적으로 100　000:1 이하, 예컨대 25　000:1 이하, 예를 들어 100:1 이하이다.
예를 들어, 20 mL 이하의 주사기를 충진하는 단일 가닥 또는 섬유 형상을 가진 본 발명에 따른 가교된 히알루론산 생성물은 팽윤된 상태에서 두께가 1 mm이고 길이가 25 m, 즉, 이의 길이방향 신장 : 이의 가장 긴 가로방향 신장의 비율이 25000:1일 수 있다. 바람직한 조성물의 예는 본 발명에 따른 가교된 가닥/섬유-성형된 히알루론산 생성물을 포함하며, 여기서, 생성물 중 50% 초과는 길이방향 신장이 2 mm 초과이고, 가장 긴 가로방향 신장이 0.2 mm 미만이며, 즉, 그 비율이 10:1 이상이다.
제1 방법 단계는 가교 없이 수행되며, 이는 이 단계에서 가교제를 생략하고/하거나 가교에 적절하지 못한 조건을 제공함으로써 달성될 수 있다. 바람직한 형상이 수득될 때까지, 가교가 발생하지 않게 하는 것이 중요하다. 이는, 원하는 형상의 최종 생성물을 수득하고 유지하는 데 유리한데, 왜냐하면 기질의 형상화는 기존의 가교에 의해 제한되지 않으며, 제3 단계에서 생성되는 모든 가교들은 생성물의 원하는 형상을 유지하는 것에 관한 것이기 때문이다. 제1 단계는 가교제의 부재 하에 수행하는 것이 바람직하다. 이는, 가교가 용해된 상태 및/또는 방법 단계들 사이에서 발생하지 않는 양호한 조절을 제공한다. 또한, 이는, 가교제가 이전 단계들에서 반응하거나 상실되지 않기 때문에, 가교제의 양이 엄격하게 조절되고 생성되는 생성물이 품질 면에서 균질하도록 보장한다. 가교를 방지하는 것, 특히 이 단계에서 가교제를 첨가하는 것은, 산업적 규모까지 규모를 키우고 균질한 품질을 가진 생성물을 제공하는 데 적절한 제조 공정을 수득하는 데 유용하다.
제2 방법 단계에서, 히알루론산 기질은, 히알루론산 기질의 용해도 감소로 인해, 석출된다. 이는, 히알루론산 기질을, 이 기질이 불용성인 제2 액체 매질로 처리함으로써 달성된다. 제2 액체 매질은 하나 이상의 제1 수용성 유기 용매(들)를, 히알루론산의 석출 조건을 제공하는 양으로 포함한다. 생성되는 고형 석출물은 용질상으로부터 떨어져 나오고, 전형적으로 여과, 경사분리, 원심분리에 의해, 또는 한 쌍의 핀셋 등을 사용하여 수동적으로, 잔여 액체로부터 분리될 수 있다. 하나의 바람직한 구현예에서, 석출된 히알루론산 기질은 또한, 매질로부터 제거되고 건조된다. 석출물은 또한, 제2 액체 매질에 현탁된 상태로 유지될 수 있다. 따라서, 다른 바람직한 구현예에서, 석출된 히알루론산 기질은 건조를 받지 않는다. 예를 들어 히알루론산 기질이 불용성인 제2 액체 매질 중에서 이 기질을 압출하거나 또는 침지시킴으로써, 히알루론산 기질을 신속한 방식으로 석출하는 것이 유리하다.
본 발명에 따라 사용되는 유기 용매는 탄소-함유 용매이며, 다양한 극성도를 나타낼 수 있다. "용매"로 지칭되지만, 이들 유기 용매는 제조 방법 동안에 히알루론산의 용해성을 균형 잡고 이동시키는 데 이용되는 것으로 이해되어야 한다. 히알루론산은 특정 유기 용매 농도 간격에서 유기 용매에 매우 잘 용해될 수 있지만, 유기 용매 농도가 증가되는 경우 떨어져 나와서 석출물을 형성한다. 예를 들어, 히알루론산은 유기 용매, 예를 들어 저급 알킬 알코올과 및 물의 50/50 (vol/vol) 혼합물에 용해될 수 있지만, 90/10 (vol/vol) 혼합물에서는 떨어져 나와 석출물을 형성한다. 비-석출 조건을 받는 경우, 예를 들어 50/50 또는 0/100 혼합물에서 처리되는 경우, 히알루론산은 비-석출된, 용해 상태로 되돌아간다. 당업자는, 다른 인자들, 예컨대 온도, pH, 이온 강도 및 유기 용매(들)의 유형이 히알루론산의 석출을 제한하는 유기 용매(들) 농도에 영향을 미칠 수 있음을 잘 알고 있다. 주어진 조건 하에서 히알루론산의 석출에 대한 제한 농도는 잘 알려져 있거나, 당해 기술분야의 당업자에 의해 쉽게 확인될 수 있다. 예를 들어, (물과 에탄올의 혼합물에서) 히알루론산의 석출에 대한 제한 농도는 약 70% 에탄올이다.
이로 제한하는 것은 아니지만, 본 발명에 따른 유기 용매는 펜탄, 헥산, 사이클로헥산, 1,4-다이옥산, N,N-다이메틸포름아미드, N,N-다이메틸아세타미드, 에틸 아세테이트, 아세타미드, 다이에틸 에테르, 테트라하이드로푸란, 아세토니트릴, 메틸 에틸 케톤, 아세톤, 저급 알킬 알코올, 예를 들어 메탄올, 에탄올, 프로판올, 이소프로판올 및 부탄올로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 본 발명에 따른 유기 용매는 수용성인 것이 바람직하다. 유기 용매의 바람직한 기(group)는 저급 알킬 알코올이다. 용어 저급 알킬 알코올은 탄소수 1 내지 6의 1차, 2차 및 3차 알킬 알코올, 즉, C1-6 알킬 알코올을 포함한다. 저급 알킬 알코올의 구체적인 예로는, 메탄올, 에탄올, 변성된 증류주, n-프로판올, 이소프로판올, n-부탄올, 이소부탄올 및 t-부탄올을 포함한다. 바람직한 저급 알킬 알코올은, 가격, 입수가능성 및 용이한 취급으로 인해, 메탄올 및 에탄올, 특히 에탄올이다.
제2 방법 단계의 제2 액체 매질은 수성 매질로서, 즉 물을 어느 정도 포함하는 것이 적절하다. 제2 액체 매질이 물 0-30 부피% 및 제1 수용성 유기 용매(들) 70-100 부피%, 바람직하게는 물 0-10 부피% 및 제1 수용성 유기 용매(들) 90-100 부피%를 포함하는 것이 바람직하다. 특정 구현예에서, 제1 수용성 유기 용매(들)의 농도는 메탄올 또는 에탄올 95%, 예컨대 99% 또는 심지어 99.5%, 예를 들어 99%일 정도로 높을 수 있다. 고 농도의 제1 수용성 유기 용매(들)는 신속한 석출을 달성하는 데 유리한 것으로 여겨진다. 이로써, 꼬인 구조가 달성될 수 있으며, 이는 아마도, 바람직한 특성을 가진 겔 생성물을 수득하는 데 유리할 것이다.
제2 방법 단계는 가교 없이 수행되며, 이는 이 단계에서 가교제를 생략하고/하거나 가교에 적절하지 못한 조건을 제공함으로써 달성될 수 있다. 바람직한 형상이 수득될 때까지, 가교가 발생하지 않게 하는 것이 중요하다. 이는, 원하는 형상의 최종 생성물을 수득하고 유지하는 데 유리한데, 왜냐하면 기질의 형상화는 기존의 가교에 의해 제한되지 않으며, 제3 단계에서 생성되는 모든 가교들은 생성물의 원하는 형상을 유지하는 것에 관한 것이기 때문이다. 제2 단계는 가교제의 부재 하에 수행하는 것이 바람직하다. 이는, 가교가 용해된 상태 및/또는 방법 단계들 사이에서 발생하지 않는 양호한 조절을 제공한다. 또한, 이는, 가교제가 이전 단계들에서 반응하거나 상실되지 않기 때문에, 가교제의 양이 엄격하게 조절되고 생성되는 생성물이 품질 면에서 균질하도록 보장한다. 가교를 방지하는 것, 특히 이 단계에서 가교제를 첨가하는 것은, 산업적 규모까지 규모를 키우고 균질한 품질을 가진 생성물을 제공하는 데 적절한 제조 공정을 수득하는 데 유용하다.
선택적으로, 제2 방법 단계는, 히알루론산 기질을, 선택적으로 중공성이거나 서로 다른 물질 층들을 포함하는, 원하는 형상, 예컨대 입자, 섬유, 스트링, 가닥, 네트, 필름, 디스크 및 비드로 배열하는 단계를 더 포함한다. 이는 다양한 방식들, 예를 들어 성형 또는 압출에 의해 달성될 수 있다. 이러한 형상은 제조 방법 전체 동안과 최종 생성물에서 유지될 수 있다. 히알루론산 기질이 석출된 형태로 존재하는 경우, 석출된 기질의 형상은 신장을 적어도 하나의 치수에서 5 mm 미만, 바람직하게는 1 mm 미만, 예컨대 0.5 mm 미만 또는 심지어 0.2 mm 미만으로 가지는 것이 바람직하다. 이는, 후속적인 가교 단계에서, 석출된 히알루론산 생성물의 이용가능한 결합 부위 다수에 가교제(들)가 접근할 수 있도록 촉진한다. 또한, 석출된 기질의 형상은 길이방향으로 신장되며, 이의 길이방향 신장 : 이의 가장 긴 가로방향 신장의 비율은 5:1 이상, 예컨대 10:1 이상, 예를 들어 20:1 이상이며, 선택적으로 100　000:1 이하, 예컨대 25　000:1 이하, 예를 들어 100:1 이하인 것이 바람직하다. 길이방향으로 신장된 형상은 본 방법 전체 동안에, 그리고 생성되는 생성물에서 유지되기 때문에, 가교된 생성물은 생체 내에서 이동/변위를 방지하거나 감소시키지만, 쉽게 주입가능한 상태가 되도록 디자인될 수 있다. 이러한 형상의 적절한 예는 섬유이며, 이의 길이와 이의 폭 사이의 비율은 5:1 이상, 예컨대 10:1 이상, 예를 들어 20:1 이상이며, 선택적으로 100　000:1 이하, 예컨대 25　000:1 이하, 예를 들어 100:1 이하이다. 예를 들어, 20 mL 이하의 주사기를 충진하는 단일 가닥 또는 섬유 형상을 가진 본 발명에 따른 가교된 히알루론산 생성물은 팽윤된 상태에서 두께가 1 mm이고 길이가 25 m, 즉, 이의 길이방향 신장 : 이의 가장 긴 가로방향 신장의 비율이 25000:1일 수 있다.
제2 방법 단계는, 히알루론산 기질을, 제1 수용성 유기 용매(들)를, 석출 조건을 제공하는 양으로 포함하는 제2 액체 매질 내로 압출하는 단계를 포함할 수 있다. 이는 전형적으로, 히알루론산 기질 용액을 원하는 크기의 개구를 통해 제2 액체 매질 내로 통과시키는 단계를 포함한다. 압출된 히알루론산 기질은 자발적으로 제2 액체 매질 중에서, 석출된 섬유, 스트링 또는 가닥을 형성한다. 섬유, 스트링 또는 가닥의 치수, 예를 들어 두께는, 예를 들어, 0.1-2 mm 또는 14-30 G 범위의 다양한 개구 직경, 압출 압력, 압출 속도 및/또는 히알루론산 농도를 사용하여, 개구의 치수 또는 유형을 다양하게 함으로써 조절될 수 있다. 다른 유형의 구멍 및 틈을 사용함으로써, 서로 다른 형상 또는 구조가 생성될 수 있다. 예를 들어, 히알루론산은 필름, 네트, 디스크 또는 비드로서 석출될 수 있다. 섬유, 스트링 또는 가닥이 형성되는 경우, 이의 길이와 이의 평균 직경 사이의 비율은 5:1 이상, 예컨대 10:1 이상, 예를 들어 20:1 이상이며, 선택적으로 100　000:1 이하, 예컨대 25　000:1 이하, 예를 들어 100:1 이하인 것이 바람직하다. 섬유/스트링/가닥 형상이 가진 이점은, 섬유/스트링/가닥 자체가 거시적인 수준에서 꼬일 수 있으며, 이러한 꼬임은 코일 효과 또는 볼 효과를 유발하며, 이러한 효과는 예를 들어 임플란트의 온전성을 유지하는 데 유리할 수 있다는 점이다.
제3 방법 단계에서, 석출된 히알루론산 기질은 처음에, 제3 액체 매질 중에서 가교를 받는다. 용어 "가교"는 (적어도) 2개의 서로 다른 히알루론산 사슬들 또는 단일 히알루론산 사슬의 (적어도) 2개의 개별 부위들 사이에서 안정한 공유 결합(가교)을 도입하는 것을 지칭하며, 이는 히알루론산 분자의 연속적인 네트워크를 형성한다. 가교는 단순하게는, 히알루론산 사슬의 2개 원자들 사이의 공유 결합, 예를 들어, 2개의 하이드록시기 간의 에테르 결합, 또는 하나의 하이드록시기와 하나의 카르복시기 간의 에스테르 결합일 수 있다. 가교는 또한, 서로 다른 히알루론산 사슬들, 또는 단일 히알루론산 사슬의 개별 부위들의 2개 이상의 원자들에 공유 결합된 링커 분자일 수도 있다. 가교는 특정 조건 하에서 자발적으로 발생할 수 있지만, 가교는 전형적으로, 이러한 과정을 촉진하고 가속화하는 하나 이상의 가교제의 사용을 수반한다. 가교가 달성되는 경우, 가교제(들)는 히알루론산에 완전히 또는 부분적으로 연결될 수 있거나, 또는 가교제(들)는 분해될 수 있다. 비-결합된 가교제 중 임의의 남아 있는 잔여물은 가교 후에 제거될 수 있다.
바람직한 형상이 수득될 때까지, 가교가 발생하지 않게 하는 것이 중요하다. 이는, 원하는 형상의 최종 생성물을 수득하고 유지하는 데 유리한데, 왜냐하면 기질의 형상화는 기존의 가교에 의해 제한되지 않으며, 제3 단계에서 생성되는 모든 가교들은 생성물의 원하는 형상을 유지하는 것에 관한 것이기 때문이다. 처음 두 단계는 가교제의 부재 하에 수행되고, 가교제는 제3 가교 단계에서 첨가되는 것이 바람직하다. 이는, 가교가 고형(석출된) 상태에서만 발생하고, 용해된 상태 및/또는 방법 단계들 사이에서 발생하지 않는 양호한 조절을 제공한다. 또한, 이는, 가교제가 이전 단계들에서, 예를 들어 석출 단계 동안에 반응하거나 상실되지 않기 때문에, 가교제의 양이 엄격하게 조절되고 생성되는 생성물이 품질 면에서 균질하도록 보장한다. 이와 더불어, 가교, 특히 최종 단계에의 가교제 첨가에 초점을 맞추는 것은, 산업적 규모까지 규모를 키우고 균질한 품질을 가진 생성물을 제공하는 데 적절한 제조 공정을 수득하는 데 유용하다.
제3 액체 매질은, 다관능성인 하나 이상의 가교제(들), 즉, 가교될 히알루론산 분자에 대해 공유 결합을 형성하기 위한 2개 이상의 반응 부위를 가진 하나 이상의 가교제(들)를 포함한다. 이러한 제3 단계에서 사용되는 가교제(들)는 이관능성인 것, 즉, 가교될 히알루론산 분자에 대해 공유 결합을 형성하기 위한 반응 부위가 2개인 것이 바람직하다. 이로 제한하는 것은 아니지만, 유용한 다관능성 가교제로는, 다이비닐 설폰, 멀티에폭사이드 및 다이에폭사이드, 예컨대 1,4-부탄다이올 다이글리시딜 에테르(BDDE), 1,2-에탄다이올 다이글리시딜 에테르(EDDE) 및 다이에폭시옥탄, 바람직하게는 BDDE를 포함한다. 하나 이상의 다관능성 가교제(들)가 에테르 가교를 제공하는 것이 바람직하다. 본 방법은 유리하게는, 안정하며 쉽게 멸균, 예를 들어 오토클레이브될 수 있는 에테르 가교된 히알루론산 겔 생성물을 제공한다. 에스테르 가교는 덜 안정하며, 보다 쉽게 가수분해될 것이다.
제3 방법 단계의 가교는, 성형된 히알루론산 기질이 석출되는 석출 조건 하에 수행된다. 특히, 히알루론산 분자의 이용가능한 표면은 석출 조건으로 인해 석출된 형태로 존재한다. 제3 액체 매질은 하나 이상의 제2 유기 용매(들)를, 히알루론산에 대해 석출 조건을 제공하는 양으로 포함하며, 이 양 및/또는 유기 용매(들)는, 성형된 히알루론산 기질을 석출하기 위한 제2 방법 단계의 제2 액체 매질에 사용된 것과 동일하거나 상이할 수 있다.
상기 설명된 바와 같이, 유기 용매는 제조 방법 동안에 히알루론산의 용해성을 균형 잡고 이동시키는 데 이용되는 것으로 이해되어야 한다. 당업자는, 다른 인자들, 예컨대 온도, pH, 이온 강도 및 유기 용매(들)의 유형이 히알루론산의 석출을 제한하는 유기 용매(들) 농도에 영향을 미칠 수 있음을 잘 알고 있다. 주어진 조건 하에서 히알루론산의 석출에 대한 제한 농도는 잘 알려져 있거나, 당해 기술분야의 당업자에 의해 쉽게 확인될 수 있다.
이러한 방법을 이용하면, 제3 방법 단계에서 단일 가교 반응을 이용하여, 성형된 가교 히알루론산 생성물을 수득하는 것이 또한 가능하다. 단일 반응 단계에서 가교제의 선택 및 수에 따라, 생성되는 성형된 생성물은 단일 가교될 수 있으며, 즉, 본질적으로 단일 유형의 가교, 바람직하게는 안정한 에테르 가교를 함유할 수 있거나, 또는 다중 가교될 수 있으며, 즉, 바람직하게는 안정한 에테르 가교를 포함한, 2개 이상의 서로 다른 유형의 가교를 함유할 수 있다. 단일 가교 반응을 이용한 공정이 이러한 바람직한 특성을 가진 성형된 생성물을 달성할 수 있다는 것은 놀라운 것이다.
이로 제한하는 것은 아니지만, 본 발명에 따른 유기 용매는 펜탄, 헥산, 사이클로헥산, 1,4-다이옥산, N,N-다이메틸포름아미드, N,N-다이메틸아세타미드, 에틸 아세테이트, 아세타미드, 다이에틸 에테르, 테트라하이드로푸란, 아세토니트릴, 메틸 에틸 케톤, 아세톤, 저급 알킬 알코올, 예를 들어 메탄올, 에탄올, 프로판올, 이소프로판올 및 부탄올로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 본 발명에 따른 유기 용매는 수용성인 것이 바람직하다. 유기 용매의 바람직한 기는 저급 알킬 알코올이다. 용어 저급 알킬 알코올은 탄소수 1 내지 6의 1차, 2차 및 3차 알킬 알코올, 즉, C1-6 알킬 알코올을 포함한다. 저급 알킬 알코올의 구체적인 예로는, 메탄올, 에탄올, 변성된 증류주, n-프로판올, 이소프로판올, n-부탄올, 이소부탄올 및 t-부탄올을 포함한다. 바람직한 저급 알킬 알코올은, 가격, 입수가능성 및 용이한 취급으로 인해, 메탄올 및 에탄올, 특히 에탄올이다.
제3 방법 단계의 제3 액체 매질은 수성 매질로서, 즉 물을 어느 정도 포함하는 것이 적절하다. 가교제(들) 외에도 제3 액체 매질은 물 0-35 부피% 및 제2 수용성 유기 용매(들) 65-100 부피%, 바람직하게는 물 20-35 부피% 및 제2 수용성 유기 용매(들) 65-80 부피%를 포함하는 것이 바람직하다.
제3 액체 매질은 pH가 11.5 이상이며, 즉 가교는 pH 11.5 이상에서 수행된다. 당업자가 잘 알고 있는 바와 같이, 제3 액체 매질 중에서 원하는 pH를 수득하기 위해서는 히알루론산 출발 물질의 산성도가 고려되어야 한다. 이는, 산, 염기, 또는 적절한 완충 용량을 가진 완충 시스템의 첨가에 의해 달성될 수 있다. 바람직한 pH 조절제는 강염기, 예컨대 수산화나트륨이다. 석출된 히알루론산 분자의 가교 시에는 염기성 pH가 유리한 것으로 확인되었다. 제3 단계의 제3 액체 매질은 pH가 13 이상인 것이 바람직하다. 물 및 유기 용매(들) 둘 다를 포함하는 액체 매질 중에서, 측정된 pH는 용매(들)의 유형 및 각각의 용매(들)의 양으로 인해, 이론학적 pH와 상이할 수 있다. 따라서, 용어 겉보기(apparent) pH(pHapp)는, 주어진 조건 하에, 표준 pH 측정 장비를 사용하여 측정되는 pH를 가리키도록 도입된다. 정확한 pH 값은 예를 들어 적정에 의해 쉽게 확인될 수 있다.
제3 방법 단계에서 가교는 본 발명에 따른 성형된 가교 히알루론산 생성물을 생성한다. 본 발명에 따른 성형된 가교 히알루론산 생성물은 겔 또는 하이드로겔이다. 즉, 이는 수-불용성인 것으로 간주될 수 있지만, 액체, 전형적으로 수성 액체에 놓이는 경우, 히알루론산 분자의 실질적으로 희석된 가교 시스템인 것으로 간주될 수 있다. 제3 방법 단계의 가교는 석출 조건 하에 수행되기 때문에, 성형된 히알루론산 기질 및 성형된 가교된 생성물 둘 다 석출된다. 특히, 성형된 히알루론산 기질과 성형된 가교된 생성물 둘 다의 이용가능한 표면은 이 제3 방법 단계의 석출 조건으로 인해 석출된 형태로 존재한다. 가교 반응은, 원하는 양의 가교제(들)가 성형된 히알루론산 기질과 반응할 때까지, 적절한 조건 하에 진행된다. 히알루론산에 결합된 가교제(들)의 양은 정량화될 수 있으며, 변형도(MoD), 즉, 반복 HA 이당류 유닛의 총 수에 대한 결합된 가교제(들)의 몰량으로서 보고될 수 있다. 가교된 히알루론산 생성물의 변형도(MoD)가 이당류 1000 유닛 당 가교제 1-40 유닛(0.1-4%), 바람직하게는 이당류 1000 유닛 당 가교제 1-10 유닛(0.1-1%)으로 될 때까지, 가교 반응이 진행되는 것이 바람직하다. 요구되는 반응 시간은 몇몇 인자들, 예컨대 히알루론산 농도, 가교제(들) 농도, 온도, pH, 이온 강도 및 유기 용매(들)의 유형에 따라 좌우된다. 이들 인자는 모두 당해 기술분야의 당업자에게 잘 알려져 있으며, 당업자는 이들 관련 인자 및 다른 관련 인자들을 수비게 조정할 수 있으며, 이로써 0.1-4% 범위의 변형도를 수득하는 데 적절한 조건을 제공하고, 생성되는 생성물의 특징을 변형도에 대해 입증할 수 있다. 제3 단계의 가교는 2시간 이상, 바람직하게는 실온에서 24시간 이상 동안 수행한다.
임의의 잔여 비-결합 가교제(들)는, 성형된 석출된 생성물이 가교 매질로부터 분리될 때, 제거될 수 있다. 성형된 가교 히알루론산 생성물은, 적절한 세정액, 예를 들어 물, 메탄올, 에탄올, 식염수 또는 이들의 혼합물 및/또는 조합물을 사용한 부가적인 세정 단계에 의해 더 정제될 수 있다.
따라서, 본 발명에 따른 제조 방법은 가교된 히알루론산 생성물의 예정된 물리적 형태 또는 구조, 예컨대 입자, 섬유, 스트링, 가닥, 네트, 필름, 디스크 또는 비드의 생성을 가능하게 한다. 길이방향으로 신장되거나 또는 막대-성형되며, 이의 길이방향 신장 : 가장 긴 가로방향 신장의 비율이 5:1 이상, 예컨대 10:1 이상, 예를 들어 20:1 이상이며 선택적으로 100　000:1 이하, 예컨대 25　000:1 이하, 예를 들어 100:1 이하인 구조들이 의학적 임플란트 또는 미용학적 임플란트로서 특히 유용한데, 왜냐하면 이들은 충분한 길이를 가짐으로써 이동을 방지하도록 치수화될 수 있으며, 동시에 제한된 길이로 인해 바늘을 통한 주입에 의해 쉽게 투여될 수 있기 때문이다. 예를 들어, 20 mL 이하의 주사기를 충진하는 단일 가닥 또는 섬유 형상을 가진 본 발명에 따른 가교된 히알루론산 생성물은 팽윤된 상태에서 두께가 1 mm이고 길이가 25 m, 즉, 이의 길이방향 신장 : 이의 가장 긴 가로방향 신장의 비율이 25000:1일 수 있다.
예정된 구조들은 선택적으로 중공성이거나 또는 다중 층으로 구성될 수 있다. 중공성의 예정된 구조에서 만들어지는 공간은 선택적으로, HA로 충진되며, 이 HA는 변형, 예컨대 다른 화합물을 사용하여 가교되거나 또는 치환될 수 있다. 예정된 층 구조에서 다중 층들 중 하나 이상은 가교된 HA 또는 비-가교된 HA로 구성될 수 있으며, 이 HA는 다른 화합물을 사용한 치환에 의해 화학적으로 변형될 수 있다. 이는, 제1 방법 단계에서 히알루론산 기질을 예를 들어, 압출 또는 성형에 의해, 원하는 형상으로 배열하거나, 또는 제2 방법 단계에서 용해된 히알루론산 기질을 석출 매질, 예를 들어 에탄올 내로 압출함으로써 달성될 수 있다. 획득된 형상은 제조 방법 전체 동안과, 최종 생성물에서 유지될 수 있다.
선택적으로, 제조 방법은, 성형된 석출된, 가교된 히알루론산 생성물을 비-석출 조건으로 처리하는 제4 단계를 더 포함한다. 즉, 본 방법은 특정 구현예에서 4개 단계를 포함하거나, 또는 다른 예로 4개 단계로 구성된다. 이는 전형적으로, 성형된 가교 히알루론산 생성물을 액체 매질로 처리한 다음, 이를 비-석출된 상태로 되돌리는 단계를 포함한다. 액체 매질은 전형적으로 물, 식염수 또는 이들의 혼합물 및/또는 조합물이며, 선택적으로 유기 용매, 예를 들어 메탄올 또는 에탄올을 비-석출 농도로 포함하고 있다. 가교로 인해, 생성되는 성형된 히알루론산 생성물은 상호연결되고 꼬인 히알루론산 사슬의 연속 네트워크이며, 이는 비-석출 조건 하에 액체를 흡수하며(팽윤되며), 겔을 형성한다. 팽윤은, 겔이 완전히 팽윤되어 더이상 액체가 흡수될 수 없을 때까지 진행시킬 수 있거나, 또는 팽윤은, 부분적으로 팽윤된 겔을 수득하기 위해 조금 더 이른 단계에서 방해를 받을 수 있다. 부분적으로 팽윤된 겔은 겔의 추가적인 가공을 위한 중간산물로서 유용할 수 있으며, 예를 들어, 원하는 크기 및 형상을 가진 겔 구조의 추가적인 기계적 제조가 수행될 수 있다. 예를 들어, 필름은 입자, 슬라이스 또는 조각으로 절단될 수 있으며, 겔 섬유는 보다 짧은 단편들로 절단될 수 있으며, 잘 규정된 불규칙한 형상은 필름 등으로 디자인 될 수 있다. 가교된 HA 섬유, 스트링 또는 가닥은 또한, 가교 완료 후, 건조 전 또는 후에, 함께 짜여져서, 네트 또는 필름을 형성할 수 있다. 또한, 투여를 용이하게 하고 환자의 불편을 최소화하며, 잔여 팽윤 용량의 사용에 의해 이동 용량을 증강시키기 위해, 부분적으로 팽윤된 성형 겔 생성물을 이의 임플란트 동안에 원하는 부위에서 사용하는 것이 편리할 수 있다.
성형된 겔 생성물이 과량의 액체 내에서 비-석출 조건을 받는 경우, 이의 최대 팽윤도를 확인하거나, 또는 역으로 이의 최소 히알루론산 농도(Cmin), 즉, 겔 생성물이 완전히 팽윤될 때의 히알루론산 농도를 확인하는 것이 가능하다. 본 발명에 따른 제조 방법을 사용하면, 히알루론산 1 g 당 4-300 mL, 바람직하게는 히알루론산 1 g 당 15-180 mL의 팽윤도를 수득하는 것이 가능하다. 이는, Cmin 값 범위가 0.3-25%(w/v), 바람직하게는 0.6-7%(w/v)이며, 이 범위들은 3-250 mg/g, 바람직하게는 6-70 mg/g에 상응함을 의미한다. 원하는 팽윤도(또는 Cmin 값)는 최소의 변형도로써 달성될 수 있지만, 팽윤도를 조절하는 전형적인 방식은 변형도의 다양화에 의한 것임이 매우 유리하다. 따라서, 본 제조 방법은 성형된 겔 생성물의 팽윤 용량을 조절하는 새로운 개념을 제공하며, 이러한 조절은 놀랍게도, 겔의 낮은 변형도와 관련하여 독특하게 높은 Cmin 값(낮은 팽윤도)을 가진 단단한 성형 겔이 생성될 수 있게 한다.
변형 효율(MoE)은, 겔의 최소 HA 농도(Cmin) 또는 강성도/강도와, 가교제(들)에 의한 화학적 변형도 사이의 비율의 측정값이다. 본 발명에 따른 제조 방법을 사용하면, 변형 효율은 10 이상, 바람직하게는 10-200, 예컨대 20-150 또는 20-190 범위인 가교된 히알루론산 생성물을 수득하는 것이 가능하다. 임의의 특정 이론으로 결부시키고자 하는 것은 아니지만, 겔의 유리한 특성은 효과적인 가교가 매우 높은 정도로 이루어진 결과이며, 즉, 결합된 가교제(들) 중 많은 비율(가교제 비율이 전형적으로 0.35 또는 35% 이상, 예컨대 40% 이상 또는 심지어 50% 이상임)이 사실상 2개(또는 그 이상의) 부위에서 히알루론산에 결합되어 있으며, 이와 더불어 원하는 목적을 위한 가교의 효과적인 위치화와, 가능하게는 극히 높은 정도의 꼬임 유지의 결과인 것으로 생각된다. 당업자가 생성되는 히알루론산 생성물의 낮은 변형도로부터 예상하는 것과는 달리, 본 발명에 따른 방법은 놀랍게도, 높은 강성도/강도를 가진 겔을 제공한다. 임의의 상황 하에, 본 발명에 따른 방법은 변형도와 관련하여 팽윤도를 추가적으로 조절하는 유용한 방식을 제공한다. 본 방법은 또한, 대규모 제조에 유리한 연속 조작에 매우 적절한다.
선택적으로, 본 제조 방법은 또한, 가교된 히알루론산 생성물을 분리하는 최종 단계를 포함한다. 즉, 특정 구현예에서, 본 방법은 4개 또는 5개 단계를 포함하거나, 또는 다른 예로 4개 또는 5개 단계로 이루어진다. 생성물이 석출 조건 하에 유지되거나 또는 비-석출 조건을 받았는지의 여부에 따라, 이 단계는 생성물을 석출된 형태 또는 비-석출된 형태로 분리하는 단계를 포함할 수 있다. 그런 다음, 분리된, 석출 또는 비-석출된 생성물은 멸균되어, 멸균된 가교 히알루론산 생성물이 수득될 수 있다.
바람직한 경우, 가교된 히알루론산 생성물이 수득된 후, 다른 성분들, 예컨대 국소 마취제(예, 리도카인 하이드로클로라이드), 항염증 약물, 항생제 및 다른 적절한 보조 약제, 예를 들어 골 성장 인자 또는 골 성장 세포가 첨가될 수 있다.
일 측면에 따르면, 본 발명은 성형된 가교 히알루론산 생성물을 제공한다. 일 구현예에 따르면, 본 발명의 제조 방법에 의해 생성물이 제조되거나 또는 제조될 수 있다. 본 발명에 따른 성형된 가교 히알루론산 생성물은 겔 또는 하이드로겔이다. 즉, 이는 수-불용성인 것으로 간주될 수 있지만, 액체, 전형적으로 수성 액체에 놓이는 경우, 히알루론산 분자의 실질적으로 희석된 가교 시스템인 것으로 간주될 수 있다. 겔은 대체로 중량 기준으로 액체이며, 예를 들어 물을 90-99.9%로 포함할 수 있지만, 겔은 액체 내에서 3차원의 가교된 히알루론산 네트워크로 인해 고체처럼 거동한다. 이의 상당한 액체 함량으로 인해, 성형된 겔은 구조적으로 유연성이 있으며, 천연 조직과 유사하며, 이는 조직 공학에서 스캐폴드로서 매우 유용하며 조직 증대에도 유용하다. 히알루론산 사슬의 자연적인 꼬임과 더불어, 겔에 이의 팽윤도와 밀접하게 관련된 특성 및 구조를 부여하는 것은 가교제와, 히알루론산 분자에서의 이의 부착 위치이다.
부착된 가교제(들)의 양은 변형도(MoD), 즉, 반복 HA 이당류 유닛의 총 수에 대한 결합된 가교제(들)의 몰량에 의해 정량화되고 보고될 수 있다. 본 발명에 따른 가교된 히알루론산 생성물의 변형도(MoD)는 이당류 1000 유닛 당 가교제 1 내지 40 유닛(0.1-4%), 바람직하게는 이당류 1000 유닛 당 가교제 1 내지 10 유닛(0.1-1%)인 것이 바람직하다. 가교 반응의 효과는 하나(또는 그 이상)의 히알루론산 사슬에 대해 (적어도) 2개의 말단에서 연결된 부착된 가교제(들)의 양으로 나타나며, 가교제 비율(CrR)로서 보고된다. 본 발명에 따른 생성물은 가교제 비율이 35% 이상, 바람직하게는 40% 이상, 보다 바람직하게는 50% 이상, 예컨대 35-80%, 40-80% 및 50-80% 범위인 것이 바람직하다. 결과적으로, 이들 생성물은 생성물에서 효과적인 가교를 제공하지 않는, 적은 수의 가교제를 가진다. 높은 가교제 비율은 겔 강도와 관련하여 매우 낮은 총 변형도를 제공하며, 이는 다시, 높은 생체적합성을 보장하는 데 유리하다.
겔의 또 다른 특징은, 겔이 완전히 팽윤될 때까지 물을 흡수하는 능력이다. 액체를 더 첨가한다고 해서 겔을 더 희석시키지는 않을 것인데, 즉, 겔은 자유 분자의 용액처럼 무한정 희석될 수 없다. 겔이 비-석출 조건을 받는 경우, 겔의 팽윤도를 확인하거나, 또는 역으로 이의 최소 농도(Cmin), 즉 겔 생성물이 완전히 팽윤될 때의 히알루론산 농도를 확인하는 것 또한, 가능하다. 더 단단한(저 팽윤성) 겔은 일반적으로, 더 연한(고 팽윤성) 겔보다 점성이 더 낮으며, 보다 탄성이고, 생체 내에서 더 긴 반감기를 가질 것으로 예상된다. 그러나, 더 단단한 겔은, 매우 화학적으로 변형되는 경우, 신체에 의해 외래 물질로서 인식될 수 있다. 본 발명에 따른 생성물은 팽윤도가 히알루론산 1 g 당 4-300 mL, 바람직하게는 히알루론산 1 g 당 15-180 mL인 것이 바람직하다. 이는 Cmin 값이 0.3-25% (w/w), 즉, 3-250 mg/g, 예컨대 0.6-7% (w/w), 즉, 6-70 mg/g 범위임을 의미한다. Cmin 값은 0.6-5% (w/v), 즉, 6-50 mg/mL인 것이 바람직하다.
본 발명에 따른 성형된 가교 히알루론산 생성물은 다관능성인 하나 이상의 가교제(들), 즉, 가교될 히알루론산 분자에 대해 공유 결합을 형성하기 위한 반응 부위를 2개 이상 가진 하나 이상의 가교제(들)로 가교되는 것이 바람직하다. 가교제(들)는 이관능성인 것, 즉, 가교될 히알루론산 분자에 대해 공유 결합을 형성하기 위한 반응 부위가 2개인 것이 바람직하다. 이로 제한하는 것은 아니지만, 유용한 다관능성 가교제로는, 다이비닐 설폰, 멀티에폭사이드 및 다이에폭사이드, 예컨대 1,4-부탄다이올 다이글리시딜 에테르(BDDE), 1,2-에탄다이올 다이글리시딜 에테르(EDDE) 및 다이에폭시옥탄, 바람직하게는 BDDE를 포함한다. 히알루론산 겔 생성물은 안정한 에테르 가교에 의해 가교되는 것이 바람직하다.
성형된 히알루론산 겔 생성물은 다중 가교될 수 있으며, 즉, 바람직하게는 에테르 결합을 포함한, 2개 이상의 서로 다른 유형의 결합을 함유할 수 있다. 히알루론산 생성물은 단일 가교되는 것, 즉, 본질적으로 단일 유형의 가교, 바람직하게는 에테르 가교를 포함한, 2개 이상의 서로 다른 유형의 결합을 함유하는 것이 바람직하다. 단일 가교된 생성물은 화학적으로 잘 정의된 이점을 가진다. 단일 유형의 가교를 가진 생성물은 이러한 바람직한 특성을 나타내는 것이 유리하다. 구체적인 구현예에서, 히알루론산 생성물은 에테르 가교에 의해 가교되어, 안정하며 오토클레이브가능한 생성물을 제공한다.
원하는 팽윤도(또는 Cmin 값)는 최소의 변형도로써 달성될 수 있지만, 팽윤도를 조절하는 전형적인 방식은 변형도의 다양화에 의한 것임이 매우 유리하다. 변형도를 최소화하는 주된 이유는, 겔의 생체적합성이 높도록 보장하는 것이지만, 당업자는 다른 이점들도 잘 알고 있다. 성형된 생성물은, 겔의 변형도와 관련하여 독특하게 높은 Cmin 값(낮은 팽윤도)에 의해 특징화된다. 변형 효율(MoE)은, 겔의 강성도 및 강도를 반영하는 최소 HA 농도(Cmin)와, 가교제(들)에 의한 겔의 화학적 변형도 사이의 비율의 측정값이다. 본 발명에 따른 성형된 가교 히알루론산 생성물은 변형 효율이 10 이상, 바람직하게는 10-200, 예컨대 20-150 또는 20-190 범위이다. 변형 효율이 10 이상, 예컨대 20-190 범위인 생성물은 처음에 낮은 변형도 내지 중간 정도의 변형도와 조합되며, 동시에 낮은 팽윤도 내지 중간 정도의 팽윤도 또는 액체 보유 용량과 조합된다. 이로써, 생체적합성이며 높은 변형저항성을 가진, 단단하며 가교된 히알루론산 생성물을 제공하는 것이 가능하다.
더욱이, 본 발명에 따른 성형된 가교 히알루론산 겔 생성물은 점탄성인 것이 바람직하다. 이는, 겔 생성물이 점성과 탄성의 조합을 나타냄을 의미한다. 당업자가 잘 알고 있는 바와 같이, 점탄성 특성은 유량계(rheometer)로 확인될 수 있다. 진동 방식에서, 탄성률(G') 및 점성률(G")은 0.1 Hz 또는 1 Hz의 진동수에서 확인될 수 있다. 본 발명에 따른 특정 점탄성 겔 생성물의 경우, 하기 관계식을 충족시키는 것이 바람직하다:
Figure pct00001
본 발명에 따른 생성물은 선택적으로 중공성이거나 서로 다른 물질 층들을 포함하는, 예정된 물리적 형태 또는 구조, 예컨대 입자, 섬유, 스트링, 가닥, 네트, 필름, 디스크 또는 비드로 제조된다. 길이방향으로 신장되거나 또는 막대-성형되며, 이의 길이방향 신장 : 가장 긴 가로방향 신장의 비율이 5:1 이상, 예컨대 10:1 이상, 예를 들어 20:1 이상이며 선택적으로 100　000:1 이하, 예컨대 25　000:1 이하, 예를 들어 100:1 이하인 구조들이 의학적 임플란트 또는 미용학적 임플란트로서 특히 유용한데, 왜냐하면 이들은 충분한 길이를 가짐으로써 이동을 방지하도록 치수화될 수 있으며, 동시에 제한된 길이로 인해 바늘을 통한 주입에 의해 쉽게 투여될 수 있기 때문이다. 섬유, 스트링 또는 가닥이 형성되는 경우, 이의 길이와 이의 폭 또는 이의 평균 직경 사이의 비율은 5:1 이상, 예컨대 10:1 이상, 예를 들어 20:1 이상이며, 선택적으로 100　000:1 이하, 예컨대 25　000:1 이하, 예를 들어 100:1 이하인 것이 바람직하다. 예를 들어, 20 mL 이하의 주사기를 충진하는 단일 가닥 또는 섬유 형상을 가진 본 발명에 따른 가교된 히알루론산 생성물은 팽윤된 상태에서 두께가 1 mm이고 길이가 25 m, 즉, 이의 길이방향 신장 : 이의 가장 긴 가로방향 신장의 비율이 25000:1일 수 있다. 바람직한 스트링 두께 간격은 50-200 ㎛이다.
겔 생성물은 인간 세포, 약물 또는 다른 성분들을 함유하는 중공 용기로서 디자인될 수 있다. 본 발명의 일 구현예에 따르면, 가교된 HA 겔 생성물은 약물 전달 기기로서 유용하며, 약물 전달 방법에 사용될 수 있다. 본 발명의 일 구현예에 따르면, 가교된 HA 겔 생성물은 변형도 또는 가교율이 상이한 비-가교된 HA 또는 가교된 HA와 조합될 수 있다. 예를 들어, 가교된 겔 생성물은 원하는 용기 형상에서 생성될 수 있다. 용기는 변형도가 상이한, 예를 들어 더 낮은 비-가교된 HA 또는 가교된 HA용 저장소를 형성할 수 있으며, 그런 다음, 생성되는 조합 생성물의 총 강도를 조정하기 위해 서서히 방출되거나 또는 함유된 채로 유지될 수 있다.
가교로 인해, 성형된 히알루론산 생성물은 상호연결되고 꼬인 히알루론산 사슬의 연속 네트워크이며, 이는 비-석출 조건 하에 액체를 흡수하며(팽윤되며), 겔을 형성한다. 팽윤은, 겔이 완전히 팽윤되어 더이상 액체가 흡수될 수 없을 때까지 진행될 수 있다. 따라서, 성형된 가교 히알루론산 생성물은 완전히 팽윤된 상태로 제공될 수 있다. 팽윤은 또한, 부분적으로 팽윤된 겔을 수득하기 위해 조금 더 이른 단계에서 방해를 받을 수 있다. 부분적으로 팽윤된 겔은 겔의 추가적인 가공, 예를 들어, 원하는 크기 및 형상을 가진 겔 구조 또는 조각의 제조를 위한 중간산물로서 유용할 수 있다. 또한, 투여를 용이하게 하고 환자의 불편을 최소화하기 위해, 부분적으로 팽윤된 겔을 이의 임플란트 동안에 원하는 부위에서 사용하는 것이 편리할 수 있다. 따라서, 본 발명에 따른 성형된 가교 히알루론산 생성물은 또한, 부분적으로 팽윤된 상태 또는 비-팽윤된 상태로 제공될 수도 있다.
본 발명에 따른 성형된 가교 히알루론산 생성물은 미용학적 수술 또는 의학적 수술에 유용하다. 미용학적 수술의 비제한적인 예는 피부 충진술 및 인체 윤곽술이다. 의학적 수술의 비제한적인 예는 피부 충진술, 인체 윤곽술, 조직 접착의 예방, 정형외과적 적용, 실금 치료, 방관요관역류(vesicoureteral reflux; VUR)의 치료, 및 예를 들어 안과학에서 그리고 조직을 분리한 채 유지시키기 위한 배수용 채널 형성을 포함한다. 본 발명에 따른 성형된 가교 히알루론산 생성물은 또한, 약물 전달에 유용하다. 더욱이, 이는 수술후(복강내) 부착용 필름으로서 사용될 수 있으며, 엉덩이와 관절 치료에 사용될 수도 있다.
일 측면에 따르면, 본 발명은, 본 발명에 따른 성형된 가교 히알루론산 생성물을 이를 필요로 하는 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 미용학적 수술 또는 의학적 수술을 받는 개체의 치료 방법을 제공한다. 의학적 수술의 비제한적인 예는 피부 충진술, 인체 윤곽술, 조직 접착의 예방, 정형외과적 적용, 예를 들어 엉덩이와 관절 치료, 및 예를 들어 안과학에서 그리고 조직을 분리한 채 유지시키기 위한 배수용 채널 형성을 포함한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 성형된 가교 히알루론산 겔 생성물은, 생리학적 염 용액으로 처리되는 경우 크기가 0.1 mm 초과인 서로 다른 형상을 가진 추가적인 구조 또는 조각으로 될 수 있다. 본 발명에 따른 가교된 히알루론산 생성물은 길이방향으로 신장된 형상을 가지며, 완전히 팽윤된 상태에서, 가장 긴 가로방향 신장이 5 mm 미만, 예컨대 1.5 mm 미만, 바람직하게는 0.2 mm 미만인 것이 바람직하다. 이는, 팽윤된 겔 생성물을 원하는 치수의 주사기를 통해 주입하는 데 유리하다. 또한, 본 발명에 따른 성형된 가교 히알루론산 생성물은 길이방향으로 신장된 형상을 가지며, 완전히 팽윤된 상태에서, 길이방향 신장이 5 mm 초과, 바람직하게는 500 mm(0.5 m) 초과, 예컨대 5 m 초과 또는 심지어 25 m 초과인 것이 바람직하다. 그 중에서도, 길이방향 신장은 생체 내에서 이식된 겔 생성물의 이동 및/또는 변위를 방지한다.
원하는 형상 및 크기는 생성물의 제조 동안에, 즉, 가교 전에 기질을 원하는 형상으로 배열함으로써, 배열된다. 원하는 구조 크기를 수득하는 또 다른 적절한 방식은, 성형된 가교 히알루론산 겔을 원하는 농도로 제조한 다음, 겔을 기계적 교란, 예컨대 민싱(mincing) 처리, 매싱(mashing) 처리하거나 또는 팽윤된 겔이나 부분적으로 팽윤된 겔 또는 석출된 가교 생성물을 적절한 기공 크기를 가진 필터 또는 메쉬에 통과시키는 단계를 포함한다. 생성되는 겔 입자 또는 조각은 생리학적 염 용액에서 분산되어, 원하는 크기 및 형상의 입자를 가진 겔 분산액 또는 슬러리가 수득된다. 형상에 따라, 겔 구조의 크기는 임의의 적절한 방식, 예컨대 레이저 회절, 현미경, 여과 등에 의해 확인될 수 있으며, 입자의 2개 말단 사이의 최장 거리에 의해 결정된다. 구형 구조의 경우, 이러한 목적을 위해 직경은 크기와 동일하다.
유용한 겔 구조 크기 범위 및 형상은 의도하는 적용에 따라 다르다. 연조직 증대, 바람직하게는 피하 투여, 근육하 투여 또는 골막상(supraperiostal) 투여에 있어서, 생리학적 염 용액으로 처리되는 경우, 크기가 0.1 mm 초과인 겔 입자, 조각 또는 섬유가 유용하다. 본원에서, 용어 "연조직 증대"는 연조직의 임의의 유형의 부피 증대를 지칭하며, 안면 윤곽술(예, 보다 두드러진 뺨 또는 턱), 오목한 기형(concave deformity)의 보정(예, 외상후, HIV 관련 지방위축병) 및 노화와 관련된 깊은 얼굴 주름의 보정을 포함하지만, 이들로 한정되는 것은 아니다. 따라서, 연조직 증대는 예컨대 외상 또는 퇴행성 질환 후, 오로지 미용학적 목적 또는 의학적 목적을 위해 사용될 수 있다. 이들 두 가지 목적은 당업자에 의해 쉽게 구별된다. 본원에서, 용어 "연조직"은 신체의 다른 장기를 연결하거나, 지지하거나 또는 둘러싸는 조직을 지칭한다. 연조직으로는, 근육, 섬유 조직 및 지방을 포함한다. 연조직 증대는 인간을 포함한 임의의 동물에서 수행될 수 있다. 본 방법은 인간에서 수행되는 것이 바람직하다.
본원에서, 용어 "표피하(subepidermal) 투여" 또는 "피내(subcuticular) 투여"는 피부 표피 아래에의 투여를 지칭하며, 진피(dermis), 피하 조직 또는 그보다 더 깊게, 예컨대 근육 아래로의 투여 또는 적용가능한 골막(periosteum)(골조직 주변에 있음) 내로의 투여를 포함한다.
겔 구조물의 투여는 임의의 적절한 방식, 예컨대 표준 캐뉼러 및 적절한 크기의 바늘로부터의 주입, 또는 예를 들어 필름 투여의 경우 수술적 삽입에 의해 수행될 수 있다. 투여는 연조직 증대가 바람직한 곳, 예컨대 턱, 뺨 또는 얼굴이나 신체 어느 부위에서나 수행된다.
본 발명에 따른 임플란트는, 본 발명에 따른 성형된 가교 히알루론산 생성물, 예를 들어 크기가 0.1 mm 이상인 히알루론산 겔 구조물, 예컨대 입자, 비드, 섬유 또는 절단된 스트립, 및 선택적으로 완충제를 포함하는 수성 조성물일 수 있다. 본 조성물은 전형적으로 생리학적 염 완충제를 포함한다. 본 조성물은 다른 적절한 첨가제, 예컨대 국소 마취제(예, 리도카인 하이드로클로라이드), 항염증 약물, 항생제 및 다른 적절한 보조 약제, 예를 들어 골 성장 인자 또는 골 성장 세포를 더 포함할 수 있다. 본 발명에 따른 성형된 가교 히알루론산 생성물 또는 이의 수성 조성물은 사전-충진된 주사기, 즉, 멸균된 성형된 가교 히알루론산 생성물 또는 성형된 생성물을 포함하는 멸균된 수성 조성물로 사전-충진된 주사기에서 제공될 수 있다. 선택적으로, 성형된 가교 히알루론산 생성물은 주사기, 백 또는 다른 적절한 용기에서 석출된 형태로 유지될 수 있으며, 주입 전에 또는 주입 후 신체에서 이의 비-석출된 형태로 될 수 있다.
팽윤된 또는 부분적으로 팽윤된, 성형된 가교 히알루론산 생성물은, 오토클레이브가 최종 생성물을 멸균하는 가장 편리한 방식이기 때문에, 오토클레이브가능한 것이 바람직하다. 이로써, 멸균된, 성형된 가교 히알루론산 생성물이 제조될 수 있다.
본 발명에 따른 겔 구조물, 예를 들어 섬유의 크기는, 겔이 얼마나 팽윤될 수 있었는지와, 겔 구조물에 포함되고/되거나 이를 둘러싸는 완충제, 용액 또는 담체의 이온 강도에 따라 다른 것은 당연하다. 본 명세서 전체에서, 주어진 구조물 크기는 생리학적 조건, 특히 등장성 조건을 취한다. 겔 구조물이 생리학적 염 용액을 포함하고 이 용액에 분산되는 것이 바람직한 한편, 본 발명에 따른 겔 구조물은, 겔 구조물을 또 다른 장성(tonicity), 상이한 pH 용액으로 처리함으로써 상이한 크기로 될 수 있는 것으로 여겨지는 것, 또는 겔 구조물이 이의 최대 크기로 팽윤될 수 없었는지에 주목해야 한다.
본원에서, 생리학적 또는 등장성 용액은 오스몰 농도(osmolarity)가 200-400 mOsm/l, 바람직하게는 250-350 mOsm/l 범위, 보다 바람직하게는 약 300 mOsm/l인 용액이다. 사실상, 이러한 오스몰 농도는 0.9% (0.154 M) NaCl 용액의 제조에 의해 쉽게 달성된다.
본 발명에 따른 성형된 가교 히알루론산 겔 생성물은 안정하지만, 생리학적 조건 하에서 영구적이지 않다. 시험관 내에서의 안정성은 실시예 7에서 60℃에서 14일 동안 가속화된 안정성 연구에 의해 언급되어 있다. 본 발명에 따른 일 구현예에서, 성형된 가교 히알루론산 겔 생성물 중 70% 이상, 바람직하게는 90% 이상은 시험관 내에서 2주 이상, 보다 바람직하게는 2주 내지 2년 동안 유지된다. 용어 "분해된"은, 매질 중 20% 미만, 바람직하게는 10% 미만이 신체에 남아 있음을 의미한다.
본 발명에 따른 성형된 가교 히알루론산 겔 생성물은 생체 내에서 천연 히알루론산보다 분해에 대해 더욱 저항성이다. 안정한 겔 생성물이 연장되어 존재하는 것은, 처치 사이의 시간이 길어지기 때문에, 환자에게 유리하다. 또한, 생성물은, 천연 히알루론산의 높은 생체적합성을 유지하기 위해, 천연 히알루론산과 매우 유사한 것이 중요하다. 천연 HA와 유사한 생성물은 히알루로니다제 효소에 의해, 바람직하게는 99% 이상 분해되어야 한다. 본 발명에 따른 단단한 히알루론산 겔 생성물의 생물분해성은 실시예 8에 언급되어 있으며, 여기서, 본 생성물은 히알루로니다제에 의해 인식된다. 이는, 본 생성물의 천연 히알루론산과의 유사성을 반영한다.
정의
본 개시내용 전체에서, 하기 용어들은 하기와 같이 정의된다.
용어 특성 의미
HA HA는 소듐 히알루로네이트를 지칭한다
겔-형태 HA 겔-형태 HA는, 추출가능한 HA와는 대조적으로, 예를 들어 식염수를 사용한 헹굼에 의해 겔로부터 추출될 수 없는 가교된 HA이다.
추출가능한 HA 추출가능한 HA는 예를 들어 식염수를 사용한 헹굼에 의해 추출될 수 있는, 가교된 HA 또는 비-가교된 HA이다.
CHA HA 농도
Figure pct00002

mg/g, mg/mL, %(w/w), %(w/v)으로 표현된다.
SwD 팽윤도
Figure pct00003

SwD는 바람직하게는 g/g, mL/g 또는 무치수(dimensionless) 숫자로 표현된다. SwD는, 0.9% 식염수에서 완전히 팽윤된 겔 내의 겔-형태 HA의 농도의 역수이며, 즉, 건조 가교된 HA 1 g 당 형성될 수 있는 완전히 팽윤된 겔의 부피 또는 질량이다. SwD는 생성물의 최대 액체-흡수(0.9% 식염수) 용량을 기술한다.
Cmin 최소 HA 농도 0.9% 식염수에서 완전히 팽윤된 겔 내의 겔-형태 HA의 농도로서, 통상 mg/g 또는 mg/mL로 표현된다.
Figure pct00004
GelC 겔 함량
Figure pct00005

g/g, 무치수 숫자 또는 %로 표현된다. 겔 함량은 생성물 내 총 HA 함량 중 겔-형태로 결합된 HA의 비율이다.
MoD 변형도
Figure pct00006

몰/몰, 무치수 숫자 또는 몰%로서 표현된다. MoD는, HA에 결합된 가교제(들)의 양, 즉, 반복 HA 이당류 유닛의 총 몰량에 대한 결합된 가교제(들)의 몰량을 기술한다. MoD는 HA가 가교제(들)에 의해 화학적으로 변형된 정도를 반영한다.
CrR 가교제 비율
Figure pct00007

여기서, X는 가교제이다. CrR은 또한, 하기와 같이 표현될 수 있다:
Figure pct00008

몰/몰, 무치수 숫자 또는 몰%로서 표현된다. CrR은, 2개(또는 그 이상)의 이당류(오로지 HA-X-HA)에 결합된 총 결합된 가교제(HA-X-HA 및 HA-X)의 비율을 기술한다.
MoE 변형 효율
Figure pct00009

MoE는 mg/g으로 표현되는 Cmin와, %로 표현되는 MoD 사이의 비율로서 수득되는 무치수 숫자이다. MoE는, 가교제(들)에 의한 화학적 변형의 특정한 비율에서 달성된, 화학적 변형 및 분자적 꼬임 둘 다에 의해 유발되는 상호작용의 양을 기술한다.
예: Cmin=35 mg/mL이고 MoD=1.15%인 생성물의 경우 MoE는 약 30이며, 하기와 같이 계산된다:
Figure pct00010
G' 탄성률 탄성률은 탄성 변형에 대한 겔의 저항성을 기술하며, Pa(파스칼)로 표현된다. 강한 겔은 약한 겔과 비교하여 더 큰 숫자를 제공할 것이다.
G'' 점성률 점성률은 점성 변형에 대한 겔의 저항성을 기술하며, Pa(파스칼) 단위로 표현된다. G'와 더불어, 점성률은 변형에 대한 총 저항성을 기술한다.
이로 제한하는 것은 아니지만, 본 발명은 하기 실시예에서 예시될 것이다.
실시예 부문
분석 방법
HA 농도의 확인
HA 함량의 확인 방법은 Ph. Eur. 1472에 기술된 소듐 히알루로네이트에 대한 분석 시험으로부터 채택된다. 이 방법의 원리는, 황산에서 가열에 의해 형성되는 푸르푸랄 유도체의 축합 반응은 카르바졸 시약을 사용하여 수행하여, 보라색 생성물을 형성한다는 것이다. 이 반응은 HA의 D-글루쿠론산 부분에 특이적이다. 흡광도를 530 nm에서 측정하고, 글루쿠론산을 표준화에 사용한다.
샘플 내 D-글루쿠론산(GlcA)의 함량으로부터 형성된 생성물을 카르바졸과의 반응으로 확인한다. 균질한 샘플 용액을 얻기 위해, HA의 안정화된 겔을 70℃에서 황산으로 분해하고, 0.9% NaCl-용액으로 희석시킨다. 용액을 95℃에서 황산과 혼합한 다음, 카르바졸 시약과 혼합한다. 반응에 의해 보라색 용액이 수득된다. 색상의 강도는 530 nm에서 비색계(colorimeter)로 측정하고, 각각의 샘플의 흡광도는 GlcA-함량에 정비례한다. HA 함량을 각각의 샘플 내 GlcA-함량으로부터 계산한다.
겔 함량( GelC )의 확인
GelC는 겔 형태로 결합된 총 HA의 비율을 %로 기술한다. 겔 함량은 0.22 ㎛ 필터를 통과하지 못한 샘플에서 HA의 양으로서 정의된다. GelC는 여과물, 본원에서 지칭되는 추출가능한 HA에 수집된 HA의 양으로부터 계산된다. 겔 함량 및 추출가능한 HA 함량은 겔 샘플 내 HA의 총량의 %로 제공한다. 간략하게는, 겔 함량은, 특정 양의 겔 샘플을 시험 튜브에서 0.9% NaCl과 혼합함으로써 확인한다. 겔이 팽윤되도록 놔두며, 이후 NaCl-상을 0.22 ㎛ 필터를 통한 여과에 의해 겔-상으로부터 분리한다. 여과물에서 HA의 농도는, HA 농도의 확인 절차에 따라 확인한다.
팽윤도( SwD )의 확인
SwD는 생성물의 액체-흡수력, 즉, 0.9% NaCl을 흡수하는 능력을 기술한다. 생성물은 전형적으로 건성의 가교된 HA 겔이다. 건조 생성물은 석출될 수 있거나 또는 석출될 수 없다. SwD는, 식염수에서 특정 중량의 건조 생성물을 팽윤시키는 경우 형성되는 완전히 팽윤된 생성물의 중량으로부터 확인될 수 있다. 건조 생성물이 석출되는 경우, 이는 이들 조건 하에서 비-석출된 형태로 되돌아갈 것이다.
예정된 중량(전형적으로 0.1 g)의 건조 생성물을 과량의 0.9% NaCl(aq)로 처리하고, 생성물이 실온(23℃)에서 1시간 동안 팽윤되도록 놔둔다. 비-흡수된 액체를 제거한 후, 완전히 팽윤된 생성물을 수집하고, 칭량한다. 비-흡수된 액체의 제거는 또한, 가교된 겔에서 결합되지 않거나 또는 꼬이지 않은 임의의 성분, 예컨대 비-가교된 히알루로네이트 분자 및 약하게 가교된 히알루로네이트 분자를 제거한다. 이들은 완전히 팽윤된 생성물의 중량에 기여하지 않을 것이며, 이로써 겉보기에 더 낮은 SwD를 제공할 것이기 때문에, 참(true) SwD를 확인하기 위해서는 겔 함량에 대한 보정이 이루어져야 한다. 겔 함량이, 결과가 영향을 받지 않는 100%에 충분히 근접한 것으로 여겨지는 경우, 이러한 보정은 생략될 수 있다.
SwD는, 상기 기술된 바와 같이 추출가능한 HA로부터 완전히 팽윤되고 헹구어진 생성물의 중량과, 생성물에서 건성의 가교된 HA의 중량 사이의 비율로서 계산된다:
Figure pct00011
,
여기서, GelC는 무치수 숫자로 표현된다. GelC가 1(100%)에 근접하는 것으로 여겨지는 경우, SwD는 하기와 같이 계산될 수 있다:
Figure pct00012
완전히 팽윤된 생성물을 수집하고 비-흡수된 액체를 제거하는 3가지 기술이 사용되었다: 1) 팽윤된 생성물을 조각조각 수집하고, 생성물을 건조 표면과 접촉시키는 기술, 2) 금속 네트를 사용하여, 팽윤된 생성물 모두를 수집하고, 네트를 건조 표면과 접촉시키는 기술, 3) 0.2 ㎛ 필터를 통한 흡입에 의해, 팽윤된 생성물로부터 액체를 제거하는 기술. 후자의 경우, 완전히 팽윤된 생성물의 중량은 정확하게 칭량되지 않았지만, 하기 식을 사용하여, 팽윤 전의 건조 샘플의 중량, 첨가된 액체의 중량, 및 여과 시 제거된 액체의 중량으로부터 계산되었다:
m 완전히 팽윤된 겔 생성물 = m 첨가된 액체 - m 제거된 액체 + m 건조 생성물 .
주목하게는, 더 강한 겔은 더 낮은 SwD를 가질 것이며, 한편 더 약한 겔은 더 높은 SwD를 가질 것이다.
최소 농도( C min )의 확인
Cmin은 모든 추출가능한 HA를 제거한 후, 0.9% NaCl에서 완전히 팽윤된 가교된 HA 겔 생성물 내의 겔-형태 HA의 농도를 기술한다. 생성물은 더 이상 액체를 흡수할 수 없기 때문에, 이 농도는, 이러한 특정 겔 생성물에 대해 수득될 수 있는 최소 HA 농도이다. 주목하게는, 더 강한 겔은 더 높은 Cmin을 가질 것이며, 한편 더 약한 겔은 더 낮은 Cmin을 가질 것이다.
Cmin은 하기 관계식을 사용하여, 전술한 바와 같이 SwD의 확인과 유사하게 확인된다:
Figure pct00013
.
변형도(MoD)의 확인
MoD는 반복 HA 이당류 유닛의 총수에 대한 결합된 가교제(들)의 몰량을 기술한다. 이러한 측정은 모노연결된 가교제(들)와 실제로 가교된 가교제(들)를 구별하지 못하며, 즉, 하나 이상의 공유 결합을 통해 HA에 결합된 모든 가교제(들)가 포함된다. 예를 들어, BDDE로 가교된 HA 겔의 경우 1%의 MoD는, HA 겔에서 100개 이당류 유닛 당 BDDE의 결합된(모노연결된 또는 가교된) 분자가 1개 존재함을 의미한다.
MoD는 효소적으로 분해된 겔 생성물 상에서 NMR 분광학을 이용하여 확인한다. 가용성 HA, 잔여(비-결합된) 가교제(들) 및 이들의 유도체는 0.22 ㎛ 필터 상에서의 여과에 의해 겔 분해 전에 세정되어 제거된다. 겔 생성물은 37℃에서 아스 로박터 아우레센스(Arthrobacter aurescens) 유래의 콘드로이티나제 AC를 사용한 효소적 처리에 의해 분해된다. 분해된 겔 생성물을, 표준 5 mm 프로브가 구비된 400 MHz 분광계 상에서의 1차원적 1H NMR 스펙트럼을 기록함으로써 NMR 분광학 처리한다.
NMR 스펙트럼은 연결된 BDDE 분자 중의 4개 양성자로부터 기원되는 δH 1.6 ppm에서의 신호와, HA 이당류의 N-아세틸글루코사민 잔기 상의 CH3 기의 3개 양성자로부터 기원되는 δH 2.0 ppm에서의 신호를 적분함으로써 평가한다. 이들 2개 신호에 대한 적분값들 사이의 비율은, 각각의 신호에 관여하는 양성자의 신호에 대한 보정 후, 결합된 BDDE의 몰량과 이당류의 몰량 사이의 비율에 비례하며, MoD가 수득된다.
Figure pct00014
변형 효율( MoE )의 확인
MoE는 최소 HA 농도와 겔의 변형도 사이의 비율, 즉:
Figure pct00015
이다.
Cmin (mg/g 또는 mg/mL) 및 MoD (%)는 전술한 바와 같이 확인된다. Cmin은 겔으 강도와 밀접하게 관련되어 있기 때문에, MoE는, 가교 절차가, 원하는 강도의 겔을 생성하는 데 있어서 얼마나 효율적인지의 측정값이다. MoE가 높은 공정은 높은 Cmin 및 낮은 MoD를 가진 겔을 생성할 것이며, 즉, HA의 제한된 화학적 변형에도 불구하고, 강한 겔이 생성된다.
가교제 비율( CrR )의 확인
CrR은, 2개(또는 그 이상)의 이당류(HA-X-HA)를 결합시킨, 총 결합된 가교제(들)(HA-X-HA 및 HA-X)의 비율을 기술한다:
Figure pct00016
여기서, X는 가교제이다.
이 방법은, 아스로박터 아우레센스 유래의 콘드로이티나제 AC 또는 프로테우스 불가리스(Proteus vulgaris ) 유래의 콘드로이티나제 AB를 사용하여 HA 겔을, 주요 이당류로 이루어진 단편(△di-HA)과, 1-16개의 이당류를 함유하는 결합된 가교제를 가진 단편(HA-X)으로 분해한 후, SEC-UV-MS를 이용한 HA-X 단편들의 확인을 토대로 한다. 단편들을 크기 배제 크로마토그래피(SEC)에 의해 분리하고, 질량 분광법(MS)을 이용하여 검출한다. 각각의 단편 그룹에 대한 피크 영역을 합하고, CrR을 하기와 같이 계산한다:
Figure pct00017
.
모든 유형의 HA-X 단편들은 MS 검출기에서 동일한 반응을 가지는 것, 즉, 특정 피크 영역은 모든 유형의 HA-X 단편들에 대해 주어진 몰량에 상응하는 것으로 가정된다(Kenne et al., Carbohydrate Polymers 91 (2013) 410-418).
CrR의 확인 시, 에테르 연결에 의해 결합된 BDDE를 포함하는 것에 오로지 주의를 기울여야 한다. 가교 동안의 조건에 따라, BDDE는 에테르 연결 및 에스테르 연결 둘 다를 통해 HA에 결합될 수 있다. 에스테르 연결은 쉽게 가수분해되기 때문에, 겔 강도 및 장기간 저장에 기여할 것은 오로지 에테르-결합된 BDDE이다. 에스테르-결합된 BDDE를 가진 단편은 에테르-결합된 BDDE와 동일한 질량을 가지지만, 약간 상이한 크로마토그래피 체류 시간을 가지기 때문에 검출될 수 있다. 임의의 에스테르-결합된 BDDE가 없는 CrR을 확인하기 위해서는, 샘플을 분석 전에 가수분해시켜야 한다. 샘플의 가수분해는 예를 들어, 효소적 분해 전 또는 후에, 염기를 첨가하고/거나 열을 가함으로써 수행될 수 있었다.
pH의 확인
pH 확인은 유리 전극을 사용하여 주위 온도에서 퍼텐셜측정적으로(potentiometrically) 수행한다. 팽윤된 생성물의 pH 확인에 사용되는 방법은 USP 방법 <791>을 토대로 한다. 절차: 주위 실온에서, pH 7.0 및 pH 4.0에서의 표준화를 위해 완충액으로 pH-미터를 보정한다. (모든 측정용) 샘플 약 1.2 mL을 적절한 용기에 옮긴다. 샘플이 실온에 있도록 보장한다. 각각의 측정들 사이에, 전극을 증류수에서 세정하고, 조심스럽게 닦아 낸다.
공정 용액, 특히 유기 용매의 pH 확인을 위한 방법은 상기와 같으나, 보정은 pH 7.0 및 pH 10.0에서 수행된다.
물과 유기 용매(들)의 혼합물에서 측정되는 pH 값은, 동일한 농도의 염기, 예를 들어 수산화나트륨(NaOH)에 대해 순수한 물 용액에서 측정되는 pH와 비교하여 차이가 난다. 따라서, 겉보기 pH(pHapp)라는 표현은, 유기 용매(들)의 수성 혼합물에서 측정되는 pH에 대해 사용된다. 겉보기 pH는 몇몇 인자들, 유기 용매(들)의 유형, 유기 용매(들)의 농도, 온도, 이온 강도 및 혼합물에서 다른 화합물의 존재에 따라 다르다.
실험 부문에서 보고되는 겉보기 pH 값은, pH 범위 0-14에 대해, Mettler Toledo Inlab Routine Pro 전극을 사용하여 Mettler Toledo MA 234 pH/Ion 분석기로 측정하였다.
유동측정
진동 방식의 유동측정을 사용하여, 팽윤된 겔 생성물의 점탄성을 확인하였다. 탄성률(G')은 탄성 변형에 대한 겔의 물리적 저항성의 측면에서 겔 강도를 기술한다. 점성률(G'')은 점성 변형에 대한 겔의 물리적 저항성의 측면에서 겔 강도를 기술한다. 측정은 진동 유량계를 사용하여 수행된다.
유동측정은 하기와 같이 수행한다. 진동수 스윕(frequency sweep)을, 샘플 로딩과 측정 사이에 적어도 15분의 휴식 시간과, 0.1%의 스트레인(strain)(γ)을 두고 만든다. 직경이 25 mm인 평행판 프로브를 2 mm 간격을 두고 사용한다. 탄성률(G') 및 점성률(G'')의 평균값을 진동수 스윕으로부터 0.1 Hz 및 1 Hz에서 평가한다. 선형 점탄성 범위 내에서의 스트레인(γ)에서 진동수 스윕이 수행되었는지 입증하기 위해, 진폭 스윕(amplitude sweep)을 1 Hz에서 만든다.
효소 분해성의 확인
가교된 겔이 생물분해성의 측면에서 천연 HA와 동일한지 입증하기 위해, 효소 분해를 수행하고, 이것이 양의 고환으로부터 유래된 히알루로니다제에 의해 분해되는지 확인한다.
예정된 중량의 생성물(건조하거나, 또는 알려진 농도로 팽윤된)을 0.9% 식염수 100 mL에서 37℃에서 밤새 팽윤시킨다. 양의 고환 유래의 히알루로니다제(Type II, H2126 Sigma)를 첨가하여, 효소 농도를 200 U/mL로 수득하고, 조제물을 37℃에서 밤새 진탕되도록 설정한다. 용액을 0.22 ㎛ 필터를 통해 여과하고, 여과물 내의 HA의 양을 카르바졸 방법을 이용해 확인한다. 분해를, 여과물 내 HA의 양 : 샘플 내 HA의 총량의 비율로서 계산한다.
실시예
실시예 1 - 가교 공정
분자량 0.8-3 MDa의 소듐 히알루로네이트 약 1 g을 0-40% 에탄올 및 0-120 mM 강염기를 포함하는 10-50 mL의 수용액에 용해시켰다. 완전히 용해시킨 후, 생성된 히알루로네이트 용액은 앞서 기재된 바와 같이 측정했을 때 pHapp가 6-13였다. (제조 단계)
히알루로네이트 용액을 0.3-0.5 mm 직경의 개구를 통해 유기 용매를 포함하는 액체 매질로 압출하였다. 압출된 히알루로네이트 용액은 히알루로네이트 섬유로 즉시 석출하였다. (석출 단계)
그 후 약 1 g의 석출된 HA 섬유를 65-80%의 유기 용매, 0.3-1.2 g (30-230 mM)의 가교제, 및 1-75 mM의 강염기를 포함하는 수성 가교 매질 약 20-70 mL로 이동시켰다. 히알루로네이트는 석출되어 섬유 형태로 남아 있었다. 생성된 HA를 포함하는 가교 매질은 pH가 11.5 이상이었다. HA 섬유는 수성/유기 가교 매질 중에 가교되도록 하였다. (가교 단계)
그렇게 얻어진 가교된 히알루로네이트 섬유는 가교 매질로부터 제거하고, 인산 등으로 중화시켰다. 가교된 HA 섬유는 약 1시간 동안 감압하(~200 mbar) 실온에서 진공 챔버 중에서 건조하였다.
석출된 중간산물은 다음과 같이 특징화된다. 건조 가교된 히알루로네이트 섬유의 중략을 측정하였다. 건조된 섬유는 과량의 0.9% 수성 식염수 중에 흠뻑 적셔, 액체를 충분히 흡수하도록 하였다. 그 다음에, 섬유는 수성 겔을 형성하였고, 섬유의 평형 (최대) 팽윤이 달성될 때까지 식염수를 흡수시켰다. 겔 섬유는 과량의 식염수 및 비-가교된 히알루로네이트의 용액으로부터 수동으로 제거하고, 저울로 직접 이동시켰다. 충분히 팽윤된 섬유의 중량을 측정하였다. 식염수 흡수 결과로부터, 충분히 팽윤된 겔 내 특정 소듐 히알루로네이트 농도(Cmin)에 해당하는, 팽윤도(SwD)를 측정하였다.
생성된 가교된 히알루로네이트 섬유의 변형도(MoD)는 전술한 바와 같이 NMR 분광법으로 측정하였다. 간략하게는, 결합된(linked) BDDE로부터의 신호의 강도는 HA 중 아세틸기로부터의 신호와 관련이 있다. 결합된 BDDE 관련 HA의 몰비는 신호를 일으키는 프로톤 수를 수정한 후 산출할 수 있다. 이에 대응되는 변형 효율(MoE)은 팽윤도로부터 산출하였다.
전술한 가교된 HA 섬유의 석출된 중간산물은 다음과 같이 규정된 HA-농도로 팽윤되도록 하였다. 인산염 완충 식염수 용액 (4 mM 인산염 및 150 mM NaCl) 등을 약 10-40 mg HA/mL 농도로 건조된 HA 섬유에 첨가하였다. 부분적으로 팽윤된 겔을 10 mL의 플라스틱 주사기에 충진하였다. 충진된 주사기를 습열을 사용하여 123℃에서 약 20분의 최종 평형 시간(F0)으로 멸균하였다. 오토클레이브 처리된 주사기의 함량은 앞서 설명한 방법으로 pH, HA 농도, 팽윤도(SwD), 및 최소 농도(Cmin)와 관련하여 특징화되고, MoE는 중간산물에 대해 결정된 MoD로부터 산출하였다.
가교된 HA 섬유를 전술한 바와 같이 제조하였다. 석출된 중간산물에 대한 분석 데이터는 하기 표 1에 나타내었고, 팽윤 및 오토클레이브 처리된 생성물에 대해 얻어진 데이터는 하기 표 2에 나타내었다.
생성물의 특징화 (석출된 중간산물)
실험 Id 건조 HA 양 (mg) 팽윤된 HA 양 (mg) SwD*
(g/g)		 Cmin (mg/mL) MoD (%) MoE
1 - - - - 0.3 -
2 23 1181 51 20 0.7 28
3 15 2200 147 7 0.2 38
4 17 1070 62 16 0.2 73
5 17 1505 89 11 0.4 30
6 16 2110 133 8 0.2 42
7 - - - - 1.3 -
8 - - - - 0.4 -
9 - - - - 0.5 -
10 - - - - 0.2 -
11 - - - - 0.3 -
12 16 501 32 31 1.7 19
13 15 313 21 48 0.3 190
14 19.8 632 32 31 0.7 46
15 - - - - 0.5 -
* 공정 1에 따라 측정됨
팽윤 및 오토클레이브 처리된 생성물의 특징화
실험 Id pH HA 농도 (mg/mL) SwD**
(mL/g)		 Cmin
(mg/mL)		 MoE
1 6.9 20* 110 9 28
2 - - - - -
3 7.3 19 85 12 65
4 - 20* - - -
5 - - - - -
6*** 7.2 20* 139 7 40
7 7.6 20* 23 43 32
8 6.6 20* 40 25 59
9 7.1 20* 21 47 97
10 7.2 20* 96 10 44
11 7.3 20* 55 18 55
12 - - - - -
13 7.3 20* 23 44 174
14 - - - - -
15 7.9 20* 97 10 21
* 추정된 HA 농도
** 공정 3에 따라 측정됨
*** 전술한 팽윤 단계에서, 인산염 완충 식염수 용액 mL 당 2 mg 리도카인 하이드로클로라이드를 첨가하였음
실시예 2 - 상이한 가교제로 가교
히알루로네이트 용액을 실시예 1에 기재된 대로 제조하였다. 완전히 용해시킨 후, 생성된 히알루로네이트 용액은 앞서 기재된 바와 같이 측정했을 때 pH가 9 이상이었다. 히알루로네이트 용액을 0.5 mm 직경의 개구를 통해 99.5% 에탄올을 포함하는 액체 매질로 압출하였다. 압출된 히알루로네이트 용액은 히알루로네이트 섬유로 즉시 석출하였다.
약 1 g의 석출된 HA 섬유를 70% 에탄올, 가교제 및 NaOH를 포함하는 수성/유기 가교 매질로 이동시켰다. 히알루로네이트는 석출되어 섬유 형태로 남아 있었다. 생성된 HA를 포함하는 가교 매질은 pH가 11.5 이상이었다.
HA 섬유는 수성/유기 가교 매질 중에 가교되도록 하였다. 그 후 얻어진 가교된 히알루로네이트 섬유는 가교 매질로부터 제거하고, 인산으로 중화시켰다. 가교된 HA 섬유는 약 2시간 동안 감압하(~200 mbar) 실온에서 진공 챔버 중에서 건조하였다.
전술한 가교된 HA 섬유의 석출된 중간산물은 다음과 같이 규정된 HA-농도로 팽윤되도록 하였다. 인산염 완충 식염수 용액을 약 20 mg HA/mL 농도로 건조된 HA 섬유에 첨가하였다. 부분적으로 팽윤된 겔을 10 mL의 플라스틱 주사기에 충진하였다. 충진된 주사기를 습열을 사용하여 123℃에서 약 20분의 최종 평형 시간(F0)으로 멸균하였다. 오토클레이브 처리된 주사기의 함량은 앞서 설명한 방법으로 pH, 팽윤도(SwD 공정 3), 최소 농도(Cmin), 변형도(MoD) 및 변형 효율(MoE)과 관련하여 특징화되었다. 표 3에 나타낸 결과는 상이한 다이에폭사이드가 상기 공정에서 유용한 가교제라는 점을 시사한다.
생성물의 특징화
가교 pH SwD* (mL/g) Cmin (mg/mL) MoD (%) MoE
EDDE** 7.6 24 41 1.5 27
EDDE** 7.3 12 86 2.8 31
다이에폭시옥탄 7.9 97 10 0.5 21
* 공정 3에 따라 측정, HA 농도는 20 mg/mL로 추정됨
** 1,2-에탄다이올 다이글리시딜 에테르, 순도 50%
실시예 3 - 메탄올 중에 가교
히알루로네이트 용액을 실시예 1에 기재된 대로 제조하였다. 완전히 용해시킨 후, 생성된 히알루로네이트 용액은 앞서 기재된 바와 같이 측정했을 때 pH가 9 이상이었다. 히알루로네이트 용액을 0.5 mm 직경의 개구를 통해 99.5% 에탄올을 포함하는 액체 매질로 압출하였다. 압출된 히알루로네이트 용액은 히알루로네이트 섬유로 즉시 석출하였다.
약 0.75 g의 석출된 HA 섬유를 80% 메탄올, 1,4-부탄다이올 다이글리시딜 에테르(BDDE), 및 NaOH를 포함하는 수성 가교 매질로 이동시켰다. 히알루로네이트는 석출되어 섬유 형태로 남아 있었다. 생성된 HA를 포함하는 가교 매질은 pH가 11.5 이상이었다.
HA 섬유는 수성/유기 가교 매질 중에 가교되도록 하였다. 그 후 얻어진 가교된 히알루로네이트 섬유는 가교 매질로부터 제거하고, 인산으로 중화시켰다. 가교된 HA 섬유는 약 1시간 동안 감압하(~200 mbar) 실온에서 진공 챔버 중에서 건조하였다.
팽윤도는 SwD 공정 1에 따라 측정하였다. 가교된 섬유의 건조된 중간산물은 인산염 완충 식염수 용액 중에 20 mg HA/mL로 팽윤하도록 하였다. 팽윤된 겔을 10 mL의 플라스틱 주사기에 충진하였다. 충진된 주사기를 습열을 사용하여 123℃에서 약 20분의 최종 평형 시간(F0)으로 멸균하였다. 오토클레이브 처리된 주사기의 함량은 앞서 설명한 방법으로 pH 및 변형도(MoD)와 관련하여 특징화되었다. 생성된 겔 제형은 pH가 6.8이고, MoD는 0.34%였다.
실시예 4 - 이소프로판올 중에 가교
히알루로네이트 용액을 실시예 3에 기재된 대로 제조하였다. 약 0.5 g의 석출된 HA 섬유를 70% 이소프로판올, 1,4-부탄다이올 다이글리시딜 에테르(BDDE), 및 NaOH를 포함하는 30 mL의 수성 가교 매질로 이동시켰다. 히알루로네이트는 석출되어 섬유 형태로 남아 있었다. 생성된 HA를 포함하는 가교 매질은 pH가 11.5 이상이었다. 생성된 HA를 포함하는 가교 매질은 pH가 11.5 이상이었다.
HA 섬유는 수성/유기 가교 매질 중에 가교되도록 하였다. 그 후 얻어진 가교된 히알루로네이트 섬유는 가교 매질로부터 제거하고, 인산으로 중화시켰다. 가교된 HA 섬유는 약 1시간 동안 감압하(~200 mbar) 실온에서 진공 챔버 중에서 건조하였다.
가교된 섬유의 건조된 중간산물은 인산염 완충 식염수 용액 중에 20 mg HA/mL의 HA-농도로 팽윤하도록 하였다. 팽윤된 겔을 10 mL의 플라스틱 주사기에 충진하였다. 충진된 주사기를 습열을 사용하여 123℃에서 약 20분의 최종 평형 시간(F0)으로 멸균하였다. 오토클레이브 처리된 주사기의 함량은 앞서 설명한 방법으로 pH, 팽윤도(공정 3에 따름), 겔 함량 및 변형도(MoD)와 관련하여 특징화되었다. 최소 농도 Cmin 및 변형 효율(MoE)은 전술한 바와 같이 산출하였다. 생성된 겔 제형은 pH 7.6, SwD 47 g/g HA, Cmin 21 mg/mL, MoD 0.41%, 및 MoE 52를 가졌다.
실시예 5 - 원하는 형태 및 구조로 가교
히알루로네이트 용액을 실시예 1에 기재된 대로 제조하였다. 완전히 용해시킨 후, 생성된 히알루로네이트 용액은 앞서 기재된 바와 같이 측정했을 때 pH가 9 이상이었다.
다른 형태 또는 구조를 가진 석출된 HA 기질을 다음과 같은 방법으로 상기 히알루로네이트 용액으로부터 제조하였다:
1) 액적을 형성하는 0.5 mm 직경의 개구를 통해 압출;
2) 네트를 형성하는 0.5 mm 직경의 개구를 통해 압출;
3) 필름을 형성하는 플라스틱 포일 상에 스프레딩, 및
이어서 99.5% 에탄올의 액체 매질에 침지시켰다. 압출된 히알루로네이트 용액은 각각 히알루로네이트 액적, 네트 및 필름으로 즉시 석출되었다.
그 후 각각 석출된 HA 기질 약 1 g을 70% 에탄올, 1,4-부탄다이올 다이글리시딜 에테르(BDDE) 및 NaOH를 포함하는 수성 가교 매질 45 mL로 이동시켰다. 가교 반응 동안, 히알루로네이트는 석출되고 예정된 형태로 남아 있었다. 생성된 HA를 포함하는 가교 매질은 pH가 11.5 이상이었다.
가교를 끝낸 후, 가교된 히알루로네이트 제형을 가교 매질로부터 수동으로 제거하고, 인산으로 중화시키고, 제형의 특징화하기 전에 약 1시간 동안 감압하(~200 mbar) 실온에서 진공 챔버 중에서 건조하였다.
팽윤도(SwD)는 액적 및 필름에 대해 측정하였다. 건조 가교된 히알루로네이트 샘플의 알려진 양을 과량의 0.9% 수성 식염수에 담가 두어, 액체를 충분히 흡수하도록 하였다. 그리고 나서 샘플은 수성 겔을 형성하였고, 샘플의 평형 (최대) 팽윤이 달성될 때까지 식염수를 흡수시켰다. 그런 다음, 겔 샘플을 과량의 식염수 및 최종적으로 비-가교된 잔여 히알루로네이트의 용액으로부터 수동적으로 제거하였으며, 저울로 직접 옮겼다. 최대 식염수 흡수(maximum saline uptake)를, 팽윤된 겔의 중량을 건조 물질의 초기 중량과 비교함으로써, 추정하였다. 결과를 팽윤도 (SwD 공정 1) 및 최소 농도 (Cmin) 둘 다로서 표 4에 제시한다. 네트를 전술한 바와 같이 과량의 0.9% 수성 식염수에서 팽윤시켰다. 팽윤된 겔을 도 1에 도시한다.
가교된 히알루로네이트 액적 및 필름의 변형도(MoD)를 전술한 바와 같이 NMR 분광법으로 확인하였다. 간략하게는, 연결된 BDDE로부터의 신호 강도는 HA 중의 아세틸기로부터의 신호와 관련 있다. 그런 다음, 신호를 내는 양성자의 수에 대한 보정 후, HA에 대한 연결된 BDDE의 몰비를 계산하였다. MoD 및 계산된 변형 효율(MoE)의 결과를 표 4에 제시한다.
가교된 액적의 건조된 중간 산물을 인산염 완충 식염수에서 20 mg HA/mL의 HA 농도로 팽윤시켰다. 팽윤된 겔을 10 mL 플라스틱 주사기 내로 충진하였다. 충진된 주사기를 123℃에서 보습 가열하여 멸균시켰으며, 이때, F0는 약 20분이었다. 오토클레이브된 액적으로부터의 결과를 또한, 표 4에 제시한다.
표 4
샘플 SwD (g/g HA) Cmin (mg/mL) MoD (%) MoE
액적 60* 17 0.47 36
오토클레이브된 액적 58** 17 0.47 37
필름 115* 9 0.43 20
* 공정 1에 따라 측정됨
** 공정 3에 따라 측정됨
결과는, 가교 공정 및 오토클레이브 동안에 유지되는 예정된 형태의 가교된 HA 물질을 제조하는 것이 가능함을 보여준다.
실시예 6 - 염기성 섬유(alkaline fibre)의 가교
실시예 1에 기술된 바와 같이 히알루로네이트 용액을 제조하였다. 완전히 용해시킨 후, 제조되는 히알루로네이트 용액은 상기와 같이 측정하였을 때 pH가 9 보다 높았다. 이 히알루로네이트 용액을 21G 바늘 (내경 0.5 mm)을 통해 99.5% 에탄올 액체 매질로 밀어내었다. 압출된 히알루로네이트 용액은 즉각적으로 히알루로네이트 섬유로 석출되었다.
석출된 비-세정 HA 섬유 약 1 g을, 70% 에탄올과 1,4-부탄다이올 다이글리시딜 에테르 (BDDE)를 함유한 가교 수용액 65 mL로 이동시켰다. 히알루로네이트는 여전히 석출된 상태이며, 염기성을 띄며 섬유 형태를 유지하였다. 염기성 HA 섬유를 투입한 후 수득되는 가교 매질은 pH가 11.5 보다 높았다.
이 HA 섬유를 수성/유기성 가교 매질 중에서 가교되게 하였다. 그런 후, 수득되는 가교된 히알루로네이트 섬유를 상기 가교 수성 매질로부터 취하고, 여기에 인산을 첨가하여 중화시킨 후, 감압 하 (~200 mbar) 실온에서 약 1시간 동안 진공 챔버에서 건조한 다음, 특징을 규명하였다.
가교된 섬유를 건조시킨 중간산물은 포스페이트 완충화된 염 용액에서 약 20 mg/mL의 HA-농도로 팽윤시켰다. 어느 정도 팽윤된 겔을 10 mL 플라스틱 주사기에 충전하였다. 충전된 주사기를 123℃에서 습식 열 처리하여 멸균하였으며, 최종 F0는 대략 20분이었다. 자동멸균된 주사기의 내용물에 대해, pH, 팽윤도 (SwD), 겔 함량 및 변형도(degree of modification: MoD)를 전술한 방법에 따라 규명하였다. 최소 농도 Cmin와 변형 효율 (modification efficiency: MoE)를 전술한 바와 같이 계산하였다. 그 결과는 표 5에 나타낸다.
제형 겔 제형의 pH SwD* (g/g HA) Cmin
(mg/mL)		 MoD (%) MoE
1 6.6 170 6 0.10 59
2 6.8 51 20 0.25 78
* 절차 3에 따라 측정하고, 겔 함량으로 교정함
즉, 최종 대략적인 pH가 11.5 보다 높은 70% 알코올을 함유한 중성 가교 매질 중에서의 염기성 섬유의 가교를 통해, 충분히 형성된 겔 섬유 (defined gel fibre)가 수득되었다.
실시예 7 - 생체적합성 및 안정성 실험
생체내 물질의 생체적합성을 조사할 목적으로, 실시예 1에 기술된 바에 따라 4가지 제형을 제조하였다. 완전히 용해시킨 후, 제조되는 히알루로네이트 용액은 상기와 같이 측정하였을 때 pH가 9 보다 높았다. 이 히알루로네이트 용액을 18G (Ф 0.8 mm; 제형 1과 2) 또는 25G (Ф 0.3 mm; 제형 3과 4) 크기의 개구부를 통해 99.5% 에탄올 액체 매질로 밀어내었다. 압출된 히알루로네이트 용액은 즉각적으로 히알루로네이트 섬유로 석출되었다.
석출된 비-세정 HA 섬유 약 1 g을 70% 에탄올, 1,4-부탄다이올 다이글리시딜 에테르 (BDDE) 및 NaOH를 함유한 가교 수용액 60 mL로 이동시켰다. 제형 2와 4에는 제형 1과 3 보다 BDDE 농도를 4배 높게 사용하였다. 히알루로네이트는 여전히 석출된 상태이며, 섬유 형태를 유지하였다. HA를 포함하여 수득되는 가교 매질은 전술한 장치로 측정하였을 때 pH가 11.5 보다 높았다.
이 HA 섬유를 수성/유기성 가교 매질 중에서 가교되게 하였다. 그런 후, 수득되는 가교된 히알루로네이트 섬유를 상기 가교 수성 매질로부터 취하고, 여기에 인산을 첨가하여 중화시킨 후, 감압 하 (~200 mbar) 실온에서 약 1시간 동안 진공 챔버에서 건조한 다음, 특징을 규명하였다.
건조된 섬유를 과량의 0.9% 식염수에 넣여, 자유롭게 액체를 흡수하게끔 하였다. 이후, 섬유는 수성 겔이 되었으며, 섬유의 평형 (최대) 팽윤에 도달할 때까지 식염수를 흡수하였다. 그런 후, 겔 섬유를 과량의 식염수와 비-가교된 히알루로네이트 용액으로부터 수동으로 꺼내, 바로 저울로 이동시켰다. 완전히 팽윤된 섬유의 무게를 석출된 물질의 최초 중량과 비교하여 식염수의 최대 흡수량을 산출하였다. 멸균 처리하기 전에 겔 섬유로부터 수득한 결과는, 팽윤도 (SwD) 및 HA 최소 농도 (Cmin)로서 표 6에 나타낸다.
제형 건조 섬유의 무게 (mg) 완전히 팽윤된 섬유의 무게 (mg) SwD* (g/g HA) Cmin (mg HA/mL) MoD (%) CrR (%) MoE
1 14 1144 81 12 0.29 51 43
2 26 739 28 36 1.22 46 29
3 14 1397 100 10 0.28 50 36
4 14 478 34 29 1.13 47 26
* SwD 절차 1에 따라 측정함
수득한 가교된 히알루로네이트 섬유의 변형도(MoD)를 전술한 바와 같이 NMR 분광측정에 의해 측정하였다. 간략하게는, 연결된 BDDE의 신호 세기는 HA의 아세틸 기의 신호와 관련있다. 신호를 발생시키는 프로톤의 수를 보정한 후 연결된 BDDE/HA의 몰 비를 계산할 수 있다. 도 2a (제형 1) 및 2b (제형 2)는 탈이온수 (D2O)내에서의 효소적으로 분해된 HA-겔의 400 MHz 1H NMR 스펙트럼을 도시한 것이다. 연결된 BDDE의 신호와 N-아세틸 기의 신호가 스펙트럼에 표시된다. 각 해당 제형에 대한 MoD와 CrR 결과를 변형 효율 (MoE)과 함께 표 6에 나타낸다.
가교된 섬유의 건조시킨 중간산물을 다음과 같이 한정된 HA-농도로 팽윤시켰다. 포스페이트 완충화된 식염수를 건조된 HA-섬유에 투입하여, 약 20 mg HA/mL로 추정되는 농도로 만들었다. 제형 1과 3은 투입된 용액을 전부 흡수하였지만, 제형 2와 4는 그렇지 않았다. 팽윤된 겔을 무균 조건 하에 1 mL 유리 주사기에 충전하였다. 충전된 주사기는 125℃, 최종 F0 약 20분간 습식 열처리를 이용해 멸균하였다.
자동멸균된 주사기의 내용물에 대해, HA 농도, 겔 함량 (GelC), 팽윤도 (SwD) 및 pH를 전술한 방법에 따라 규명하였다. 멸균된 이후의 제품에 대한 결과는 표 7에 나타낸다.
제형 HA 농도 (mg/mL) GelC (%) SwD* (g/g HA) pH
1 18 96 95 7.5
2 32 ~99 25 7.6
3 19 95 87 7.6
4 36 ~99 23 7.5
* SwD 절차 3에 따라 측정하여, 겔 함량으로 보정함
표 6 및 7에서, 제형 1과 3은 제형 2와 4에 비해 견고성이 낮고 화학적인 변형도가 낮다는 것이 명확하게 명시된다. 제형 2와 4의 HA 고농도는 최대 물 흡수량이 낮고, 이들 조건 하에 제조되는 겔의 경우 HA 농도가 낮은 겔 생성물의 제조가 불가능한 것으로, 확인된다.
제형들을 바이오버든 (bioburden) (주입 플레이트 방법)과 내독소 (겔-응고 방법)에 대해 분석하였다. 제형들 모두 바이오버든은 0 cfu/주사기였으며, 내독소 수치는 <0.21 EU/mL이었다. 제형들 모두 생체적합성 순도 실험과 관련된 요건들을 충족시켰다.
현미경 검경
팽윤되고 자동멸균된 섬유를, 15분간 톨루이딘 블루 수용액 중에서 염색하여 가시화하였다. 현미경 사진을 도 3a-d에 도시한다. 3a: 제형 1; 3b: 제형 2; 3c: 제형 3; 및 3d: 제형 4. Bar = 1 mm.
안정성 검사
제형의 안정성 검사는 14일간 60℃/주위 상대 습도 (RH)에서 수행하였다. 제형들 모두 양호한 안정성을 나타내었다. 도 4는, 60℃에서 경시적인 SwD 증가를 도시한다 (SwD 절차 3에 따라 측정하고, 겔 함량에 대해 보정함). 제형 1 (◆); 제형 2 (■); 제형 3 (▲); 및 제형 4(×).
생물학적 평가
스프레그-다울리 랫 24마리에 피하 주사하여 제형의 생체적합성을 조사하였다. 동물은 마취시킨 후 등을 제모하고, 각 제형 1 mL을 피하 주사하였다. 주사는 랫은 등의 중앙선 양쪽으로 2회 실시하였다. 동물들은 2개의 그룹으로 나누었다. 하나의 그룹은 주사 후 1주일째에 안락사시키고, 다른 그룹은 주사후 3주째에 안락사시켰다. 동물들은 매일 체크하였으며, 질환의 신호가 없는지를 기록하였다. 주사된 제형들은 모든 피부 샘플들에서 거시적으로도 조직학적으로도 허용성이 우수하였다. 즉, 괴사 또는 급성 염증의 신호는 관찰할 수 없었다. 제형의 이식 부위를 둘러싼 얇은 섬유 캡슐 (도시 안됨) 이외에는 조직 반응 증상, 또는 육아종의 형성 발견되지 않았다. 제형들은 랫에서 생체적합한 것으로 결론내릴 수 있었다.
실시예 8 - 여러가지 겔 강도를 가진 겔들의 히알루로니다제에 의한 분해
실시예 1에 언급된 바와 같이 히알루로네이트 용액을 제조하였다. 완전히 용해시킨 후, 수득되는 히알루로네이트 용액의 pH는 전술한 바와 같이 측정하였을 때 11.5 보다 높았다. 히알루로네이트 용액을 0.5 mm 직경의 개구부를 통해 99.55 에탄올 액체 매질로 밀어내었다. 밀려나온 히알루로네이트 용액은 즉시 히알루로네이트 섬유로 석출되었다.
석출된 HA 섬유 약 1 g을 70% 에탄올, BDDE 및 NaOH를 함유한 가교 수용액 60 mL로 옮겼다. 히알루로네이트는 여전히 석출된 상태이며, 섬유 형태를 유지하였다. HA를 비롯하여 수득되는 가교 매질은 pH가 11.5 보다 높았다.
이 HA 섬유를 수성/유기성 가교 매질 중에서 가교되게 하였다. 그런 후, 수득되는 가교된 히알루로네이트 섬유를 상기 가교 매질로부터 취하고, 여기에 인산을 첨가하여 중화하였다. 가교된 HA 섬유를 감압 하 (~200 mbar) 실온에서 약 2시간 동안 진공 챔버에서 건조하였다.
가교된 HA 섬유의 상기와 같이 석출시킨 중간산물을 다음과 같이 한정된 HA 농도로 팽윤시켰다. 포스페이트 완충화된 식염수를 건조된 HA 섬유에 투입하여, 약 20-40 mg HA/mL 농도로 만들었다. 어느 정도 팽윤된 겔을 10 mL 플라스틱 주사기에 충전하였다. 충전된 주사기를 123℃에서 습식 열 처리하여 멸균하였으며, 최종 F0는 대략 20분이었다. 자동멸균된 주사기의 내용물에 대해, 팽윤도 (SwD 절차 2), HA 농도, HA 최소 농도 (Cmin), 변형도(MoD), 변형 효율 (MoE) 및 점탄성 특징들을 전술한 방법에 따라 규명하였다. 여러가지 생성물들 모두 "효소 분해성 결정"에 따라 히알루로니다제 분해를 실시하여, HA의 생분해성이 가교된 생성물에서 유지되는 지를 검증하였다.
그 결과는 표 8A 및 8B에 나타낸다. G'/(G'+G") 값은, 모든 제형들에서, >70%이므로, 이들 모두 겔임이 명확하게 확인된다. 아울러, G' 값은 겔이 단단함을 보여준다. 그러나, 측정된 팽윤 특성 및 유동학적 특성으로 확인되는 바와 같이, 겔은 광범위한 겔 강도 범위에서 히알루로니다제에 의해 99% 이상으로 분해가능하다. 이는, 천연 HA의 생분해성이 본 발명에 따른 겔 생성물에서도 유익하게도 유지됨을 의미한다.
표 8A
가교 공정 특징
샘플 가교 농도 SwD* (mL/g) Cmin (mg/mL) MoD (%) 히알루로니다제 의한 분해 (%) HA 농도
(mg/mL)
1 1Ф 75 14 0.2 > 99 20
2 2Ф 26 39 0.4 > 99 17
3** 6Ф 17 59 1.9 > 99 44
4 8Ф 17 59 1.6 > 99 39
* 절차 2에 따라 측정함
** 가교 온도 29℃
표 8B
샘플 G' 1 Hz (Pa) G" 1 Hz (Pa) G' 0.1 Hz (Pa) G" 0.1 Hz (Pa) G' 1 Hz (%)* G' 0.1 Hz (%)*
1 202 90 117 47 69% 71%
2 435 45 674 36 91% 95%
3 7975 527 7207 689 94% 91%
4 6485 352 5914 478 95% 93%
* G'/(G'+G")로 계산한 겔 특징.
실시예 9 - 비교예
아래 표 9A를 참조하여, EP 2 199 308 A1의 실시예 4에 따라 5종의 히알루론산 (HA) 겔 샘플을 준비하였다. 본 발명에 따른 참조 샘플 (FU0509:1)은 상기 실시예 1에 기술된 가교 공정을 이용해 준비하였다.
표 9A - 가교 조건
샘플 HA 공급업체 가교 중의 교반 가교 온도 반응 시간
(h)
1 Shiseido 안함 RT 16 h
2 Shiseido 마그넷 RT 16 h
3 Shiseido 안함 45℃ 16 h
4 Shiseido 마그넷 40℃ 16 h
5 Food Chemifa 프로펠러 RT 16 h
참조 샘플 Food Chemifa N/A RT 48 h
표 9B - 결과
샘플 MoD (%) GФ 0.1 Hz G" 0.1 Hz GФ 1 Hz G" 1 Hz
0.34 57 50 174 110
2 0.53 58 37 141 80
3 1.05 78 24 127 48
4 0.79 32 13 58 28
5 1.70 145 6 157 10
참조 샘플 0.36 853 40 932 53
표 9B를 참조하여, 모든 샘플들에서 겔이 수득되었다. 비교 샘플 1-5에 의해 제공된 불규칙적인 형태의 겔 입자들은, 본 발명에 따른 방법에 의해 제조된 샘플과 동일한 범위 안에서 MoD 값을 나타내었다. 그러나, G' 및 G" 값은 본 발명에 따른 방법에 의해 제조된 샘플과 비교해, 비교 샘플 1-5에서 현저하게 낮았다. 본 발명은 낮은 MoD에서 이미 보다 단단한 겔을 제공하기 때문에, 본 발명에 따른 방법이 EP 2 199 308 A1에 기술된 방법 보다 효과적인 것으로 결정되었다.
비교 샘플 1-5 각각의 현미경 사진 (도 5a-e 각각 50x 배율)은 생성물의 크기와 형태의 분포도가 넓다는 것을 보여주는데, 이는 EP 2 199 308 A1에 개시된 방법이 랜덤 크기의 입자들을 만든다는 것을 의미한다. 반면, 본 발명에 따른 방법에 의해 제조된 생성물의 현미경 사진 (도 5f)은 크기와 형태가 균일한 생성물을 보여준다.
실시예 10 - 석출 단계에서의 에탄올 농도
여러가지 에탄올 농도들에서 HA 스트링 석출 효과를 테스트하였다. 농도 65, 75, 85, 95 % w/w인 에탄올 수용액 4개를 제조하였다. 에탄올 (35 % w/w) + 0.5 % NaOH (w/w) 중의 HA 용액 (5 % w/w)을 소형 플라스틱 (PE) 필름 상에 수동으로 압출시키고, 에탄올 용액과 순수 (99.5 % w/w) 에탄올이 각각 든 수조에 담그거나, 또는 75% 및 85% 에탄올에 1분씩 단계적으로 담근 후 99.5% 에탄올로 이동시켰다.
제조되는 석출된 스트링을 수집하여, 광 현미경을 사용해 가시적으로 평가하였다. 스트링을 다룰 때의 감각적인 느낌도 평가하였다. 스트링은, 석출 수조에 사용되는 에탄올 농도가 높을 수록, 보다 부드럽고 더 평평한 표면을 가지고 있으며, 컬링이 강하고, 부서지기 쉬운 것으로 관찰되었으며, 더 많은 번들 구조를 나타내었다.
단계적으로 석출시킨 (75 % -> 85 % -> 99.5 %) 스트링은 75 w/w% 또는 85 w/w%에서만 석출시킨 스트링과 유사한 행태를 나타내었다. 이들 조건에서 65% 에탄올을 사용한 경우 HA는 완전히 석출되지 않는 것으로 관찰되었다. 20분간 65% 에탄올 중에 둔 다음 99.5% 에탄올에서 완전히 석출시킨 샘플은, 다른 스트링들과는 전혀 다른 외양을 가지고 있었으며; 번들 구조가 없고, 편평하고 얇은 밴드-유사 구조를 가지고 있었다.
실시예 11 - 소수성 표면 위에 원하는 형태의 배열
석출 방법의 효과는 아래 2가지 공정을 비교함으로써 테스트하였다:
(I): 1) 압출 - 2) PE 필름 위에 둠 - 3) 99.5 % 에탄올 중에 석출 (비교, 실시예 10)
(II): 1) 압출 - 2) 99.5 % 에탄올로 자유 낙하 - 3) PE 필름 위에 안착
제조한 석출된 스트링들을 수집하여, 광 현미경으로 가시적으로 평가하였다. 스트링을 다룰 때의 감각적인 느낌도 평가하였다. 제1 타입의 석출 공정 (I)에서는 부드럽고, 균등한 스트링이 만들어졌지만, 제2 타입의 석출 공정 (II)에서는 쉽게 부서지고, 균일하지 않고 돌출부가 있는 스트링이 만들어졌다.
실시예 12 - 랫에 피하 주사
실시예 7에 기술된 바와 기본적으로 동일한 방법으로 제조한 겔 제형을, 털이 없는 랫 (Sprague Dawley)에 피하 주사하여, 생체내 검사를 수행하였다. 관찰 결과, 이식된 겔의 스트링 형태 (도 6a)가 랫의 피하 영역에서 6개월 이후에도 남아있었다 (도 6b). 도 6a는 Milli-RX로 희석하고, 18G 캐뉼러를 통해 압출한 후 톨루이딘 블루로 염색한 (비-외식) 스트링을 나타낸 것이다. 도 6b는 6개월 후 랫의 피하 영역에서 꺼낸 동일한 스트링 배치를 나타낸 것이다.
스트링의 형태는 바늘에서 압출된 후 뿐 아니라 랫에서 6개월 후에도 유지되는 것으로 판단되었다.
실시예 13 - 비교예
US 2012/0034462 A1은, 기교된 HA 겔의 가느다란 가닥은 체 또는 메쉬를 통해 가교된 HA 겔의 고체 매스를 통과시킴으로써 제조할 수 있음을, 실험적인 증거없이 제시하고 있다. 이 이론을 테스트하기 위해, US 2012/0034462 A1의 실시예 1 (HA MW 3 MDa; BDDE 75 mg/g HA; 온도 50℃, 2시간)에 따라 겔을 제조하였다. 하이드로 겔을 32 ㎛ 또는 63 ㎛ 메쉬 스크린을 통해 1번 통과시켰다.
수득되는 HA 겔의 구조를 10x 배율로 도 7에 나타낸다: (A) 32 ㎛ 메쉬 크기; (B) 63 ㎛ 메쉬 크기 (바 = 2 mm). 제조된 입자들은 어떠한 질서정연한 구조를 나타내지 않았으며, 특히 어떠한 긴 형상이 아니었다.

Claims (40)

  1. 성형된 가교 히알루론산 생성물의 제조 방법으로서,
    (i) 가교 없이, 수용액인 제1 액체 매질에 용해된 히알루론산 기질을 제공하는 단계;
    (ii) 상기 히알루론산 기질을, 가교 없이, 하나 이상의 제1 수용성 유기 용매(들)를 히알루론산에 대한 석출 조건을 제공하는 양으로 포함하는 제2 액체 매질로 처리함으로써, 상기 히알루론산 기질을 석출하는 단계; 및
    (iii) 원하는 형상의 비-가교된 석출된 히알루론산 기질을, pH가 11.5 이상이며 하나 이상의 다관능성 가교제(들), 및 히알루론산에 대한 석출 조건을 제공하는 양의 하나 이상의 제2 유기 용매(들)를 포함하는 제3 액체 매질 중에서, 석출된, 성형된 가교 히알루론산 생성물을 수득하기에 적절한 조건 하에, 단일 가교 반응시키는 단계를 포함하며,
    상기 단계 (i) 및/또는 단계 (ii)는 상기 히알루론산 기질을 원하는 형상으로 배열(arranging)하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 제조 방법.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 처음 두 단계 (i) 및 단계 (ii)가 가교제의 부재 하에 수행되고,
    상기 다관능성 가교제(들)가 상기 제3의 가교 단계 (iii)에서 첨가되는 것을 특징으로 하는, 제조 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    상기 단계 (i)이 상기 히알루론산 기질 용액을 소수성 표면 상에 원하는 형상으로 배열하는 단계를 더 포함하고;
    상기 단계 (ii)에서 상기 성형된 히알루론산 기질의 석출이 상기 소수성 표면 상에서 발생하는 것을 특징으로 하는, 제조 방법.
  4. 제3항에 있어서,
    상기 소수성 표면이 플루오로카본, 폴리프로필렌(PP), 폴리에틸렌 테레프탈레이트 글리콜-변형물(PETG), 폴리에틸렌(PE) 및 폴리테트라플루오로에틸렌(PTFE)으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 제조 방법.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 형상이 입자, 섬유, 스트링, 가닥(strand), 네트, 필름, 디스크 및 비드로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 제조 방법.
  6. 제5항에 있어서,
    상기 형상이 섬유이고,
    상기 섬유의 길이 : 섬유의 폭의 비율이 10:1 이상인 것을 특징으로 하는, 제조 방법.
  7. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    상기 단계 (ii)가, 상기 히알루론산 기질을, 히알루론산에 대한 석출 조건을 제공하는 양으로 제1 수용성 유기 용매(들)를 포함하는 제2 액체 매질 내로 압출시킴으로써, 압출된 히알루론산 기질이 상기 제2 액체 매질 중에서 석출된 섬유를 형성하게 하는 것을 특징으로 하는, 제조 방법.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 단계 (ii)의 제2 액체 매질이 물 0 부피% 내지 30 부피% 및 상기 제1 수용성 유기 용매(들) 70 부피% 내지 100 부피%를 포함하는 것을 특징으로 하는, 제조 방법.
  9. 제8항에 있어서,
    상기 단계 (ii)의 제2 액체 매질이 물 0 부피% 내지 10 부피% 및 상기 제1 수용성 유기 용매(들) 90 부피% 내지 100 부피%를 포함하는 것을 특징으로 하는, 제조 방법.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 단계 (iii)의 제3 액체 매질이 물 0 부피% 내지 35 부피%, 상기 제2 유기 용매(들) 65 부피% 내지 100 부피%, 및 하나 이상의 다관능성 가교제(들)를 포함하는 것을 특징으로 하는, 제조 방법.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 유기 용매(들)가 하나 이상의 저급 알킬 알코올(들)로부터 개별적으로 선택되는 것을 특징으로 하는, 제조 방법.
  12. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 단계 (i)의 수용액이 물 40 부피% 내지 100 부피% 및 저급 알킬 알코올(들) 0 부피% 내지 60 부피%를 포함하는 것을 특징으로 하는, 제조 방법.
  13. 제11항 또는 제12항에 있어서,
    상기 저급 알킬 알코올이 에탄올인 것을 특징으로 하는, 제조 방법.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 다관능성 가교제(들)가 다이비닐 설폰, 멀티에폭사이드 및 다이에폭사이드로 이루어진 군으로부터 개별적으로 선택되는 것을 특징으로 하는, 제조 방법.
  15. 제14항에 있어서,
    상기 다관능성 가교제(들)가 1,4-부탄다이올 다이글리시딜 에테르(BDDE), 1,2-에탄다이올 다이글리시딜 에테르(EDDE) 및 다이에폭시옥탄으로 이루어진 군으로부터 개별적으로 선택되는 것을 특징으로 하는, 제조 방법.
  16. 제15항에 있어서,
    상기 다관능성 가교제가 1,4-부탄다이올 다이글리시딜 에테르(BDDE)인 것을 특징으로 하는, 제조 방법.
  17. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서,
    (iv) 상기 석출된, 가교된 히알루론산 생성물을 비-석출 조건으로 처리하는 단계; 및
    (v) 상기 가교된 히알루론산 생성물을 비-석출된 형태로 분리하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 제조 방법.
  18. 제17항에 있어서,
    상기 단계 (v)가 상기 가교된 히알루론산 생성물을 멸균시키는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 제조 방법.
  19. 변형도(degree of modification)가 이당류 1000 유닛 당 가교제 1 내지 40 유닛이며, 팽윤도(swelling degree)가 히알루론산 1 g 당 4 mL 내지 300 mL이고, 변형 효율(modification efficiency)이 10 이상인, 성형된 가교 히알루론산 생성물.
  20. 제19항에 있어서,
    상기 생성물이 입자, 섬유, 스트링, 가닥, 네트, 필름, 디스크 및 비드로 이루어진 군으로부터 선택되는 형상을 가지는 것을 특징으로 하는, 성형된 가교 히알루론산 생성물.
  21. 제20항에 있어서,
    상기 생성물이 섬유이고,
    상기 섬유의 길이 : 섬유의 폭의 비율이 10:1 이상인 것을 특징으로 하는, 성형된 가교 히알루론산 생성물.
  22. 제20항 또는 제21항에 있어서,
    상기 생성물이 섬유이고,
    상기 섬유의 길이방향 신장(longitudinal extension)이 2 mm보다 큰 것을 특징으로 하는, 성형된 가교 히알루론산 생성물.
  23. 제19항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 팽윤도가 히알루론산 1 g 당 15 mL 내지 180 mL인 것을 특징으로 하는, 성형된 가교 히알루론산 생성물.
  24. 제19항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 변형 효율이 20 내지 190 범위인 것을 특징으로 하는, 성형된 가교 히알루론산 생성물.
  25. 제19항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 가교율이 35% 이상인 것을 특징으로 하는, 성형된 가교 히알루론산 생성물.
  26. 제19항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서,
    다이비닐 설폰, 멀티에폭사이드 및 다이에폭사이드로 이루어진 군으로부터 개별적으로 선택되는 하나 이상의 다관능성 가교제(들)로 가교되는 것을 특징으로 하는, 성형된 가교 히알루론산 생성물.
  27. 제26항에 있어서,
    상기 다관능성 가교제(들)가 1,4-부탄다이올 다이글리시딜 에테르(BDDE), 1,2-에탄다이올 다이글리시딜 에테르(EDDE) 및 다이에폭시옥탄으로 이루어진 군으로부터 개별적으로 선택되는 것을 특징으로 하는, 성형된 가교 히알루론산 생성물.
  28. 제27항에 있어서,
    상기 다관능성 가교제가 1,4-부탄다이올 다이글리시딜 에테르(BDDE)인 것을 특징으로 하는, 성형된 가교 히알루론산 생성물.
  29. 제19항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 생성물이 멸균되는 것을 특징으로 하는, 성형된 가교 히알루론산 생성물.
  30. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 따른 방법에 의해 제조되는, 성형된 가교 히알루론산 생성물.
  31. 제19항 내지 제30항 중 어느 한 항에 따른 성형된 가교 히알루론산 생성물 및 선택적으로 완충제를 포함하는 수성 조성물.
  32. 제19항 내지 제30항 중 어느 한 항에 따른 성형된 가교 히알루론산 생성물 또는 제31항에 따른 수성 조성물의, 미용학적 수술용으로서의 용도.
  33. 제32항에 있어서,
    피부 충진술 및 인체 윤곽술로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 미용학적 수술용으로서의 용도.
  34. 약제 또는 의료 기기로서 사용하기 위한, 제19항 내지 제30항 중 어느 한 항에 따른 성형된 가교 히알루론산 생성물 또는 제31항에 따른 수성 조성물.
  35. 미용학적 수술 또는 의학적 수술에 사용하기 위한, 제19항 내지 제30항 중 어느 한 항에 따른 성형된 가교 히알루론산 생성물 또는 제31항에 따른 수성 조성물.
  36. 제35항에 있어서,
    피부 충진술 및 인체 윤곽술로부터 선택되는 미용학적 수술에 사용하기 위한 것임을 특징으로 하는, 성형된 가교 히알루론산 생성물 또는 수성 조성물.
  37. 제35항에 있어서,
    피부 충진술, 인체 윤곽술, 조직 접착의 예방, 채널 형성, 실금 치료 및 정형외과적 적용으로부터 선택되는 의학적 수술에 사용하기 위한 것임을 특징으로 하는, 성형된 가교 히알루론산 생성물 또는 수성 조성물.
  38. 약물 전달에 사용하기 위한, 제19항 내지 제30항 중 어느 한 항에 따른 성형된 가교 히알루론산 생성물 또는 제31항에 따른 수성 조성물.
  39. 제19항 내지 제30항 중 어느 한 항에 따른 멸균된, 성형된 가교 히알루론산 생성물 또는 제31항에 따른 멸균된 수성 조성물로 사전-충진된, 사전-충진된 주사기.
  40. 제19항 내지 제30항 중 어느 한 항에 따른 성형된 가교 히알루론산 생성물 또는 제31항에 따른 수성 조성물을, 이를 필요로 하는 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 미용학적 수술 또는 의학적 수술을 받는 개체의 치료 방법.
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