WO2021172694A1 - 가교 히알루론산을 이용한 약물 전달 조성물 및 이의 제조방법 - Google Patents

가교 히알루론산을 이용한 약물 전달 조성물 및 이의 제조방법 Download PDF

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이윤기
최민용
한송이
이명희
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Definitions

  • the present invention provides a drug delivery composition using cross-linked hyaluronic acid, a method for preparing the same, and a drug delivery composition comprising the drug delivery composition and a drug
  • Hyaluronic acid has a water adsorption capacity up to 1,000 times its own mass, but uncrosslinked hyaluronic acid alone is decomposed within a few days in vivo, and the drug delivery effect is insignificant.
  • a cross-linked hyaluronic acid gel was formed using a cross-linking agent (BDDE) in a relatively high ratio to the existing hyaluronic acid, but this has a high probability of side effects when used in the body. If the cross-linking agent ratio is lowered to reduce the probability of side effects in the body, it becomes difficult to maintain the durability and physical properties of hyaluronic acid.
  • BDDE cross-linking agent
  • An example of the present invention is to provide a drug delivery composition comprising two cross-linked hyaluronic acids having a desired release characteristic behavior and different swelling degrees, and a method for preparing the same.
  • a further embodiment of the present invention is to provide a drug delivery composition comprising two cross-linked hyaluronic acids having different swelling degrees and a pharmaceutical composition comprising the drug.
  • the present invention relates to a drug delivery composition using two or more cross-linked hyaluronic acids, a method for preparing the same, and a pharmaceutical composition comprising the drug delivery composition and a drug having a desired release characteristic behavior.
  • the present invention develops cross-linked hyaluronic acid as a drug carrier to which cross-linking and purification technology is applied to increase physical properties while minimizing hyaluronic acid pulverization. It can lead to more effective and safe pain management for patients and secure procedure convenience.
  • cross-linked hyaluronic acid gel by mixing gels with different swelling ratios of the cross-linked hyaluronic acid gel, it is possible to realize a technology capable of maintaining a constant drug release rate by controlling the decomposition rate of the hyaluronic acid gel in stages.
  • An example of the present invention is a drug delivery composition comprising two cross-linked hyaluronic acids having different degrees of swelling, wherein the hyaluronic acid having different degrees of swelling has a difference in swelling degree ranging from 100% to 500%, and a formulation having a low degree of swelling It will include 1 cross-linked hyaluronic acid and a second cross-linked hyaluronic acid having a high degree of swelling.
  • the drug delivery composition (1) a sample of the drug delivery composition having a solid content of 2% by weight, has a complex viscosity of 500,000-1,500,000cp measured at 0.02Hz, (2) an elastic modulus of 150-250pa (1Hz) and (3) It may have one or more physical properties selected from the group consisting of a swelling degree of 100 to 250%.
  • the two types of cross-linked hyaluronic acid having a different degree of swelling have a difference in swelling degree in the range of 100% to 500%, and may include a first cross-linked hyaluronic acid having a low degree of swelling and a second cross-linked hyaluronic acid having a high degree of swelling, specifically As such, the first cross-linked hyaluronic acid may have a swelling degree of 50 to 175%, and the second cross-linked hyaluronic acid may include a swelling degree of 150 to 675%.
  • the swelling degree of the cross-linked hyaluronic acid can be expressed by the following Equation 1, and more specifically, 2 g of cross-linked hyaluronic acid obtained by purification and pulverization of the cross-linking reaction product is added to 25 mL of a phosphate buffer solution, and centrifuged at 2,000 rpm for 5 minutes. After separation and removal of the supernatant, the weight of the swollen hyaluronic acid gel is measured and obtained by Equation 1 below.
  • the weight of the gel of cross-linked hyaluronic acid initially measured in Equation 1 below is the weight before adding the phosphate buffer solution, for example, a product that has undergone purification and pulverization of the cross-linking reaction product, and has a solid content of 0.5 to 5.0 wt% or 1.0 to 5.0 wt% and the water content may be 95.0 to 99.0 wt% or 95.0 to 99.5 wt%.
  • Swelling degree (%) (weight of swollen cross-linked hyaluronic acid gel/weight of initially measured cross-linked hyaluronic acid gel) X 100
  • the modulus of elasticity (G') of the drug delivery composition according to the present invention can be measured in a frequency range of 0.02 Hz to 1 Hz using a rheometer, and the complex viscosity is 0.02 Hz using a rheometer. It can be measured in the frequency range of to 1 Hz.
  • the first cross-linked hyaluronic acid having a low swelling degree and the second cross-linked hyaluronic acid having a high swelling degree include a crosslinking reaction, purification and grinding process using hyaluronic acid having a molecular weight of 1,000 KDa to 2,000 KDa and 0.3 to 1.3 mol% of a crosslinking agent. method can be prepared. Specifically, two types of cross-linked hyaluron having different swelling degrees can be produced through purification and pulverization processes by performing the cross-linking reaction at different reaction capacities in the step of performing the cross-linking reaction.
  • the first cross-linked hyaluronic acid has a cross-linking reaction capacity of 100 to 800 mL, preferably 150 to 800 mL, 150 to 700 mL, 150 to 600 mL, 150 to 550 mL, 200 to 800 mL, 200 to 700 mL, 200-600 mL, 200-550 mL, 250-800 mL, 250-700 mL, 250-600 mL, or 250-550 mL.
  • the first cross-linked hyaluronic acid may have a low degree of swelling, for example, having a degree of swelling of 50 to 175%.
  • the second cross-linked hyaluronic acid may have a cross-linking reaction capacity of 3 to 50 mL, preferably 5 to 30 mL, and the second cross-linked hyaluronic acid has a high degree of swelling, for example, having a degree of swelling of 150 to 675%. it could be Preferably, the difference in swelling degree between the first crosslinked hyaluronic acid having a low degree of swelling and the second crosslinked hyaluronic acid having a high degree of swelling may be 100% to 500%.
  • the drug delivery composition according to the present invention includes two cross-linked hyaluronic acids having different degrees of swelling, wherein the hyaluronic acids having different degrees of swelling have a difference in swelling degree ranging from 100% to 500%, and a first cross-linked hyaluronic acid having a low degree of swelling It includes ronic acid and a second cross-linked hyaluronic acid having a high degree of swelling.
  • the mixing weight ratio of the first cross-linked hyaluronic acid having a low swelling degree and the second cross-linked hyaluronic acid having a high degree of swelling included in the drug delivery composition is 5:1 to 1:5, 4:1 to 4:1, 3:1 to 1:3, 2:1 to 1:2, 1: 1 to 5, 1: 1 to 4, 1:1 to 3, 1:1 to 2, or 1:1.
  • the drug delivery composition according to the present invention can be used for the preparation of a pharmaceutical composition including a drug and exhibiting a specific drug release behavior. Accordingly, another embodiment of the present invention provides a drug delivery composition comprising two cross-linked hyaluronic acids having different swelling degrees according to the present invention, and a pharmaceutical composition comprising the drug.
  • the cumulative drug release amount of the pharmaceutical composition comprising the drug delivery composition according to the present invention and a drug, such as a local anesthetic is 55 to 75% by weight at 24 hours, 70 to 90% by weight at 48 hours, and 90% by weight or more at 72 hours, , provided that the cumulative drug release amount for 48 hours has a drug release pattern with a difference of 5 wt% or more from the cumulative drug release amount for 24 hours.
  • the cumulative drug release amount for 24 hours may be 57 to 75 wt%, 59 to 75 wt%, or 60 to 75 wt%
  • the cumulative drug release amount for 48 hours is 75 to 90 wt% %, 77 to 90 wt%, 80 to 90 wt%, 80 wt% or more to less than 90 wt%, 75 to 87 wt%, 77 to 87 wt%, or 80 to 87 wt%, provided that the above 48 hours
  • the cumulative drug release amount during 24 hours has a drug release pattern with a difference of 5 wt% or more from the drug cumulative release amount for 24 hours.
  • the pharmaceutical composition comprising the drug and the drug delivery composition comprising two or more crosslinked hyaluronic acids having different swelling degrees according to the present invention, based on 100% by weight of the total solid content of the crosslinked hyaluronic acid and the drug,
  • the solid content of the cross-linked hyaluronic acid may be 40 to 90 wt%, and the content of the drug may be 10 to 60 wt%.
  • the solid content of the crosslinked hyaluronic acid is 45 to 90% by weight, 50 to 90% by weight, 55 to 90% by weight, 60 to 90 wt%, 65-90 wt%, 70-90 wt%, 45-87 wt%, 50-87 wt%, 55-87 wt%, 60-87 wt%, 65-87 wt%, 70-87 wt% %, 45 to 85% by weight, 50 to 85% by weight, 55 to 85% by weight, 60 to 85% by weight, 65 to 85% by weight, or 70 to 85% by weight, wherein the solids content of the drug is 10 to 55 wt%, 10-50 wt%, 10-45 wt%, 10-40 wt%, 10-35 wt%, 10-30 wt%, 13-55 wt%, 13-50 wt%, 13-45
  • the drug may be used without particular limitation as long as it achieves the desired release behavior, for example, lopivacaine, bupivacaine, chlorprocaine, lidocaine, mepivacaine, procaine, tetracaine, levobupivacaine, and It may be at least one local anesthetic selected from the group consisting of articaine.
  • the content of the local anesthetic is 0.01 to 3% by weight, 0.05 to 3% by weight, 0.075 based on 1 mL containing the additive (sodium chloride, sodium hydroxide, water for injection, hydrochloric acid) to 3 wt%, 0.1 to 3 wt%, 0.01 to 1 wt%, 0.05 to 1 wt%, 0.075 to 1 wt%, 0.1 to 1 wt%, 0.01 to 0.5 wt%, 0.05 to 0.5 wt%, 0.075 to 0.5 % by weight, or 0.1 to 0.5% by weight.
  • the additive sodium chloride, sodium hydroxide, water for injection, hydrochloric acid
  • hyaluronic acid is a biopolymer material in which repeating units consisting of N-acetyl-D-glucosamine and D-glucuronic acid are linearly connected.
  • hyaluronic acid is hyaluronic acid itself, a salt thereof or these It is used in the meaning including all combinations of.
  • the salt of hyaluronic acid includes, for example, inorganic salts such as sodium hyaluronate, potassium hyaluronate, calcium hyaluronate, magnesium hyaluronate, zinc hyaluronate, cobalt hyaluronate, and organic salts such as tetrabutylammonium hyaluronate. to be, but is not limited thereto.
  • hyaluronic acid itself or a salt thereof may be used alone, or hyaluronic acid itself or a salt thereof may be used in combination of two or more types.
  • the molecular weight of the hyaluronic acid may be in the range of molecular weight 1,000 KDa to 2,000 KDa.
  • the cross-linked hyaluronic acid polymer or cross-linked dilute aluronic acid derivative can be prepared by cross-linking the hyaluronic acid itself or a salt thereof as described above using a cross-linking agent.
  • a method using a crosslinking agent in an aqueous alkali solution can be used.
  • the aqueous alkali solution NaOH, KOH, preferably, NaOH aqueous solution may be used, but is not limited thereto. In this case, NaOH aqueous solution may be used at a concentration of 0.25N to 5N.
  • the cross-linked hyaluronic acid derivative may have a complex viscosity of 500,000 to 1,500,000 cp measured at 0.02 Hz in a sample of the drug delivery composition having a solid content of 2% by weight.
  • the crosslinking agent may be various as a compound containing two or more epoxy functional groups, and preferred examples thereof include butanediol diglycidyl ether (1,4-butandiol diglycidyl ether: BDDE), ethylene glycol diglycidyl ether (ethylene glycol diglycidyl).
  • BDDE butanediol diglycidyl ether
  • ethylene glycol diglycidyl ether ethylene glycol diglycidyl
  • crosslinking agent 0.3 to 1.3 mol% of the crosslinking agent, preferably 0.35 to 1.0 mol%, may be used.
  • the term "degree of crosslinking” is defined as the % weight ratio of the crosslinking agent to the hyaluronic acid monomer units in the crosslinked portion of the hyaluronic acid based composition. It is measured as the weight ratio of the crosslinking agent to the weight ratio of the hyaluronic acid monomer.
  • the degree of crosslinking (MOD, Degree of Modification, mol%) of such hyaluronic acid is 0.1 mol% to 5 mol%, 0.2 to 5 mol%, 0.25 to 5 mol%, through crosslinking by the crosslinking agent as described above.
  • mol% to 3 mol% 0.2 to 3 mol%, 0.25 to 3 mol%, 0.3 to 3 mol%, 0.35 to 3 mol% , 0.4 to 3 mol%, 0.1 mol% to 2 mol%, 0.2 to 2 mol%, 0.25 to 2 mol%, 0.3 to 2 mol%, 0.35 to 2 mol%, 0.4 to 2 mol%, 0.1 mol% to 1 mol%, 0.2 to 1 mol%, 0.25 to 1 mol%, 0.3 to 1 mol%, 0.35 to 1 mol%, 0.4 to 1 mol%, specifically 0.1 mol% to 5% water, 0.2 to 4 mol% , 0.3 to 3 mol%, 0.4 to 2 mol%, or 0.4 to 1 mol%.
  • the cross-linked hyaluronic acid derivative prepared by the method according to the present invention may have a solid content of 0.5 to 5.0% by weight or 1.0 to 5.0% by weight and a water content of 95.0 to 99.0% by weight or 95.0 to 99.5% by weight.
  • step (a) of preparing the crosslinking reaction product specifically, hyaluronic acid or a salt thereof is added at a concentration of 1 to 30% by weight with respect to an aqueous solution of 0.25 to 2.5 N, for example, an aqueous NaOH solution, with respect to the hyaluronic acid.
  • a crosslinking agent preferably 0.35 to 1.0% of water, of a crosslinking agent is added and mixed with hyaluronic acid or a salt thereof in a homogeneous state, and the crosslinking reaction is carried out at at least two different doses to prepare a crosslinking reaction product.
  • the crosslinking reaction of the hyaluronic acid and the crosslinking agent in the above step may be carried out at 10 to 60 °C, more preferably 20 to 50 °C, most preferably 25 to 40 °C.
  • the first cross-linked hyaluronic acid has a cross-linking reaction capacity of 100 to 800 mL, preferably 150 to 800 mL, 150 to 700 mL, 150 to 600 mL, 150 to 550 mL, 200 to 800 mL, 200 to 700 mL, 200-600 mL, 200-550 mL, 250-800 mL, 250-700 mL, 250-600 mL, or 250-550 mL.
  • the first cross-linked hyaluronic acid may have a low degree of swelling, for example, having a degree of swelling of 50 to 175%.
  • the second cross-linked hyaluronic acid may have a cross-linking reaction capacity of 3 to 50 mL, preferably 5 to 30 mL, and the second cross-linked hyaluronic acid has a high degree of swelling, for example, having a degree of swelling of 150 to 675%. it could be Preferably, the difference in swelling degree between the first crosslinked hyaluronic acid having a low degree of swelling and the second crosslinked hyaluronic acid having a high degree of swelling may be 100% to 500%.
  • the step of (b) obtaining at least two or more cross-linked hyaluronic acids having different swelling degrees is performed by performing a step of purifying and/or pulverizing the cross-linking reaction product obtained in step (a) to have at least two or more cross-linked hyaluronic acids having different swelling degrees. get The purification and pulverization are separately performed for each cross-linking reaction product obtained by cross-linking at different doses to obtain at least two or more cross-linked hyaluronic acids having different swelling degrees.
  • the crosslinking reaction capacity of the first crosslinked hyaluronic acid having a low degree of swelling in step (b) may be 100 to 800 mL, and the obtained crosslinking reaction product having a relatively large reaction capacity is mixed with a pore diameter of 500 to 2,000 ⁇ m, for example, 1000 Pre-pulverization is performed using a sieve having a pore diameter of mu m to obtain a pre-pulverized product.
  • the pre-pulverized product may be purified to remove the unreacted cross-linking agent and the pH may be stabilized at a level of 6.5 to 7.5.
  • the cross-linked hyaluronic acid may be washed with washing water to remove the cross-linking agent, and the washing water may be saline or a phosphate buffer solution, but is not particularly limited.
  • the purified pulverized product ⁇ 450 ⁇ m, 150 ⁇ m ⁇ 450 ⁇ m, or 200 ⁇ m ⁇ 450 ⁇ m pore diameter for example, it can be carried out by passing through a sieve having a pore diameter of 350 ⁇ m.
  • the second cross-linked hyaluronic acid having a high degree of swelling in step (b) obtains a cross-linking reaction product that has undergone a cross-linking reaction in a volume of 3 to 50 mL, and performs a purification process without a grinding step to remove the unreacted cross-linking agent and adjust the pH to 6.5 ⁇ It was stabilized at the 7.5 level.
  • the cross-linked hyaluronic acid may be washed with washing water, and the washing water may be saline or a phosphate buffer solution, but is not particularly limited.
  • the second cross-linked hyaluronic acid cross-linking reaction product having a high degree of swelling is purified and then pulverized, and the pulverization is 20 ⁇ m to 500 ⁇ m, 50 ⁇ m to 500 ⁇ m, 100 ⁇ m to 500 ⁇ m, 150 ⁇ m to 500 ⁇ m, 200 ⁇ m ⁇ 500 ⁇ m, 20 ⁇ m ⁇ 450 ⁇ m, 50 ⁇ m ⁇ 450 ⁇ m, 100 ⁇ m ⁇ 450 ⁇ m, 150 ⁇ m ⁇ 450 ⁇ m, or 200 ⁇ m ⁇ 450 ⁇ m pore diameter, for example, a pore diameter of 350 ⁇ m It can be carried out by passing it through a sieve with
  • the solid content of the first cross-linked hyaluronic acid obtained after performing the pre-grinding, refining and pulverizing processes is 2.0 wt% or less, or 1.5 wt% or less, for example, 0.5 to 2.0 wt%, 0.5 to 1.5 wt%, 1.0 to 1.5% by weight, or 1.1 to 1.4% by weight, the balance may be water content.
  • the solid content of the second cross-linked hyaluronic acid obtained after performing the purification and grinding process is 1.5 wt% or more, 2.0 wt% or more, or 2.5 wt% or more, for example 1.5 to 5.0 wt%, 2.0 to 5.0 wt%, It may be 2.5 to 5.0% by weight, or 3.0 to 5.0% by weight, and the remainder excluding the solid content from the total 100% by weight may be the content of water.
  • the hyaluronic acid having a different swelling degree has a difference in swelling degree in the range of 100% to 500%, and may include a first crosslinked hyaluronic acid having a low degree of swelling and a second crosslinked hyaluronic acid having a high degree of swelling, or the first The cross-linked hyaluronic acid may have a swelling degree of 50 to 175%, and the second cross-linked hyaluronic acid may have a swelling degree of 150 to 675%.
  • step (b) of the manufacturing method purification and pulverization are separately performed on the cross-linking reaction product obtained by cross-linking reaction of different doses to obtain at least two or more cross-linked hyaluronic acids having different swelling degrees, and further, the different swelling degrees It may include the step of mixing at least two or more cross-linked hyaluronic acids having.
  • the first cross-linked hyaluronic acid may be prepared by a process of primary grinding, refining, and secondary grinding of the cross-linking reactant with a sieve.
  • the second cross-linked hyaluronic acid may be prepared by refining the cross-linked product and pulverizing it through a sieve.
  • the drug delivery composition prepared by the above method may be prepared by adjusting the solid content of the product, and further comprising the steps of container filling, sterilization and packaging.
  • the present invention develops cross-linked hyaluronic acid as a drug carrier to which cross-linking and purification technology is applied to increase physical properties while minimizing hyaluronic acid pulverization. It can lead to more effective and safe pain management for patients and secure procedure convenience.
  • Example 4 is a result of confirming the degree of swelling for the cross-linked hyaluronic acid prepared in Example 2.
  • Example 7 is a graph showing the drug release behavior of bupivacaine with respect to the cross-linked hyaluronic acid prepared in Example 1.
  • Example 8 is a graph showing the drug release behavior of ropivacaine with respect to the cross-linked hyaluronic acid prepared in Example 2.
  • FIG. 9 is a graph showing the results of measuring the degree of mechanical allodynia (threshold) after administering a drug formulation containing cross-linked hyaluronic acid (Voferon-L60) and ropivacaine prepared in Example 2 to an experimental animal.
  • Example 10 is a result of observing the muscles and sciatic nerve around the administration site after administering a drug formulation containing cross-linked hyaluronic acid (Voperon-L60) and ropivacaine prepared in Example 2 to an experimental animal.
  • a drug formulation containing cross-linked hyaluronic acid (Voperon-L60) and ropivacaine prepared in Example 2 to an experimental animal.
  • FIG. 11 shows the blood lopivacaine concentrations of test groups Ge, Gf and Gg according to the elapsed time after administration of a drug formulation containing cross-linked hyaluronic acid (Voferon-L60) and ropivacaine prepared in Example 2;
  • SC cross-linked hyaluronic acid
  • Vo Voferon-L60
  • Ro means ropivacaine.
  • AUC blood concentration-under the time curve
  • AUC 0-48hr means the average area for 48 hours.
  • Example 1 Preparation of cross-linked hyaluronic acid and evaluation of physical properties
  • non-crosslinked hyaluronic acid (repeat unit molecular weight 401.3) having a molecular weight of 1,500,000 Da was dissolved in 400 parts by weight of a 0.25N NaOH solution to prepare a 20% by weight hyaluronic acid solution.
  • 1,4-butanediol diglycidyl ether (1,4-butanediol diglycidyl ether, BDDE), a crosslinking agent, was added at a ratio of 0.7 mol%, and reacted in 4 different doses, specifically JPD001 Silver 400 mL, JPD002 5 mL, JPD003 15 mL, and JPD004 25 mL were dispensed and cross-linked at room temperature for 24 hours to obtain cross-linking products having different capacities.
  • BDDE 1,4-butanediol diglycidyl ether
  • JPD001 was passed through a sieve having a pore diameter of 1,000 ⁇ m and pulverized to obtain a primary pulverized product having a diameter of each pulverized product of about 1,000 ⁇ m. Thereafter, the first pulverized product of JPD001 was washed several times with a phosphate buffer solution to remove unreacted BDDE, and the pH was stabilized at a level of 6.5 to 7.5, and the purification time was 24 hours.
  • JPD002, JPD003, and JPD004 reactants after the cross-linking reaction was completed were washed several times with a phosphate buffer solution as they were without grinding to remove unreacted BDDE and stabilized the pH to a level of 6.5 to 7.5.
  • the time taken for the purification process was about 36 hours for the JPD002 and JPD003 reactants, and about 72 hours for the JPD004 reactants.
  • the obtained four reactants (JPD001, JPD002, JPD003, JPD004) were passed through a sieve having a pore size of 300 ⁇ m and pulverized, and the solid content was measured by the Korean Pharmacopoeia's loss on drying test method.
  • the solid content of the reactant obtained after the pulverization was 1.4 wt/wt% for JPD001, 2.2 wt/wt% for JPD002, 2.5 wt/wt% for JPD003, and 3.9 wt/wt% for JPD004.
  • the JPD001 reactant was adjusted to 2.0 wt% by adding non-crosslinked hyaluronic acid used as a raw material for the crosslinking reaction, and the JPD002, JPD003, and JPD004 reactants had a solid content of 2.0 wt%. Since it exceeds, PBS was added and diluted to 2.0 wt% so that the solid content was 2.0 wt%.
  • the four samples obtained above were sterilized at 121° C. for 20 minutes to prepare a cross-linked hyaluronic acid gel.
  • the sample containing the purified and pulverized JPD002 to JPD004 reactants has little water absorption in the purification process of the cross-linked reactant, and when mixed with an aqueous solution containing a drug, the cross-linked hyaluronic acid swells and the drug is further introduced into the cross-linked hyaluronic acid. You can mix a lot.
  • the capacity of the crosslinking reaction is JPD001, which is 400 mL, has a lower solid content than 2% of the solid content contained in conventional products and has absorbed more water, and thus the amount of drug that can be incorporated is rather low when mixed with a drug.
  • the weight of the swollen hyaluronic acid gel was measured, and it means the degree of swelling as shown in Equation 1 below.
  • the weight of the crosslinked hyaluronic acid gel initially measured in Equation 1 below is the weight before adding the phosphate buffer solution, and is substantially the weight of the sample in which the solid content obtained in Example 1 contains 2.0% by weight.
  • Swelling degree (%) (weight of swollen cross-linked hyaluronic acid gel/weight of initially measured cross-linked hyaluronic acid gel) X 100
  • the elastic modulus (G') was measured in the frequency range of 0.02 Hz to 1 Hz using a rheometer.
  • complex viscosity was measured in the frequency range of 0.02 Hz to 1 Hz using a rheometer.
  • swelling In relation to the drug release rate, swelling also acts as the most important factor, and in the case of elastic modulus and complex viscosity, it acts as a factor supporting the action of local anesthetics in actual clinical application.
  • the swelling degree of the cross-linked hyaluronic acid shown in Table 1 was in the range of 100 to 600, and it was confirmed that the drug was stably released under the condition of mixing JPD001 and JPD004 for 3 days when the pain was the most severe.
  • non-crosslinked hyaluronic acid (repetitive unit molecular weight 401.3) having a molecular weight of 1,500 kDa was dissolved in 400 parts by weight of a 0.25N NaOH solution to prepare a 20% by weight hyaluronic acid solution.
  • 1,4-butanediol diglycidyl ether (1,4-butanediol diglycidyl ether, BDDE) as a crosslinking agent was added in a ratio of 0.4 mol%, and reacted in three different doses, specifically JD005
  • the crosslinking reaction was carried out at room temperature for 24 hours by dispensing into dose volumes of 400 mL of silver, 5 mL of JD006, and 25 mL of JD007, to obtain crosslinking products having different capacities.
  • a 20 wt% hyaluronic acid solution was prepared by dissolving uncrosslinked hyaluronic acid having a molecular weight of 1,500 KDa in 0.25N NaOH solution.
  • 1,4-butanediol diglycidyl ether (1,4-butanediol diglycidyl ether, BDDE), a crosslinking agent, was added at a ratio of 0.4 mol%, and reacted in 4 different doses, specifically JD005
  • the crosslinking reaction was carried out at room temperature for 24 hours by dispensing into dose volumes of 400 mL of silver, 5 mL of JD006, and 25 mL of JD007, to obtain crosslinking products having different capacities.
  • JD005 was passed through a sieve having 1,000 ⁇ m pores and pulverized to obtain a primary pulverized product so that the diameter of each pulverized product was about 1,000 ⁇ m. Thereafter, the primary pulverized product of JD005 was washed several times with a phosphate buffer solution to remove unreacted BDDE, and the pH was stabilized at a level of 6.5 to 7.5, and the purification time was 24 hours.
  • JD006 and JD007 reactants after the crosslinking reaction were completed were washed several times with a phosphate buffer solution as they were without grinding to remove unreacted BDDE and stabilized the pH to a level of 6.5 to 7.5.
  • the time taken for the purification process was about 36 hours for the JD006 reactant and about 72 hours for the JD007 reactant.
  • the obtained three reactants (JD005, JD006, JD007) were passed through a 300 ⁇ m sieve and pulverized, and the solid content was measured by the Korean Pharmacopoeia weight loss test method.
  • the solid content of the reactant obtained after the pulverization was 1.1 wt/wt% for JD005, 1.8 wt/wt% for JD006, and 2.5 wt/wt% for JD007.
  • the JD005 and JD006 reactants were adjusted to have a solid content of 2.0 wt% by adding non-crosslinked hyaluronic acid used as a raw material for the crosslinking reaction, and the JD007 reactant had a solid content of 2.0 wt% Since it exceeds, PBS was added and diluted to 2.0% by weight so that the solid content was 2.0% by weight.
  • the three samples obtained above were sterilized at 121° C. for 20 minutes to prepare a cross-linked hyaluronic acid gel.
  • the mixed sample is about twice represents the increased modulus of elasticity (G').
  • G' modulus of elasticity
  • Example 3 Evaluation of release behavior of drug (bupivacaine) using cross-linked hyaluronic acid
  • JPD001 and JPD004 which are crosslinked hyaluronic acid gels containing the crosslinked hyaluronic acid solids prepared in Example 1 in an amount of 2% by weight, and (a mixture of JPD001 and JPD004 in a 1:1 weight ratio), that is, samples 1-1 and 1 of Example 1
  • a drug formulation was prepared by mixing 6 g of -4 and 1-5, respectively, and 3 g of a 0.75 wt% bupivacaine solution.
  • a formulation containing 2 wt% of non-crosslinked hyaluronic acid (repeat unit molecular weight 401.3) having a molecular weight of 1,500 kDa and a formulation containing only the buppacaine drug were prepared, respectively.
  • Each of the drug formulations prepared above was placed in a dialysis bag (MWCO: 12 K-14 K Da). Thereafter, the tube with the dialysis bag was immersed in 15 ml of phosphate buffer solution. A 50 mL conical tube containing an immersed dialysis bag was placed in a shaking water bath maintained at 37° C. and horizontally shaken at 100 rpm. At scheduled time intervals thereafter, an aliquot of 1.5 mL of release medium (PBS) was withdrawn and the entire release medium was replaced with 15 mL of fresh PBS to maintain sink conditions.
  • PBS release medium
  • Quantification of the released bupivacaine was performed by reverse-phase high-performance liquid chromatography (RP-) using a ZORBAX Eclipse XDB C18 column (4.6 mm ⁇ 250 mm, 5 ⁇ m) and acetonitrile/pH 8.0 buffer (60:40, v/v) for at least 10 minutes. HPLC). The drug release behavior was evaluated and the results are shown in FIG. 7 .
  • the drug delivery system (Sample 1-5) mixed in a 1:1 weight ratio of JPD001 and JPD004 showed the same release rate as that of JPD001 at the beginning of release, and then showed a slow release profile. Specifically, the cumulative release amount of the drug was 24 A release pattern of more than 60% at hr, 75% at 48 hr and 90% at 72 hr was exhibited.
  • a drug formulation was prepared by mixing 3 g of a 0.75 wt% ropivacaine solution with respect to 6 g of each of Samples 2-3 and 2-4.
  • a formulation containing 2 wt% of non-crosslinked hyaluronic acid (repeat unit molecular weight 401.3) having a molecular weight of 1,500 kDa and a formulation containing only the buppacaine drug were prepared, respectively.
  • the drug release behavior of the prepared drug formulation was evaluated in the same manner as in Example 3, and the results are shown in FIG. 8 .
  • the swelling degree is similar for JD006 (Sample 2-3) and JD005+JD007 mixture (Sample 2-4), but The mixture case shows a release profile up to 72 hours.
  • the cumulative drug release amount of JD006 (Sample 2-3) showed a release pattern of 90% at 24 hours and more than 95% at 48 hours.
  • the JD005+JD007 mixture (Sample 2-4) was used, the cumulative release amount of the drug was 60.7% at 24 hours, 79.6% at 48 hours, and 90.8% at 72 hours. Therefore, it was confirmed that the local anesthetic was gradually released when applied to the body, thereby reducing the pain during the most painful 3 days after surgery.
  • Example 5 Pain relief effect and safety evaluation of surgical product (Voferon-L60) injection solution and ropivacaine mixed administration
  • SPF pathogen-free Sprague-Dawley rats [Crl:CD(Sprague Dawley)] (Producer: Orient Bio, 322, Galmachi-ro, Jungwon-gu, Seongnam-si, Gyeonggi-do) were prepared according to the following conditions.
  • the body weight was measured on the day before administration and group separation was performed by weight ranked using the Excel program. Only animals falling within the range of ⁇ 20% of the mean body weight were used for the test.
  • Temperature and humidity range temperature 22 ⁇ 3°C, relative humidity 50 ⁇ 20 %RH
  • Feed (Teklad Certified Irradiated Global 18% Protein Rodent Diet, Envigo, USA) was supplied from Coretech (181-21, Jinwi-ro, Sinwi-myeon, Pyeongtaek-si, Gyeonggi-do), put into a feeder, and consumed freely. After purifying drinking water, the water was put into a polycarbonate water bottle and consumed freely.
  • the skin and fascia with a length of 1 cm were incised in the longitudinal direction starting from the part 0.5 cm away from the tip of the back of the foot.
  • the plantar muscle (plantar muscle) of the incision was lifted with forceps to separate 1 cm in length. Both ends of the longitudinal direction were carefully lifted so that the plantar muscles did not fall off and separated, and the cross-linked hyaluronic acid solids prepared in Example 2 were included in an amount of 2 wt% in the sciatic nerve part of the lateral biceps femoris on the left thigh.
  • a white rat is placed in a wire mesh cage with a net eye size of 2 ⁇ 2 mm and acclimatized for at least 15 minutes.
  • thick von Frey filament (1, 2, 4, 6, 8, 15, 26, 60 g, Stoelting, USA)
  • the filament was placed in vertical contact with the left foot of the affected foot and held for 5-6 seconds, and a positive reaction was considered if the rat showed a quick avoidance reaction, or immediately flinched or licked the sole while removing the hairs.
  • Stimulation was carried out from the von Frey filament in the central part, and if a positive reaction was shown, the weak filament was stimulated, and if there was no positive reaction, the strong filament was stimulated. In this way, measurements were made before and 1, 2, 4, 8, 24, 48, 72, 120, and 168 hours after administration of the test substance. For the interpretation of the pain behavior test result, it was judged as positive if there was an avoidance reaction or if the foot was lifted up on the net while in contact with the plastic plate. Stimulation was given twice at an interval of 3-5 minutes, and a response change curve with time was obtained using the positive threshold among them.
  • test substance surgical product used in the test substance surgical product (Voferon-L60) for stability evaluation is administered around the sciatic nerve of the test group
  • test substance After 14 days of administration, the muscle and sciatic nerve around the site of administration are cut out, and tissue sections are prepared and sliced through general tissue processing such as trimming, dehydration, and paraffin embedding, followed by H&E staining (Hematoxylin & Eosin stain), followed by a microscopic examination. did.
  • the pharmacodynamic analysis results according to the time-dependent response after drug administration are shown in Table 4 and FIG. 9 below. Pain threshold values were measured before and 1, 2, 4, 8, 24, 48, 72, 120, and 168 hours after administration of the test substance in each animal in the Ga to Gd group test group, and the threshold value for each test group was calculated. Table 4 below shows the threshold values (g) measured for each drug administration time.
  • Ga group Gb group GC group Gd group 0 60 60 60 60 60 60 60 60 60 One 9.8 60 60 60 2 9.5 60 60 60 60 4 10.5 37.3 48.7 60 8 10.5 31.7 45.8 57.2 24 10 28.0 30.8 39.3 48 10.8 17.5 20.5 24.2 72 22 29.8 35.5 43 120 54.3 60 60 60 168 60 60 60 60 60
  • the Gb group started to decrease to an average threshold of 37.3 g from 4 hours after surgery, and gradually recovered to an average threshold of 17.5 g after 48 hours, with a complete recovery at 120 hours.
  • the Gc group started to decrease to an average threshold of 48.7 g from 4 hours after surgery, and gradually recovered to an average threshold of 20.5 g after 48 hours, and the pain was stably recovered at 120 hours.
  • the average threshold of 57.2 g started to decrease from 8 hours after surgery, and the average threshold of 24.2 g after 48 hours gradually recovered to a stable pain level and completely recovered at 120 hours.
  • the threshold was measured high in the Voferon-L60 mixed administration group, and the pain relief effect was found to be larger. This result is judged to be an effect caused by delayed drug release due to mixed administration with Voferon-L60.
  • the threshold was measured to be high in Gd, which had a lower concentration of ropivacaine and a higher concentration of Voferon-L60, confirming that the pain relief effect was greater.
  • This result is considered to be the effect caused by the delayed drug release of ropivacaine according to the increase in the concentration of Voferon-L60. Therefore, it is judged that as the concentration of Voferon-L60 increases, the drug release is controlled and the pain relief effect increases.
  • Example 6 Evaluation of pharmacokinetics according to mixed administration of surgical product (Voferon-L60) injection solution and ropivacaine
  • SPF pathogen-free Sprague-Dawley rats [Crl:CD(Sprague Dawley)] (Producer: Orient Bio, 322, Galmachi-ro, Jungwon-gu, Seongnam-si, Gyeonggi-do) were prepared according to the following conditions.
  • the body weight was measured on the day before administration and group separation was performed by weight ranked using the Excel program. Only animals falling within the range of ⁇ 20% of the mean body weight were used for the test.
  • Sample 2- which is a mixture of JD005 and JD007, the crosslinked hyaluronic acid prepared in Example 2, in a 1: 1 weight ratio around the sciatic nerve after performing inhalation anesthesia on the prepared test animal using isoflurane and incision of the skin of the femur 4
  • a formulation containing (Voferon-L60) and ropivacaine was administered with a syringe once and the skin was sutured to form a test group as shown in Table 5 below, and the dose ( ⁇ l) of Ge to Gg was all The same amount was set to 600 ⁇ l, and 5 animals were included in the experimental group.
  • 0.5 ⁇ l of blood from the test group was collected from the jugular vein using a disposable syringe before and 0.5, 1, 2, 4, 6, 8, 12, 24 and 48 hours after administration of the test substance.
  • the collected blood was transferred to a heparin-treated tube (5 IU/ml), centrifuged at 12,000 rpm (4° C.) for 5 minutes, and the upper layer (plasma) was separated.
  • the separated plasma was stored in an ultra-low temperature freezer (Daehan Science, Korea; MAI-040-03) set at -70°C until analysis and then used for analysis.
  • LC/MS/MS analysis was performed using 1290 Infinity (Agilent, USA) using an LC instrument and 6460 Triple Quadruple (Agilent, USA) using an MS/MS instrument.
  • Ropivacaine hydrochloride monohydrate Lidocaine hydrochloride monohydrate (Lot No.: WS-054, Jungheon Pharmaceutical, Korea) was used as a standard material. It was used as an internal standard.
  • lidocaine hydrochloride hydrate (purity 100.0%) into a 50 ml bottle, fill 50% methanol and dissolve to prepare 1,000.000 mg / l Put in a 100ml volumetric flask, 50% methanol was added up to the 100ml mark to prepare a stock solution with a concentration of 10.000mg/l, and 60 ⁇ l of the prepared stock solution and 9,940 ⁇ l of Acetonitrile were mixed to prepare a 600ng/ml working solution. .
  • Stock solution The stock solution of the standard solution was used, and the stock solution of the prepared standard solution having the concentration and volume shown in Table 9 was serially diluted with 50% methanol to prepare a working solution having the concentration shown in Table 9 below.
  • the plasma stored at 70° C. or lower was dissolved by standing at room temperature, and then mixed well in a vortex for about 30 seconds.
  • the working solution having the concentration and volume shown in Table 10 was serially diluted with plasma, and the working solution of the standard solution was prepared by preparing standard plasma of the calibration curve sample having the concentration shown in Table 10 below.
  • Working solution concentration (ng/ml) Working solution volume (ul) plasma volume (ul) Lidocaine concentration in plasma (ng/ml) S1 50 40 360 5 S2 100 40 360 10 S3 500 40 360 50 S4 1,000 40 360 100 S5 2,000 40 360 200 S6 5,000 40 360 500 S7 10,000 40 360 1,000
  • the peak area ratio of the standard material to the peak area of the internal standard material was obtained from the obtained chromatogram.
  • concentration of the test substance in plasma was calculated from the pre-prepared calibration curve using the MassHunter Workstation Software, version B.07.1 (Agilent, USA) of the device.
  • Ge group had an AUC 0-48hr average of 1254.97ng ⁇ h/ml, a Cmax average of 439.90ng/ml, a Tmax average of 1.2hr, and an MRT average of 1.86hr.
  • the mean AUC 0-48hr was 1308.39ng ⁇ h/ml
  • the mean Cmax was 409.23ng/ml
  • the mean Tmax was 2hr
  • the mean MRT was 2.17hr.
  • the mean AUC 0-48hr was 947.86ng ⁇ h/ml
  • the mean Cmax was 320.41ng/ml
  • the mean Tmax was 1.2hr
  • the mean MRT was 2.15hr.
  • the injection solution used for the surgical product delays the drug release of ropivacaine, and it is judged that the drug release is delayed as the concentration of Voferon-L60 increases.
  • the low Cmax values in the blood in the test group Gf and Gg groups delayed drug release due to the effect of the increase in the concentration of Voferon-L60, so it would be safer than using ropivacaine alone. is judged to be

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Abstract

본 발명은 가교 히알루론산을 이용한 약물 전달 조성물 및 이의 제조방법과, 상기 약물 전달 조성물과 약물을 포함하여 목적하는 방출 특성 거동을 갖는 약학적 조성물에 관한 것이다.

Description

가교 히알루론산을 이용한 약물 전달 조성물 및 이의 제조방법
본 발명은 가교 히알루론산을 이용한 약물 전달 조성물 및 이의 제조방법과, 상기 약물 전달 조성물과 약물을 포함하여
히알루론산은 자체 질량 대비 최대 1,000배의 수분 흡착력을 가지고 있으나, 가교되지 않은 히알루론산 단독으로는 생체 내에서 수일 내 분해되고, 약물전달 효과가 미미한 점 등으로 약물전달체의 역할을 크게 기대하기 어려웠다.
이러한 히알루론산 자체의 짧은 반감기를 보완하고자 기존 히알루론산에 상대적으로 높은 비율의 가교제(BDDE)를 사용하여 가교 히알루론산 겔을 형성하였으나, 이는 체내 사용 시 부작용 발생 확률을 높다. 체내 부작용 발생 확률을 감소시키기 위해 가교제 비율을 낮추면 히알루론산의 지속성과 물성을 유지하기 어렵게 되는데, 가교제 비율을 낮추더라도 지속성 및 물성을 유지하는 데 주요한 사항은 히알루론산 정제에 있다.
종래 히알루론산을 정제하기 전 1차 분쇄를 통하여 정제시간을 단축시켰으나, 정제 시 가교 히알루론산 겔의 팽윤이 되면서 물성을 저하시키는 단점이 있었다.
본 발명의 일 예는 목적하는 방출 특성 거동을 가지며, 상이한 팽윤도를 갖는 2종의 가교 히알루론산을 포함하는 약물 전달 조성물 및 이의 제조방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 추가 일 예는 상이한 팽윤도를 갖는 2종의 가교 히알루론산을 포함하는 약물 전달 조성물과 약물을 포함하는 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명은 2이상의 가교 히알루론산을 이용한 약물 전달 조성물 및 이의 제조방법과, 상기 약물 전달 조성물과 약물을 포함하여 목적하는 방출 특성 거동을 갖는 약학적 조성물에 관한 것이다.
본 발명은 히알루론산 분쇄를 최소화시키면서 물성을 증가시키는 가교 및 정제기술을 적용한 가교 히알루론산을 약물 전달체로 개발하여, 생체 내 분해기간 및 약물의 방출속도를 조절하고, 1회 투여로도 충분한 약효를 이끌어내 시술 편의성 확보 및 환자에게 보다 효과적이고 안전한 통증관리를 이끌어 낼 수 있다. 또한 가교 히알루론산 겔의 팽윤도(Swelling Ratio)가 상이한 겔을 혼합하여 히알루론산 겔의 분해속도를 단계적으로 조절하여 약물의 방출속도를 일정하게 유지할 수 있는 기술을 실현할 수 있다.
본 발명의 일 예는, 상이한 팽윤도를 갖는 2종의 가교 히알루론산을 포함하는 약물 전달 조성물로서, 상기 상이한 팽윤도를 갖는 히알루론산은 팽윤도 차이가 100% 내지 500% 범위를 가지며, 저팽윤도를 갖는 제1 가교 히알루론산과 고팽윤도를 갖는 제2 가교 히알루론산을 포함하는 것이다.
상기 약물 전달 조성물은, (1)고형분 함량 2중량%의 약물 전달 조성물의 시료를 0.02Hz에서 측정한 복합점도가 500,000~1,500,000cp, (2) 탄성계수가 150 내지 250pa(1Hz) 및 (3) 팽윤도 100 내지 250%로 이루어지는 군에서 선택된 1이상의 물성을 갖는 것일 수 있다.
상기 상이한 팽윤도를 갖는 2종의 가교 히알루론은 팽윤도 차이가 100% 내지 500% 범위를 가지며, 저팽윤도를 갖는 제1 가교 히알루론산과 고팽윤도를 갖는 제2 가교 히알루론산을 포함할 수 있으며, 구체적으로 상기 제1 가교 히알루론산은 팽윤도 50 내지 175%을 가지며, 제2 가교 히알루론산은 팽윤도 150 내지 675%를 갖는 포함하는 것일 수 있다. 본 발명에서 가교 히알루론산의 팽윤도는 하기 수학식 1로 나타낼 수 있으며, 더욱 자세하게는 가교 반응물의 정제 및 분쇄로 얻어진 가교 히알루론산 2g을 25mL의 인산완충용액에 첨가하고, 5분 동안 2,000rpm으로 원심분리하고 상등액을 제거한 후 팽윤된 히알루론산 겔 무게를 측정 하기 수학식 1로 얻어진다. 하기 수학식 1에서 초기 측정된 가교 히알루론산의 겔의 무게는 인산완충용액을 투입하기 전의 무게로서, 예를 들면 가교 반응물의 정제 및 분쇄를 거친 산물로서, 고형분 함량이 0.5 내지 5.0 중량% 또는 1.0 내지 5.0 중량%이고 물의 함량이 95.0 내지 99.0 중량% 또는 95.0 내지 99.5 중량%인 것일 수 있다.
[수학식 1]
팽윤도(%) = (팽윤된 가교 히알루론산 겔의 무게/초기 측정된 가교 히알루론산의 겔의 무게) X 100
본 발명에 따른 약물 전달 조성물의 탄성계수(G')는 레오미터 (rheometer)를 사용하여 0.02 Hz 내지 1 Hz의 진동수 범위에서 측정할 수 있으며, 복합점도는 레오미터 (rheometer)를 사용하여 0.02 Hz 내지 1 Hz의 진동수 범위에서 측정할 수 있다.
상기 저팽윤도를 갖는 제1 가교 히알루론산과 고팽윤도를 갖는 제2 가교 히알루론산은 분자량 1,000 KDa 내지 2,000 KDa 범위의 히알루론산과 가교제 0.3 내지 1.3 몰%를 이용한 가교 반응, 정제 및 분쇄 공정을 포함하는 방법으로 제조될 수 있다. 구체적으로, 상이한 팽윤도를 갖는 2종의 가교 히알루론은 가교반응을 수행하는 단계에서, 상이한 반응 용량으로 가교반응을 수행하여 정제 및 분쇄 공정을 거쳐 제조될 수 있다.
예를 들면, 제1 가교 히알루론산은 가교반응의 용량이 100 내지 800 mL, 바람직하게는 150 내지 800 mL, 150 내지 700 mL, 150 내지 600 mL, 150 내지 550 mL, 200 내지 800 mL, 200 내지 700 mL, 200 내지 600 mL, 200 내지 550 mL, 250 내지 800 mL, 250 내지 700 mL, 250 내지 600 mL, 또는 250 내지 550 mL 일 수 있다. 상기 제1가교 히알루론산은 저팽윤도를 가지며, 예를 들면 상기 팽윤도 50 내지 175%을 갖는 것일 수 있다. 상기 제2 가교 히알루론산은 가교반응의 용량이 3 내지 50mL, 바람직하게는 5 내지 30 mL 일 수 있으며, 상기 제2가교 히알루론산은 고팽윤도를 가지며, 예를 들면 상기 팽윤도 150 내지 675%을 갖는 것일 수 있다. 바람직하게는 저팽윤도를 갖는 제1 가교 히알루론산과 고팽윤도를 갖는 제2 가교 히알루론산의 팽윤도 차이는 100% 내지 500%일 수 있다.
본 발명에 따른 약물 전달 조성물은 상이한 팽윤도를 갖는 2종의 가교 히알루론산을 포함하며, 상기 상이한 팽윤도를 갖는 히알루론산은 팽윤도 차이가 100% 내지 500% 범위를 가지며, 저팽윤도를 갖는 제1 가교 히알루론산과 고팽윤도를 갖는 제2 가교 히알루론산을 포함하는 것이다. 구체적인 일예에서, 상기 약물 전달 조성물에 포함되는 저팽윤도를 갖는 제1 가교 히알루론산과 고팽윤도를 갖는 제2 가교 히알루론산의 혼합 중량비 (제1 가교 히알루론산: 제2 가교 히알루론산)는 5:1 내지 1:5, 4:1 내지 4:1, 3:1 내지 1:3, 2:1 내지 1:2, 1: 1 내지 5, 1: 1 내지 4, 1: 1 내지 3, 1:1 내지 2, 또는 1:1일 수 있다.
본 발명에 따른 약물 전달 조성물은, 약물을 포함하여 특정 약물 방출거동을 나타내는 약학적 조성물의 제조에 사용될 수 있다. 따라서, 본 발명의 또 다른 일예는, 본 발명에 따른 상이한 팽윤도를 갖는 2종의 가교 히알루론산을 포함하는 약물 전달 조성물과 약물을 포함하는 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명에 따른 약물 전달 조성물과 약물, 예컨대 국소 마취제를 포함하는 약학적 조성물의 누적 약물 방출량이 24시간에 55~75 중량%, 48시간에 70~90 중량% 및 72시간에 90 중량% 이상이며, 단 상기 48시간 동안 약물 누적 방출량은 24시간 동안의 약물 누적 방출량과 차이가 5중량% 이상인 약물 방출 패턴을 갖는다. 예를 들면, 바람직하게는 24시간동안 누적 약물 방출량은, 57 내지 75중량%, 59 내지 75 중량%, 또는 60 내지 75 중량%일 수 있으며, 상기 48시간동안 누적 약물 방출량은, 75 내지 90중량%, 77 내지 90 중량%, 80 내지 90 중량%, 80 중량%이상 내지 90 중량% 미만, 75 내지 87중량%, 77 내지 87 중량%, 또는 80 내지 87 중량%일 수 있으며, 단 상기 48시간 동안 약물 누적 방출량은 24시간 동안의 약물 누적 방출량과 차이가 5중량%이상인 약물 방출 패턴을 갖는다.
본 발명에 따른 상이한 팽윤도를 갖는 2종 이상의 가교 히알루론산을 포함하는 약물 전달 조성물과 약물을 포함하는 약학적 조성물에서, 가교 히알루론산과 약물의 합계 고형분 함량 100 중량%를 기준으로, 가교 히알루론산의 고형분 함량은 40 내지 90 중량%이고 상기 약물의 함량은 10 내지 60 중량%일 수 있다. 구체적으로, 약학적 조성물에서 가교 히알루론산과 약물의 합계 고형분 함량 100 중량%를 기준으로, 가교 히알루론산의 고형분 함량은 45 내지 90 중량%, 50 내지 90 중량%, 55 내지 90 중량%, 60 내지 90 중량%, 65 내지 90 중량%, 70 내지 90 중량%, 45 내지 87 중량%, 50 내지 87 중량%, 55 내지 87 중량%, 60 내지 87 중량%, 65 내지 87 중량%, 70 내지 87 중량%, 45 내지 85 중량%, 50 내지 85 중량%, 55 내지 85 중량%, 60 내지 85 중량%, 65 내지 85 중량%, 또는 70 내지 85 중량%일 수 있으며, 약물의 고형분 함량은 10 내지 55 중량%, 10 내지 50 중량%, 10 내지 45 중량%, 10 내지 40 중량%, 10 내지 35 중량%, 10 내지 30 중량%, 13 내지 55 중량%, 13 내지 50 중량%, 13 내지 45 중량%, 13 내지 40 중량%, 13 내지 35 중량%, 13 내지 30 중량%, 15 내지 55 중량%, 15 내지 50 중량%, 15 내지 45 중량%, 15 내지 40 중량%, 15 내지 35 중량%, 또는 15 내지 30 중량%일 수 있다.
상기 약물을 목적하는 방출거동을 달성한다면 특별히 제한없이 사용될 수 있으며, 예를 들면 로피바카인, 부피바카인, 클로르프로카인, 리도카인, 메피바카인, 프로카인, 테트라카인, 레보부피바카인, 및 아티카인으로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상의 국소마취제일 수 있다. 상기 약학적 조성물이 국소 마취제를 포함하는 경우, 국소 마취제의 함량은 첨가제(염화나트륨, 수산화나트륨, 주사용수, 염산)를 포함하는 1mL를 기준으로, 0.01 내지 3 중량%, 0.05 내지 3 중량%, 0.075 내지 3 중량%, 0.1 내지 3 중량%, 0.01 내지 1 중량%, 0.05 내지 1 중량%, 0.075 내지 1 중량%, 0.1 내지 1 중량%, 0.01 내지 0.5 중량%, 0.05 내지 0.5 중량%, 0.075 내지 0.5 중량%, 또는 0.1 내지 0.5 중량%일 수 있다.
본 발명에 있어서, 히알루론산은 N-아세틸-D-글루코사민과 D-글루쿠론산으로 이루어진 반복 단위가 선형으로 연결되어 있는 생체 고분자 물질로서, 본 발명에서 히알루론산은 히알루론산 자체, 이의 염 또는 이들의 조합을 모두 포함하는 의미로 사용된다. 상기 히알루론산의 염은 예를 들어 히알루론산 나트륨, 히알루론산 칼륨, 히알루론산 칼슘, 히알루론산 마그네슘, 히알루론산 아연, 히알루론산 코발트 등의 무기염과, 히알루론산 테트라부틸암모늄 등의 유기염이 모두 포함되는 것이나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명에서는, 히알루론산 자체, 또는 이의 염을 단독으로, 또는 히알루론산 자체, 또는 이의 염을 2종 이상 조합하여 사용할 수 있다. 본 발명에서, 상기 히알루론산의 분자량은 분자량 1,000 KDa 내지 2,000 KDa 범위일 수 있다.
가교 히알루론산 중합체 또는 가교 희알루론산 유도체는 상기와 같은 히알루론산 자체 또는 이의 염을 가교제를 사용하여 가교시켜 제조할 수 있다. 가교를 위해서는, 알칼리 수용액 하에서 가교제를 사용하는 방법을 사용할 수 있다. 상기 알칼리 수용액으로는 NaOH, KOH, 바람직하게는 NaOH 수용액을 사용할 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니다. 이때 NaOH 수용액의 경우 0.25N 내지 5N의 농도로 사용할 수 있다.
또한 상기 가교된 히알루론산 유도체는 고형분 함량 2중량%의 약물 전달 조성물의 시료를 0.02Hz에서 측정한 복합점도가 500,000~1,500,000cp인 것일 수 있다.
상기 가교제는 둘 또는 그 이상의 에폭시 작용기를 포함하는 화합물로서 다양할 수 있으며, 바람직한 예로 부탄디올디글리시딜에테르(1,4-butandiol diglycidyl ether: BDDE), 에틸렌글리콜디글리시딜에테르(ethylene glycol diglycidyl ether: EGDGE), 헥산디올디글리시딜에테르(1,6-hexanediol diglycidyl ether), 프로필렌글리콜디글리시딜에테르(propylene glycol diglycidyl ether), 폴리프로필렌글리콜디글리시딜에테르(polypropylene glycol diglycidyl ether), 폴리테트라메틸렌글리콜디글리시딜에테르(polytetramethylene glycol diglycidyl ether), 네오펜틸글리콜디글리시딜에테르 (neopentyl glycol diglycidyl ether), 폴리글리세롤폴리글리시딜에테르(polyglycerol polyglycidyl ether), 디글리세롤폴리글리시딜에테르(diglycerol polyglycidyl ether), 글리세롤폴리글리시딜에테르(glycerol polyglycidyl ether), 트리메틸프로판폴리글리시딜에테르(tri-methylpropane polyglycidyl ether), 비스에폭시프로폭시에틸렌(1,2-(bis(2,3-epoxypropoxy)ethylene), 펜타에리쓰리톨폴리글리시딜에테르(pentaerythritol polyglycidyl ether) 및 소르비톨폴리글리시딜에테르(sorbitol polyglycidyl ether) 등을 들 수 있고 1,4-부탄디올디글리시딜에테르가 특히 바람직하다.
본 발명에 따른 가교 알루론산와 가교제를 이용한 가교방법에서, 가교제 0.3 내지 1.3 몰%, 바림작하게는 0.35 내지 1.0 몰%를 사용할 수 있다.
본 발명에서 용어 "가교도(degree of crosslinking)"는 히알루론산 기반 조성물의 가교결합된 부분 내의 히알루론산 단량체 단위에 대한 가교결합제의 %중량비로 정의된다. 이것은 히알루론산 단량체의 중량비에 대한 가교결합제의 중량비로서 측정된다. 본 발명에서는 특히, 이러한 히알루론산의 가교도(MOD, Degree of Modification, mol%)가 상기와 같은 가교제에 의한 가교를 통해 0.1 몰% 내지 5 몰%, 0.2 내지 5 몰%, 0.25 내지 5 몰%, 0.3 내지 5 몰%, 0.35 내지 5 몰%, 0.4 내지 5몰%, 0.1 몰% 내지 3 몰%, 0.2 내지 3 몰%, 0.25 내지 3 몰%, 0.3 내지 3 몰%, 0.35 내지 3 몰%, 0.4 내지 3몰%, 0.1 몰% 내지 2 몰%, 0.2 내지 2 몰%, 0.25 내지 2 몰%, 0.3 내지 2 몰%, 0.35 내지 2 몰%, 0.4 내지 2몰%, 0.1 몰% 내지 1 몰%, 0.2 내지 1 몰%, 0.25 내지 1 몰%, 0.3 내지 1 몰%, 0.35 내지 1 몰%, 0.4 내지 1몰%, 구체적으로 0.1 몰% 내지 5 물%, 0. 2 내지 4 몰%, 0.3 내지 3 몰%, 0.4 내지 2몰% 또는 0.4 내지 1 몰%일 수 있다.
본 발명의 일 예에 따른 상이한 팽윤도를 갖는 적어도 2종의 가교 히알루론산을 포함하는 약물 전달 조성물의 제조방법은
(a)알칼리 수용액 하에서 분자량 1,000 KDa 내지 2,000 KDa 범위의 히알루론산 또는 이의 염과, 가교제 0.3 내지 1.3 몰%를 혼합하여, 적어도 2이상의 상이한 용량으로 가교반응을 수행하여 가교 반응물을 제조하는 단계, 및
(b)상기 얻어진 가교 반응물을 정제 및 분쇄하여, 상이한 팽윤도를 갖는 적어도 2종 이상의 가교 히알루론산을 얻는 단계를 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 방법으로 제조된 상기 가교 히알루론산 유도체는 고형분 함량이 0.5 내지 5.0 중량% 또는 1.0 내지 5.0중량%이고 물의 함량이 95.0 내지 99.0 중량% 또는 95.0 내지 99.5 중량%인 것일 수 있다.
상기 (a)가교 반응물을 제조하는 단계는, 구체적으로 0.25 내지 2.5 N의 염기성 수용액, 예를 들면 NaOH 수용액에 대해 1 내지 30 중량%의 농도로 히알루론산 또는 이의 염을 넣고, 상기 히알루론산에 대해 0.3 내지 1.3 몰%, 바람직하게는 0.35 내지 1.0 물%의 가교제를 첨가하여 히알루론산 또는 그의 염과 균질한 상태로 혼합하여, 적어도 2이상의 상이한 용량으로 가교반응을 수행하여 가교 반응물을 제조할 수 있다. 구체적인 일 양태로서, 상기 단계에서 히알루론산과 가교제의 가교반응은 10 내지 60 ℃, 더욱 바람직하게는 20 내지 50 ℃, 가장 바람직하게는 25 내지 40 ℃에서 이루어질 수 있다.
상기 제조방법의 단계(a)의 가교 반응은 상이한 용량으로 가교 반응을 수행한다. 예를 들면 제1 가교 히알루론산은 가교반응의 용량이 100 내지 800 mL, 바람직하게는 150 내지 800 mL, 150 내지 700 mL, 150 내지 600 mL, 150 내지 550 mL, 200 내지 800 mL, 200 내지 700 mL, 200 내지 600 mL, 200 내지 550 mL, 250 내지 800 mL, 250 내지 700 mL, 250 내지 600 mL, 또는 250 내지 550 mL 일 수 있다. 상기 제1가교 히알룰론산은 저팽윤도를 가지며, 예를 들면 상기 팽윤도 50 내지 175%을 갖는 것일 수 있다. 상기 제2 가교 히알루론산은 가교반응의 용량이 3 내지 50mL, 바람직하게는 5 내지 30 mL 일 수 있으며, 상기 제2가교 히알루론산은 고팽윤도를 가지며, 예를 들면 상기 팽윤도 150 내지 675%를 갖는 것일 수 있다. 바람직하게는 저팽윤도를 갖는 제1 가교 히알루론산과 고팽윤도를 갖는 제2 가교 히알루론산의 팽윤도 차이는 100% 내지 500%일 수 있다.
상기 (b) 상이한 팽윤도를 갖는 적어도 2종 이상의 가교 히알루론산을 얻는 단계는, 상기 단계(a)에서 얻어진 가교 반응물을 정제 및/또는 분쇄하는 단계를 수행하여 상이한 팽윤도를 갖는 적어도 2이상의 가교 히알루론산을 얻는다. 상기 정제 및 분쇄를 상이한 용량의 가교반응으로 얻어진 각 가교 반응물에 대해 별도로 수행하여, 상이한 팽윤도를 갖는 적어도 2종 이상의 가교 히알루론산을 얻을 수 있다.
상기 단계(b)에서 저팽윤도를 갖는 제1 가교 히알루론산은 가교반응의 용량이 100 내지 800 mL일 수 있으며, 상기 얻어진 비교적 큰 반응용량의 가교 반응물을 500 내지 2,000 ㎛ 기공직경, 예를 들면 1000㎛ 기공직경을 갖는 체를 이용하여 예비 분쇄하여 예비 분쇄물을 얻는다. 상기 예비 분쇄물을 정제하여 미반응 가교제를 제거하고 pH를 6.5~7.5 수준으로 안정화할 수 있다. 가교제 등을 제거하고자 세척수를 이용하여 가교 히알루론산을 세척할 수 있으며, 세척수는 식염수 또는 인산완충용액 등을 사용할 수 있으나 특별히 제한되지 않는다.
상기 정제된 분쇄물을 20㎛~500㎛, 50㎛~500㎛, 100㎛~500㎛, 150㎛~500㎛, 200㎛~500㎛, 20㎛~450㎛, 50㎛~450㎛, 100㎛~450㎛, 150㎛~450㎛, 또는 200㎛~450㎛ 기공직경, 예를 들면 350 ㎛의 기공직경을 갖는 체를 통과시켜 수행할 수 있다.
상기 단계(b)에서 고팽윤도를 갖는 제2 가교 히알루론산은 3 내지 50mL의 용량으로 가교반응을 수행한 가교 반응물을 얻고, 분쇄공정없이 정제공정을 수행하여 미반응 가교제를 제거하고 pH를 6.5~7.5 수준으로 안정화하였다. 상기 단계(b)에서 가교제 등을 제거하고자 세척수를 이용하여 가교 히알루론산을 세척할 수 있으며, 세척수는 식염수 또는 인산완충용액 등을 사용할 수 있으나 특별히 제한되지 않는다. 고팽윤도를 갖는 제2 가교 히알루론산이 가교 반응물은 정제를 완료한 후에, 분쇄 공정을 수행하며, 상기 분쇄는 20㎛~500㎛, 50㎛~500㎛, 100㎛~500㎛, 150㎛~500㎛, 200㎛~500㎛, 20㎛~450㎛, 50㎛~450㎛, 100㎛~450㎛, 150㎛~450㎛, 또는 200㎛~450㎛ 기공직경, 예를 들면 350 ㎛의 기공직경을 갖는 체를 통과시켜 수행할 수 있다.
상기 예비분쇄, 정제 및 분쇄공정을 수행한 후 얻어지는 제1가교 히알루론산의 고형분 함량은 2.0 중량% 이하, 또는 1.5 중량% 이하, 예를 들면 0.5 내지 2.0 중량%, 0.5 내지 1.5 중량%, 1.0 내지 1.5 중량%, 또는 1.1 내지 1.4 중량%이며, 나머지는 물 함량일 수 있다. 상기 정제 및 분쇄공정을 수행한 후 얻어지는 제2가교 히알루론산의 고형분 함량은 1.5 중량%이상, 2.0 중량%이상, 또는 2.5 중량%이상, 예를 들면 1.5 내지 5.0 중량%, 2.0 내지 5.0 중량%, 2.5 내지 5.0 중량%, 또는 3.0 내지 5.0 중량%일 수 있으며, 총 100중량% 중에서 상기 고형분 함량을 제외한 나머지는 물의 함량일 수 있다.
상기 상이한 팽윤도를 갖는 히알루론산은 팽윤도 차이가 100% 내지 500% 범위를 가지며, 저팽윤도를 갖는 제1 가교 히알루론산과 고팽윤도를 갖는 제2 가교 히알루론산을 포함하는 것일 수 있으며, 또는 상기 제1 가교 히알루론산은 팽윤도 50 내지 175%를 가지며, 제2 가교 히알루론산은 팽윤도 150 내지 675%를 갖는 것일 수 있다.
상기 제조방법의 상기 단계(b)는, 정제 및 분쇄를 상이한 용량의 가교반응으로 얻어진 가교 반응물에 대해 별도로 수행하여, 상이한 팽윤도를 갖는 적어도 2종 이상의 가교 히알루론산을 얻고, 추가로 상기 상이한 팽윤도를 갖는 적어도 2종 이상의 가교 히알루론산을 혼합하는 단계를 포함하는 것일 수 있다. 상기 제1 가교 히알루론산은 상기 가교 반응물을 체로 1차 분쇄, 정제 및 체로 2차 분쇄하는 공정으로 제조될 수 있다. 또한, 상기 제2 가교 히알루론산은 상기 가교반응물을 정제하고 및 체로 분쇄하는 공정으로 제조되는 것일 수 있다.
상기 방법으로 제조된 약물 전달 조성물은, 제품의 고형분 함량으로 조정하고, 용기 충전, 멸균 및 포장하는 공정을 추가로 포함하여 제조될 수 있다.
본 발명은 히알루론산 분쇄를 최소화시키면서 물성을 증가시키는 가교 및 정제기술을 적용한 가교 히알루론산을 약물 전달체로 개발하여, 생체 내 분해기간 및 약물의 방출속도를 조절하고, 1회 투여로도 충분한 약효를 이끌어내 시술 편의성 확보 및 환자에게 보다 효과적이고 안전한 통증관리를 이끌어 낼 수 있다.
도 1은 본 발명의 일 예에 따라 제조된 가교 히알루론산에 대한 팽윤도를 확인한 결과이다.
도 2는 실시예 1에서 제조된 가교 히알루론산에 대한 탄성계수(G')을 확인한 결과이다.
도 3은 실시예 1에서 제조된 가교 히알루론산에 대한 복합점도(cp)를 확인한 결과이다.
도 4는 실시예 2에서 제조된 가교 히알루론산에 대한 팽윤도를 확인한 결과이다.
도 5는 실시예 2에서 제조된 가교 히알루론산에 대한 탄성계수(G')을 확인한 결과이다.
도 6은 실시예 2에서 제조된 가교 히알루론산에 대한 복합점도(cp)를 확인한 결과이다.
도 7은 실시예 1에서 제조된 가교 히알루론산에 대한 부피바카인의 약물방출 거동을 나타낸 그래프이다.
도 8은 실시예 2에서 제조된 가교 히알루론산에 대한 로피바카인의 약물방출 거동을 나타낸 그래프이다.
도 9는 실시예 2에서 제조된 가교 히알루론산 (Voferon-L60)과 로피바카인을 포함하는 약물 제제를 실험동물에 투여 후 기계적 이질통 정도 (역치)를 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 10은 실시예 2에서 제조된 가교 히알루론산 (Voferon-L60)과 로피바카인을 포함하는 약물 제제를 실험동물에 투여 후 투여부위 주변의 근육 및 좌골신경을 관찰한 결과이다.
도 11은 실시예 2에서 제조된 가교 히알루론산 (Voferon-L60)과 로피바카인을 포함하는 약물 제제를 투여한 후에, 경과 시간에 따른 시험군 Ge, Gf 및 Gg의 혈중 로피바카인의 농도를 측정한 결과를 나타낸 그래프로서, SC는 0.9% 염화나트륨, Vo는 Voferon-L60, Ro는 로피바카인을 의미한다.
도 12는 실시예 2에서 제조된 가교 히알루론산 (Voferon-L60)과 로피바카인을 포함하는 약물 제제를 투여한 후에, 약물 투여 후 시험군 Ge, Gf 및 Gg의 AUC (혈중농도 - 시간곡선 하 면적) 평균을 측정한 결과를 나타낸 그래프이고, AUC0-48hr은 48시간 동안의 면적 평균을 의미한다.
하기 실시예를 들어 본 발명을 더욱 자세히 설명할 것이나, 본 발명의 범위가 하기 실시예로 한정되는 의도는 아니다.
실시예 1: 가교 히알루론산의 제조 및 물성평가
1-1: 가교 히알루론산의 제조
1,500,000 Da의 분자량을 갖는 비가교 히알루론산 (반복단위 분자량 401.3) 100중량부를 0.25N NaOH 용액 400중량부에 용해하여 20 중량%의 히알루론산 용액을 제조하였다. 상기 히알루론산 용액에 가교제인 1,4-부탄디올 디글리시딜 에테르 (1,4-butanediol diglycidyl ether, BDDE)를 0.7 몰%의 비율로 첨가하여, 각각 4개의 상이한 용량으로 반응하였으며, 구체적으로 JPD001은 400mL, JPD002은 5mL, JPD003은 15mL, 및 JPD004는 25mL의 용량 부피로 분주하여 실온에서 24시간 동안 가교 반응을 수행하여, 상이한 용량을 갖는 가교 반응물을 얻었다.
상기 가교반응 완료 후 JPD001는 기공직경 1,000㎛을 갖는 체로 통과시켜 분쇄함으로써, 각 분쇄물의 직경이 약 1,000㎛가 되게 1차 분쇄물을 얻었다. 이후, 상기 JPD001의 1차 분쇄물을 인산완충용액으로 수차례 세척하여 미반응 BDDE를 제거하고 pH를 6.5~7.5 수준으로 안정화하였으며, 정제에 소요된 시간은 24시간이었다.
또한, 상기 가교반응이 완료된 JPD002, JPD003 및 JPD004 반응물은 분쇄과정없이 그대로 인산완충용액으로 수차례 세척하여 미반응 BDDE를 제거하고 pH를 6.5~7.5 수준으로 안정화하였다. 상기 정제 공정에 소요된 시간은 JPD002 및 JPD003 반응물은 약 36시간이었고, JPD004 반응물은 약 72시간이었다.
상기 얻어진 4가지 반응물 (JPD001, JPD002, JPD003, JPD004)에 대하여 pore size 300㎛의 체를 통과시켜 분쇄하였으며, 고형분의 함량을 대한약전의 건조감량 시험방법으로 측정하였다. 상기 분쇄 후 얻어진 반응물의 고형분 함량은 JPD001은 1.4 wt/wt%, JPD002은 2.2 wt/wt%, JPD003은 2.5 wt/wt%, JPD004은 3.9 wt/wt%이었다.
고형분 함량 2.0중량%의 시료 제품을 제조하고자, JPD001 반응물은 상기 가교 반응의 원료로 사용한 비가교 히알루론산을 첨가하여 2.0 중량 %를 맞추었으며, JPD002, JPD003, JPD004 반응물은 고형분 함량이 2.0중량%를 초과하므로 PBS를 첨가하여 2.0 중량 %로 희석하여 고형분 함량이 2.0 중량%가 되도록 하였다. 상기 얻어진 4가지 시료는 121℃에서 20분간 멸균하여 가교 히알루론산 겔을 제조하였다.
상기 정제 및 분쇄된 JPD002~JPD004 반응물을 포함하는 시료는, 가교 반응물의 정제 공정에서 수분 흡수가 적어, 약물이 포함된 수용액과 혼합하는 경우 가교 히알루론산이 팽윤되면서 약물을 가교 히알루론산의 내부로 더 많이 혼입할 수 있다. 반면에 가교 반응의 용량이 400mL인 JPD001는 통상의 제품에 포함된 고형분 함량 2% 보다 더 낮은 고형분 함량을 가져 더 많은 수분을 흡수한 상태이며, 이에 약물과 혼합하는 경우 혼입할 수 있는 약물량이 다소 낮다.
1-2: 가교 히알루론산의 물성 평가
상기 제조된 가교 히알루론산 겔 JPD001, JPD002, JPD003, JPD004, 및 (JPD001과 JPD004의 중량비 1:1로 포함하는 혼합물)에 대해, 팽윤도 비율, 탄성계수 및 복합점도를 측정하여 그 결과를 표 1와 도 1 내지 도 3에 나타냈다.
(1) 팽윤도
각 샘플 2g을 정확하게 칭량하여 50mL 코니컬 튜브에 투입하고, 25mL의 인산완충용액을 투입한 후에, 15분 동안 100rpm 으로 shaking, 5분 동안 2,000rpm으로 원심분리, 그리고 코니컬 튜브의 상등액을 제거한 후 팽윤된 히알루론산 겔 무게를 측정하였으며, 하기 수학식 1과 같이 팽윤도를 의미한다. 하기 수학식 1에서 초기 측정된 가교 히알루론산의 겔의 무게는 인산완충용액을 투입하기 전의 무게이며, 실질적으로 실시예 1에서 얻어진 고형분 함량이 2.0중량%을 포함하는 시료의 무게이다.
[수학식 1]
팽윤도(%) = (팽윤된 가교 히알루론산 겔의 무게/초기 측정된 가교 히알루론산의 겔의 무게) X 100
(2) 탄성계수
유변학적 특성을 비교하기 위하여 레오미터 (rheometer)를 사용하여 0.02 Hz 내지 1 Hz의 진동수 범위에서 탄성계수(G')를 측정하였다.
(3) 복합점도
유변학적 특성을 비교하기 위하여 레오미터 (rheometer)를 사용하여 0.02 Hz 내지 1 Hz의 진동수 범위에서 복합점도(complex viscosity)를 측정하였다.
[회전형 레오미터(Rotational Rheometer)의 분석조건]
(a) 시험장비: Rotational Rheometer (KINEXUS pro+)
(b) Frequency: 0.01 ~ 1 Hz
(c) Temperature: 25
(d) Strain: 4 %
(e) Measuring geometry: 40 mm plate
(f) Measuring gap: 0.145 mm
명명 팽윤도(%) 저장탄성계수 복합점도(cP)
시료1-1 (JPD001) 143.29 318 3,226,514
시료1-2 (JPD002) 260.74 189 2,413,216
시료1-3 (JPD003) 333.90 157 1,573,636
시료1-4 (JPD004) 591.25 98 804,534
시료1-5 (JPD001 + JPD004) 221.45 219 1,078,940
팽윤도가 낮을수록 국소마취제 용액과 혼합하여 체내 적용 시 약물방출이 빠르게 진행되며, 반대로 팽윤도가 높을수록 약물방출 속도가 느리게 작용한다. 구체적으로, 도 7에서와 같이 팽윤도가 가장 낮은 JPD001의 경우 약물이 가장 빠르게 방출되었으며, 팽윤도가 가장 높은 JPD004의 경우에는 약물 방출 속도가 가장 느리게 나타냈다. 가교 히알루론산의 탄성계수가 낮을수록 체내 적용 시 조직 내 퍼짐 정도가 높으며, 즉 넓은 부위에 국소마취제의 통증 감소 효과를 제공할 수 있다. 복합점도는 낮을수록 체내 적용 시 주사바늘을 사용하였을 때 주입력이 낮아 사용이 용이하게 한다. 약물방출 속도에 관련하여 팽윤도 가장 중요한 요인으로 작용하며, 탄성계수 및 복합점도의 경우에는 실제 임상 적용시에 국소마취제의 작용을 보조해주는 요인으로 작용한다. 상기 표 1에 나타낸 가교 히알루론산의 팽윤도는 100~600까지 범위에서 나타났으며, 통증이 가장 심한 3일 동안 JPD001과 JPD004를 혼합한 조건에서 약물이 안정적으로 방출되는 것을 확인할 수 있었다.
실시예 2: 가교 히알루론산의 제조 및 물성평가
2-1: 가교 히알루론산의 제조
1,500 kDa의 분자량을 갖는 비가교 히알루론산 (반복단위 분자량 401.3) 100중량부를 0.25N NaOH 용액 400중량부에 용해하여 20 중량%의 히알루론산 용액을 제조하였다. 상기 히알루론산 용액에 가교제인 1,4-부탄디올 디글리시딜 에테르 (1,4-butanediol diglycidyl ether, BDDE)를 0.4 몰%의 비율로 첨가하여, 각각 3개의 상이한 용량으로 반응하였으며, 구체적으로 JD005은 400mL, JD006은 5 mL, 및 JD007는 25mL의 용량 부피로 분주하여 실온에서 24시간 동안 가교 반응을 수행하여, 상이한 용량을 갖는 가교 반응물을 얻었다.
1,500 KDa의 분자량을 갖는 비가교 히알루론산을 0.25N NaOH 용액에 용해하여 20 중량%의 히알루론산 용액을 제조하였다. 상기 히알루론산 용액에 가교제인 1,4-부탄디올 디글리시딜 에테르 (1,4-butanediol diglycidyl ether, BDDE)를 0.4 몰%의 비율로 첨가하여, 각각 4개의 상이한 용량으로 반응하였으며, 구체적을 JD005은 400mL, JD006은 5 mL, 및 JD007는 25mL의 용량 부피로 분주하여 실온에서 24시간 동안 가교 반응을 수행하여, 상이한 용량을 갖는 가교 반응물을 얻었다.
상기 가교반응 완료 후 JD005는 1,000㎛ 기공을 갖는 체로 통과시켜 분쇄함으로써, 각 분쇄물의 직경이 약 1,000㎛가 되게 1차 분쇄물을 얻었다. 이후, 상기 JD005의 1차 분쇄물을 인산완충용액으로 수 차례 세척하여 미반응 BDDE를 제거하고 pH를 6.5~7.5 수준으로 안정화하였으며, 정제에 소요된 시간은 24시간이었다.
또한, 상기 가교반응이 완료된 JD006 및 JD007 반응물은 분쇄과정없이 그대로 인산완충용액으로 수 차례 세척하여 미반응 BDDE를 제거하고 pH를 6.5~7.5 수준으로 안정화하였다. 상기 정제 공정에 소요된 시간은 JD006 반응물은 약 36시간이었고, JD007 반응물은 약 72시간 이었다.
상기 얻어진 3가지 반응물 (JD005, JD006, JD007)에 대하여 300㎛의 체를 통과시켜 분쇄하였으며, 고형분의 함량을 대한약전 건조감량 시험방법으로 측정하였다. 상기 분쇄후 얻어진 반응물의 고형분 함량은 JD005은 1.1 wt/wt%, JD006은 1.8 wt/wt%, JD007은 2.5 wt/wt%이었다.
고형분 함량 2.0중량%의 시료 제품을 제조하고자, JD005 및 JD006 반응물은 상기 가교 반응의 원료로 사용한 비가교 히알루론산을 첨가하여 고형분 함량 2.0 중량%를 맞추었으며, JD007 반응물은 고형분 함량이 2.0중량%를 초과하므로 PBS를 첨가하여 2.0 중량%로 희석하여 고형분 함량이 2.0 중량%가 되도록 하였다. 상기 얻어진 3가지 시료는 121℃에서 20분간 멸균하여 가교 히알루론산 겔을 제조하였다.
2-2: 가교 히알루론산의 물성 평가
상기 제조된 가교 히알루론산 JD005, JD006, JD007, 및 (JD005와 JD007의 중량비 1:1로 포함하는 혼합물)에 대해, 팽윤도 비율, 탄성계수 및 복합점도를 실시예 1과 동일한 방법으로 측정하여 그 결과를 표 2와 도 4 내지 도 6에 나타냈다.
명명 팽윤도(%) 탄성계수(G') 복합점도(cP)
시료2-1 (JD005) 63.2 88.2 287,800
시료2-2 (JD006) 138.9 90.6 328,150
시료2-3 (JD007) 221.0 90.0 299,600
시료2-4 (JD005& JD007) 121.9 185.4 737,650
상기 표 2와 도 4 내지 도 6에 나타낸 바와 같이, 상이한 팽윤도를 갖는 JD005+JD007을 1:1로 혼합한 시료와 유사한 팽윤도를 갖는 시료-JD006의 물성을 비교한 경우, 혼합시료는 2배 정도가 증가한 탄성계수(G')을 나타낸다. 낮은 탄성값을 갖는 시료는 조직에 투입 시에 조직 내 퍼짐성이 높으며 조직 내에서 흩어질 가능성이 높다. 따라서, 바람직한 팽윤도 범위는 100~200%인 것으로 확인하였다.
복합점도 분석 데이터의 경우에도 상이한 팽윤도를 갖는 (JD005+JD007)시료를 1:1로 혼합한 시료와 유사한 팽윤도를 갖는 시료-JD006의 물성을 비교한 경우, 혼합시료는 복합점도가 2배 정도 높은 결과를 나타냈다. 따라서, 바람직한 탄성계수(G') 범위는 1Hz 에서 측정한 값이 0~250pa(1Hz)이며, 복합점도는 0.02Hz에서 측정한 값이 500,000~1,500,000cp(0.02Hz) 인 것으로 확인하였다.
실시예 3: 가교 히알루론산을 이용한 약물(부피바카인)의 방출거동 평가
실시예 1에서 제조한 가교 히알루론산 고형분이 2 중량% 함량으로 포함된 가교 히알루론산 겔인 JPD001, JPD004 및 (JPD001과 JPD004의 1:1 중량비의 혼합물), 즉 실시예 1의 시료 1-1, 1-4 및 1-5를 각각 6g과, 0.75 중량% 부피파카인 (bupivacaine) 용액 3g을 혼합하여 약물 제제를 제조하였다. 대조군으로서 1,500 kDa의 분자량을 갖는 비가교 히알루론산 (반복단위 분자량 401.3) 2 중량%를 혼합한 제제와 부피파카인 약물만 포함하는 제제를 각각 제조하였다.
상기 제조된 약물 제제에 대해 각각 투석 백 (MWCO: 12 K-14 K Da)에 넣었다. 그 후 투석백을 있는 튜브에 15ml 인산완충용액으로 침지시켰다. 침지된 투석백이 들어간 50mL 코니칼 튜브를 37 ℃에서 유지되는 진탕 수조에 넣고 100rpm에서 수평으로 진탕시켰다. 그 후 예정된 시간 간격으로, 1.5 mL의 이형 배지 (PBS) 분취량을 회수하고, 전체 이형 매체를 15 mL의 새로운 PBS로 교체하여 싱크 조건을 유지 하였다. 방출된 부피바카인의 정량화는 ZORBAX Eclipse XDB C18 컬럼(4.6mm×250mm, 5μm)과 아세토니트릴/pH 8.0 버퍼(60:40, v/v)를 10분 이상 사용한 역상고성능 액체 크로마토그래피(RP-HPLC)에 의해 결정되었다. 약물 방출 거동을 평가하고 그 결과를 도 7에 나타냈다.
도 7의 경시적 약물 방출 거동에 나타낸 바와 같이, 부피바카인 시간대별 누적방출량에서 부피바카인 단독 사용 시 8시간 이내에 99% 방출되었다. 가교 히알루론산 2% 용액의 경우 8시간 경과 후 65.8%, 24시간 경과 후 99%의 부피바카인을 방출하였다. 팽윤도가 비교적 낮은 JPD001 (시료 1-1)의 경우 24시간 동안 70%의 방출이 이루어지고, 48시간에 96.7%의 부피바카인 방출되었다. 팽윤도가 높은 JPD004(시료 1-4)의 경우 초기 비교적 낮은 방출속도를 보이며, 72시간에 85.3%의 방출하였다. 또한, JPD001과 JPD004의 1:1 중량비로 혼합한 약물 전달체 (시료 1-5)는, 방출 초기에 JPD001과 같은 방출속도를 보이다가 서서히 방출하는 프로파일을 나타내며, 구체적으로, 약물의 누적 방출량이 24시간에 60%, 48시간에 75% 및 72시간에 90%이상의 방출 패턴을 보였다.
따라서, 체내에 적용 시 국소마취제가 서서히 방출되어 수술 후 가장 통증이 심한 3일 동안 통증을 감소시킬 수 있을 것으로 확인하였다.
실시예 4: 약물(로피바카인)의 방출거동 평가
실시예 2에서 제조한 가교 히알루론산 고형분이 2 중량% 함량으로 포함된 가교 히알루론산 겔인 JD006, JD007 및 (JD005과 JD007의 1:1 중량비의 혼합물), 즉 실시예 2에 따른 시료 2-2, 시료 2-3 및 시료 2-4를 각각 6g 에 대해, 0.75 중량% 로피바카인 (ropivacaine) 용액 3g을 혼합하여 약물 제제를 제조하였다. 대조군으로서 1,500 kDa의 분자량을 갖는 비가교 히알루론산 (반복단위 분자량 401.3) 2 중량%를 혼합한 제제와 부피파카인 약물만 포함하는 제제를 각각 제조하였다.
상기 제조된 약물 제제에 대해 실시예 3과 같은 방법으로 약물 방출 거동을 평가하고 그 결과를 도 8에 나타냈다.
도 8의 경시적 약물 방출 거동에 나타낸 바와 같이, HA의 필러의 경우 24시간 이내에 99% 방출되고, JD006 (시료 2-3)과 JD005+JD007 혼합물(시료 2-4)의 경우 팽윤도가 유사하지만 혼합물의 경우가 72시간까지 방출되는 프로파일을 나타낸다. 구체적으로, JD006(시료 2-3)의 약물 누적 방출량이 24시간에 90%, 48시간에 95%이상의 방출 패턴을 보였다. 또한, JD005+JD007 혼합물 (시료 2-4)을 사용한 경우 약물의 누적 방출량이 24시간에 60.7%, 48시간에 79.6% 및 72시간에 90.8%의 방출 패턴을 보였다. 따라서, 체내에 적용 시 국소마취제가 서서히 방출되어 수술 후 가장 통증이 심한 3일 동안 통증을 감소시킬 수 있을 것으로 확인하였다.
실시예 5. 외과용품 (Voferon-L60) 주입액 및 로피바카인의 혼합투여에 따른 통증완화 효과 및 안전성 평가
5.1: 시험동물 준비
1) 시험계
특정병원균 부재 (SPF) Sprague-Dawley 랫트 [Crl:CD(Sprague Dawley)] (생산처: (주)오리엔트바이오 (경기도 성남시 중원구 갈마치로 322))를 하기 조건에 따라 준비하였다.
(1) 입수시 동물수: 수컷 28마리
(2) 입수시 주령: 약 7주령　
(3) 입수 시 체중 범위: 199.29 ~ 222.35 g
(4) 투여개시 시 주령: 약 8주령
(5) 투여개시 시 체중범위: 265.63 ~ 294.00 g
(6) 사용 동물수: 24마리
(7) 군 분리
투여 전일에 체중을 측정하고 Excel program을 이용하여 순위화한 체중으로 군 분리를 실시하였다. 평균체중의 ±20% 범위 내에 속하는 동물만을 시험에 사용하였다.
2) 사육환경
(1) 온습도 범위: 온도 22±3℃, 상대습도 50±20 %RH
(2) 환기횟수: 10∼15회/hr
(3) 명암 cycle: 형광등조명 12hr (08:00 점등∼20:00 소등)
(4) 조도: 150∼300lx
(5) 소음: 60dB 이하
(6) 암모니아 농도: 5ppm 이하
(7) 사육상자 및 사육밀도
검역, 순화, 투여 및 관찰기간 중 스테인레스제 망사육상자 (250 W×350 L×180 H ㎜)에 3마리 이하로 수용하였고, 투여 및 관찰기간 중에는 1마리 이하로 수용하였다. 사육상자의 교체는 군 분리 시 실시하였다.
(8) 사료 및 물
사료 (Teklad Certified Irradiated Global 18% Protein Rodent Diet, Envigo, USA)는 코아텍 (경기도 평택시 신위면 진위로 181-21)으로부터 공급받아 급이기에 넣고 자유섭취 시켰다. 물은 음용 상수도수를 정수시킨 후 폴리카보네이트제 물병에 넣고 자유섭취 시켰다.
5.2: 시험군 준비
상기 준비한 시험동물의 전신마취상태에서 좌측 족저부를 깨끗이 소독한 후 발 뒷금치 끝부분 0.5cm 떨어진 부분에서 시작하여 세로방향으로 1cm 길이의 피부와 근막을 절개하였다. 절개한 부분의 발바닥 근육 (족저근)을 포셉으로 들어올려 1cm 길이를 분리하였다. 세로방향의 양쪽 끝부분은 발바닥 근육이 떨어지지 않게 조심해서 들어 올려 분리하였고, 좌측 넓적다리 측면 대퇴이둔군의 좌골신경 부분에, 실시예 2에서 제조한 가교 히알루론산 고형분이 2 중량% 함량으로 포함된 가교 히알루론산 겔인 JD005와 JD007의 1:1 중량비의 혼합물인 시료 2-4 (Voferon-L60)과 로피바카인 (ropivacaine)을 포함하는 제제를 1회 투여하고 피부를 봉합하여 하기 표 3과 같이 시험군을 구성하였다. Ga 내지 Gd 투여액량(㎕)은 모두 동일하게 600㎕을 신경조직 근처에 투여하였고, 실험군에 포함된 동물은 6마리이었다.
동물군 Ga Gb Gc Gd
동물번호 Ga-1~Ga-6 Gb-7~Gb-12 Gc-13~Gc-18 Gd-19~Gd-24
로피바카인 농도 (%w/w) 0 0.75 0.75 0.75
조제비율 (㎕) 0.9% 염화나트륨 (SC) 600 300 0 0
Voferon-L60 (Vo) 0 0 300 400
로피바카인 (Ro) 0 300 300 200
Voferon-L60 (Vo)의 고형분 함량 (mg) 0 0 6 8
로피바카인의 고형분 함량 (mg) 0 2.25 2.25 1.5
Gc에 투여되는 약물 제제는 2 중량% 농도의 가교 히알루론산 겔 3g, 0.75 중량% 농도의 로피바카인 용액 3g을 사용하였고, 이를 각각의 유효성분 고형분 함량으로 환산하면 가교 히알루론산 60mg 및 로피바카인 23mg을 포함하며, 가교 히알루론산과 약물의 합계 고형분 함량 100 중량%를 기준으로 voferon-L60의 고형분 함량은 72.2 중량%이고 로피바카인 고형분 함량은 27.3 중량%이다.
Gd에 투여되는 약물 제제는 2 중량% 농도의 가교 히알루론산 겔 4g, 0.75 중량% 농도의 로피바카인 용액 2g을 사용하였고, 이를 각각의 유효성분 고형분 함량으로 환산하면 가교 히알루론산 80mg 및 로피바카인 15mg을 포함하며, 가교히알루론산과 약물의 합계 고형분 함량 100 중량%를 기준으로 voferon-L60의 고형분 함량은 84.2 중량%이고 로피바카인 고형분 함량은 15.8 중량%이다.
5.3: 시험방법
상기 시험군 제작 후 기계적 이질통의 정도를 측정하기 위한 방법으로 흰 쥐를 그물 눈의 크기가 2×2 mm 인 철망 케이지에 넣고 15분 이상 적응시킨 뒤, 쥐의 움직임 등이 조용해지면 8개의 연속된 굵기의 von Frey filament (1, 2, 4, 6, 8, 15, 26, 60 g, Stoelting, USA)를 사용하여 연속적인 반응을 up-down method로 평가하였다. Filament를 좌측 환부 발바닥에 수직으로 접촉시키고 5-6초간 유지시켜 쥐가 신속한 회피반응을 보이거나 또는 hairs를 떼면서 즉시 움찔하거나 발바닥을 핥으면 양성반응을 보인 것으로 간주하였다. 중앙부의 von Frey filament 부터 자극하여 양성반응을 보이면 약한 filament로 자극하고, 양성반응이 없으면 강한 filament 로 자극하며 진행하였다. 상기 방법으로 시험물질 투여 전, 투여 후 1, 2, 4, 8, 24, 48, 72, 120, 168시간째에 측정하였다. 통증행동검사 결과 해석은 회피 반응을 보이거나 발이 플라스틱 판에 닿은 상태로 망 위로 들여 올려지는 경우를 양성으로 판정하였다. 자극은 3-5분 간격으로 2회 주었고, 이 중 양성 반응을 보인 역치를 이용하여 시간에 따른 반응 변화 곡선을 얻었다.
또한, 안정성 평가를 위해 시험물질 외과용품 (Voferon-L60)에 사용되는 주입액과 로피바카인의 혼합물을 상기 시험군 좌골신경 주위에 투여 시 나타나는 약물 투여부위의 국소독성을 조사하기 위해, 시험물질 투여 14일 후에 투여부위 주변의 근육 및 좌골신경을 절취하여 삭정, 탈수 및 파라핀 포매 등의 일반적인 조직처리과정을 거쳐 조직절편을 제작하여 박절하고, H&E 염색 (Hematoxylin & Eosin stain) 염색을 실시한 후 검경하였다.
5.4: 약동력학적 분석결과
약물투여 후 시간 별 반응에 따른 약력학적 분석결과를 하기 표 4 및 도 9에 나타내었다. Ga 내지 Gd 그룹 시험군의 각 동물의 시험물질 투여 전, 투여 후 1, 2, 4, 8, 24, 48, 72, 120, 168시간째의 통증 역치값을 측정하였고 각 시험군마다의 역치값의 평균을 계산하였다. 하기 표 4에서 약물 투여 시간별 측정된 역치값 (g)을 나타낸다.
시간(hr) Ga그룹 Gb그룹 Gc그룹 Gd그룹
0 60 60 60 60
1 9.8 60 60 60
2 9.5 60 60 60
4 10.5 37.3 48.7 60
8 10.5 31.7 45.8 57.2
24 10 28.0 30.8 39.3
48 10.8 17.5 20.5 24.2
72 22 29.8 35.5 43
120 54.3 60 60 60
168 60 60 60 60
Ga 그룹은 수술 후 1시간부터 측정된 평균 역치(g)값이 9.8g으로 감소하기 시작하여 48시간 이후부터 역치 평균 10.8g으로 점차 통증이 안정적으로 회복하여 168시간에 완전히 회복하였다.
Gb 그룹은 수술 후 4시간부터 역치 평균 37.3g으로 감소하기 시작하여 48시간 이후부터 역치 평균 17.5g으로 점차 통증이 안정적으로 회복하여 120시간에 완전히 회복하였다.
Gc 그룹은 수술 후 4시간부터 역치 평균 48.7g으로 감소하기 시작하여 48시간 이후부터 역치 평균 20.5g으로 점차 통증이 안정적으로 회복하여 120시간에 완전히 회복하였다.
Gd 그룹은 수술 후 8시간부터 역치 평균 57.2g으로 감소하기 시작하여 48시간 이후부터 역치 평균 24.2g으로 점차 통증이 안정적으로 회복하여 120시간에 완전히 회복하였다.
상기 시험군의 분석결과에서 생리식염수 혼합 투여군 (Ga 및 Gb)과 Voferon-L60 혼합 투여군 (Gc 및 Gd)의 약력학적 변화를 비교한 결과, Voferon-L60 혼합 투여군에서 역치가 높게 측정되어 통증완화 효과가 더 크다는 것이 확인되었다. 이와 같은 결과는 Voferon-L60과 혼합 투여로 약물방출이 지연되어 발생하는 효과로 판단된다.
또한, Gc 및 Gd를 비교할 경우, 로피바카인 농도가 더 낮고 Voferon-L60의 농도가 더 높은 Gd에서 역치가 높게 측정되어 통증완화 효과가 더 크다는 것이 확인되었다. 이와 같은 결과는 Voferon-L60의 농도증가에 따른 로피바카인의 약물방출이 지연되어 발생한 효과로 판단된다. 따라서, Voferon-L60의 농도가 증가할수록 약물방출이 조절되어 통증완화 효과가 증가하는 것으로 판단된다.
5.5: 조직병리학적 관찰결과
투여부위 주변의 근육 및 좌골신경을 H&E 염색을 실시한 후 검경한 결과를 도 10에 나타내었다.
도 10a에서 Ga, Gb, Gc 및 Gd군의 대표 사진에 나타낸 바와 같이, Gc-14 및 Gc-15의 신경 주변에 이물 (foreign body)이 경계를 이루며 국소적으로 관찰되었고, Gd-21에서는 이물과 함께 염증 세포의 침윤이 관찰되었다. 이와 관련하여, 관찰된 염증 세포의 침윤은 투여한 일부 시험물질 잔존에 의한 것으로 추정되고, 시험물질에 의한 독성과는 관련이 없는 것이다. 상기 관찰상황을 제외하면, 모든 시험군의 시험물질 투여 부위 주변의 근육 및 좌골신경에서는 이상소견이 관찰되지 않았다. 이러한 결과를 바탕으로 외과용품 (Voferon-L60)에 사용되는 주입액과 로피바카인의 혼합물을 좌골신경 주위에 투여한 결과, 시험물질에 의한 국소독성이 없는 것으로 판단되며, Voferon-L60 농도 증가에 따라 로피바카인의 약물방출이 조절되어 통증완화 효과가 증가하는 것으로 판단된다.
실시예 6. 외과용품 (Voferon-L60) 주입액 및 로피바카인의 혼합투여에 따른 약물동태 평가
6.1: 시험동물 준비
특정병원균 부재 (SPF) Sprague-Dawley 랫드 [Crl:CD(Sprague Dawley)] (생산처: (주)오리엔트바이오 (경기도 성남시 중원구 갈마치로 322))를 하기 조건에 따라 준비하였다.
(1) 입수시 동물수: 수컷 18마리
(2) 입수시 주령: 약 8주령　
(3) 입수 시 체중 범위: 256.91~272.24 g
(4) 투여개시 시 주령: 약 9주령
(5) 투여개시 시 체중범위: 259.33~272.24 g
(6) 사용 동물수: 15마리
(7) 군 분리
투여 전일에 체중을 측정하고 Excel program을 이용하여 순위화한 체중으로 군 분리를 실시하였다. 평균체중의 ±20% 범위 내에 속하는 동물만을 시험에 사용하였다.
상기 시험군 검역, 순화, 투여 및 관찰기간 중 스테인레스제 망사육상자 (250 W×350 L×180 H ㎜)에 3마리 이하로 수용하였고, 투여 및 관찰기간 중에는 2마리 이하로 수용하였고 그 이외의 조건은 실질적으로 실시예 5의 시험군 사육환경과 동일하게 사육하였다.
6.2: 시험군 준비
상기 준비한 시험동물을 Isoflurane을 이용하여 흡입마취를 실시하고 대퇴부위의 피부를 절개한 후 좌골신경 주위에 실시예 2에서 제조한 가교 히알루론산인 JD005와 JD007의 1:1 중량비의 혼합물인 시료 2-4 (Voferon-L60)과 로피바카인 (ropivacaine)을 포함하는 제제를 주사기로 1회 투여하고 피부를 봉합하여 하기 표 5과 같이 시험군을 구성하였고, 투여액량(㎕)은 Ge 내지 Gg가 모두 동일하게 600㎕로 설정하였고, 실험군에 포함된 동물은 5마리이었다.
실험군 Ge Gf Gg
동물번호 Ge-1~Ge-5 Gf-6~Gf-10 Gg-11~Gg-15
로피바카인 농도 (wt/wt%) 0.75 0.75 0.75
조제비율 (㎕) 0.9% 염화나트륨 (SC) 300 0 0
Voferon-L60 (Vo) 0 300 400
로피바카인 (Ro) 300 300 200
Voferon-L60 (Vo)의 고형분 함량 (mg) 0 6 8
로피바카인의 고형분 함량 (mg) 2.25 2.25 1.5
6.3: 시험동물 채혈
Jugular vein에서 일회용 주사기를 이용하여 약 0.5㎕의 상기 시험군의 혈액을 시험물질 투여 전, 투여 후 0.5, 1, 2, 4, 6, 8, 12, 24 및 48시간째에 채혈하였다. 채혈한 혈액은 heparin 처리한 튜브 (5 IU/ml)에 옮기고, 12,000rpm (4℃)으로 5분간 원심분리한 후 상층 (혈장)을 분리하였다. 분리한 혈장은 분석 전까지 -70℃로 설정되어 있는 초 저온 냉동고 (대한과학, Korea; MAI-040-03)에 보관 후 분석에 이용하였다.
6.4: 시험방법
6.4.1 시험기기 및 시약
본 발명에서 사용한 실험 기기는 하기 표 6, 시약은 하기 표 7과 같다.
실험 기기 명칭 제조사
LC 1290 Infinity Agilent, USA
MS/MS 6460 Triple Quadruple Agilent, USA
Centrifuge Eppendorf Centrifuge 5810R Eppendorf, USA
Ultra pure water system Basic 361 Series 및 Ultra 370 Series 영린기기, Korea
시약 입수처
로피바카인 염산염수화물(표준물질) Lot No. : 0000077915, Sigma Aldrich, USA
리도카인 염산염수화물 (내부 표준물질) Lot No. : WS-054, 중헌제약, Korea
메탄올 Lot No. : 0000110849, J.T. Baker, USA
수산화나트륨 Lot No. : 110117, 삼전순약공업주식회사, Korea
tert-Butyl methyl ether Lot No. : SHBJ9210, Sigma Aldrich, USA
포름산 Lot No. : SHBH3180V, Sigma Aldrich, USA
증류수 Basic 361 Series 및 Ultra 370 Series, 영린기기, Germany
1290 Infinity (Agilent, USA)를 LC기기로, 6460 Triple Quadruple (Agilent, USA)를 MS/MS기기로 LC/MS/MS 분석을 진행하였다. 로피바카인 염산염수화물 (Ropivacaine hydrochloride monohydrate) (Lot No.: 0000077915, Sigma Aldrich, USA) 를 표준물질로, 리도카인 염산염수화물 (Lidocaine hydrochloride monohydrate) (Lot No.: WS-054, 중헌제약, Korea) 를 내부 표준물질로 사용하였다.
6.4.2 표준용액 및 시료의 조제
0.0500g의 로피바카인 염산염수화물 표준물질 (순도 98.7 %)을 칭량하여 50㎖ bottle에 넣고, 50% 메탄올을 채운 후 용해시켜 987.000㎎/ℓ을 조제한 후, 987.000㎎/ℓ농도의 로피바카인 염산염수화물 표준물질 1.013㎖을 10㎖ volumetric flask에 넣고 50% 메탄올을 10㎖ 표선까지 첨가하여 100.000㎎/ℓ농도의 stock solution을 조제하였고, 하기 표 8의 농도 및 부피를 가지는 조제된 stock solution을 50% 메탄올로 계열 희석하여 하기 표 8의 농도를 가지는 working solution을 제조하여 사용하였다.
ID Stock solution 농도 (ng/ml) Stock solution 부피 (ul) 50% 메탄올 부피 (ul) Working solution 농도 (ng/ml)
WS1 100 400 400 50
WS2 500 200 800 100
WS3 1,000 500 500 500
WS4 2,000 500 500 1,000
WS5 5,000 400 600 2,000
WS6 10,000 500 500 5,000
WS7 100,000 100 900 10,000
0.05g의 리도카인 염산염수화물 (순도 100.0%)을 칭량하여 50㎖ bottle에 넣고, 50% 메탄올을 채운 후 용해시켜 1,000.000㎎/ℓ을 조제한 후, 1,000.000㎎/ℓ농도의 리도카인 염산염수화물 표준물질 1㎖을 100㎖ volumetric flask에 넣고 50% 메탄올을 100㎖ 표선까지 첨가하여 10.000㎎/ℓ 농도의 stock solution을 조제하였고, 조제된 stock solution 60㎕와 Acetonitrile 9,940㎕를 혼합하여 600ng/㎖의 working solution을 조제하였다.
Stock solution 표준용액의 stock solution을 사용하였고, 하기 표 9의 농도 및 부피를 가지는 조제된 표준용액의 stock solution을 50% 메탄올로 계열 희석하여 하기 표 9의 농도를 가지는 working solution을 제조하여 사용하였다.
ID Stock solution 농도 (ng/ml) Stock solution 부피 (ul) 50% 메탄올 부피 (ul) Working solution 농도 (ng/ml)
WS7 5,000 30 970 150
WS8 8,000 625 375 5,000
WS9 100,000 80 920 8,000
상기 70℃ 이하에 보관했던 혈장을 실온에 방치하여 녹인 후 약 30초간 vortex에서 잘 섞었다. 하기 표 10의 농도 및 부피를 갖는 working solution을 혈장으로 계열 희석하여 표준용액의 working solution을 하기 표 10의 농도를 가지는 검량선 시료의 표준 혈장을 조제하여 준비하였다.
ID Working solution 농도 (ng/ml) Working solution 부피 (ul) 혈장 부피 (ul) 혈장 내 리도카인 농도 (ng/ml)
S1 50 40 360 5
S2 100 40 360 10
S3 500 40 360 50
S4 1,000 40 360 100
S5 2,000 40 360 200
S6 5,000 40 360 500
S7 10,000 40 360 1,000
6.4.3 시료의 전처리
검량선 시료 및 생체시료 200㎕에 600.000ng/㎖ 농도의 내부표준용액 40㎕, 1M Sodium hydroxide 40㎕, tert-Butyl methyl ether 1,200㎕를 첨가한 후 30초 간 vortex mixing 한 후 3,400rpm에서 5분간 원심분리 하여 상층액 900㎕를 취하였다. 이 상층액 900㎕에 0.1% 포름산 90㎕를 첨가한 후 30초간 vortex mixing 한 후 3,400 rpm에서 5 분간 원심분리 하여 하층액 80㎕를 취하였다.
6.4.4 분석조건 및 정량방법 및 결과해석
이하, 본 발명에 사용한 구체적인 LC/MS/MS 조건은 하기 표 11와 같다.
Figure PCTKR2020014829-appb-T000001
정량값은 얻어진 크로마토그램으로부터 내부표준물질의 peak area에 대한 표준물질의 peak area ratio (표준물질의 peak area/내부표준물질의 peak area)를 구하였다. 해당기기의 MassHunter Workstation Software, version B.07.1(Agilent, USA)를 이용하여 미리 작성한 검량선으로부터 혈장 중 시험물질의 농도를 구하였다.
독성동태 결과 해석은 혈중농도 곡선에 근거한 비모델 해석법에 의하여 PhoenixTM WinNonlin을 이용하여 Tmax (최고혈중농도 도달시간), Cmax (최고혈중농도), AUC0-48hr (0～48 시간의 혈중농도-시간곡선 하 면적) 및 MRT (약물의 평균체류시간)의 동태학적인 파라미터를 산출하여 해석하였다.
6.5: 혈중 로피바카인 농도 변화 분석결과
모든 시험군에서 로피바카인의 약물농도는 약물투여 후 1~2시간에 약물의 농도가 급격하게 증가하고 이후 6시간까지 급격하게 감소하는 경향을 보였으며, 12시간에 약물이 모두 소실되었고 상기 결과를 도 11, 표 12에 나타내었다. Ge 내지 Gg 그룹 시험군의 각 동물의 시험물질 투여 전, 투여 후 0.5, 1, 2, 4, 6, 8, 12, 24 및 48시간째에 채혈한 혈장의 로피바카인 농도를 측정하였고, 각 시험군마다의 농도의 평균을 계산하였다. 하기 표 12에서 시간별 측정된 Rat의 혈장 내에 로피바카인 농도 (ng/kg)의 평균을 나타내었다.
시간(Hr) Ge Gf Gg
0 0 0 0
0.5 361.54 293.02 241.94
1 429.62 327.58 311.45
2 384.59 409.23 252.82
4 68.46 127.13 81.74
6 18.86 22.3 19.93
8 5.92 4.69 12.69
12 1.66 1.23 1.8
24 0.97 0.8 0.87
48 0.8 0.8 0.8
6.6: 로피바카인 약동학적 파라미터 분석결과
약물 투여 후 혈중 시간별 농도를 바탕으로 혈장 중 로피바카인의 약동학적 파라미터를 분석하였고 분석 결과는 하기 도 12 및 표 13에 나타내었다. Ge 내지 Gg 그룹 시험군의 각 동물의 파라미터 값을 측정하였고 각 시험군마다의 각 파라미터값의 평균을 계산하였다. 하기 표 13에서 분석된 파라미터의 평균을 나타내었다.
동물번호 AUC0-48hr
(ng·hr/㎖)		 Cmax
(ng/㎖)		 Tmax
(hr)		 MRT
(hr)
Ge 1254.97 439.90 1.20 1.86
Gf 1308.39 409.23 2.00 2.17
Gg 947.86 320.41 1.20 2.15
Ge 그룹은 AUC0-48hr 평균이 1254.97ng·h/㎖, Cmax 평균이 439.90ng/㎖, Tmax 평균이 1.2hr, MRT 평균이 1.86hr로 나타났다.
Gf 그룹은 AUC0-48hr 평균이 1308.39ng·h/㎖, Cmax 평균이 409.23ng/㎖, Tmax 평균이 2hr, MRT 평균이 2.17hr로 나타났다.
Gg 그룹은 AUC0-48hr 평균이 947.86ng·h/㎖, Cmax 평균이 320.41ng/㎖, Tmax 평균이 1.2hr, MRT 평균이 2.15hr로 나타났다.
생리식염수 (0.9% 염화나트륨) 혼합 투여군과 Voferon-L60 혼합 투여군의 약동학적 변화를 비교하기 위해 Ge 및 Gf를 비교한 결과, AUC0-48hr 평균은 동일하고 Tmax, MRT이 Voferon-L60 혼합 투여군에서 증가하였고, Cmax는 생리식염수 혼합 투여군이 증가하는 것으로 판단된다. 이와 같은 결과는 생체 이용율은 동일하지만 Voferon-L60 혼합의 경우 약물방출 지연에 따른 결과로 판단된다.
Voferon-L60의 희석비율에 따른 로피바카인 농도 변화에 의한 약동학적 비교하기 위해 Gf 및 Gg를 비교한 결과, 농도변화에 따른 AUC0-48hr, Cmax, Tmax의 감소가 관찰되었고, MRT는 변화가 없었다. 이와 같은 결과는 생체 이용율은 동일하지만 Voferon-L60 혼합의 경우 약물방출 지연에 따른 결과이다.
　혼합 투여군의 로피바카인 농도 약동학적 변화를 비교를 위해 Ge 및 Gf와 Gg를 비교한 결과, AUC0-48hr, Tmax, Cmax의 감소가 관찰되었고, MRT은 변화가 없었다. 이와 같은 결과는 로피바카인의 농도 감소에 따른 AUC0-48hr, Tmax, Cmax의 감소로 판단되며 Voferon-L60의 농도증가에 따른 영향으로 약물방출이 지연되어 평균체류시간에는 영향이 없는 것으로 판단된다. 따라서 Voferon-L60의 농도가 증가할수록 약물방출이 지연될 것으로 판단된다.
　이상의 결과를 바탕으로 외과용품(Voferon-L60)에 사용되는 주입액은 로피바카인의 약물방출을 지연하는 것으로 판단되며 Voferon-L60 농도 증가에 따라 약물방출이 지연되는 것으로 판단된다. 또한, 대조군 (Ge)과 비교하여 시험군인 Gf 및 Gg군에서 혈액 내 낮은 Cmax 값은 Voferon-L60의 농도증가에 따른 영향으로 약물방출이 지연되어, 로피바카인을 단독으로 사용하는 경우보다 안전할 것으로 판단된다.

Claims (21)

  1. 상이한 팽윤도를 갖는 2종의 가교 히알루론산 겔을 포함하는 약물 전달 조성물로서,
    상기 상이한 팽윤도를 갖는 히알루론산 겔은 팽윤도 차이가 100% 내지 500% 범위를 가지며, 저팽윤도를 갖는 제1 가교 히알루론산 겔과 고팽윤도를 갖는 제2 가교 히알루론산 겔을 포함하며,
    상기 가교 히알루론산 겔은 0.1 내지 5몰%의 가교도를 가지며,
    상기 약물 전달 조성물은, 고형분 함량 2중량%의 약물 전달 조성물 시료를 0.02Hz에서 측정한 복합점도가 500,000 내지 1,500,000cp인 것이고, 탄성계수가 150 내지 250pa (1Hz)인, 약물 전달 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 약물은 국소마취제이며, 상기 약물 전달 조성물은 약물의 누적 방출량이, 24시간에 55~75 중량%, 48시간에 70~90 중량% 및 72시간에 90 중량% 이상의 방출 패턴을 갖는 것이고, 상기 48시간 동안 약물의 누적 방출량은 상기 24시간 동안 약물의 누적 방출량보다 5 중량% 이상 높은 방출 패턴을 갖는 것인, 약물 전달 조성물.
  3. 제1항에 있어서, 상기 약물 전달 조성물은, 팽윤도 100 내지 250%를 갖는 조성물.
  4. 제1항에 있어서, 상기 제1 가교 히알루론산 겔은 팽윤도 50 내지 175%를 가지며, 제2 가교 히알루론산 겔은 팽윤도 150 내지 675%를 갖는 포함하는 것인 조성물.
  5. 제1항에 있어서, 상기 제1 가교 히알루론산 겔과 제2 가교 히알루론산 겔은 혼합 중량비는 3:1 내지 1:3인 것인 조성물.
  6. 제1항에 있어서, 상기 상이한 팽윤도를 갖는 가교 히알루론산 겔은, 분자량 1,000 KDa 내지 2,000 KDa 범위의 히알루론산과 가교제 0.3 내지 1.3 몰%를 이용하여 가교반응으로 얻어진 것인 조성물.
  7. 제6항에 있어서, 상기 제1 가교 히알루론산 겔은 가교반응의 용량이 100 내지 800 mL이며 상기 제2 가교 히알루론산 겔은 가교반응의 용량이 3 내지 50mL인 것인 조성물.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 따른 상이한 팽윤도를 갖는 2종의 가교 히알루론산 겔을 포함하는 약물 전달 조성물과 약물을 포함하며, 상기 약물은 국소마취제인, 약학적 조성물.
  9. 제8항에 있어서, 상기 약물은 로피바카인, 부피바카인, 클로르프로카인, 리도카인, 메피바카인, 프로카인, 테트라카인, 레보부피바카인, 및 아티카인으로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상의 국소마취제인 약학적 조성물.
  10. 제8항에 있어서, 상기 가교 히알루론산과 약물의 합계 고형분 함량 100 중량%를 기준으로, 가교 히알루론산의 고형분 함량은 40 내지 90 중량%이고 약물의 함량은 10 내지 60 중량%인, 약학적 조성물.
  11. 알칼리 수용액 하에서 분자량 1,000 KDa 내지 2,000 KDa 범위의 히알루론산 또는 이의 염과, 가교제를 혼합하여, 적어도 2 이상의 상이한 용량으로 가교반응을 수행하여 가교 반응물을 제조하는 단계 및
    상기 얻어진 가교 반응물을 정제 및 분쇄하여, 상이한 팽윤도를 갖는 적어도 2종 이상의 가교 히알루론산 겔을 얻는 단계를 포함하며,
    상기 정제 및 분쇄를 상이한 용량의 가교 반응으로 얻어진 각 가교 반응물에 대해 별도로 수행하여 상이한 팽윤도를 갖는 적어도 2종 이상의 가교 히알루론산 겔을 얻고, 상기 상이한 팽윤도를 갖는 적어도 2종 이상의 가교 히알루론산 겔을 혼합하는 단계를 포함하는, 상이한 팽윤도를 갖는 적어도 2종의 가교 히알루론산 겔을 포함하는 약물 전달 조성물의 제조방법으로서,
    상기 가교 히알루론산 겔은 0.1 내지 5몰%의 가교도를 가지며,
    상기 상이한 팽윤도를 갖는 히알루론산 겔은 팽윤도 차이가 100% 내지 500% 범위를 가지며, 저팽윤도를 갖는 제1 가교 히알루론산 겔과 고팽윤도를 갖는 제2 가교 히알루론산 겔을 포함하는 것이며,
    상기 약물 전달 조성물은, 고형분 함량 2중량%의 약물 전달 조성물 시료를 0.02Hz에서 측정한 복합점도가 500,000 내지 1,500,000cp인 것이고, 탄성계수가 150 내지 250pa (1Hz)이며,
    상이한 팽윤도를 갖는 적어도 2종의 가교 히알루론산 겔을 포함하는 약물 전달 조성물의 제조방법.
  12. 제11항에 있어서, 상기 제1 가교 히알루론산 겔과 제2 가교 히알루론산 겔의 혼합 중량비는 3:1 내지 1:3인 것인 제조방법.
  13. 제11항에 있어서, 상기 약물 전달 조성물은, 팽윤도 100 내지 250%를 갖는 것인 제조방법.
  14. 제11항에 있어서, 상기 약물 전달 조성물은, 약물의 누적 방출량이, 24시간에 55~75 중량%, 48시간에 70~90 중량% 및 72시간에 90 중량% 이상의 방출 패턴을 갖는 것이고, 상기 48시간 동안 약물의 누적 방출량은 상기 24시간 동안 약물의 누적 방출량보다 5 중량% 이상 높은 방출 패턴을 갖도록 하며, 상기 약물은 국소마취제인, 제조방법.
  15. 제11항에 있어서, 상기 제1 가교 히알루론산 겔은 가교반응 용량이 100 내지 800 mL이며, 상기 제2 가교 히알루론산 겔은 3 내지 50mL의 용량으로 가교반응을 수행한 것인 제조방법.
  16. 제11항에 있어서, 상기 제1 가교 히알루론산 겔은 팽윤도 50 내지 175%을 가지며, 제2 가교 히알루론산 겔은 팽윤도 150 내지 675%를 갖는 것인 제조방법.
  17. 제11항에 있어서, 상기 제1 가교 히알루론산 겔은 상기 가교반응물을 체로 1차 분쇄, 정제 및 체로 2차 분쇄하는 공정으로 제조되는 것인 제조방법.
  18. 제11항에 있어서, 상기 제2 가교 히알루론산 겔은 상기 가교반응물을 정제하고 및 체로 분쇄하는 공정으로 제조되는 것인 제조방법.
  19. 제11항에 있어서, 상기 가교 반응물을 제조하는 단계는, 분자량 1,000 KDa 내지 2,000 KDa 범위의 히알루론산과 가교제 0.3 내지 1.3 몰%을 가교반응으로 수행하는 것인 조성물.
  20. 제11항에 있어서, 상기 제1 가교 히알루론산 겔은 가교반응의 용량이 100 내지 800 mL이며 상기 제2 가교 히알루론산 겔은 가교반응의 용량이 3 내지 50mL인 것인 조성물.
  21. 제11항에 있어서, 상기 가교제는, 부탄디올디글리시딜에테르(1,4-butandiol diglycidyl ether: BDDE), 에틸렌글리콜디글리시딜에테르(ethylene glycol diglycidyl ether: EGDGE), 헥산디올디글리시딜에테르(1,6-hexanediol diglycidyl ether), 프로필렌글리콜디글리시딜에테르(propylene glycol diglycidyl ether), 폴리프로필렌글리콜디글리시딜에테르(polypropylene glycol diglycidyl ether), 폴리테트라메틸렌글리콜디글리시딜에테르(polytetramethylene glycol diglycidyl ether), 네오펜틸글리콜디글리시딜에테르 (neopentyl glycol diglycidyl ether), 폴리글리세롤폴리글리시딜에테르(polyglycerol polyglycidyl ether), 디글리세롤폴리글리시딜에테르(diglycerol polyglycidyl ether), 글리세롤폴리글리시딜에테르(glycerol polyglycidyl ether), 트리메틸프로판폴리글리시딜에테르(tri-methylpropane polyglycidyl ether), 비스에폭시프로폭시에틸렌(1,2-(bis(2,3-epoxypropoxy)ethylene), 펜타에리쓰리톨폴리글리시딜에테르(pentaerythritol polyglycidyl ether) 및 소르비톨폴리글리시딜에테르(sorbitol polyglycidyl ether)로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상인 제조방법.
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