CN102731801B - 外科整形用交联透明质酸钠凝胶及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种外科整形用交联透明质酸钠凝胶及其制备方法，制备时将透明质酸钠干粉分散在由10wt%～20wt%的氢氧化钠水溶液与丙酮组成的混合溶液，然后向所得的透明质酸钠碱性混悬液中加入交联剂1,4-丁二醇二缩水甘油醚，混匀后在搅拌状态下将反应物料于35℃～50℃保温5～8小时；过滤洗涤后真空干燥得交联透明质酸钠粉末，粉末过筛后，将过筛的粉末收集，依次用去离子水和PBS纯化，然后依次用两种规格的筛网筛分而得到3种规格的凝胶，分别收集3份凝胶沉淀，消毒后灌装于事先灭菌的一次性注射器中。
Description
技术领域
本发明涉及一种可用于人体的外科整形用交联透明质酸钠凝胶及其制备方法。
背景技术
透明质酸（Hyaluronic acid ，以下简称HA）为一种多糖，其结构由β-1,3-葡萄糖乙酰胺（β-1,3-N-acetylglucosamine）和β-1,4-葡萄糖酸（β-1,4-glucuronic acid）以β-1-4键结形成分子量约为400D的双糖重复单位，此双糖重复单位再以β-1-3 键结重复连结，形成的直链高分子聚合物。商品透明质酸钠（sodium hyaluronate，以下简称SH）为HA的钠盐，其商业来源可由菌种如链球菌属的发酵以及动物组织如鸡冠中萃取得到。
直链的透明质酸在生物体内易因酶如透明质酸水解酶和自由基的作用而发生降解，因此在生物体内的滞留时间短；直链的透明质酸由于缺乏机械强度，也限制其应用。为了提高透明质酸在体内的滞留时间，常对透明质酸进行交联，制备成可溶于水的交联透明质酸溶液或不溶于水的交联透明质酸凝胶（hydrogel）或介于两者之间的物质，也可视需要混合两者使用。
交联透明质酸凝胶的生物相容性优异，具有在体内可以随时间的推移而分解并最终消除的特性。交联透明质酸凝胶通常是将透明质酸与交联剂在碱性水溶液中搅拌混合，通过交联剂使透明质酸高分子链间化学键合来制备。但是当通过交联剂进行透明质酸的交联反应以制备交联透明质酸时，常有大量交联剂残留于产物中，将上述交联透明质酸凝胶施予生物体内时，凝胶在生物体内分解后，残留的交联剂成分对于生物体来说被识别为异物，引发炎症反应等不良影响；致使制得的交联透明质酸的细胞毒性较大，使用后对生物体产生副作用。
为了降低交联剂的残留，如果减少交联剂的添加量，则所制得的交联透明质酸凝胶的粘弹性降低，不柔软；例如作为皱纹拉伸注入剂使用时，无法在注入部位确保一定的体积。另外，使用交联透明质酸凝胶作为药物缓释制剂时，为了使药物的适当效果维持一定期间，必须在生物体内长时间滞留，因此要求以更高浓度的高粘弹性的交联凝胶，若干减少交联剂的使用量，则难以获得所述高粘弹性的交联凝胶。
目前最常用的去除或降低残留交联剂的方法包括以透析法或以水或缓冲溶液清洗，但上述纯化方法效果有限，同时对于一端已是键结态而另一端仍为自由态官能团的交联剂而言，无法用透析或清洗的方法去除，并且这种含有自由态官能团的交联剂具有反应性。
中国专利文献CN 101056891 A（申请号 200580038760.0）公开了一种交联透明知识凝胶的制备方法，为了降低残留交联剂的残留，提高透明质酸的浓度，在酸性或碱性条件下将含有透明质酸10W/V%以上、交联剂和水的混合物搅拌混合。但是这种在交联剂用量不变的情况下提高透明质酸浓度的方法，与上述减少交联剂的添加量应属于相同性质的手段，会带来制得的交联透明质酸凝胶的粘弹性降低、不柔软的问题。
中国专利文献CN 101724164 A（申请号 200810172328.6）公开了一种交联透明质酸的制造方法，是在约10℃至约30℃的低反应温度下使包含交联剂与透明质酸、其金属盐类、其衍生物或其混合物的溶液在碱性环境进行交联反应超过约48小时。该技术方案的特征是使用长时间的低温反应温度条件进行交联反应，较佳反应温度为约15℃至约30℃，最佳为约20℃至约30℃，在低反应温度下进行的交联反应，所形成的交联透明质酸不会因碱的水解作用而快速劣化，在使交联剂消耗至合理的含量后即终止反应。反应时间超过48小时，较佳为3至28天，最佳为3至7天。但是这种技术方案的反应时间太长，生产效率大大降低。
中国专利文献CN 101502677 A（申请号 200810009194.6）公开了一种注射用交联透明质酸钠凝胶及其制备方法，先将缩水甘油醚和透明质酸钠在0.5%～2%的NaOH溶液中混合，于40℃～80℃保温2～8小时，得到水不溶性凝胶；将得到的凝胶浸泡于去离子水水中，纯化6～12小时；然后收集含水凝胶，使其通过筛孔内径为100～400μm，得到含水凝胶颗粒；提高含水凝胶颗粒中去离子水的离子强度，40℃～80℃保温2～8小时，含水凝胶颗粒收缩沉降，收集后灭菌包装得成品。该方案中透明质酸钠于碱的水溶液中进行交联反应，但是在反应过程中，透明质酸钠会因碱的水解作用而劣化。
综上，现有技术的交联反应均是在碱性水溶液中进行，存在水解及纯化不利的情况。另外，现有技术虽提出种种降低交联剂残留的技术方案，但是并没有具体提供检测交联剂残留的方法，因此制备的交联透明质酸或其钠盐的凝胶中交联剂的残留量也不得而知。而且现有技术均未公开所制备的凝胶的流变学指标，而交联透明质酸钠凝胶的流变学制备对于其使用场所即人体意义重大。
发明内容
本发明的目的是提供一种外科整形用交联透明质酸钠凝胶及其制备方法。
实现本发明目的的技术方案是一种外科整形用交联透明质酸钠凝胶的制备方法，包括以下步骤：
①将透明质酸钠干粉分散在由10 wt%～20 wt%的氢氧化钠水溶液和丙酮组成的混合溶液后获得透明质酸钠碱性混悬液，然后向透明质酸钠碱性混悬液中加入交联剂1,4-丁二醇二缩水甘油醚BDDE，混匀后获得反应物料，从而开始发生生成交联透明质酸钠的反应；搅拌状态下将反应物料于35℃～50℃保温5～8小时后反应结束，用浓盐酸调节反应后固液混合物料的pH值至7；其中所述反应物料中透明质酸钠的浓度为2 wt%～5wt%，交联剂与透明质酸钠的质量比为（1∶1.3）～（1∶1.8）。
②将步骤①反应后的pH=7的固液混合物料过滤以除去液体，剩余的物料用丙酮洗涤至GC-MS检测BDDE含量低于2ppm，剩余的物料包括白色粉末及透明的凝胶，然后将洗涤后的物料真空干燥获得水不溶性白色干粉即交联透明质酸钠粉末。
③将步骤②真空干燥获得的交联透明质酸钠粉末过筛分离，收集过筛的粉末。
④向步骤③收集的过筛的粉末中加入去离子水，使得交联透明质酸钠粉末充分溶胀，在室温15℃～35℃纯化6～10小时后，收集凝胶颗粒得到交联透明质酸钠凝胶。
⑤向步骤④收集的凝胶中分别加入等渗PBS缓冲液，于室温15℃～35℃纯化6～10小时后，过滤除去PBS，收集凝胶；将凝胶依次用第一种规格和第二种规格的筛网分筛而获得3份不同平均粒径的凝胶，将3份凝胶分别消毒后灌装于事先灭菌的一次性注射器中。
上述步骤①中氢氧化钠水溶液与丙酮的体积比为（2∶8）～（4∶6）。
上述步骤①的反应液中透明质酸钠的浓度为3wt%～4wt%。
上述步骤③中，步骤②真空干燥获得的交联透明质酸钠粉末经第三规格的筛网过筛分离，而得到过第三种规格筛网的粉末和未过第三种规格筛网的粉末，收集过第三种规格筛网的粉末；所述的第三种规格筛网为30～50目的筛网。
上述步骤④中向步骤③经过筛分离的交联透明质酸钠粉末中加入去离子水时，去离子水加入后干粉吸水膨胀形成凝胶，去离子水的加入量保证能完全没过干粉吸水后形成的凝胶；并且纯化过程中隔55min～80min更换去离子水。
上述步骤⑤中的第一种规格的筛网为200目的筛网，步骤⑤中的第二种规格的筛网为100目的筛网；
经等渗PBS纯化的凝胶先经第一种规格的筛网筛分，收集筛网下方的凝胶得到凝胶颗粒的平均粒径为50μm～150μm的凝胶；将第一种规格的筛网上方的凝胶再经第二种规格的筛网筛分，收集筛网下方的凝胶得到凝胶颗粒的平均粒径为150μm～300μm的凝胶，收集筛网上方的凝胶得到凝胶颗粒的平均粒径为300μm～450μm的凝胶。
上述步骤⑤中凝胶分别于115℃～125℃消毒15～25min。
一种外科整形用交联透明质酸钠凝胶，该凝胶由以下步骤制得：
①将透明质酸钠干粉分散在由10 wt%～20 wt%的氢氧化钠水溶液和丙酮组成的混合溶液后获得透明质酸钠碱性混悬液，然后向透明质酸钠碱性混悬液中加入交联剂1,4-丁二醇二缩水甘油醚BDDE，混匀后获得反应物料，从而开始发生生成交联透明质酸钠的反应；搅拌状态下将反应物料于35℃～50℃保温5～8小时后反应结束，用浓盐酸调节反应后固液混合物料的pH=7；其中所述反应物料中透明质酸钠的浓度为2 wt%～5wt%，交联剂与透明质酸钠的质量比为（1∶1.3）～（1∶1.8）。
②将步骤①反应后的pH=7的固液混合物料过滤以除去液体，剩余的物料用丙酮洗涤至GC-MS检测BDDE含量低于2ppm，剩余的物料包括白色粉末及透明的凝胶，然后将洗涤后的物料真空干燥获得水不溶性白色干粉即交联透明质酸钠粉末。
③将步骤②真空干燥获得的交联透明质酸钠粉末过30～50目筛分离，收集过筛的粉末。
④向步骤③收集的过筛的粉末中加入去离子水，使得交联透明质酸钠粉末充分溶胀，在室温15℃～35℃纯化6～10小时后，收集凝胶颗粒得到交联透明质酸钠凝胶。
⑤向步骤④收集的凝胶中分别加入等渗PBS，于室温15℃～35℃纯化6～10小时后，过滤除去PBS，收集凝胶；将凝胶依次用第一种规格和第二种规格两种规格的筛网分筛而获得3份不同平均粒径的凝胶，将3份凝胶分别消毒后灌装于事先灭菌的一次性注射器中。
上述步骤⑤中的第一种规格的筛网为200目的筛网，步骤⑤中的第二种规格的筛网为100目的筛网；
经等渗PBS纯化的凝胶先经第一种规格的筛网筛分，收集筛网下方的凝胶得到凝胶颗粒的平均粒径为50μm～150μm的凝胶；将第一种规格的筛网上方的凝胶再经第二种规格的筛网筛分，收集筛网下方的凝胶得到凝胶颗粒的平均粒径为150μm～300μm的凝胶，收集筛网上方的凝胶得到凝胶颗粒的平均粒径为300μm～450μm的凝胶；凝胶中交联剂BDDE的含量低于2ppm。
上述步骤①中氢氧化钠水溶液与丙酮的体积比为（2∶8）～（4∶6）；步骤①的反应液中透明质酸钠的浓度为3wt%～4wt%。
本发明具有积极的效果：
（1）本发明制备的交联透明质酸凝胶为可用于人体的医用级，无热原、无菌、无残留交联剂，并且细胞毒性低。
（2）经MALVERN粒度仪检测，本发明制备的三份交联透明质酸钠凝胶的颗粒粒径较均匀；经GC-MS检测，与瑞典Q-Med AB 公司的瑞蓝TM2和瑞蓝TM3相比，本发明制备的凝胶中交联剂的含量低于2ppm，细胞毒性更低。
（3）本发明的制备方法是将透明质酸钠和交联剂在丙酮/水的碱溶液中直接分散混合进行交联反应，减轻了现有技术中制得的交联透明质酸钠在碱的水溶液中水解的问题。另外由于交联剂BDDE能够溶解在丙酮中，而丙酮与水互溶，因此BDDE均匀分散在反应体系中，与透明质酸钠充分接触，有效提高了交联反应速率和转化率。
（4）本发明制备方法的交联反应结束后的物料用有机溶剂洗涤除去交联剂后真空干燥形成水不溶性干粉，由于反应结束后交联透明质酸钠主要是以固态粉末状分散在丙酮/水混合溶剂中，只有少量吸水溶胀，因此用丙酮洗涤时可以尽可能得除去残留交联剂。
（5）本发明的制备方法是先将真空干燥得到的水不溶性干粉过40目筛分离，收集过筛的粉末；然后向粉末中加入去离子水，交联透明质酸钠溶胀后获得凝胶颗粒，制得的交联透明质酸钠凝胶中凝胶颗粒粒径比较均匀；与现有技术的直接在水溶液中形成块状凝胶，然后打散得到凝胶颗粒的方法相比，本发明比较简便，制得的凝胶颗粒不易团聚结块。
（6）本发明的制备方法通过改变消毒时间或者改变凝胶中透明质酸钠的浓度，可以获得具有不同耐酶性的凝胶；改变凝胶中透明质酸钠的浓度，可以获得在体内不同停留时间的凝胶。
（7）本发明的制备方法将经等渗PBS纯化的凝胶依次用两种规格的筛网分筛而获得3份不同平均粒径的凝胶，从而很简便地获得不同型号的除皱美容产品。
（8）本发明制得的交联透明质酸钠凝胶经英国Malvern CVO100动态剪切流变仪DSR检测，在25℃，剪切速率为2s-1时，交联透明质酸钠凝胶的动力粘度大于45000mPa·s；在25℃，振荡频率为0.01Hz，交联透明质酸钠凝胶的复数粘度值大于1000Pa·s；在25℃，振荡频率为10Hz，交联透明质酸钠凝胶的复数粘度值大于3.5Pa·s；上述数据显示本发明制备的凝胶达到外科整形用交联透明质酸钠凝胶的流变学指标。
附图说明
图1为透明质酸钠的结构式；
图2为本发明制备的交联透明质酸钠的网状结构的化学键连接示意图，其中A为-CH2-CH（OH）-CH2-O-CH2-CH2--CH2-CH2- O-CH2-CH（OH）-CH2-；
图3为实施例1制备的凝胶颗粒的平均粒径为50μm～150μm的交联透明质酸钠凝胶的粒度分布图；
图4为实施例1制备的凝胶颗粒的平均粒径为50μm～150μm的交联透明质酸钠凝胶的粘弹性曲线图；
图5为实施例1制备的凝胶颗粒的平均粒径为150μm～300μm的交联透明质酸钠凝胶的粒度分布图；
图6为实施例1制备的凝胶颗粒的平均粒径为150μm～300μm的交联透明质酸钠凝胶的粘弹性曲线图；
图7为实施例1制备的凝胶颗粒的平均粒径为150μm～300μm的交联透明质酸钠凝胶中残留BDDE的GC-MS检测的图谱；
图8为实施例1制备的凝胶颗粒的平均粒径为300μm～450μm的交联透明质酸钠凝胶的粒度分布图；
图9为实施例1制备的凝胶颗粒的平均粒径为300μm～450μm的交联透明质酸钠凝胶的粘弹性曲线图。
具体实施方式
（实施例1）
本实施例所用试剂均为分析纯。
本实施例的制备交联透明质酸钠凝胶的方法包括以下步骤：
①向一定重量的白色透明质酸钠（结构式如图1所示）干粉中加入500mL的由15wt%的氢氧化钠水溶液和丙酮组成的混合溶液，或者向500mL的由15wt%的氢氧化钠水溶液和丙酮组成的混合溶液中加入一定重量的白色透明质酸钠干粉；所述透明质酸钠的平均分子量为50万～160万道尔顿（本实施例中为150万道尔顿）；搅拌使透明质酸钠均匀分散后获得透明质酸钠碱性混悬液，即透明质酸钠部分溶解于氢氧化钠水溶液和丙酮组成的混合溶液中，还有部分以固态形式存在；然后向透明质酸钠碱性混悬液中加入11.1mL交联剂1,4-丁二醇二缩水甘油醚（BDDE），混匀后获得反应物料，从而开始发生生成交联透明质酸钠的反应。上述白色的透明质酸钠干粉的重量的具体数值控制在所述反应物料中，透明质酸钠的浓度为2wt%～5wt%，本实施例中，白色的透明质酸钠干粉的重量为20g。
在搅拌状态下将反应液于40℃保温5小时后反应结束，加入37wt%的浓盐酸调节反应后固液混合物料的pH值至7，交联透明质酸钠的网状结构的化学键连接示意见图2。上述氢氧化钠水溶液和丙酮的混合溶液中氢氧化钠水溶液与丙酮的体积比为（2∶8）～（4∶6），本实施例中为3∶7。所述透明质酸钠（CAS号：9067-32-7）来自鸡冠或者由细菌发酵而得。
②将步骤①反应后pH=7的固液混合物料过滤以除去液体，剩余的物料中包括白色交联透明质酸钠粉末及透明的交联透明质酸钠凝胶，剩余物料用丙酮洗涤至气相色谱-质谱联用仪（GC-MS）检测BDDE含量低于2ppm；然后将洗涤后的物料真空干燥获得水不溶性白色干粉即交联透明质酸钠粉末。所用气相色谱-质谱联用仪为日本岛津公司的QP-2010型号气相色谱-质谱联用仪。
③将步骤②真空干燥获得的交联透明质酸钠粉末过40目筛分离，收集过筛的粉末，未过筛的粉末由于其中可能包含具有粘性的杂质，弃之不用。
④向步骤③收集的过40目筛的交联透明质酸钠粉末中加入足量去离子水，交联透明质酸钠于室温25℃溶胀纯化8小时后，收集凝胶颗粒得到交联透明质酸钠凝胶，纯化过程中隔1小时更换去离子水。
加入去离子水后干粉吸水膨胀形成凝胶，去离子水的加入量应保证每次能完全没过干粉吸水溶胀后形成的凝胶。
⑤向步骤④收集的凝胶中加入3倍凝胶体积的等渗PBS缓冲液（每1000mL含有NaH2PO4·2H2O 90mg，Na2HPO4·12H2O 1.12g，NaCl 17g，其余为水），于室温25℃纯化8小时后，除去PBS，收集凝胶；将经等渗PBS缓冲液纯化的凝胶先经200目的筛网筛分，收集筛网下方的凝胶得到凝胶颗粒的平均粒径为50μm～150μm的1号凝胶；将200目筛网上方的凝胶再经100目的筛网筛分，收集筛网下方的凝胶得到凝胶颗粒的平均粒径为150μm～300μm的2号凝胶，收集筛网上方的凝胶得到凝胶颗粒的平均粒径为300μm～450μm的3号凝胶。
将上述收集的3份凝胶分别于120℃高温消毒15分钟后，分别灌装于事先灭菌的一次性注射器中，从而获得3份不同规格的用于不同注射层次和应用范围的外科整形用交联透明质酸钠凝胶。
上述凝胶颗粒的平均粒径为50μm～150μm的1号交联透明质酸钠凝胶的注射层次为真皮层上层，用于祛除较轻微皱纹和纹路。凝胶颗粒的平均粒径为150μm～300μm的2号交联透明质酸钠凝胶的注射层次为真皮层中层，用于祛除中层皱纹或丰唇。凝胶颗粒的平均粒径为300μm～450μm的3号交联透明质酸钠凝胶的注射层次为真皮层深层和皮下组织浅层，用于祛除深层皱纹及丰唇。
为了了解制备的交联透明质酸钠凝胶的性质，按照以下方法对凝胶进行检测：
1、凝胶中透明质酸钠（SH）含量的检测。
取0.5g步骤⑤消毒后的凝胶颗粒的平均粒径为50μm～150μm的交联透明质酸钠凝胶，将其加入10mL0.5mol/L的硫酸溶液中，沸水浴水解15分钟后，向水解后的溶液中加水至体积为100mL。用咔唑法测定糖醛酸含量，然后乘系数2.07得2.05wt%，即为本实施例制备的凝胶中透明质酸钠的含量。
按照同样的方法检测凝胶颗粒的平均粒径为150μm～300μm和300μm～450μm的交联透明质酸钠凝胶，凝胶中透明质酸钠的含量均为2.05wt%。
2、收率检测。步骤⑤收集的3份凝胶中的SH的质量之和/反应前SH的质量，本实施例的收率为78%。
3、凝胶中凝胶颗粒的粒度检测。粒度检测使用英国Malvern公司的Mastersizer 2000型粒度测定仪。
将步骤⑤消毒后的1号交联透明质酸钠凝胶0.1g送入粒度测定仪检测，测得的粒度分布图见图3，其中与图3对应的粒度分布表中粒度1.262μm至399.052μm之间的凝胶颗粒的分布见如下表1。
表1
由图3及表1可见，1号交联透明质酸钠凝胶的凝胶颗粒的粒径主要分布在50μm～150μm范围内，1号交联透明质酸钠凝胶的凝胶颗粒的平均粒径为127.764μm。
将步骤⑤消毒后的2号交联透明质酸钠凝胶0.1g送入粒度测定仪检测，测得的粒度分布图见图5，其中与图5对应的粒度分布表中粒度8.934μm至3000μm之间的凝胶颗粒的分布见如下表2。
表2
由图5及表2可见，2号交联透明质酸钠凝胶的凝胶颗粒的粒径主要分布在140μm～400μm，凝胶颗粒的平均粒径为266.935μm，制得的凝胶颗粒比较均匀。
将步骤⑤消毒后的3号交联透明质酸钠凝胶0.1g送入粒度测定仪检测，测得的粒度分布图见图8，其中与图8对应的粒度分布表中粒度8.394μm至3000μm之间的凝胶颗粒的分布见如下表3。
表3
由图8及表3可见，3号交联透明质酸钠凝胶的颗粒粒度分布在250μm～560μm的占到总含量的70%，凝胶颗粒的平均粒径为432.235μm，制得的凝胶颗粒比较均匀。
4、体外细胞毒性检测。根据GB/T16886国家标准，交联透明质酸钠作为国家三类医疗器械进行体外细胞毒性测试。
先将待测交联透明质酸钠与RPMI1640培养液按0.2g/mL混合，置于37℃，5%二氧化碳孵箱中浸提72小时，用0.22μm微孔滤膜过滤除菌，得到浸提液。
然后将1*105个/mL的L929细胞悬浮液接种于96孔细胞培养板，置于37℃二氧化碳培养箱中培养24小时；待细胞贴壁生长后，去除上清液，分成空白对照组和实验组两组，对照组加入RPMI1640培养液，实验组用含50%上述浸提液的RPMI1640培养液进行交换。分别置于37℃二氧化碳培养箱中继续培养，于2天后取出，培养板每孔加入MTT溶液（5mg/mL）20μL，于37℃继续培养4小时，终止培养。小心吸弃孔内培养上清液，每孔加入200μL DMSO，振荡10分钟混匀后，用酶联免疫检测仪在630nm下分别测定其吸光度值。
根据下面的公式计算细胞相对增值率（RCR），RCR（%）=（实验组平均吸光度值/空白对照组平均吸光度值）*100%。
细胞相对增值率与细胞毒性分级关系如下：RCR不小于100%，细胞毒性分级为0级；RCR为75-99%，细胞毒性分级为1级；RCR为50-74%, 细胞毒性分级为2级；RCR为25-49%，细胞毒性分级为3级；RCR为1-24%，细胞毒性分级为4级；RCR为0%, 细胞毒性分级为5级。
本实施例步骤⑤消毒后的1号交联透明质酸钠凝胶按照上述方法，RCR为83.69，细胞毒性低。
本实施例步骤⑤消毒后的2号交联透明质酸钠凝胶按照上述方法，RCR为83.69，细胞毒性低。
本实施例步骤⑤消毒后的3号交联透明质酸钠凝胶按照上述方法，RCR为83.69，细胞毒性低。
5、耐酶性检测。取0.5g待测交联透明质酸钠凝胶，向其加入1.25mL浓度为10U/mL的透明质酸酶溶液后加pH为7.2的PBS至体积为2.5mL，于37℃酶解24小时；用离心机以10000rpm离心40分钟，取上清液，按照上述离心方法再离心分离两次，每次都取上清液，合并上清液。采用改良咔陛显色法（参考文献：Bitter .T，Muir H.M，(1962) A modified uronic acid carbarbazole reation .Anal.Biochem.4,330-333.）测定糖醛酸含量，乘以2.07后折算为透明质酸钠含量，作为a值，以凝胶中透明质酸钠含量c即2.05%为b值，计算a/b。
本实施例步骤⑤消毒后的1号交联透明质酸钠凝胶按照上述方法，a/b=0.23。
本实施例步骤⑤消毒后的2号交联透明质酸钠凝胶按照上述方法，a/b=0.21。
本实施例步骤⑤消毒后的3号交联透明质酸钠凝胶按照上述方法，a/b=0.15。
6、凝胶中重金属含量的检测。参考中国药典2005版二部附录的方法，取凝胶1g，在60℃烘干，炽灼至炭化后，加0.5mL硫酸加热蒸干，再加0.5mL硝酸加热蒸干，在500℃～600℃加热使灰化；然后加2mL盐酸，水浴蒸干后，加15mL蒸馏水，用4%的氨水调为中性，加2mL pH为3.5的醋酸盐缓冲液，溶解后稀释成25mL；同时对照品取上述所用试剂蒸干后，加等量醋酸缓冲液和蒸馏水，加适量标准铅试液，稀释成25mL，此时铅含量为10ppm；分别加入硫代乙酰胺试液显色后进行比较检查。
本实施例步骤⑤消毒后的1号交联透明质酸钠凝胶按照上述方法，凝胶的重金属含量小于10ppm。
本实施例步骤⑤消毒后的2号交联透明质酸钠凝胶按照上述方法，凝胶的重金属含量小于10ppm。
本实施例步骤⑤消毒后的3号交联透明质酸钠凝胶按照上述方法，凝胶的重金属含量小于10ppm。
为了了解凝胶中各重金属的确切含量，进一步用电感耦合等离子光谱发生仪对2号凝胶进行检测，检测设备为日本岛津公司的ICP-7510，检测环境的温度20℃，湿度50%。检测结果如下：
7、凝胶流变学指标的检测。
待测消毒后的2号交联透明质酸钠凝胶的流变学指标的检测采用英国Malvern CVO100动态剪切流变仪DSR。
设定测量温度为25，在VISCOMETRY 模式下，选择速率控制，设定剪切速率为2.0001/s，延迟时间20s，积分时间5s，采点数15个，得到消毒后的2号交联透明质酸钠凝胶的粘度值，具体测量结果见下表4。
表4中第一行的英文名词对应的中文如下：Time—时间，Temperature—温度，Target Shear Rate—目标剪切速率，Shear Rate—剪切速率，Percentage Deviation—百分偏差，Shear Stress—剪切应力，Viscosity—粘度。
表4
由表4检测结果可知，在25℃，剪切速率为2s-1时，交联透明质酸钠凝胶的动力粘度为77500 mPa·s左右，远远大于45000mPa·s。
同样设定测量温度为25，在OSCILLATION模式下，选择频率扫描，扫描频率从0.01Hz到10Hz，消毒后的2号交联透明质酸钠凝胶的各项流变学指标的具体测量结果见下表5和表6，粘弹性曲线图见图6，图6中G’为弹性模量，G’’为粘性模量。
表5、表6中第一行的英文名词对应的中文如下：Time—时间，Temperature—温度，Frequency—频率，Phase Angle—相角，Complex Modulus—复数模量，Elastic Modulus—弹性模量，Viscous Modulus—粘性模量，Complex Viscosity—复数粘度，Shear Stress—剪切应力，Strain—应变。
由表5、表6和图6可知，振荡频率为0.01Hz时，交联透明质酸钠凝胶的复数粘度值为2205.6 Pa·s，大于1000Pa·s；振荡频率为10Hz时，交联透明质酸钠凝胶的复数粘度值为6.6307 Pa·s，大于3.5Pa·s。
表5
表6
检测消毒后的1号交联透明质酸钠凝胶的流变学指标，设定测量温度为25℃，在VISCOMETRY 模式下，选择速率控制，设定剪切速率为2.0001/s，延迟时间20s，积分时间5s；在25℃，剪切速率为2s-1时，交联透明质酸钠凝胶的动力粘度约为64000mPa·s左右，远远大于45000mPa·s。
同样设定测量温度为25，在OSCILLATION模式下，选择频率扫描，扫描频率从0.01Hz到10Hz，振荡频率为0.01Hz时，交联透明质酸钠凝胶的复数粘度值为2134.3Pa·s，大于1000Pa·s；振荡频率为10Hz时，交联透明质酸钠凝胶的复数粘度值为7.1196Pa·s，大于3.5Pa·s。
消毒后的1号交联透明质酸钠凝胶的粘弹性曲线图见图4，图4中G’为弹性模量，G’’为粘性模量。
检测消毒后的3号交联透明质酸钠凝胶的流变学指标，设定测量温度为25℃，在VISCOMETRY 模式下，选择速率控制，设定剪切速率为2.0001/s，延迟时间20s，积分时间5s；在25℃，剪切速率为2s-1时，交联透明质酸钠凝胶的动力粘度为81352mPa·s，远远大于45000mPa·s。
同样设定测量温度为25，在OSCILLATION模式下，选择频率扫描，扫描频率从0.01Hz到10Hz，振荡频率为0.01Hz时，交联透明质酸钠凝胶的复数粘度值为2511.7Pa·s，大于1000Pa·s；振荡频率为10Hz时，交联透明质酸钠凝胶的复数粘度值为8.0724Pa·s，大于3.5Pa·s。
消毒后的3号交联透明质酸钠凝胶的粘弹性曲线图见图9，图9中G’为弹性模量，G’’为粘性模量。
8、凝胶中交联剂BDDE残留量的检测。
凝胶中交联剂残留量的检测采用GC-MS检测，日本岛津公司的QP-2010型号气相色谱-质谱联用仪。
首先空白回收验证该方法的可行性，取10ppm的BDDE样品5mL，向其中加入BDDE至BDDE的浓度为15ppm，经GC-MS进行6次检测，待测样中BDDE的含量为14.9±0.1ppm，其检测精密度达到要求。
配置待测样，取待测交联透明质酸钠凝胶1g，加水1mL，再用分析纯二氯甲烷萃取2次，二氯甲烷每次用量10mL；合并萃取液，萃取液干燥后蒸除二氯甲烷直至得到0.2mL含BDDE的二氯甲烷溶液，然后经GC-MS检测。
本实施例步骤⑤消毒后的2号交联透明质酸钠凝胶按照上述方法，GC-MS检测的谱图见图7，测得凝胶中BDDE的含量为0.7239ppm。
本实施例步骤⑤消毒后的1号和3号交联透明质酸钠凝胶按照上述方法，测得凝胶中BDDE的含量为0.7239ppm。
（实施例2至实施例3）
实施例2和实施例3的制备交联透明质酸钠凝胶的方法其余与实施例1相同，不同之处在于：实施例2的步骤①中交联剂BDDE的加入量为13.3g，实施例3的步骤①中交联剂BDDE的加入量为15.5g。
将实施例1至实施例3制得的凝胶的收率、凝胶中SH的含量以及分别制得的2号交联透明质酸钠凝胶的细胞毒性以及耐酶性比较如下表7：
表7
由表7比较可见，调整交联剂BDDE的使用量，可以得到不同浓度、不同收率、不同细胞毒性及耐酶性的凝胶；收率随着BDDE的用量增大而提高，制得的凝胶中透明质酸钠的含量随着BDDE的用量增大逐渐提高，凝胶的细胞毒性随着BDDE的用量增大而增强，凝胶的耐酶性随着BDDE的用量增大而增强。
（实施例4至实施例6）
实施例4至实施例6的制备交联透明质酸钠凝胶的方法其余与实施例1相同，不同之处在于步骤①中混合溶液的体积、NaOH浓度以及步骤④的消毒时间，将上述参数列于表8，并比较实施例4至实施例6的制备的消毒后的2号交联透明质酸钠凝胶的耐酶性。
表8
由表8可见，透明质酸钠凝胶的耐酶性随着消毒时间的加长而下降，因此优选将凝胶120℃下消毒20min。
（实施例7）
本实施例的制备交联透明质酸钠凝胶的方法其余与实施例1相同，不同之处在于步骤⑤中，经等渗PBS纯化的凝胶经过两次筛分，分成1号、2号、3号凝胶后，分别再用等渗PBS稀释至15mg/mL后再灭菌灌装。
按照实施例1所述的检测耐酶性的方法，本实施例制备的消毒后的2号凝胶的耐酶性检测值为0.32。
（实施例8）
本实施例的制备交联透明质酸钠凝胶的方法其余与实施例1相同，不同之处在于步骤⑤中，经等渗PBS纯化的凝胶经过两次筛分，分成1号、2号、3号凝胶后，分别再用等渗PBS稀释至18mg/mL后再灭菌灌装。
按照实施例1所述的检测耐酶性的方法，本实施例制备的消毒后的2号凝胶的耐酶性检测值为0.28。
比较实施例1、实施例7和实施例8制备的凝胶的耐酶性，调整凝胶中交联透明质酸钠的浓度，耐酶性随着交联透明质酸钠浓度的下降而下降。
Claims (10)
1.一种外科整形用交联透明质酸钠凝胶的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
①将透明质酸钠干粉分散在由10 wt%～20 wt%的氢氧化钠水溶液和丙酮组成的混合溶液后获得透明质酸钠碱性混悬液，然后向透明质酸钠碱性混悬液中加入交联剂1,4-丁二醇二缩水甘油醚BDDE，混匀后获得反应物料，从而开始发生生成交联透明质酸钠的反应；搅拌状态下将反应物料于35℃～50℃保温5～8小时后反应结束，用浓盐酸调节反应后固液混合物料的pH值至7；其中所述反应物料中透明质酸钠的浓度为2 wt%～5wt%，交联剂与透明质酸钠的质量比为（1∶1.3）～（1∶1.8）；
②将步骤①反应后的pH=7的固液混合物料过滤以除去液体，剩余的物料用丙酮洗涤至GC-MS检测BDDE含量低于2ppm，剩余的物料包括白色粉末及透明的凝胶，然后将洗涤后的物料真空干燥获得水不溶性白色干粉即交联透明质酸钠粉末；
③将步骤②真空干燥获得的交联透明质酸钠粉末过筛分离，收集过筛的粉末；
④向步骤③收集的过筛的粉末中加入去离子水，使得交联透明质酸钠粉末充分溶胀，在室温15℃～35℃纯化6～10小时后，收集凝胶颗粒得到交联透明质酸钠凝胶；
⑤向步骤④收集的凝胶中分别加入等渗PBS缓冲液，于室温15℃～35℃纯化6～10小时后，过滤除去PBS，收集凝胶；将凝胶依次用第一种规格和第二种规格的筛网分筛而获得3份不同平均粒径的凝胶，将3份凝胶分别消毒后灌装于事先灭菌的一次性注射器中。
2.根据权利要求1所述的外科整形用交联透明质酸钠凝胶的制备方法，其特征在于：步骤①中氢氧化钠水溶液与丙酮的体积比为（2∶8）～（4∶6）。
3.根据权利要求1所述的外科整形用交联透明质酸钠凝胶的制备方法，其特征在于：步骤①的反应液中透明质酸钠的浓度为3wt%～4wt%。
4.根据权利要求1所述的外科整形用交联透明质酸钠凝胶的制备方法，其特征在于：步骤③中，步骤②真空干燥获得的交联透明质酸钠粉末经第三规格的筛网过筛分离，而得到过第三种规格筛网的粉末和未过第三种规格筛网的粉末，收集过第三种规格筛网的粉末；所述的第三种规格筛网为30～50目的筛网。
5.根据权利要求1所述的外科整形用交联透明质酸钠凝胶的制备方法，其特征在于：步骤④中向步骤③经过筛分离的交联透明质酸钠粉末中加入去离子水时，去离子水加入后干粉吸水膨胀形成凝胶，去离子水的加入量保证能完全没过干粉吸水后形成的凝胶；并且纯化过程中隔55min～80min更换去离子水。
6.根据权利要求1所述的外科整形用交联透明质酸钠凝胶的制备方法，其特征在于：步骤⑤中的第一种规格的筛网为200目的筛网，步骤⑤中的第二种规格的筛网为100目的筛网；
经等渗PBS纯化的凝胶先经第一种规格的筛网筛分，收集筛网下方的凝胶得到凝胶颗粒的平均粒径为50μm～150μm的凝胶；将第一种规格的筛网上方的凝胶再经第二种规格的筛网筛分，收集筛网下方的凝胶得到凝胶颗粒的平均粒径为150μm～300μm的凝胶，收集筛网上方的凝胶得到凝胶颗粒的平均粒径为300μm～450μm的凝胶。
7.根据权利要求1所述的外科整形用交联透明质酸钠凝胶的制备方法，其特征在于：步骤⑤中凝胶分别于115℃～125℃消毒15～25min。
8.一种外科整形用交联透明质酸钠凝胶，其特征在于该交联透明质酸钠凝胶由以下步骤制得：
①将透明质酸钠干粉分散在由10 wt%～20 wt%的氢氧化钠水溶液和丙酮组成的混合溶液后获得透明质酸钠碱性混悬液，然后向透明质酸钠碱性混悬液中加入交联剂1,4-丁二醇二缩水甘油醚BDDE，混匀后获得反应物料，从而开始发生生成交联透明质酸钠的反应；搅拌状态下将反应物料于35℃～50℃保温5～8小时后反应结束，用浓盐酸调节反应后固液混合物料的pH=7；其中所述反应物料中透明质酸钠的浓度为2 wt%～5wt%，交联剂与透明质酸钠的质量比为（1∶1.3）～（1∶1.8）；
②将步骤①反应后的pH=7的固液混合物料过滤以除去液体，剩余的物料用丙酮洗涤至GC-MS检测BDDE含量低于2ppm，剩余的物料包括白色粉末及透明的凝胶，然后将洗涤后的物料真空干燥获得水不溶性白色干粉即交联透明质酸钠粉末；
③将步骤②真空干燥获得的交联透明质酸钠粉末过30～50目筛分离，收集过筛的粉末；
④向步骤③收集的过筛的粉末中加入去离子水，使得交联透明质酸钠粉末充分溶胀，在室温15℃～35℃纯化6～10小时后，收集凝胶颗粒得到交联透明质酸钠凝胶；
⑤向步骤④收集的凝胶中分别加入等渗PBS，于室温15℃～35℃纯化6～10小时后，过滤除去PBS，收集凝胶；将凝胶依次用第一种规格和第二种规格两种规格的筛网分筛而获得3份不同平均粒径的凝胶，将3份凝胶分别消毒后灌装于事先灭菌的一次性注射器中。
9.根据权利要求8所述的外科整形用交联透明质酸钠凝胶，其特征在于步骤⑤中的第一种规格的筛网为200目的筛网，步骤⑤中的第二种规格的筛网为100目的筛网；
经等渗PBS纯化的凝胶先经第一种规格的筛网筛分，收集筛网下方的凝胶得到凝胶颗粒的平均粒径为50μm～150μm的凝胶；将第一种规格的筛网上方的凝胶再经第二种规格的筛网筛分，收集筛网下方的凝胶得到凝胶颗粒的平均粒径为150μm～300μm的凝胶，收集筛网上方的凝胶得到凝胶颗粒的平均粒径为300μm～450μm的凝胶；凝胶中交联剂BDDE的含量低于2ppm。
10.根据权利要求8所述的外科整形用交联透明质酸钠凝胶，其特征在于步骤①中氢氧化钠水溶液与丙酮的体积比为（2∶8）～（4∶6）；步骤①的反应液中透明质酸钠的浓度为3wt%～4wt%。
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