JP6865980B2 - 低分子量ヒアルロン酸の製造方法 - Google Patents

Description

本発明は、皮膚透過及び保湿効果に優れた分子量範囲のヒアルロン酸を製造する方法に関する。

ヒアルロン酸は、Ｄ−グルクロン酸（Ｄ−ｇｌｕｃｕｒｏｎｉｃ ａｃｉｄ）及びＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミン（Ｎ−ａｃｅｔｙｌ−Ｄ−ｇｌｕｃｏｓａｍｉｎｅ）を基本単位とし、分子量が数十万ダルトン〜数百万ダルトンに至り、ほぼ全ての生体において同一の構造で発見される直鎖状ポリマー（ｌｉｎｅｒ ｐｏｌｙｍｅｒ）であって、主に、細胞外マトリックス（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｍａｔｒｉｘ）の構成成分である。また、ヒアルロン酸は、種間差なく同一の構造を有するので、抽出源とは関係なく免疫反応のないものと知られており、現在まで、退行性関節炎、白内障、シワ改善、薬物伝達、幹細胞支持体、化粧品保湿維持成分などの多くの分野で使用される安全な天然多糖類である。重合体であるヒアルロン酸は、分子量が大きいほど密度が高くなるという特徴を有し、高い粘性を有する。

ヒアルロン酸は、初期には鶏冠から抽出して医薬品、化粧品、食品用などの産業化に使用していたが［Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，５，２１２２−２１２７（２００４）］、最近は、鳥インフルエンザなどの動物から誘発され得る感染性疾患の憂いのために、主に微生物を用いた発酵法で生産して使用している［Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．６６（４）：３４１−５１（２００５）］。

人体の皮膚において、ヒアルロン酸の量は老化と共に減少すると報告されているが、これは、皮膚弾力の低下及び水分含有量の減少の直接的な原因の一つとして見なされている［Ｉｎ：Ｆｒｅｅ ｒａｄｉｃａｌ Ｄａｍａｇｅ ａｎｔ Ｉｔｓ ｃｏｎｔｒｏｌ，２８１−３００，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９４）］。

ヒアルロン酸は、水によく溶解され、分子構造内に多くの水分を保有できるという特性により、化粧品の保湿剤として広く使用されており、火傷や創傷の治療のために塗るクリーム、注射剤、ガーゼなどに適用されており、角膜の内側を保護する製剤としても使用されている。また、ヒアルロン酸は、組織工学分野で創傷被覆材や歯科用マトリックスに使用される多孔性スポンジ形態のマトリックスの製造に使用されてきた。

しかし、動物組織からの抽出又は発酵法で生産されるヒアルロン酸は、重合度が高い５０万ダルトン以上の高分子多糖類であるので、一般的に皮膚を透過できない。すなわち、５０万ダルトン以上のヒアルロン酸を皮膚に塗布すると、空気中の水分を吸収しようとする性質のために皮膚からの水分蒸発を防止することはできるが、ヒアルロン酸が皮膚を透過できないので、皮膚表面に留まってから洗顔などによって皮膚表面から容易に洗われてしまい、その結果、皮膚の保湿効果が持続されにくい。その一方で、１０万ダルトン以下のヒアルロン酸は、皮膚を透過することはできるが、分子サイズが小さいので、水分を含有しようとする性質が不足し、保湿効果が持続されない。

また、２万ダルトン以下のヒアルロン酸は、皮膚を効果的に透過するが、炎症反応（ｐｒｏ−ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ｒｅｓｐｏｎｓｅ）を誘発するものと知られている。これは、皮膚内大食細胞上の受容体であるトル様（Ｔｏｌｌ−ｌｉｋｅ）受容体−２及び４と結合して免疫反応を開始し得るためである。

ヒアルロン酸を低分子化する方法としては、ガンマ線、超音波又は紫外線を用いる方法（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ，４３５，ｐｐ３３５−３４２，１９８８；Ｉｎｔ．Ｂｉｏｌ．Ｍａｃｒｍｏｌ．，ｐ１０，１９８８）、酸又は塩基触媒を用いる方法（日本特許公開Ｓ６３−５７６０２）、マイクロフルイダイザー（ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｚｅｒ）を使用する方法などが知られている。しかし、これらの公知の方法は、１０万ダルトン以下のヒアルロン酸を製造する方法であって、皮膚透過の直接的な効果を有したり、水分吸収及び含有が可能な分子量範囲のヒアルロン酸を効果的に製造する方法は未だに提示されていない。

本発明は、前記のような従来技術の問題を解決するためのものであって、既存の化粧品などの原料として使用される５０万ダルトン以上のヒアルロン酸が持つ保湿効果を維持しながらも、皮膚の角質層に透過されずに洗われることによって皮膚に長時間保湿効果を提供できないという短所を克服し、皮膚に透過されると共に、最適な湿潤状態の維持が可能な低分子量ヒアルロン酸を効果的に製造する方法を提供することを目的とする。

本発明において、前記のような課題を解決するための手段は次の通りである。

１．分子量５０万ダルトン以上のヒアルロン酸を含有する水溶液をｐＨ２．５〜ｐＨ３．５の範囲で熱処理することを含む、分子量１０万ダルトン〜２０万ダルトンの低分子量ヒアルロン酸の製造方法。

２．水溶液の濃度が１％〜２％（重量／体積）である前記１の低分子量ヒアルロン酸の製造方法。

３．熱処理温度が８０℃〜９０℃である前記１の低分子量ヒアルロン酸の製造方法。

４．熱処理時間が１５分〜３０分である前記１の低分子量ヒアルロン酸の製造方法。

５．熱処理後、反応溶液をアルカリ金属水酸化物水溶液で中和し、低分子量ヒアルロン酸をアルカリ金属塩の形態で収得することである前記１の低分子量ヒアルロン酸の製造方法。

６．アルカリ金属塩がナトリウム塩である前記１の低分子量ヒアルロン酸の製造方法。

７．中和後、反応溶液に有機溶媒を添加し、沈殿物を生成・ろ過することによってヒアルロン酸のアルカリ金属塩を粉末の形態で収得することである前記５の低分子量ヒアルロン酸の製造方法。

８．有機溶媒がメタノール、エタノール、アセトン及びイソプロピルアルコールで構成された群から１種以上選ばれることである前記７の低分子量ヒアルロン酸の製造方法。

９．有機溶媒を、反応溶液を基準にして１：５〜１：６の体積比で添加することである前記７の低分子量ヒアルロン酸の製造方法。

本発明により、既存の多くの複雑な方法を省略し、単純化された方法を通じて既存の化粧品原料として使用されるヒアルロン酸の短所である皮膚透過が難しいという問題を克服し、皮膚透過のみならず、最大の保湿力を維持できる分子量１００ｋＤａ〜２００ｋＤａのヒアルロン酸を製造する方法を提供した。本発明で提示した方法で製造した低分子量ヒアルロン酸は、皮膚透過が可能であり、最大限の含湿状態を維持することによってアトピー症状緩和などの機能性を有するので、これを化粧品用、医薬用及び医療用組成物に適宜使用することができる。

実施例１〜実施例３で製造した低分子量ヒアルロン酸ナトリウムの分子量分布を確認したＨＰＬＣクロマトグラムである。（青色：分子量２０万ダルトン標準、赤色：実施例１、緑色：実施例２、黒色：実施例３） 本発明の実施例４及び実施例５で製造した低分子量ヒアルロン酸ナトリウムの分子量分布を確認したＨＰＬＣクロマトグラムである。（青色：分子量２０万ダルトン標準、赤色：実施例４、緑色：実施例５） 本発明の実施例６及び実施例７で製造した低分子量ヒアルロン酸ナトリウムの分子量分布を確認したＨＰＬＣクロマトグラムである。（青色：分子量２０万ダルトン標準、赤色：実施例６、緑色：実施例７） 比較例１〜比較例３で製造したヒアルロン酸ナトリウムの分子量分布を確認したＨＰＬＣクロマトグラムである。（青色：分子量２０万ダルトン標準、赤色：分子量１０万ダルトン標準、緑色：比較例１、黒色：比較例２、桃色：比較例３）） 本発明の比較例４〜比較例６で製造したヒアルロン酸ナトリウムの分子量分布を確認したＨＰＬＣクロマトグラムである。（青色：分子量２０万ダルトン標準、赤色：分子量１０万ダルトン標準、緑色：比較例４、黒色：比較例５、桃色：比較例６）） 蛍光標識された本発明の実施例４、対照群及び比較例７の試料をＢＡＬＢ／ｃ−ヌードマウスの背中に１０μＬ（１０μｇ／ｍｌ）ずつ塗布し、マウスの左側は１５分後、右側は３０分後にＰＢＳ緩衝液で洗浄し、残留物を除去してから３０分後、１時間後、２時間後、６時間後、２４時間後にそれぞれＩＶＩＳスペクトラムで測定した結果を示した図である。 蛍光標識された本発明の実施例４、対照群及び比較例７の試料をＢＡＬＢ／ｃ−ヌードマウスの背中に１０μＬ（１０μｇ／ｍｌ）ずつ塗布し、１５分後にＰＢＳ緩衝液で洗浄し、残留物を除去した後、マウスの皮膚切片を摘出して４％のホルムアルデヒドで固定することによって切開試験片を製作し、２光子顕微鏡を用いて皮膚組織スライドの共焦点イメージングを行った結果を示した図である。

本発明は、分子量５０万ダルトン以上のヒアルロン酸を含有する水溶液をｐＨ２．５〜ｐＨ３．５の範囲で熱処理することを含む、分子量１０万ダルトン〜２０万ダルトンの低分子量ヒアルロン酸の製造方法に関する。

本発明において、出発物質として使用する分子量５０万ダルトン〜３００万ダルトンのヒアルロン酸は、一般的なヒアルロン酸化粧品等級原料である平均分子量５０万ダルトン、医薬品原料等級である１００万ダルトン及び３００万ダルトンのヒアルロン酸を全て含み得る。一般に、価格が低い化粧品原料である平均分子量５０万ダルトンのヒアルロン酸を使用することが経済的な側面で好ましいと言えるが、これに限定されることはない。

前記水溶液は、分子量５０万ダルトン〜３００万ダルトンのヒアルロン酸を水、好ましくは蒸留水に１％〜２％（重量／体積）の濃度で溶解させたものであってもよく、前記酸は、塩酸、リン酸、酢酸などの本発明の分野で通常的に使用する酸のうちいずれでも構わない。

前記熱処理温度は、工程の効率性のために８０℃〜９０℃であることが好ましく、熱処理時間は、出発物質として使用する原料によって１５分〜３０分であることが好ましい。

本発明では、分子量５０万ダルトン以上のヒアルロン酸を含有する水溶液をｐＨ２．５〜ｐＨ３．５の範囲に調整し、前記のような温度及び時間で熱処理することによって平均分子量１０万ダルトン〜２０万ダルトンのヒアルロン酸を収得することができる。

本発明では、前記熱処理後、反応溶液を塩基、好ましくはアルカリ金属水酸化物水溶液で中和し、低分子量ヒアルロン酸をアルカリ金属塩の形態で収得することもできる。この場合、反応溶液のｐＨを６．５以上、好ましくは６．５〜７．０に調整する。前記アルカリ金属水酸化物は水酸化ナトリウムであってもよく、この場合、低分子量ヒアルロン酸のナトリウム塩を収得することができる。

上述した方法で製造した低分子量ヒアルロン酸の金属塩は、反応溶液に有機溶媒を添加し、沈殿物を生成・ろ過することによって低分子量ヒアルロン酸のアルカリ金属塩を粉末の形態で回収することができる。前記有機溶媒は、メタノール、エタノール、アセトン及びイソプロピルアルコールで構成された群から１種以上選ばれるものであってもよく、反応溶液を基準にして１：５〜１：６の体積比で添加することができる。

実施例

以下では、実施例を通じて本発明をさらに詳細に説明する。しかし、以下で提示した実施例は、本発明を実施するための例示に過ぎなく、本発明の範囲がこれらの実施例の範囲に限定されることはない。

１．低分子量ヒアルロン酸ナトリウム塩の製造条件の最適化

実施例１

市販の化粧品等級のヒアルロン酸ナトリウム（Ｂｌｏｏｍａｇｅ Ｆｒｅｄａ Ｂｉｏｐｈａｒｍ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．製品、分子量５０万ダルトン〜１２０万ダルトン）１ｇを蒸留水１００ｍｌに溶かすことによって１．０％（ｗ／ｖ）の水溶液を製造し、４Ｎ ＨＣｌ溶液０．５８ｍｌを加えてｐＨ２．５に調整した後、９０℃の水で１５分間湯煎した。その次に、冷水に入れて室温に温度を下げた後、４Ｎ ＮａＯＨ溶液を加えてｐＨ６．５に調整した後、無水エタノール４００ｍｌを加えることによって沈殿を生成させた。沈殿物をろ過した後、５０℃で乾燥することによって８．９ｇのヒアルロン酸ナトリウム塩を得た。

実施例２

９０℃の水で３０分間湯煎したことを除いては、実施例１と同一の方法で実施することによって８．７ｇのヒアルロン酸ナトリウム塩を得た。

実施例３

ヒアルロン酸ナトリウム水溶液に４Ｎ ＨＣｌ溶液０．２３ｍｌを加えてｐＨ３．５に調整し、９０℃の水で３０分間湯煎したことを除いては、実施例１と同一の方法で実施することによって９．１ｇのヒアルロン酸ナトリウム塩を得た。

図１は、実施例１（赤色ピーク）及び実施例３（黒色ピーク）で得られたヒアルロン酸ナトリウム塩の平均分子量が２０万ダルトン標準（青色ピーク）と重畳すること、そして、実施例２（緑色ピーク）で得られたヒアルロン酸ナトリウム塩の分子量が２０万ダルトン（青色ピーク）より小さいことを示す。

実施例４

ヒアルロン酸ナトリウム水溶液に４Ｎ ＨＣｌ溶液０．２１ｍｌを加えてｐＨ３．０に調整したことを除いては、実施例１と同一の方法で実施することによって８．９ｇのヒアルロン酸ナトリウム塩を得た。

実施例５

ヒアルロン酸ナトリウム水溶液に４Ｎ ＨＣｌ溶液０．２１ｍｌを加えてｐＨ３．０に調整し、９０℃の水で３０分間湯煎したことを除いては、実施例１と同一の方法で実施することによって８．２ｇのヒアルロン酸ナトリウム塩を得た。

図２は、実施例４（赤色ピーク）で得られたヒアルロン酸ナトリウム塩の平均分子量が２０万ダルトン標準と重畳し、実施例５（緑色ピーク）で得られたヒアルロン酸ナトリウム塩の分子量は２０万ダルトン標準（青色ピーク）より小さいことを示す。

実施例６

ヒアルロン酸ナトリウム水溶液に４Ｎ ＨＣｌ溶液０．２１ｍｌを加えてｐＨ３．０に調整し、８０℃の水で１５分間湯煎したことを除いては、実施例１と同一の方法で実施することによって８．７ｇのヒアルロン酸ナトリウム塩を得た。

実施例７

ヒアルロン酸ナトリウム水溶液に４Ｎ ＨＣｌ溶液０．２１ｍｌを加えてｐＨ３．０に調整し、８０℃の水で３０分間湯煎したことを除いては、実施例１と同一の方法で実施することによって８．５ｇのヒアルロン酸ナトリウム塩を得た。

図３は、実施例６（赤色ピーク）で得られたヒアルロン酸ナトリウム塩の分子量分布が２０万ダルトン標準（青色ピーク）とほぼ一致し、実施例７（緑色ピーク）で得られたヒアルロン酸ナトリウム塩の平均分子量が２０万ダルトン標準（青色ピーク）より小さいことを示す。

比較例１

市販の化粧品等級のヒアルロン酸ナトリウム（Ｂｌｏｏｍａｇｅ Ｆｒｅｄａ Ｂｉｏｐｈａｒｍ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．製品、分子量５０万ダルトン〜１２０万ダルトン）１ｇを蒸留水１００ｍｌに溶かすことによって１．０％（ｗ／ｖ）の水溶液を製造し、４Ｎ ＨＣｌ溶液０．６２ｍｌを加えてｐＨ２．０に調整した後、９０℃の水で１５分間湯煎した。その次に、冷水に入れて室温に温度を下げ、４Ｎ ＮａＯＨ溶液を加えてｐＨ６．５に調整した後、無水エタノール４００ｍｌを加えることによって沈殿を生成させた。沈殿物をろ過した後、５０℃で乾燥することによって７．３ｇのヒアルロン酸ナトリウム塩を得た。

比較例２

９０℃の水で３０分間湯煎したことを除いては、比較例１と同一の方法で実施することによって６．９ｇのヒアルロン酸ナトリウム塩を得た。

比較例３

ヒアルロン酸ナトリウム水溶液に４Ｎ ＨＣｌ溶液０．１８ｍｌを加えてｐＨ４．０に調整し、９０℃の水で３０分間湯煎したことを除いては、比較例１と同一の方法で実施することによって９．３ｇのヒアルロン酸ナトリウム塩を得た。

図４は、比較例１（緑色ピーク）、比較例２（黒色ピーク）及び比較例３（桃色ピーク）で得られたヒアルロン酸ナトリウム塩の分子量が１０万ダルトン標準（赤色ピーク）より小さいことを示す。

比較例４

ヒアルロン酸ナトリウム水溶液に４Ｎ ＨＣｌ溶液０．２１ｍｌを加えてｐＨ３．０に調整し、７０℃の水で３０分間湯煎したことを除いては、比較例１と同一の方法で実施することによって９．１ｇのヒアルロン酸ナトリウム塩を得た。

比較例５

ヒアルロン酸ナトリウム水溶液に４Ｎ ＨＣｌ溶液０．２１ｍｌを加えてｐＨ３．０に調整し、１００℃の水で１５分間湯煎したことを除いては、比較例１と同一の方法で実施することによって７．８ｇのヒアルロン酸ナトリウム塩を得た。

比較例６

１００℃の水で３０分間湯煎したことを除いては、比較例５と同一の方法で実施することによって７．４ｇのヒアルロン酸ナトリウム塩を得た。

図５は、比較例４（緑色ピーク）、比較例５（黒色ピーク）及び比較例６（桃色ピーク）で得られたヒアルロン酸ナトリウム塩の分子量が１０万ダルトン標準（赤色ピーク）より小さいことを示す。

実験例

実験例１．ＦＦＦ−ＭＡＬＳを用いた分子量分布度の確認

前記実施例４で製造したヒアルロン酸ナトリウム塩及び比較例７（市販の化粧品等級のヒアルロン酸ナトリウム（Ｂｌｏｏｍａｇｅ Ｆｒｅｄａ Ｂｉｏｐｈａｒｍ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．製品、分子量５０万ダルトン〜１２０万ダルトン））をそれぞれ蒸留水に溶解させた１．０％（ｗ／ｖ）の水溶液を分析試料とし、ＦＦＦ／ＭＡＬＳ（Ｆｌｏｗ ｆｉｅｌｄ−ｆｌｏｗ ｆｒａｃｔｉｏｎ／ｍｕｌｔｉ−ａｎｇｌｅ ｌｉｇｈｔ ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ）分析装置（Ｗｙａｔｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社）で分子量分布を分析した。その結果は下記の表１の通りである。

分析条件は次の通りである。

スペーサー厚さ（ｓｐａｃｅｒ ｔｈｉｃｋｎｅｓｓ）：２５０μｍ

メンブレン：複合再生セルロール（Ｃｏｍｐｏｓｉｔｅ Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｅｄ Ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ） ２０ｋＤａ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）

注入量（ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ ａｍｏｕｎｔ）：２０μｇ

試料濃度：１ｍｇ／ｍｌ

キャリア溶液：０．１Ｍ ＮａＮＯ_３＋０．０２％ ＮａＮ_３

試料流速（ｓａｍｐｌｅ ｆｌｏｗ ｒａｔｅ）：０．１ｍＬ／ｍｉｎ

クロスフロー流速（ｃｒｏｓｓ ｆｌｏｗ ｒａｔｅ）：０分〜４分間２．０ｍＬ／ｍｉｎ；４分〜５分間０．５ｍＬ／ｍｉｎ；５分〜６分間０．１ｍＬ／ｍｉｎ；６分〜８分間０．０２ｍＬ／ｍｉｎ

表１に示すように、本発明の実施例４で製造したヒアルロン酸ナトリウム塩の平均分子量は１６万ダルトンである一方で、一般的な化粧品原料（比較例７）の平均分子量は１００万ダルトンであると分析された。

実験例２．ＨＰＬＣを用いた分子量の確認

ＨＰＬＣ分析装置（Ｖａｒｉａｎ Ｐｒｏｓｔａｒ ２１０ Ｓｏｌｖｅｎｔ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍ）を使用し、実施例１〜実施例７及び比較例１〜比較例６で製造したヒアルロン酸塩の分子量を確認した。前記実施例１〜実施例７及び比較例１〜比較例６で製造したヒアルロン酸塩と基準物質（株式会社ライフコアの１００ｋＤａ及び２００ｋＤａ製品）の各試料１０ｍｇを秤量して移動相１０ｍｌに溶解させ、０．４５μｍのフィルターでろ過した後で分析した。その結果は図１〜図６の通りである。

分析条件は次の通りである。

−カラム：１）ウルトラハイドロゲル（Ｕｌｔｒａｈｙｄｒｏｇｅｌ）１０００、１２μｍ、７．８ｍｍ ｘ ３００ｍｍ、２Ｋ−４Ｍカラム／２）ウルトラハイドロゲル５００、１０μｍ、７．８ｍｍ ｘ ３００ｍｍ、１０Ｋ−４００Ｋカラム、直列連結（ｔａｎｄｅｍ ｃｏｎｎｅｃｔｉｏｎ）

−カラムオーブン：室温

−流速：０．８ｍｌ／ｍｉｎ

−注入体積：１００μｌ

−検出器：Ａｌｌｔｅｃｈ ＥＬＳＤ ３３００

−気体流量（ｇａｓ ｆｌｏｗ）：１Ｌ／ｍｉｎ、温度：７０℃

−移動相：２０ｍＭ−炭酸アンモニウム（ｐＨ７．８）

−分子量基準物質：２００ｋＤａ、１００ｋＤａ ＨＡ

実験例３．極限粘度の測定を通じた水分含有度の測定

分子量による水分含有程度を確認するために、欧州薬局方のヒアルロン酸ナトリウム塩の極限粘度測定方法によって次のように試験した。

粘度計としては、ウベローデ（Ｕｂｂｅｌｏｈｄｅ）型粘度計を使用した。実施例４及び実施例５で製造したヒアルロン酸ナトリウム塩、比較例７及び基準物質（株式会社ライフコアの分子量２０ｋＤａ、１０ｋＤａ、５ｋＤａのヒアルロン酸）（Ｍ_０ｐ）をそれぞれ緩衝溶液１０．０ｇ（Ｍ_０Ｓ）に入れて４℃で２４時間振って混ぜた後、ガラスろ過器でろ過して検液（Ｔ_０）として使用した。この検液１０ｇ（Ｔ_０）に緩衝溶液５０ｇを入れて２５℃で２０分間振って混ぜた後、ガラスろ過器でろ過した。最初の余液５ｍｌを捨て、次の余液を検液Ｔ_１とした。検液（Ｔ_１）１５ｇに緩衝溶液５ｇを入れ、前記と同一の過程を経て検液Ｔ_２とした。検液（Ｔ_１）１０ｇに緩衝溶液１０ｇを入れ、前記と同一の過程を経て検液Ｔ_３とした。検液（Ｔ_１）５ｇに緩衝溶液１５ｇを入れ、前記と同一の過程を経て検液Ｔ_４とした。

検液を粘度計に入れ、検液の液面が球Ａの二つの標線間に来るようにする。この粘度計は、球Ｄが完全に浸るように動物用医薬品各条で規定する温度（０．１℃）の恒温槽に入れて垂直に維持し、検液が規定温度に到逹するまで約２０分間定置する。管Ｍを指で塞ぎ、気泡が管Ｎ中に入らないようにし、管Ｎの上端から弱く吸入することによって液面を球Ｄの中心部まで引き上げた後、吸入を停止し、管Ｍの入口を開けてから管Ｎの入口を塞ぐ。毛細管の最下端の液柱が切れていることを確認した後、管Ｎの入口を開け、液面が球Ｃの上の標線から下の標線まで流下する時間ｔ（秒）を測定する。

１．粘度測定法：毛細管粘度計法

ニュートン液体の粘度を測定する方法で一定体積の液体が毛細管を介して流下するのにかかる時間ｔ（ｓ）を測定し、次の式１によって動粘度νを計算する。

粘度ηを求めるためには、再びその温度での液体の密度ρ（ｇ／ｍＬ）を測定し、次の式２によって計算する。

式１及び式２において、Ｋ（ｍｍ^２／ｓ^２）は、粘度計の定数であって、粘度計校正用標準液を使用して予め決定しておく。極限粘度は、液体（検液）中での高分子の拡散程度を示すものであって、分子量の標準ともなる。濃度ｃ（ｇ／ｄＬ）である検液が流下する時間ｔ及び溶媒が流下する時間ｔ_ｏを測定し、極限粘度［η］を次の式３によって計算する。

２．緩衝溶液：０．１５Ｍの塩化ナトリウムリン酸ナトリウム緩衝溶液（ｓｏｄｉｕｍ ｃｈｌｏｒｉｄｅ ｉｎ ｓｏｄｉｕｍ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）ｐＨ７．０

溶液Ａ：ＮａＨ_２ＰＯ_４ １．５６ｇ及びＮａＣｌ ９．０ｇを蒸留水１Ｌに溶解させて製造する。

溶液Ｂ：Ｎａ_２ＨＰＯ_４ ３．５８ｇ及びＮａＣｌ ９．０ｇを蒸留水１Ｌに溶解させて製造する。

溶液Ａに溶液ＢをｐＨ７．０になるまで混ぜた後、ガラスろ過器でろ過する。

３．実験の有効性判定

検液Ｔ_１、Ｔ_２、Ｔ_３、Ｔ_４及び緩衝溶液が２５℃で毛細管粘度計を介して流下する時間を測定し、それぞれｔ_１、ｔ_２、ｔ_３、ｔ_４、ｔ_０とする。全ての試験に対して同一の粘度計を使用し、全ての試験液に対して３回測定する。３回測定値の偏差が平均値から０．３５％以内であり、ｔ_１がｔ_０に対して１．６倍〜１．８倍であると、この値は有効なものと判定する。適切な結果でない場合、緩衝溶液及び検液を再び調剤して試験する。

前記のような方法で実験して得た極限粘度値は、下記の表２に示した通りである。

表２に示すように、分子量が小さいほど極限粘度値が低いことが分かり、これによって、分子量が小さいほど水分を含有する能力が減少することを確認することができる。

実験例４．動物モデルを用いた皮膚透過試験

実施例４で製造したヒアルロン酸ナトリウム、対照群として株式会社ライフコアの分子量２００ｋＤａのヒアルロン酸及び比較例７（市販の化粧品等級のヒアルロン酸ナトリウム（Ｂｌｏｏｍａｇｅ Ｆｒｅｄａ Ｂｉｏｐｈａｒｍ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．製品、分子量５０万ダルトン〜１２０万ダルトン）に蛍光染料（Ｆｌａｍｍａ４９６−ジクロロトリアジン、Ｆｌａｍｍａ６４８−ジクロロトリアジン）を付着させ、ＢＡＬＢ／ｃ−ヌードマウス（雄、５週齢、１４匹）を対象にして皮膚透過度試験を進めた。試験方法は次の通りである。

１．測定装備

−ＩＶＩＳスペクトラム（製造社：パーキンエルマー、製品番号：１２４２６２）

−２光子顕微鏡（Ｔｗｏ Ｐｈｏｔｏｎ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ）（製造社：ライカマイクロシステムズ）

２．薬物の蛍光標識

ａ．実施例４、対照群及び比較例７の試料をＰＢＳに１２．５μｇ／ｍｌの濃度で準備する。

ｂ．蛍光染料（Ｆｌａｍｍａ４９６−ジクロロトリアジン、Ｆｌａｍｍａ６４８−ジクロロトリアジン）を１ｍｇ／ｍｌの濃度でＤＭＳＯに溶解させる。反応直前に製造し、新鮮な状態で使用する。

ｃ．ａの薬物溶液１ｍＬにｂの蛍光染料溶液２０μＬを入れる。

ｄ．常温で２時間培養する。１５分ごとに上下をひっくり返す。

３．光学イメージングを用いた薬物の皮膚浸透確認

蛍光標識された実施例４、対照群及び比較例７の試料をＢＡＬＢ／ｃ−ヌードマウスの背中に１０μＬ（１０μｇ／ｍｌ）ずつ塗布し、マウスの左側は１５分後、右側は３０分後にＰＢＳ緩衝液で洗浄し、残留物を除去する。残留物を除去してから３０分後、１時間後、２時間後、６時間後、２４時間後にそれぞれＩＶＩＳスペクトラムで測定した。その結果は図６の通りである。

図６に示すように、対照群及び実施例４の場合は皮膚に透過されたことが分かるが、１５分後に比べて３０分後にさらに効果的に皮膚組織に透過された。しかし、比較例７の場合は、分子量が実施例４に比べて大きいので、皮膚に透過されずに洗われたことが確認された。

４．２光子顕微鏡（Ｔｗｏ Ｐｈｏｔｏｎ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ、ＴＰＭ）イメージングを用いた薬物の皮膚浸透確認

蛍光標識された実施例４、対照群及び比較例７の試料をＢＡＬＢ／ｃ−ヌードマウスの背中に１０μＬ（１０μｇ／ｍｌ）ずつ塗布し、１５分後にＰＢＳ緩衝液で洗浄し、残留物を除去する。マウスの皮膚切片を摘出し、４％のホルムアルデヒドで固定して切開試験片を製作した後、２光子顕微鏡を用いて皮膚組織スライドの共焦点イメージング（ｃｏｎｆｏｃａｌ ｉｍａｇｉｎｇ）を行った。

図７に示すように、皮膚組織を切り取り、ＴＰＭイメージングを用いた薬物の皮膚浸透を確認したとき、実施例４及び対照群の場合は、相対的な差なしで皮膚組織に浸透されたことが確認されたが、比較例７の場合は、ほとんど皮膚組織内に存在しないことが分かる。

以上説明したように、本発明の属する技術分野で通常の技術者は、多様に変形した形態で実施可能であることを理解できるだろう。そのため、上述した各実施例は、全ての面で例示的なものであって、限定的なものでないことを理解しなければならない。本発明の範囲は、詳細な説明よりは後述する特許請求の範囲によって示されるものであって、特許請求の範囲の意味及び範囲、そして、等価概念から導出される全ての変更又は変形した形態は本発明の範囲に含まれるものと解釈しなければならない。

Claims (6)

1. 数平均分子量５０万〜３００万ダルトンのヒアルロン酸を含有する水溶液をｐＨ２．５〜ｐＨ３．５の範囲で熱処理することを含み、
   前記水溶液の濃度は１％〜２％（重量／体積）であり、
   前記熱処理温度は８０℃〜９０℃であり、
   前記熱処理時間は１５分〜３０分である、低分子量ヒアルロン酸の製造方法。
2. 熱処理後、反応溶液をアルカリ金属水酸化物水溶液で中和し、低分子量ヒアルロン酸をアルカリ金属塩の形態で収得することである、請求項１に記載の低分子量ヒアルロン酸の製造方法。
3. 前記アルカリ金属塩はナトリウム塩である、請求項２に記載の低分子量ヒアルロン酸の製造方法。
4. 中和後に反応溶液に有機溶媒を添加し、沈殿物を生成・ろ過することによってヒアルロン酸のアルカリ金属塩を粉末の形態で収得することである、請求項２に記載の低分子量ヒアルロン酸の製造方法。
5. 前記有機溶媒は、メタノール、エタノール、アセトン及びイソプロピルアルコールで構成された群から１種以上選ばれることである、請求項４に記載の低分子量ヒアルロン酸の製造方法。
6. 前記有機溶媒は、反応溶液を基準にして１：５〜１：６の体積比で添加することである、請求項４に記載の低分子量ヒアルロン酸の製造方法。

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