CN103923328B - 高质量交联透明质酸钠凝胶及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种高质量交联透明质酸钠凝胶及其制备方法，在获得交联透明质酸钠干粉后，将收集的过筛粉末用二甲基亚砜洗涤；将经DMSO洗涤后的粉末用乙醇洗涤；将经乙醇洗涤后的粉末真空干燥获得交联透明质酸钠粉末；将粉末充分溶胀，在室温15℃～35℃纯化6～10小时后，用高速分散机中进行匀质微化处理，然后收集凝胶颗粒得到交联透明质酸钠凝胶。匀质处理后获得具有稳定的不同粒径大小的低推挤力的交联透明质酸钠凝胶。本发明的制备方法虽然增加了DMSO洗涤过程、去除DMSO过程以及DMSO残留量检测的过程，但是最后制得的交联透明质酸钠凝胶质量更好，杂质含量更低，蛋白质指标检测100%达标。

Description

高质量交联透明质酸钠凝胶及其制备方法

技术领域

本发明涉及一种高质量交联透明质酸钠凝胶及其制备方法。

背景技术

中国专利文献CN102731801B（申请号201210245094.X）公开了一种外科整形用交联透明质酸钠凝胶及其制备方法，制备时将透明质酸钠干粉分散在由10wt%～20wt%的氢氧化钠水溶液与丙酮组成的混合溶液，然后向所得的透明质酸钠碱性混悬液中加入交联剂1,4-丁二醇二缩水甘油醚，混匀后在搅拌状态下将反应物料于35℃～50℃保温5～8小时；过滤除去液体，剩余的物料用丙酮洗涤至GC-MS检测BDDE含量低于2ppm，然后将洗涤后的物料真空干燥得交联透明质酸钠粉末，粉末过筛后，将过筛的粉末收集，依次用去离子水和PBS纯化，然后依次用两种规格的筛网筛分而得到3种规格的凝胶，分别收集3份凝胶沉淀，消毒后灌装于事先灭菌的一次性注射器中。

按照上述制备方法，实际生产中对制得的交联透明质酸钠凝胶进行检测时，发现有些批次的蛋白质指标超标，不符合国标规定的使用要求，这些批次的产品弃之。

但是上述制备过程中，没有向反应体系外加蛋白质，交联反应过程也不会生成蛋白质，说明在交联反应过程中生成了“假蛋白”，这些“假蛋白”干扰了蛋白质的检测过程，影响了蛋白含量检测结果。因此为了进一步提高交联透明质酸钠的质量，需要去除这些假蛋白。

另外，发现最后用筛网筛分得到3种规格的凝胶中，放置一段时间后，在各种外力作用下小凝胶颗粒会聚集变成大凝胶颗粒，然后随着时间的推移及各种外在因素大颗粒又会变成小颗粒，凝胶颗粒大小不是很稳定。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种高质量交联透明质酸钠凝胶的制备方法。

实现本发明第一目的的技术方案是一种高质量交联透明质酸钠凝胶的的制备方法，包括以下步骤：

①将透明质酸钠干粉分散在由10wt%～20wt%的氢氧化钠水溶液和丙酮组成的混合溶液后获得透明质酸钠碱性混悬液，然后向透明质酸钠碱性混悬液中加入交联剂1,4-丁二醇二缩水甘油醚BDDE，混匀后获得反应物料，从而开始发生生成交联透明质酸钠的反应；搅拌状态下将反应物料于35℃～50℃保温5～8小时后反应结束，用浓盐酸调节反应后固液混合物料的pH值至7；其中所述反应物料中透明质酸钠的浓度为2wt%～5wt%，交联剂与透明质酸钠的质量比为（1∶1.3）～（1∶1.8）。

②将步骤①反应后的pH=7的固液混合物料过滤以除去液体，剩余的物料用丙酮洗涤至GC-MS检测BDDE含量低于2ppm，然后将洗涤后的物料真空干燥获得水不溶性白色干粉即交联透明质酸钠粉末。

③将步骤②真空干燥获得的交联透明质酸钠粉末过筛分离，收集过筛的粉末。

④将步骤③收集的过筛粉末用二甲基亚砜洗涤2～6次。

⑤将步骤④经DMSO洗涤后的粉末用乙醇洗涤2～6次。

⑥将步骤⑤经乙醇洗涤后的粉末真空干燥获得水不溶性白色干粉即交联透明质酸钠粉末。

⑦向步骤⑥真空干燥获得的交联透明质酸钠粉末中加入去离子水，使得交联透明质酸钠粉末充分溶胀，在室温15℃～35℃纯化6～10小时后，收集凝胶颗粒得到交联透明质酸钠凝胶。

⑧向步骤⑦收集的凝胶中分别加入等渗PBS缓冲液，于室温15℃～35℃纯化6～10小时后，过滤除去PBS，收集凝胶；将凝胶依次用第一种规格和第二种规格的筛网分筛而获得3份不同平均粒径的凝胶。

⑨将步骤⑧收集的3份凝胶分别送入高速分散机中进行匀质微化处理，获得3份不同规格的交联透明质酸钠凝胶。

上述步骤④用二甲基亚砜洗涤时，第一次洗涤时，向每30g过筛粉末中加入DMSO直至浸没过筛粉末，将过筛粉末与DMSO搅拌2～3小时后静置，粉末沉降后倒掉DMSO完成一次洗涤操作；向第一次洗涤后的粉末中倒入新鲜的DMSO直至浸没过筛粉末，开始第二次洗涤，第3至第6次的洗涤操作同第一次。

上述步骤④每30g过筛粉末的二甲基亚砜洗涤过程总共消耗1.5L～5L的二甲基亚砜。

上述步骤⑤用乙醇洗涤时，第一次洗涤时，向每30g经DMSO洗涤后的粉末中加入无水乙醇直至浸没粉末，将粉末与无水乙醇搅拌1.5～2.5小时后静置，粉末沉降后倒掉乙醇完成一次洗涤操作；后续第2次至第6次的洗涤操作同第一次。

优选的，步骤⑤每30g经DMSO洗涤后的粉末的洗涤过程总共消耗1.5L～5L的无水乙醇。

实现本发明第二目的的技术方案是一种如上所述的高质量交联透明质酸钠凝胶的的制备方法所制备的高质量交联透明质酸钠凝胶。

上述凝胶中交联剂BDDE的含量低于2ppm；凝胶中交联剂DMSO的含量低于0.2ppm；凝胶中蛋白质浓度低于0.1%。

上述凝胶中交联剂DMSO的残留量的检测采用毛细管气相色谱法测定。

本发明具有积极的效果：（1）本发明的交联透明质酸钠凝胶的制备方法在将真空干燥获得的交联透明质酸钠粉末过筛分离后，对收集的过筛的粉末用DMSO进行洗涤，以去除交联反应中可能生成的干扰蛋白质检测的“假蛋白”。虽然增加了DMSO洗涤过程、去除DMSO过程以及确认DMSO已被去除的过程，但是最后制得的交联透明质酸钠凝胶质量更好，杂质含量更低，蛋白质指标检测100%达标。

（2）本发明的交联透明质酸钠凝胶的制备方法在获得3份不同平均粒径的凝胶后，将三份凝胶分别送入匀质机中进行匀质微化处理，将小凝胶颗粒聚集成的不稳定的大凝胶颗粒分散，经过匀质处理的凝胶中凝胶颗粒大小更加均匀、颗粒更稳定，消除小凝胶颗粒聚集成大颗粒及大颗粒分散成小颗粒的情况。

另外经过匀质处理得到的凝胶中凝胶颗粒光滑圆润、柔软，经MALVERN粒度仪检测，凝胶的颗粒粒径分布更集中，峰形狭窄形态美观。

本发明制得的交联透明质酸钠凝胶经英国MalvernCVO100动态剪切流变仪DSR检测，流变学指标更优异，凝胶在受到外加压力时更易流动，能够顺利地通过注射针头注入体内。

附图说明

图1为实施例1筛分得到的第一种规格的凝胶匀质处理后的粒度分布图；

图2为实施例1筛分得到的第二种规格的凝胶匀质处理后的粒度分布图；

图3为实施例1筛分得到的第三种规格的凝胶匀质处理后的粒度分布图；

图4为实施例1筛分得到的第一种规格的凝胶匀质处理后的粘弹性曲线图；

图5为实施例1筛分得到的第一种规格的凝胶未匀质处理前的粘弹性曲线图；

图6为实施例1筛分得到的第二种规格的凝胶匀质处理后的粘弹性曲线图；

图7为实施例1筛分得到的第二种规格的凝胶未匀质处理前的粘弹性曲线图；

图8为实施例1筛分得到的第三种规格的凝胶匀质处理后的粘弹性曲线图；

图9为实施例1筛分得到的第三种规格的凝胶未匀质处理前的粘弹性曲线图；

图10为凝胶中交联剂DMSO残留量的检测的DMSO对照品溶液的气相色谱图；

图11为凝胶中交联剂DMSO残留量的检测的空白溶剂的气相色谱图；

图12为凝胶中交联剂DMSO残留量的检测的步骤⑨经过均质处理的消毒后的1号交联透明质酸钠凝胶的气相色谱图；

图13为实施例1筛分得到的第一种规格的凝胶匀质处理后的扫描电子显微照片。

具体实施方式

（实施例1）

本实施例所用试剂均为分析纯。

本实施例的高质量交联透明质酸钠凝胶的制备方法包括以下步骤：

①向20g的白色透明质酸钠干粉中加入500mL的由10wt%～20wt%（本实施例中为15wt%）的氢氧化钠水溶液和丙酮组成的混合溶液，或者向500mL的由15wt%的氢氧化钠水溶液和丙酮组成的混合溶液中加入20g白色透明质酸钠干粉；所述透明质酸钠的平均分子量为50万～160万道尔顿（本实施例中为150万道尔顿）；搅拌使透明质酸钠均匀分散后获得透明质酸钠碱性混悬液，即透明质酸钠部分溶解于氢氧化钠水溶液和丙酮组成的混合溶液中，还有部分以固态形式存在；然后向透明质酸钠碱性混悬液中加入11.1mL交联剂1,4-丁二醇二缩水甘油醚（BDDE），混匀后获得反应物料，从而开始发生生成交联透明质酸钠的反应。上述白色的透明质酸钠干粉的加入量控制在所述反应物料中，透明质酸钠的浓度为2wt%～5wt%。

在搅拌状态下将反应液于40℃保温5小时后反应结束，得到交联透明质酸钠。然后加入37wt%的浓盐酸调节反应后固液混合物料的pH值至7。

上述氢氧化钠水溶液和丙酮的混合溶液中氢氧化钠水溶液与丙酮的体积比为（2∶8）～（4∶6），本实施例中为3∶7。所述透明质酸钠（CAS号：9067-32-7）来自鸡冠或者由细菌发酵而得。

②将步骤①反应后pH=7的固液混合物料过滤以除去液体，剩余的物料中包括白色交联透明质酸钠粉末及透明的交联透明质酸钠凝胶，剩余物料用丙酮洗涤至气相色谱-质谱联用仪（GC-MS）检测BDDE含量低于2ppm；然后将洗涤后的物料真空干燥获得交联透明质酸钠粉末。所用气相色谱-质谱联用仪为日本岛津公司的QP-2010型号气相色谱-质谱联用仪。

③将步骤②真空干燥获得的交联透明质酸钠粉末过40目筛分离，收集过筛的粉末，未过筛的粉末由于其中可能包含具有粘性的杂质，弃之不用。

④将步骤③收集的过筛粉末用二甲基亚砜（以下简称DMSO）洗涤2～6次。

第一次洗涤时，向每30g过筛粉末中加入DMSO直至浸没过筛粉末，将过筛粉末与DMSO搅拌2～3小时后静置，粉末沉降后倒掉DMSO完成一次洗涤操作；向第一次洗涤后的粉末中倒入新鲜的DMSO直至浸没过筛粉末，开始第二次洗涤，第二次洗涤的操作与第一次相同。若还需进行第3至6次洗涤操作，则重复上述步骤。每30g过筛粉末的DMSO洗涤过程总共消耗1.5L～5L的DMSO。本实施例的过筛粉末用DMSO洗涤4次，第四次洗涤时粉末沉降后倒掉DMSO，粉末待进一步处理。

⑤将步骤④经DMSO洗涤后的粉末用无水乙醇洗涤2～6次。

第一次洗涤时，向每30g经DMSO洗涤后的粉末中加入无水乙醇直至浸没粉末，将粉末与乙醇搅拌1.5～2.5小时后静置，粉末沉降后倒掉无水乙醇完成一次洗涤操作，向第一次洗涤后的粉末中倒入新鲜的无水乙醇直至浸没过筛粉末，开始第二次洗涤，第二次洗涤的操作与第一次相同。若还需进行第3至6次洗涤操作，则重复上述步骤。每30g经DMSO洗涤后的粉末的洗涤过程总共消耗1.5L～5L的无水乙醇。本实施例的粉末用乙醇洗涤4次，第四次洗涤时粉末沉降后倒掉无水乙醇，无水乙醇洗涤后的粉末待处理。

⑥将步骤⑤经乙醇洗涤后的粉末真空干燥获得水不溶性白色干粉即交联透明质酸钠粉末。

⑦向步骤⑥真空干燥获得的交联透明质酸钠粉末中加入足量去离子水，交联透明质酸钠于室温25℃溶胀纯化8小时后，收集凝胶颗粒得到交联透明质酸钠凝胶，纯化过程中隔1至3小时更换去离子水。

加入去离子水后干粉吸水膨胀形成凝胶，去离子水的加入量应保证每次能完全没过干粉吸水溶胀后形成的凝胶。

⑧向步骤⑦收集的凝胶中加入3倍凝胶体积的等渗PBS缓冲液（每1000mL含有NaH₂PO₄·2H₂O90mg，Na₂HPO₄·12H₂O1.12g，NaCl17g，其余为水），于室温25℃纯化8小时后，除去PBS，收集凝胶；将经等渗PBS缓冲液纯化的凝胶先经200目的筛网筛分，收集筛网下方的凝胶得到凝胶颗粒的平均粒径为200μm～250μm的1号凝胶；将200目筛网上方的凝胶再经100目的筛网筛分，收集筛网下方的凝胶得到凝胶颗粒的平均粒径为240μm～280μm的2号凝胶，收集筛网上方的凝胶得到凝胶颗粒的平均粒径为310μm～360μm的3号凝胶。

⑨将步骤⑧收集的3份凝胶分别送入IKA公司的MP型T25数显型Ultra-turrax高速分散机中进行匀质微化处理。

匀质微化处理应用德国IKA的混合分散技术，为了达到更好的均质处理效果，增加使用剪切泵；处理时选用TM/2分散头，最高耐压16Bar（KD机械密封），最高耐温250℃。

将匀质微化处理后得到的3份凝胶分别于121℃高温消毒20分钟后，分别灌装于事先灭菌的一次性注射器中，从而获得3份不同规格的交联透明质酸钠凝胶。

为了了解制备的交联透明质酸钠凝胶的性质，按照以下方法对凝胶进行检测：

1、凝胶中透明质酸钠（SH）含量的检测。

取0.5g步骤⑨消毒后的凝胶颗粒的平均粒径为200μm～250μm的交联透明质酸钠凝胶，将其加入10mL0.5mol/L的硫酸溶液中，沸水浴水解15分钟后，向水解后的溶液中加水至体积为100mL。用咔唑法测定糖醛酸含量，然后乘系数2.07得2.05wt%，即为本实施例制备的凝胶中透明质酸钠的含量。

按照同样的方法检测凝胶颗粒的平均粒径为240μm～280μm和310μm～360μm的交联透明质酸钠凝胶，凝胶中透明质酸钠的含量均为2.05wt%。

2、收率检测。步骤⑨收集的3份凝胶中的SH的质量之和/反应前SH的质量，本实施例的收率为78%。

3、凝胶中凝胶颗粒的粒度检测。粒度检测使用英国Malvern公司的Mastersizer2000型粒度测定仪。

将步骤⑧收集的1号交联透明质酸钠凝胶0.1g送入粒度测定仪检测，凝胶颗粒的平均粒径为246μm。

将步骤⑨消毒后的1号交联透明质酸钠凝胶0.1g送入粒度测定仪检测，测得的粒度分布图见图1，其中与图1对应的粒度分布表中粒度8.934μm至2000μm之间的凝胶颗粒的分布见如下表1。

表1

由图1及表1可见，1号交联透明质酸钠凝胶的凝胶颗粒的粒径主要分布在50μm～500μm范围内，1号交联透明质酸钠凝胶的凝胶颗粒的平均粒径为205.737μm。

进一步将步骤⑨消毒后的1号交联透明质酸钠凝胶送入荷兰飞利浦公司的PhenomG2Pure扫描电子显微镜中进行检测，其扫描电子显微照片见图13。

由于经过匀质处理，凝胶颗粒的粒径大小分布更窄，粒径分布图峰形狭窄形态美观。

将步骤⑧收集的2号交联透明质酸钠凝胶0.1g送入粒度测定仪检测，凝胶颗粒的平均粒径为264μm。

将步骤⑨消毒后的2号交联透明质酸钠凝胶0.1g送入粒度测定仪检测，测得的粒度分布图见图2，其中与图2对应的粒度分布表中粒度8.934μm至1415.892μm之间的凝胶颗粒的分布见如下表2。

由图2及表2可见，2号交联透明质酸钠凝胶的凝胶颗粒的粒径分布在60μm～550μm范围内，2号交联透明质酸钠凝胶的凝胶颗粒的平均粒径为255μm。

表2

表2

将步骤⑧收集的3号交联透明质酸钠凝胶0.1g送入粒度测定仪检测，凝胶颗粒的平均粒径为350μm。

将步骤⑨消毒后的3号交联透明质酸钠凝胶0.1g送入粒度测定仪检测，测得的粒度分布图见图3，其中与图3对应的粒度分布表中粒度8.934μm至2000μm之间的凝胶颗粒的分布见如下表3。

表3

由图3及表3可见，3号交联透明质酸钠凝胶的凝胶颗粒的粒径分布在100μm～800μm范围内，3号交联透明质酸钠凝胶的凝胶颗粒的平均粒径为329μm。

4、体外细胞毒性检测。根据GB/T16886国家标准，交联透明质酸钠作为国家三类医疗器械进行体外细胞毒性测试。

先将待测交联透明质酸钠与RPMI1640培养液按0.2g/mL混合，置于37℃，5%二氧化碳孵箱中浸提72小时，用0.22μm微孔滤膜过滤除菌，得到浸提液。

然后将1*105个/mL的L929细胞悬浮液接种于96孔细胞培养板，置于37℃二氧化碳培养箱中培养24小时；待细胞贴壁生长后，去除上清液，分成空白对照组和实验组两组，对照组加入RPMI1640培养液，实验组用含50%上述浸提液的RPMI1640培养液进行交换。分别置于37℃二氧化碳培养箱中继续培养，于2天后取出，培养板每孔加入MTT溶液（5mg/mL）20μL，于37℃继续培养4小时，终止培养。小心吸弃孔内培养上清液，每孔加入200μLDMSO，振荡10分钟混匀后，用酶联免疫检测仪在630nm下分别测定其吸光度值。

根据下面的公式计算细胞相对增值率（RCR），RCR（%）=（实验组平均吸光度值/空白对照组平均吸光度值）*100%。

细胞相对增值率与细胞毒性分级关系如下：RCR不小于100%，细胞毒性分级为0级；RCR为75-99%，细胞毒性分级为1级；RCR为50-74%,细胞毒性分级为2级；RCR为25-49%，细胞毒性分级为3级；RCR为1-24%，细胞毒性分级为4级；RCR为0%,细胞毒性分级为5级。

本实施例步骤⑨消毒后的1号交联透明质酸钠凝胶按照上述方法，RCR为85%，细胞毒性低。

本实施例步骤⑨消毒后的2号交联透明质酸钠凝胶按照上述方法，RCR为85%，细胞毒性低。

本实施例步骤⑨消毒后的3号交联透明质酸钠凝胶按照上述方法，RCR为85%，细胞毒性低。

5、耐酶性检测。取0.5g待测交联透明质酸钠凝胶，向其加入1.25mL浓度为10U/mL的透明质酸酶溶液后加pH为7.2的PBS至体积为2.5mL，于37℃酶解24小时；用离心机以10000rpm离心40分钟，取上清液，按照上述离心方法再离心分离两次，每次都取上清液，合并上清液。采用改良咔陛显色法（参考文献：Bitter.T，MuirH.M，(1962)Amodifieduronicacidcarbarbazolereation.Anal.Biochem.4,330-333.）测定糖醛酸含量，乘以2.07后折算为透明质酸钠含量，作为a值，以凝胶中透明质酸钠含量c即2.05%为b值，计算a/b。

本实施例步骤⑨消毒后的1号交联透明质酸钠凝胶按照上述方法，a/b=0.23。

本实施例步骤⑨消毒后的2号交联透明质酸钠凝胶按照上述方法，a/b=0.21。

本实施例步骤⑨消毒后的3号交联透明质酸钠凝胶按照上述方法，a/b=0.15。

6、凝胶中重金属含量的检测。参考中国药典2005版二部附录的方法，取凝胶1g，在60℃烘干，炽灼至炭化后，加0.5mL硫酸加热蒸干，再加0.5mL硝酸加热蒸干，在500℃～600℃加热使灰化；然后加2mL盐酸，水浴蒸干后，加15mL蒸馏水，用4%的氨水调为中性，加2mLpH为3.5的醋酸盐缓冲液，溶解后稀释成25mL；同时对照品取上述所用试剂蒸干后，加等量醋酸缓冲液和蒸馏水，加适量标准铅试液，稀释成25mL，此时铅含量为10ppm；分别加入硫代乙酰胺试液显色后进行比较检查。

本实施例步骤⑨消毒后的1号交联透明质酸钠凝胶按照上述方法，凝胶的重金属含量小于10ppm。

本实施例步骤⑨消毒后的2号交联透明质酸钠凝胶按照上述方法，凝胶的重金属含量小于10ppm。

本实施例步骤⑨消毒后的3号交联透明质酸钠凝胶按照上述方法，凝胶的重金属含量小于10ppm。

7、凝胶流变学指标的检测。

待测交联透明质酸钠凝胶的流变学指标的检测采用英国MalvernCVO100动态剪切流变仪DSR。

设定测量温度为25，剪切模式为控制应变，扫描类型为按步扫描，延迟时间5s，最小频率0.010Hz，最大频率10.000Hz，稳态剪切速率0.0001/s；压力模式为应变模态，目标应变为0.020Pa。

1）步骤⑨经过均质处理的消毒后的1号交联透明质酸钠凝胶的流变学指标见下表4和表5。

表4和表5中第一行的英文名词对应的中文如下：Time—时间，Temperature—温度，Frequency—频率，PhaseAngle—相角，ComplexModulus—复数模量，ElasticModulus—弹性模量，ViscousModulus—粘性模量，ComplexViscosity—复数粘度，ShearStress—剪切应力，Strain—应变。

步骤⑨经过均质处理的消毒后的1号交联透明质酸钠凝胶的粘弹性曲线图见图4，图2中G’为弹性模量，G’’为粘性模量.，δ为相角。

表4

表5

由表4、表5及图4可知，设定测量温度为25，扫描频率从0.01Hz到10Hz，振荡频率为0.01Hz时，交联透明质酸钠凝胶的复数粘度值为2883.5Pa·s，振荡频率为10Hz时，交联透明质酸钠凝胶的复数粘度值为7.0649Pa·s。

另外，步骤⑨经过均质处理的消毒后的1号交联透明质酸钠凝胶在25℃，剪切速率为0.0001s^-1时，凝胶的动力粘度为46160mPa·s。

2）作为对比的，步骤⑧收集的1号交联透明质酸钠凝胶（即凝胶未经过匀质处理）按照上述检测仪器和参数设置，在25℃，剪切速率为0.0001s^-1时，凝胶的动力粘度为117678mPa·s。

未经过匀质处理的1号交联透明质酸钠凝胶的粘弹性曲线图见图5，具体的流变学指标见下表6和表7。

表6

表7

由表6、表7及图5可知，设定测量温度为25，扫描频率从0.01Hz到10Hz，振荡频率为0.01Hz时，未匀质处理的1号交联透明质酸钠凝胶的复数粘度值为5705.6Pa·s，振荡频率为10Hz时，交联透明质酸钠凝胶的复数粘度值为14.667Pa·s。

3）步骤⑨经过均质处理的消毒后的2号交联透明质酸钠凝胶的流变学指标见下表8和表9。

步骤⑨经过均质处理的消毒后的2号交联透明质酸钠凝胶的粘弹性曲线图见图6，图6中G’为弹性模量，G’’为粘性模量.，δ为相角。

表8

表9

由表8、表9及图6可知，设定测量温度为25，扫描频率从0.01Hz到10Hz，振荡频率为0.01Hz时，交联透明质酸钠凝胶的复数粘度值为2304.2Pa·s，振荡频率为10Hz时，交联透明质酸钠凝胶的复数粘度值为8.0942Pa·s。

另外，步骤⑨经过均质处理的消毒后的1号交联透明质酸钠凝胶在25℃，剪切速率为0.0001s^-1时，凝胶的动力粘度为63868mPa·s。

4）作为对比的，步骤⑧收集的2号交联透明质酸钠凝胶（即凝胶未经过匀质处理）按照上述检测仪器和参数设置，在25℃，剪切速率为0.0001s^-1时，凝胶的动力粘度为162859mPa·s。

未经过匀质处理的2号交联透明质酸钠凝胶的粘弹性曲线图见图7，具体的流变学指标见下表10和表11。

表10

表11

由表10、表11及图7可知，设定测量温度为25，扫描频率从0.01Hz到10Hz，振荡频率为0.01Hz时，未匀质处理的2号交联透明质酸钠凝胶的复数粘度值为2355.4Pa·s，振荡频率为10Hz时，交联透明质酸钠凝胶的复数粘度值为13.762Pa·s。

5）步骤⑨经过均质处理的消毒后的3号交联透明质酸钠凝胶的流变学指标见下表12和表13。

步骤⑨经过均质处理的消毒后的3号交联透明质酸钠凝胶的粘弹性曲线图见图8，图8中G’为弹性模量，G’’为粘性模量.，δ为相角。

表12

表13

由表12、表13及图8可知，设定测量温度为25，扫描频率从0.01Hz到10Hz，振荡频率为0.01Hz时，3号交联透明质酸钠凝胶的复数粘度值为772.48Pa·s，振荡频率为10Hz时，交联透明质酸钠凝胶的复数粘度值为3.3303Pa·s。

另外，步骤⑨经过均质处理的消毒后的3号交联透明质酸钠凝胶在25℃，剪切速率为0.0001s^-1时，凝胶的动力粘度为37381mPa·s。

6）作为对比的，步骤⑧收集的3号交联透明质酸钠凝胶（即凝胶未经过匀质处理）按照上述检测仪器和参数设置，在25℃，剪切速率为0.0001s^-1时，凝胶的动力粘度为79801mPa·s。

未经过匀质处理的3号交联透明质酸钠凝胶的粘弹性曲线图见图9，设定测量温度为25，扫描频率从0.01Hz到10Hz，振荡频率为0.01Hz时，未匀质处理的3号交联透明质酸钠凝胶的复数粘度值为1291.6Pa·s，振荡频率为10Hz时，交联透明质酸钠凝胶的复数粘度值为4.4704Pa·s。

8、凝胶中交联剂DMSO残留量的检测。

采用毛细管气相色谱法测定交联透明质酸钠凝胶中DMSO的残留量，具体包括以下步骤：

①对照品溶液的制备。用电子天平称取二甲基亚砜53.57mg，用无水乙醇溶解并定量稀释制成1mL中含二甲基亚砜1.0714mg的溶液，作为对照品储备液。用移液管量取对照品储备液0.2mL至10mL量瓶中，加入无水乙醇稀释至刻度作为对照品溶液。

②供试品溶液的制备。

用电子天平称取待测凝胶1.0g，转移至5mL量瓶中，加入无水乙醇并稀释至刻度，漩涡混合器混合，凝胶变成絮状沉淀，然后再超声20分钟，取上清液，用0.45μm针头过滤器过滤后作为供试品溶液。

③系统适应性试验。

色谱条件：色谱柱：SE-30毛细管柱（50m×0.53mm×3.0μm）；柱流速：4mL/min，载气：氮气；柱温：150℃；进样口温度：210℃；FID检测器温度：230℃；进样量：1μL。

取DMSO对照品溶液，在上述色谱条件下进样，DMSO对照品溶液的气相色谱图见图10，其中4至5之间出现的峰即为DMSO的色谱峰（空白溶剂的气相色谱图见图11）；DMSO的理论塔板数为32437，空白溶剂污水乙醇对测定无干扰。

④重现性试验。将DMSO对照品溶液在系统适应性试验的色谱条件下进样测定6次，DMSO峰面积的RSD为2.2%（n=6）。

⑤线性关系考察。

用移液管量取对照品溶液0.02、0.04、0.06、0.08、0.1、0.2、1.0mL，分别转移至10mL量瓶中，加入无水乙醇稀释至刻度，DMSO的浓度分别为2.1428、4.2856、6.4284、8.5712、10.714、21.428、107.140μg/mL，连同对照品溶液（DMSO浓度1071.4μg/mL），在系统适应性试验的色谱条件下进行测定，记录色谱图，以色谱峰面积（Y）对浓度（X）进行线性回归，得DMSO的线性回归方程为：Y=4919.1X-6413.1（r=1）。DMSO在2.1428～1071.4μg/mL浓度范围内线性关系良好。

⑥定量限与检测限。逐步稀释对照品溶液，在系统适应性试验的色谱条件下进样，当信噪比为10∶1时，定量限为0.5μg/mL；当信噪比为3∶1时，检测限为0.2μg/mL。

⑦DMSO回收率实验。取9份待测凝胶，每份1.0g，分别转移至5mL量瓶中；向其中3个量瓶中分别加入对照品溶液0.8mL，向其中3个量瓶中分别加入对照品溶液1.0mL，向其中3个量瓶中分别加入对照品溶液1.2mL；然后分别用无水乙醇稀释至刻度，漩涡混合器混合后超声20分钟，取上清液，用0.45μm针头过滤器过滤，作为回收率供试品溶液。分别取对照品溶液与回收率供试品溶液，在上述色谱条件下以外标法进行测定，结果平均回收率为100.99%，RSD为4.1%（n=9）。

具体数据如下：

交联透明质酸钠凝胶在水中不溶，但在无水乙醇中能完全析出。无水乙醇不会溶解样品，但能完全溶解DMSO，所以采用无水乙醇作为溶剂。为了更好的将待测凝胶中可能存在的DMSO溶出，采用了无水乙醇与待测凝胶样品漩涡混合并超声的处理方式。用上述检测方法DMSO与凝胶能得到很好的分离，峰面积与质量浓度线性关系良好，回收率良好，因此上述检测方法可用于交联透明质酸钠凝胶中DMSO残留量的检测。

⑧取步骤⑨经过均质处理的消毒后的1号交联透明质酸钠凝胶，按照步骤②制备成供试品，按照系统适应性试验的色谱条件下进样检测，气相色谱图见图12，步骤⑨经过均质处理的消毒后的1号交联透明质酸钠凝胶中未检出DMSO。

取步骤⑨经过均质处理的消毒后的2号交联透明质酸钠凝胶，按照步骤②制备成供试品，按照系统适应性试验的色谱条件下进样检测，步骤⑨经过均质处理的消毒后的2号交联透明质酸钠凝胶中未检出DMSO。

步骤⑨经过均质处理的消毒后的3号交联透明质酸钠凝胶，按照步骤②制备成供试品，按照系统适应性试验的色谱条件下进样检测，步骤⑨经过均质处理的消毒后的3号交联透明质酸钠凝胶中未检出DMSO。

9、凝胶中蛋白质含量的检测。

作为对比的，步骤③收集的过筛粉末中加入去离子水，使得交联透明质酸钠粉末充分溶胀，在室温15℃～35℃纯化8小时后，收集凝胶颗粒得到交联透明质酸钠凝胶；然后向凝胶中加入3倍凝胶体积的等渗PBS缓冲液，于室温25℃纯化8小时后，过滤除去PBS，收集凝胶；将凝胶依次用交联透明钠凝胶制备方法的步骤⑧的第一种规格和第二种规格的筛网分筛而获得3份不同平均粒径的凝胶，分别作为1^*、2^*、3^*号凝胶。

凝胶中蛋白质浓度的检测方法采用《YY0308-2004医用透明质酸钠凝胶》标准中的福林-酚试剂法。

步骤⑨经过均质处理的消毒后的1号交联透明质酸钠凝胶经检测，蛋白质含量为0.005%。1^*号凝胶的蛋白质含量为0.20%。

步骤⑨经过均质处理的消毒后的2号交联透明质酸钠凝胶经检测，蛋白质含量为0.005%。2^*号凝胶的蛋白质含量为0.20%。

步骤⑨经过均质处理的消毒后的3号交联透明质酸钠凝胶经检测，蛋白质含量为0.005%。3^*号凝胶的蛋白质含量为0.20%。

由此证明经过DMSO洗涤，所制得的凝胶中的杂质“假蛋白”基本被清洗掉，所制得的凝胶质量更高。

Claims (8)

1.一种交联透明质酸钠凝胶的的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

①将透明质酸钠干粉分散在由10wt%～20wt%的氢氧化钠水溶液和丙酮组成的混合溶液后获得透明质酸钠碱性混悬液，然后向透明质酸钠碱性混悬液中加入交联剂1,4-丁二醇二缩水甘油醚BDDE，混匀后获得反应物料，从而开始发生生成交联透明质酸钠的反应；搅拌状态下将反应物料于35℃～50℃保温5～8小时后反应结束，用浓盐酸调节反应后固液混合物料的pH值至7；其中所述反应物料中透明质酸钠的浓度为2wt%～5wt%，交联剂与透明质酸钠的质量比为（1∶1.3）～（1∶1.8）；

②将步骤①反应后的pH=7的固液混合物料过滤以除去液体，剩余的物料用丙酮洗涤至GC-MS检测BDDE含量低于2ppm，然后将洗涤后的物料真空干燥获得水不溶性白色干粉即交联透明质酸钠粉末；

③将步骤②真空干燥获得的交联透明质酸钠粉末过筛分离，收集过筛的粉末；

④将步骤③收集的过筛粉末用二甲基亚砜洗涤2～6次；

⑤将步骤④经二甲基亚砜洗涤后的粉末用乙醇洗涤2～6次；

⑥将步骤⑤经乙醇洗涤后的粉末真空干燥获得水不溶性白色干粉即交联透明质酸钠粉末；

⑦向步骤⑥真空干燥获得的交联透明质酸钠粉末中加入去离子水，使得交联透明质酸钠粉末充分溶胀，在室温15℃～35℃纯化6～10小时后，收集凝胶颗粒得到交联透明质酸钠凝胶；

⑧向步骤⑦收集的凝胶中分别加入等渗PBS缓冲液，于室温15℃～35℃纯化6～10小时后，过滤除去PBS，收集凝胶；将凝胶依次用第一种规格和第二种规格的筛网分筛而获得3份不同平均粒径的凝胶；

⑨将步骤⑧收集的3份凝胶分别送入高速分散机中进行匀质微化处理，获得3份不同规格的交联透明质酸钠凝胶。

2.根据权利要求1所述的交联透明质酸钠凝胶的的制备方法，其特征在于：步骤④用二甲基亚砜洗涤时，第一次洗涤时，向每30g过筛粉末中加入二甲基亚砜直至浸没过筛粉末，将过筛粉末与二甲基亚砜搅拌2～3小时后静置，粉末沉降后倒掉二甲基亚砜完成一次洗涤操作；向第一次洗涤后的粉末中倒入新鲜的二甲基亚砜直至浸没过筛粉末，开始第二次洗涤，第二次洗涤的操作与第一次相同；若还需进行第3至6次洗涤操作，第3至第6次的洗涤操作同第一次。

3.根据权利要求2所述的交联透明质酸钠凝胶的的制备方法，其特征在于：步骤④每30g过筛粉末的二甲基亚砜洗涤过程总共消耗1.5L～5L的二甲基亚砜。

4.根据权利要求1所述的交联透明质酸钠凝胶的的制备方法，其特征在于：步骤⑤用乙醇洗涤时，第一次洗涤时，向每30g经二甲基亚砜洗涤后的粉末中加入无水乙醇直至浸没粉末，将粉末与无水乙醇搅拌1.5～2.5小时后静置，粉末沉降后倒掉乙醇完成一次洗涤操作；后续第2次至第6次的洗涤操作同第一次。

5.根据权利要求4所述的交联透明质酸钠凝胶的的制备方法，其特征在于：步骤⑤每30g经二甲基亚砜洗涤后的粉末的洗涤过程总共消耗1.5L～5L的无水乙醇。

6.一种如权利要求1所述的交联透明质酸钠凝胶的的制备方法所制备的交联透明质酸钠凝胶。

7.根据权利要求6所述的交联透明质酸钠凝胶，其特征在于：凝胶中交联剂BDDE的含量低于2ppm；凝胶中二甲基亚砜的含量低于0.2ppm；凝胶中蛋白质浓度低于0.1%。

8.根据权利要求7所述的交联透明质酸钠凝胶，其特征在于：凝胶中二甲基亚砜的残留量的检测采用毛细管气相色谱法测定。