CN102226009B - 一种交联透明质酸凝胶的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种交联透明质酸凝胶及其制备方法。该方法特征在于二乙烯基砜先与聚乙二醇结合成新的交联剂，再与透明质酸分子发生反应而成交联透明质酸凝胶。该方法制备得到的交联透明质酸钠凝胶具有良好的生物相容性及较长的半衰期，且颗粒细小均匀，适合整形美容，组织填充，骨关节润滑或药物缓释制剂等。
Description
技术领域
本发明属于药学领域，涉及一种交联透明质酸凝胶及其制备方法。
背景技术
透明质酸(Hyaluronic acid、简称HA)来源于动物组织或是微生物发酵，广泛应用于食品、日化和医药领域。HA在溶液中的无规则卷曲状态和它的流体动力学特点赋予HA高度粘弹性、可塑性、渗透性、独特的流变学特性以及良好的生物相溶性，是一种生物可吸收材料，由于其本身就是人和动物体的组成成分，作为医药原料不仅安全可靠，还没有任何副作用，因此是在当今医学界深受欢迎的新型生物医学材料，具有很高的医用价值。但由于它在体内很快被扩散和降解，难以维持理想效果，很大程度上限制了其在某些领域的应用。
近年来，HA经修饰或交联后获得了一些毒性小、生物相容性好的抗降解产物，陆续被开发为多种医药产品。常用的交联剂为戊二醛(GTA)、双环氧化物(DEC)、二乙烯基砜(DVS)、和1，4-丁二醇缩水甘油醚(BDDE)等，这些交联剂形成的交联透明质酸钠凝胶，在施与生物体时，残留的交联剂容易引起体内炎症反应，用常规方法减少交联剂使用量，得到的交联透明质酸凝胶粘弹性降低，不柔软，作为组织填充物时填充效果不理想或者作为药物缓释制剂时维持效果时间不理想。聚乙二醇(PEG)为毒性非常小的线性分子，对HA来说是一种新型交联剂。PEG无抗原性，具有良好的具有水溶性和良好的两亲性，还具有免疫学惰性和分子大小可变性，其生物相容性已经得到FDA认证。PEG有不同种类，可通过调控其分子量及不同的PEG活化形式，使产物形成很大的溶解度范围，以满足各种需要。本发明采用二乙烯基砜活化聚乙二醇成新的交联剂，与HA交联得到透明质酸凝胶，提高了交联剂的安全性，有效解决了交联剂的使用问题。
发明内容
本发明的目的是提供一种交联透明质酸凝胶及其制备方法，以克服现有技术存在的上述缺陷。
本发明的方法包括如下步骤：
(1)将聚乙二醇在碱性物质溶液中，加热回流0.5小时，冷却至室温，制成聚乙二醇碱性溶液；
所说的聚乙二醇为二乙二醇、三乙二醇和聚乙二醇200～20000中的一种；
所说的碱性物质溶液为NaOH水溶液、KOH水溶液或Na2CO3水溶液中的一种，浓度为0.001～2.0M，优选为0.02M。
(2)将二乙烯基砜加入步骤(1)的聚乙二醇碱性溶液中，然后将溶液升温至35℃引发反应，5分钟后置于冰浴中使温度不高于60℃，停止放热后再加热至80℃反应5分钟，冷却至室温，加水溶解得到交联剂的水溶液；
反应方程式为：
所说的交联剂的水溶液浓度为0.02～0.2g/ml；
所说的交联剂为聚乙二醇活化后的产物聚醚乙烯基砜与少量残留的二乙烯基砜的混合物；
(3)将透明质酸干粉溶于氢氧化钠溶液，加入步骤(2)的产物中，室温搅拌2～3小时，形成交联的透明质酸凝胶；
所说的透明质酸碱溶液浓度为4％(w/v)。
(4)随后在步骤(3)的产物中加入pH为6.5～7.5的PBS缓冲溶液或生理盐水，浸泡至凝胶透明均质；
(5)除去PBS缓冲液或生理盐水，然后将凝胶在一定压力下通过0.22μm的滤膜，挤出成微粒状凝胶。
交联透明质酸凝胶分子结构主要为：
其中：n，x，y为整数；
本发明中，交联剂的使用量没有特别限制，但考虑到交联透明质酸凝胶的生物体适应性，优先选用尽可能少量的交联剂进行交联反应，交联剂在混合物中的浓度优选为0.005～0.2g/ml；
所说的聚乙二醇可以采用市售产品；
所说的透明质酸是由N-己酰氨基葡萄糖及D-葡萄糖醛酸的重复结构组成的线形多糖结构，包括透明质酸钠、透明质酸镁或透明质酸钙等；
所说的透明质酸的分子量为5万～300万道尔顿，优选为30万～100万道尔顿。
本发明中，透明质酸原料选用细菌发酵法生产或组织提取的均可，为降低抗原性，优先选用细菌发酵法原料；
交联HA的制备原理是使用一种或多种组合的化学交联剂，使透明质酸链之间部分交联，分子链之间被相互立体的束缚，分子量和分子体积显著增大，形成连续稳固的网状结构，在水中可溶胀但不再溶解，同时也保留了天然透明质酸的生物相容性、可降解性和生物活性等特性。
本发明采用二乙烯基砜活化聚乙二醇后的产物作为交联剂，每一个聚醚乙烯基砜含有两个乙烯基，后者可以与透明质酸上的羟基发生反应，形成醚键。同时，少量残留的二乙烯基砜也可参与交联反应，使透明质酸凝胶很容易达到无毒要求。此方法制备的交联透明质酸凝胶，与透明质酸相比，分子量更高、稳定性更好，体内保留时间更长，拓宽了透明质酸的用途和应用效果。
本发明的优点是：
(1)增大透明质酸分子量，增加粘弹性；
(2)降低了交联剂的毒性，提高交联率，延长了凝胶的半衰期；
(3)增强透明质酸的稳定性，交联透明质酸凝胶在酸性或碱性条件下稳定，并且耐高温；
(4)凝胶中引入聚乙二醇，拓宽了交联透明质酸的应用范围；
(5)无毒和无抗原性，交联透明质酸凝胶最终产品为微粒凝胶制剂，适合注射入体内。
具体实施方式
以下给出本发明的实施例对本发明作进一步说明，但本发明并不限于此。
实施例1
将0.22g二乙二醇加入到4ml 0.02M NaOH水溶液中，加热回流0.5h，制成二乙二醇碱溶液，冷却至室温；
将0.05g二乙烯基砜加入聚乙二醇碱溶液中，然后将溶液升温至35℃引发反应，用冰浴冷却使温度保持在60℃左右，停止放热后再加热至80℃反应5分钟，冷却至室温，得到粘稠状产物，加10ml水溶解；
将1g分子量为100万透明质酸钠干粉加入25ml 0.2M NaOH水溶液中，搅拌溶解后加到上述产物中，室温搅拌2～3小时形成交联透明质酸钠凝胶；
随后加入160ml PBS缓冲溶液(pH7.0)中溶胀24或48h，去掉缓冲液，用生理盐水冲洗并浸泡至凝胶透明均质；
然后将凝胶在一定压力下通过0.22μm的滤膜，挤出成微粒状凝胶。
实施例2
将1.64g聚乙二醇400加入到4ml 0.02M NaOH水溶液中，加热回流0.5h，制成聚乙二醇碱溶液，冷却至室温；
将0.05g二乙烯基砜加入聚乙二醇碱溶液中，然后将溶液升温至35℃引发反应，用冰浴冷却使温度保持在60℃左右，停止放热后再加热至80℃反应5分钟，冷却至室温，得到粘稠状产物，加20ml水溶解；
将1g分子量为100万透明质酸钠干粉加入25ml 0.2M NaOH水溶液中，搅拌溶解后加到上述产物中，室温搅拌2～3小时形成交联透明质酸钠凝胶；
随后加入160ml PBS缓冲溶液(pH7.0)中溶胀24或48h，去掉缓冲液，用生理盐水冲洗并浸泡至凝胶透明均质；
然后将凝胶在一定压力下通过0.22μm的滤膜，挤出成微粒状凝胶。
实施例3
将2.52g聚乙二醇600加入到4ml 0.02M NaOH水溶液中，加热回流0.5h，制成聚乙二醇碱溶液，冷却至室温；
将0.05g二乙烯基砜加入聚乙二醇碱溶液中，然后将溶液升温至35℃引发反应，用冰浴冷却使温度保持在60℃左右，停止放热后再加热至80℃反应5分钟，冷却至室温，得到粘稠状产物，加25ml水溶解；
将1g分子量为30万透明质酸钠干粉加入25ml 0.2M NaOH水溶液中，搅拌溶解后加到上述产物中，室温搅拌2～3小时形成交联透明质酸钠凝胶；
随后加入160ml PBS缓冲溶液(pH7.0)中溶胀24或48h，去掉缓冲液，用生理盐水冲洗并浸泡至凝胶透明均质；
然后将凝胶在一定压力下通过0.2μm的滤膜，挤出成微粒状凝胶。
实施例4
将3.28g聚乙二醇400加入到8ml 0.02M NaOH水溶液中，加热回流0.5h，制成聚乙二醇碱溶液，冷却至室温；
将0.1g二乙烯基砜加入聚乙二醇碱溶液中，然后将溶液升温至35℃引发反应，用冰浴冷却使温度保持在60℃左右，停止放热后再加热至80℃反应5分钟，冷却至室温，得到粘稠状产物，加30ml水溶解；
将1g分子量为30万透明质酸钠干粉加入25ml 0.2M NaOH水溶液中，搅拌溶解后加到上述产物中，室温搅拌2～3小时形成交联透明质酸钠凝胶；
随后加入160ml PBS缓冲溶液(pH7.0)中溶胀24或48h，去掉缓冲液，用生理盐水冲洗并浸泡至凝胶透明均质；
然后将凝胶在一定压力下通过0.22μm的滤膜，挤出成微粒状凝胶。
实施例5
将2.12g聚乙二醇20000加入到4ml 0.02M NaOH水溶液中，加热回流0.5h，制成聚乙二醇碱溶液，冷却至室温；
将0.025g二乙烯基砜加入聚乙二醇碱溶液中，然后将溶液升温至35℃引发反应，用冰浴冷却使温度保持在60℃左右，停止放热后再加热至80℃反应5分钟，冷却至室温，得到粘稠状产物，加30ml水溶解；
将1g分子量为30万透明质酸钠干粉加入25ml 0.2M NaOH水溶液中，搅拌溶解后加到上述产物中，室温搅拌2～3小时形成交联透明质酸钠凝胶；
随后加入160ml PBS缓冲溶液(pH7.0)中溶胀24或48h，去掉缓冲液，用生理盐水冲洗并浸泡至凝胶透明均质；
然后将凝胶在一定压力下通过0.22μm的滤膜，挤出成微粒状凝胶。
Claims (8)
1.一种交联透明质酸凝胶的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）将聚乙二醇在碱性物质溶液中，加热回流0.5小时，制成聚乙二醇碱性溶液，冷却至室温；
所说的聚乙二醇为二乙二醇、三乙二醇和聚乙二醇200~20000中的一种；
（2）将二乙烯基砜加入步骤（1）的聚乙二醇碱性溶液中，然后将溶液升温至35℃引发反应，然后用冰浴冷却使温度不高于60℃，停止放热后再加热至80℃反应5分钟，冷却至室温，加水溶解得到交联剂的水溶液；
（3）将透明质酸的氢氧化钠水溶液加入步骤（2）的产物中，室温搅拌2~3小时；
（4）随后在步骤（3）的产物中加入pH为6.5~7.5的PBS缓冲溶液或生理盐水，浸泡至凝胶透明均质；
（5）除去PBS缓冲液或生理盐水，然后将凝胶在一定压力下通过0.22μm的滤膜，挤出形成微粒状凝胶。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所说的透明质酸的分子量为5万~300万道尔顿。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所说的碱性物质溶液为NaOH水溶液、KOH水溶液或Na2CO3水溶液中的一种，浓度为0.001~2.0M。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所说的交联剂为聚醚二乙烯基砜与未反应的聚乙二醇与二乙烯基砜的混合物。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所说的透明质酸的氢氧化钠水溶液浓度为4%（w/v）。
6.根据权利要求1~5任一项所述的方法，其特征在于，所述的原料透明质酸干粉为商品化产品，其工艺来自于动物组织提取，或来自于细菌发酵生产。
7.根据权利要求1~5任一项所述的方法，其特征在于，透明质酸为透明质酸钠、透明质酸镁或透明质酸钙。
8.根据权利要求1~5任一项所述方法制备的交联透明质酸凝胶。
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