CN108697805B - 包含核酸及壳聚糖的温敏性水凝胶组合物 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种包含核酸及壳聚糖的温敏性水凝胶组合物。所述水凝胶具有优异的生物相容性和生物稳定性，同时具有基于温度变化的溶胶‑凝胶相变(phase transition)性质，在常温下以溶胶状态存在，而当被注入于人体内或涂抹于表皮皮肤表面使，随着温度上升而凝胶化。因此，本发明的温敏性水凝胶可以直接注入及涂抹于需要治疗的特定部位，通过基于温度的凝胶化来提高药物的滞留和附着时间，从而能够使药效得到充分发挥，期待能够应用于多种治疗中。

Description

包含核酸及壳聚糖的温敏性水凝胶组合物
技术领域
本发明涉及一种包含核酸及壳聚糖的温敏性水凝胶组合物。
背景技术
水凝胶(hydrogel)是指，具有含水相的三维网状结构的高分子结构体(RohindraD.R.et al.,2004)，通过在亲水性高分子之间构成共价键或非共价键来形成(HwangJunseok et al.,2008)。由于由多种亲水性高分子构成的水凝胶具有高含水量，生物相容性(biocompatibility)优异，因此进行了许多作为生物材料应用的研究。尤其对pH值、温度、电场、磁场、光、超声波等刺激(stimuli)敏感的水凝胶，能够用于根据是否存在刺激来控制释放的药物递送系统中(Hoffman A.S.,2002)。
其中，就温敏性水凝胶最而言，在组织再生细胞传递体和药物传递系统中研究得最为广泛。这是因为许多高分子表现出温度转变特性，若导入能够将普通高分子溶解或溶胀于水的亲水基团，则该高分子通过水溶解或溶胀，水溶性随着温度的升高而增加，但由亲水性部分和甲基、乙基和丙基等疏水性部分构成的高分子具有随温度升高而水溶性降低的低临界溶解温度(lower critical solution temperature，LCST)，当温度升高时凝结而形成凝胶(Ward M.A.et al.,2011)。即，由亲水性部分和疏水性部分构成的高分子在低温下，因高分子的亲水基团与水分子之间的氢键结合力处于优势，溶于水成为溶胶(sol)状态，但温度升高时，高分子的疏水基团部分的结合力优于氢键结合力，高分子的疏水基团部分凝聚，成为凝胶(gel)状态，产生相变(phase transition)。
在这样的高分子溶液在常温下为流体等溶胶状态的情况下，通过简单的混合过程，能够进行药物的混合，当施加人体温度以上的热的情况下，形成凝胶，而能够实现药物的持续释放(sustained release)。但这种高分子用于人体内后，通过新陈代谢必须排出到体外。因此，就用于医疗或人体的温敏性水凝胶应而言，具备生物相容性(biocompatibility)和生物降解性(biodegradability)性质尤为重要。
从至今为止研究的温敏性水凝胶组合物的含量比可知，就通过疏水性-亲水性键合来体现温敏性的水凝胶而言，组合物的反应浓度高。反应浓度高不仅意味着向人体注入水凝胶时可能会对人体产生影响，而且还可能会影响人体内的降解速率。因此，开发在低浓度下也能够表现出温敏性的水凝胶，能够有助于开发更安全的生物相容性物质。
构成水凝胶的高分子有壳聚糖(chitosan)(Berger J.et al.,2004)、海藻酸盐(alginate)(Augst A.D.et al.,2006)、葡聚糖(dextran)、透明质酸(hyaluronic acid)、明胶(gelatin)、胶原蛋白(collagen)等天然高分子和聚乙烯醇(poly(vinylalcohol))(Bodugoz-Senturk H.,et al.,2009)、聚乙烯亚胺(polyethyleneimine)(Jin R.H.etal.,2005)、聚乙二醇(poly(ethylene glycol))(Mahoney M.J.et al.,2006)等合成高分子。
壳聚糖(chitosan)能够通过使天然多糖的几丁质去乙酰化(deacetylation)来制得，几丁质呈N-乙酰-D-氨基葡萄糖(N-acetyl-D-glucosamine)与β-(1→4)键合的状态，并且可从螃蟹、普通虾、龙虾等甲壳类、墨鱼等软体类、昆虫类及细菌的细胞壁等中获得。由于壳聚糖易溶于无机酸水溶液，因此应用于污水处理用凝集剂、重金属吸附剂、食品及化妆品等多种领域。另外，据报道壳聚糖作为从天然物中获得的多糖，不仅生物相容性和生物降解性优异，还具有细胞结合及生物组织培养、抗菌性、芳香性、无毒性、止血作用等生物活性(Park Jungyu et al.,2015)。
已知被认为储存和传递遗传信息的遗传体的核酸(nucleic acid)分布在患病组织周围并起到细胞生长和分化、促进血管生成和抑制炎症的作用。即，核酸在细胞外分解成小片段，并与细胞表面的受体结合，从而起到利用信号刺激细胞内部的作用。
在另一研究领域，利用核酸固有的自组装(self-assembly)性质来制成非常精致的纳米结构物等，在多种领域中正活跃进行研究。在2006年由DNA构成的水凝胶的形成结果(Um S.H.et al.,2006)被发表后，许多团队正进行利用DNA制备水凝胶的研究。
由DNA构成的水凝胶具有非常优异的生物相容性，已在各种医学领域进行研究。近来，制备反应于热和酶而自由分解及重组的功能性DNA水凝胶的结果(Xing Y.et al.,2011)也已被发表。因此，能够实现仅在必要时才输送药物的智能药物递送方法，具有减少过量服用药物导致的副作用的优点。另外，与利用现有聚合物的水凝胶制备方法不同，DNA水凝胶由生物物质DNA构成，因此具有对人体无毒的优点，因此可期待在医学领域中用作各种形状的伤口部位的人造组织及有效的药物传递体的多种应用。
但是,就核酸而言，由于容易被人体中的降解酶降解，因此核酸用于靶标疾病组织时的体内滞留性低，导致药效的持续性不足，而用作DNA水凝胶的情况下，因降解酶的降解，导致该结构物崩解，具有不能充分发挥人造组织和药物传递体的功能的问题(LeeJongbeom et al.,2012)。因此，有必要进行研究以增强核酸的药效持久性并解决DNA水凝胶的问题。
为此，本发明人为制备在常温下以溶胶状态存在而注入体内后形成凝胶的温敏性水凝胶而不断进行研究的结果，通过壳聚糖与核酸的组合制备出具有生物相容性和生物降解性的温敏性水凝胶，以能够完成本发明。
虽在作为现有技术，韩国公开专利第2014-0090670号中公开了原位交联聚合体组合物，但完全没有涉及到温敏性及水凝胶。另外，该公开专利的交联聚合体组合物包含约0.1重量％至约95％重量比的大于一种的多聚阴离子聚合物，约0.1重量％至约90％重量比的大于一种的多聚阳离子聚合物及约0.1重量％至约99.8％重量比的水，与本发明的温敏性水凝胶组合物的混合比的构成具有差异。另外，公开所述多聚阴离子聚合物包含交联和非交联多聚阴离子，并作为非交联多聚重阴离子的成分之一示出多核苷酸。然而，非交联多聚阴离子是附加包含的，可知其对交联没有影响。相反，本发明是通过核酸及壳聚糖的非交联来形成温敏性水凝胶，可知其构成存在差异。再参考韩国公开专利第2014-0090670号中示出的比例，混合1重量％的核酸及0.1重量％的壳聚糖的结果，出现了不透明的白色沉淀，三天后确认发生分层。
欧洲公开专利第2745849号示出多聚脱氧核苷酸(polydeoxyribonucleotide，PDRN)与壳聚糖的组合，但没有涉及温敏性水凝胶，其包含0.002至0.25重量％的多聚脱氧核苷酸及1至10重量％壳聚糖，可知与本发明的构成具有差异。
另外，美国公开专利第2015-0111834号公开原位(in-situ)凝胶的组合物，为防止在常温下的凝胶化，添加抗凝胶剂，可知与本发明的构成具有差异。
发明内容
发明要解决的问题
本发明的目的在于提供一种包含核酸及壳聚糖的温敏性水凝胶组合物。
用于解决问题的手段
本发明涉及一种温敏性水凝胶组合物，其包含核酸及壳聚糖，核酸及壳聚糖的重量比为20：1至10000：1。
就温敏性水凝胶组合物而言，优选地，核酸与壳聚糖的重量比为50：1至2000：1，最优选地，核酸与壳聚糖的重量比为100：1至1000：1。
以组合物的总重量为基准，所述核酸的含量可以为0.01重量％至3重量％。
所述核酸可以为脱氧核糖核酸(deoxyribonucleic acid，DNA)、核糖核酸(ribonucleic acid，RNA)或它们的混合物。
以组合物的总重量为基准，所述壳聚糖的含量可以为1×10-6重量％至0.15重量％。
所述壳聚糖的分子量可以为3kDa至1,000kDa。
另外，所述温敏性水凝胶组合物可包含作为附加成分的高分子物质。
所述高分子物质可以是选自透明质酸(hyaluronic acid)、聚谷氨酸(poly-γ-glutamic acid)、纤维素(cellulose)、聚丙烯酸(polyacrylic acid)、多聚氨基酸(polyamino acid)及藻酸盐(alginate)、它们的衍生物及它们的组合中的一种以上。
另外，本发明涉及一种温敏性水凝胶组合物的制备方法，包括：步骤i)，制备核酸储备溶液；步骤ii)，制备壳聚糖储备溶液；步骤iii)，将所述步骤i)的核酸储备溶液及所述步骤ii)的壳聚糖储备溶液进行混合并搅拌，使核酸与壳聚糖的重量比达到20：1至10000：1；以及步骤iv)，对所述步骤iii)的核酸-壳聚糖混合溶液进行搅拌，并降温至常温。
所述制备方法，可包括：步骤i)，在缓冲液(buffer)中加入核酸，在60℃至70℃下搅拌溶解1小时至2小时，从而制备核酸储备溶液；步骤ii)，将壳聚糖溶解于酸性缓冲液中，从而制备壳聚糖储备溶液；步骤iii)，将所述步骤i)的核酸储备溶液和所述步骤ii)的壳聚糖储备溶液进行混合，使核酸与壳聚糖的重量比达到20：1至10000：1，并在55℃至65℃下搅拌1小时至2小时；以及步骤iv)，对所述步骤iii)的核酸-壳聚糖混合溶液进行搅拌，并降温至常温。
所述温敏性水凝胶组合物的制备方法中，温敏性水凝胶组合物的渗透压为100mOsm至500mOsm，pH值为6至8。
以下对本发明进行详细说明。
所述温敏性水凝胶，是指随着温度发生相变(phase transition)的水凝胶，即，溶胶(sol)变凝胶(gel)或凝胶变溶胶，溶胶变凝胶的现象称为凝胶化(gelation)。将本发明中的凝胶化定义为具有粘弹性且随着温度上升，高分子形成三维网状结构而不溶于溶剂而残留的状态。
就包含所述核酸及壳聚糖的温敏性水凝胶组合物而言，根据核酸及壳聚糖的配比，溶胶-凝胶转变温度可能会改变，此时，可根据使用目的来改变配比，以此调节溶胶-凝胶转变温度。
包含所述核酸及壳聚糖的温敏性水凝胶组合物保持均匀(homogeneous)的状态，且不发生分层、稳定性(stability)高，优选为，核酸及壳聚糖的重量比为20：1至10000：1，更优选为，50：1至2000：1，最优选为100：1至1000：1。
以组合物的总重量为基准，所述核酸的含量可以为0.01重量％至3重量％，优选为0.1重量％至2重量％，最优选为1重量％至1.5重量％。
所述核酸分子量可以为1kDa至100,000kDa。优选为10kDa至10,000kDa，最优选为50kDa至3,500kDa。
所述核酸可以为脱氧核糖核酸(deoxyribonucleic acid，DNA)、核糖核酸(ribonucleic acid，RNA)或它们的混合物。可以优选为脱氧核糖核酸。
另外，所述脱氧核糖核酸可以为寡核苷酸(oligonucleotide)、多核苷酸(polynucleotide)及多聚脱氧核苷酸(polydeoxyribonucleotide，PDRN)。
所述核酸通过与壳聚糖的结合可形成水凝胶，可用作体内治疗药物。
另外，以组合物的总重量为基准，所述壳聚糖的含量可以为1×10-6重量％至0.15重量％。优选为1×10-5重量％至0.1重量％，最优选为1×10-4重量％至0.075重量％。
所述壳聚糖的分子量优选为3kDa至1,000kDa，但并不限定于此。
另外，所述温敏性水凝胶组合物可包含作为附加成分的高分子物质，此时的高分子物质的添加是为了巩固根据使用用途来调节包含核酸及壳聚糖的温敏性水凝胶的物性变化。
所述高分子物质可使用选自透明质酸(hyaluronic acid)、聚谷氨酸(poly-γ-glutamic acid)、纤维素(cellulose)、聚丙烯酸(polyacrylic acid)，多聚氨基酸(polyamino acid)及藻酸盐(alginate)、它们的衍生物及它们的组合中的一种以上，但并不限定于此。
另外，所述温敏性水凝胶组合物可用于医疗或化妆品。
所述温敏性水凝胶组合物制备方法包括：步骤i)，在缓冲液(buffer)中加入核酸，并在60℃至70℃下搅拌溶解1小时至2小时，从而制备核酸储备溶液；步骤ii)，将壳聚糖溶解于酸性缓冲液中，从而制备壳聚糖储备溶液的；步骤iii)，将所述步骤i)的核酸储备溶液和所述步骤ii)的壳聚糖储备溶液进行混合，使核酸与壳聚糖的重量比达到20：1至10000：1，并将混合溶液在55℃至65℃下搅拌1至2小时；以及步骤iv)，对所述步骤iii)的核酸-壳聚糖混合溶液进行搅拌，并降至常温。
作为能够用于制备核酸储备溶液的缓冲液，有十二水合磷酸氢二钠(sodiumphosphate dibasic dodecahydrate)、氯化钠(sodium chloride)、氯化镁(magnesiumchloride)、氯化钾(potassium chloride)、磷酸盐缓冲生理盐水(phosphate buffersaline)、N-(2-羟乙基)哌嗪-N'-2-乙烷磺酸(N-(2-hydroxyethyl)-piperazine-N′-2-ethanesulfonic acid，HEPES)缓冲液，优选地，可使用十二水合磷酸氢二钠(sodiumphosphate dibasic dodecahydrate)，但并不限定于此。
作为制备壳聚糖储备溶液时能够使用的酸性缓冲液，有乙酸(acetic acid)、盐酸(hydrochloric acid)、抗坏血酸(ascorbic acid)、乳酸(lactic acid)、硝酸(nitricacid)，可优选使用乙酸(acetic acid)，但并不限定于此。
混合所述核酸及壳聚糖时，以使核酸及壳聚糖的重量比达到20：1至10000：1。此时，优选地，以组合物的总重量为基准，核酸的含量为0.01重量％至3重量％，所述壳聚糖的含量为1×10-6重量％至0.15重量％。
以所述制备方法制得的温敏性水凝胶组合物，能够通过调节渗透压和pH值来注入于人体或涂抹于皮肤。
为了调节通过所述制备方法制得的温敏性水凝胶组合物的pH值，在所述步骤iv)中还可以包括调节pH值的步骤。
通过所述制备方法制得的温敏性水凝胶组合物的渗透压可以为100mOsm至500mOsm，优选为150mOsm至450mOsm，最优选为200mOsm至400mOsm。
通过所述制备方法制得的温敏性水凝胶组合物的pH值可以为6至8，优选地，pH值可以为6.5至7.5，最优选地，pH值可以为7。
发明效果
本发明提供一种包含核酸及壳聚糖的温敏性水凝胶组合物。所述水凝胶具有优异的生物相容性与生物稳定性，同时具有基于温度变化的溶胶-凝胶相变(phasetransition)性质，在常温下以溶胶状态存在，而当被注入于人体或涂抹于皮肤表面时，随着温度上升而凝胶化。
因此，本发明的温敏性水凝胶可以直接注入及涂抹于需要治疗的特定部位，可通过基于温度的凝胶化来提高药物的滞留和附着时间，从而能够充分发挥药效，期待能够用于多种治疗。
附图说明
图1是对随着核酸与壳聚糖的混合比例而变化的温敏性水凝胶的物理性质进行核实的结果。混合各组合物后，对透明度和粘弹性(A)以及是否生成沉淀物和分层(B)实施了为期三天的核实。
图2示出对凝胶溶解性核实的结果。
图3示出对温敏性水凝胶组合物的溶胶-凝胶转变进行核实的结果。
具体实施方式
以下，对本发明的优选实施例进行详细说明。然而，本发明不限于在此说明的实施例，可以以不同方式具体化。相反，这些实施例能够使在这里介绍的内容彻底且完整，并且向本领域技术人员充分传达本发明的思想。
<实施例1.制备核酸-壳聚糖水凝胶>
为了制备核酸-壳聚糖水凝胶，准备了下述表1的实施例对应浓度的核酸和壳聚糖储备溶液(stock solution)。此时，在200mM的十二水合磷酸氢二钠(sodium phosphatedibasic dodecahydrate)缓冲液中加入核酸，使用65℃的加热搅拌器溶解1小时以上。
利用100mM乙酸(acetic acid)溶解壳聚糖。
将按下述表1的浓度准备的核酸和壳聚糖储备溶液，以1：1的重量比进行混合，并在60℃的加热搅拌器中搅拌1小时。之后，将温度降至常温并搅拌1小时，从而制备核酸-壳聚糖水凝胶。
<比较例1.制备比较对象核酸-壳聚糖水凝胶>
准备了下述表1的比较例对应浓度的核酸和壳聚糖储备溶液(stock solution)。与实施例1相同地制备了比较对象核酸-壳聚糖水凝胶。
[表1]
Figure GDA0001746808030000091
<实施例2.制备核酸-壳聚糖-透明质酸水凝胶>
通过以下过程制备核酸-壳聚糖-透明质酸水凝胶。
将核酸溶解于200mM的十二水合磷酸氢二钠(sodium phosphate dibasicdodecahydrate)缓冲液中，使浓度达到2.2重量％。此时，使用65℃的加热搅拌器溶解1小时以上。
将壳聚糖溶解于100mM乙酸(acetic acid)中，使浓度达到0.4重量％。
将透明质酸钠溶解于200mM的十二水合磷酸氢二钠(sodium phosphate dibasicdodecahydrate)缓冲液中，使浓度达到2重量％。此时，使用40℃的加热搅拌器溶解30分钟之后，搅拌的同时降至常温。
将准备好的2.2重量％的核酸和0.4重量％的壳聚糖溶液以9：1的重量比进行混合，并在65℃的加热搅拌器中搅拌10分钟。在核酸-壳聚糖混合溶液中，以1：1的重量比进一步添加2重量％的透明质酸钠，并在65℃的加热搅拌器中搅拌1小时后，搅拌的同时降至常温，从而制备实施例2的核酸-壳聚糖-透明质酸水凝胶。
<比较例2.制备比较对象核酸-壳聚糖-透明质酸水凝胶>
准备了下述表2的浓度的壳聚糖和透明质酸储备溶液(stock solution)。
将壳聚糖溶于100mM乙酸(acetic acid)中。
将透明质酸钠溶解于200mM的十二水合磷酸氢二钠(sodium phosphate dibasicdodecahydrate)缓冲液中。此时，使用40℃的加热搅拌器溶解30分钟后，搅拌的同时降至常温。
将备好的壳聚糖和透明质酸溶液以1：1的重量比进行混合，在65℃的加热搅拌器中搅拌1小时。之后，将温度降至常温并搅拌1小时，从而制备壳聚糖-透明质酸水凝胶。
[表2]
Figure GDA0001746808030000101
<实验例1.核实核酸-壳聚糖-水凝胶的物理性质>
利用实施例1、实施例2、比较例1及比较例2的水凝胶组合物来核实凝胶化、凝胶稳定性及溶解性。
混合各组合物后，肉眼观察三天各组合物的透明度和凝胶化状态，凝胶化是通过是否有粘弹性来核实，并且凝胶稳定性是通过是否生成有沉淀物以及是否发生分层来核实。
就凝胶溶解性而言，将实施例1、实施例2、比较例1及比较例2的水凝胶组合物滴定于37.5℃的水溶液中使其凝胶化，之后维持37.5℃的情况下以400rpm搅拌5分钟，同时确认凝胶是否被溶解。结果示于表3、图1及图2。
[表3]
Figure GDA0001746808030000111
从所述表3及图1可知，实施例1-1至实施例1-11的温敏性水凝胶组合物在混合核酸及壳聚糖后，即使经过三天也没有出现沉淀物分离及分层现象，且保持粘弹性。但是，如比较例1-1至比较例1-4所示，超过本发明的核酸及壳聚糖重量比的情况下，生成沉淀物，出现分层现象，或没有显现粘弹性。
另外，从表3及图2的凝胶的溶解性可知，实施例1-1至实施例1-11的温敏性水凝胶组合物在37.5℃下形成凝胶，且所形成的凝胶被持续保持形成的凝胶，相反，比较例1-1至比较例1-4在37.5℃下不发生凝胶化或即使发生凝胶化也在20秒内全部溶解。
确认到，在核酸和壳聚糖中作为附加成分含有透明质酸的实施例2中，也没有出现沉淀物分离及分层现象，且保持粘弹性，在凝胶化后也持续保持凝胶状，相反，如比较例2-2在不包含核酸的情况下，虽具有粘弹性且不产生沉淀物分离及分层现象，但在37.5℃下形成凝胶后在20秒内溶解(参照表3及图1)。
由此能够确认到，本发明的水凝胶组合物显现出温度敏感性，而且稳定性高且凝胶化后持续保持凝胶状态，此时，核酸与壳聚糖的重量比起着重要的作用。
<实验例2.核实基于温度的溶胶-凝胶转变(sol-gel transition)>
利用实施例1、实施例2、比较例1及比较例2中制备的水凝胶组合物来核实了溶胶-凝胶转变。
为核实溶胶-凝胶转变，使用了流变仪(rheometer)。此时，采用的测定条件为PU20，间隙(Gap)为0.5mm，0.1Hz及1％的应力-应变率(stress strain)，从24℃以1℃为单位进行升温且每上升1℃保持1分钟直至升到40℃，测定G'(弹性)及G”(粘性)的变化。另外，对各组合物进行加热，肉眼观察36℃前后的溶胶-凝胶转变，其结果示于图3。
如图3所示，观察到实施例1-3的温敏性水凝胶组合物显现出温敏性水凝胶所具有的特征，即，随着温度上升G'(弹性)缓慢降低且G”(粘度)上升(图3A)。另外，观察到实施例1-3的温敏性水凝胶组合物在小于36℃的温度下呈溶胶状态，相反，在大于36℃时发生凝胶化(图3B)。而且还证实到在实施例1及实施例2的温敏性水凝胶组合物中均发生了这种结果。由此可知，本发明的水凝胶组合物显现出温敏性特性。

Claims (13)

1.一种温敏性水凝胶组合物，其特征在于，
包含核酸及壳聚糖，
所述核酸与壳聚糖的重量比为20：1至10000：1。
2.根据权利要求1所述的温敏性水凝胶组合物，其特征在于，所述核酸与壳聚糖的重量比为50：1至2000：1。
3.根据权利要求2所述的温敏性水凝胶组合物，其特征在于，所述核酸与壳聚糖的重量比为100：1至1000：1。
4.根据权利要求1所述的温敏性水凝胶组合物，其特征在于，以组合物的总重量为基准，所述核酸的含量为0.01重量％至3重量％。
5.根据权利要求4所述的温敏性水凝胶组合物，其特征在于，所述核酸为脱氧核糖核酸、核糖核酸或它们的混合物。
6.根据权利要求1所述的温敏性水凝胶组合物，其特征在于，以组合物的总重量为基准，所述壳聚糖的含量为1×10-6重量％至0.15重量％。
7.根据权利要求6所述的温敏性水凝胶组合物，其特征在于，所述壳聚糖的分子量为3kDa至1,000kDa。
8.根据权利要求1所述的温敏性水凝胶组合物，其特征在于，所述温敏性水凝胶组合物包含作为附加成分的高分子物质。
9.根据权利要求8所述的温敏性水凝胶组合物，其特征在于，所述高分子物质是选自透明质酸、聚谷氨酸、纤维素、聚丙烯酸、多聚氨基酸、藻酸盐及它们的组合中的一种以上。
10.权利要求1至9中任一项所述的温敏性水凝胶组合物的制备方法，其特征在于，包括：
步骤i)，制备核酸储备溶液；
步骤ii)，制备壳聚糖储备溶液；
步骤iii)，将所述步骤i)的核酸储备溶液及所述步骤ii)的壳聚糖储备溶液进行混合并在55℃至65℃下进行搅拌，使核酸与壳聚糖的重量比达到20：1至10000：1；
步骤iv)，对所述步骤iii)的核酸-壳聚糖混合溶液进行搅拌，并降温至常温。
11.根据权利要求10所述的温敏性水凝胶组合物的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括：
步骤i)，在缓冲液中加入核酸，并在60℃至70℃下搅拌溶解1小时至2小时，从而制备核酸储备溶液；
步骤ii)，将壳聚糖溶解于酸性缓冲液中，从而制备壳聚糖储备溶液；
步骤iii)，将所述步骤i)的核酸储备溶液和所述步骤ii)的壳聚糖储备溶液进行混合，使核酸与壳聚糖的重量比达到20：1至10000：1，并在55℃至65℃下搅拌1至2小时；
步骤iv)，对所述步骤iii)的核酸-壳聚糖混合溶液进行搅拌，并降温至常温。
12.根据权利要求10所述的温敏性水凝胶组合物的制备方法，其特征在于，所述温敏性水凝胶组合物的渗透压为100mOsm至500mOsm。
13.根据权利要求10所述的温敏性水凝胶组合物制备方法，其特征在于，所述温敏性水凝胶组合物的pH值为6至8。
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