KR101916193B1 - 핵산 및 키토산을 포함하는 관절강 주사용 조성물 - Google Patents

핵산 및 키토산을 포함하는 관절강 주사용 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 핵산 및 키토산을 포함하는 관절강 주사용 조성물에 관한 것으로, 보다 자세하게는 핵산 및 키토산의 혼합을 통해 제조된 관절강 주사용 조성물이 온도에 따라 졸-겔 전이가 일어나는 것을 확인하였고, 조성물의 주입에 따라 연골조직의 프로테오글리칸 생합성이 증가되어 연골 재생 효과가 나타나고, 통증이 완화되어 관절의 운동성인 보행 속도와 보폭이 향상된 것을 확인하였다.
따라서, 본 발명의 핵산 및 키토산을 포함하는 관절강 주사용 조성물을 이용한 우수한 치료 효과를 가지는 관절염 치료제로의 개발이 기대된다.

Description

핵산 및 키토산을 포함하는 관절강 주사용 조성물 {Injectable composition comprising nucleic acid and chitosan for articular cavity}
본 발명은 핵산 및 키토산을 포함하는 관절강 주사용 조성물에 관한 것이다.
관절(articulation)은 뼈와 뼈가 연결되는 부위로, 관절을 구성하는 두 뼈가 마주하는 면에는 관절 연골이라고 불리는 유리 연골의 얇은 층이 있다. 관절 주위는 골막의 연속인 결합조직성 막으로 둘러싸여져 있고 이것을 관절낭이라고 하며, 그 내강을 관절강(articular cavity)이라고 한다. 관절낭의 내면에는 활막이라는 얇은 막이 있으며 끊임없이 소량의 활액을 관절강 내에 분비하여 관절 운동을 부드럽게 한다.
이러한 관절에 문제가 생기면 관절 질환이 나타나는데, 이 중 가장 유병률이 높은 질환이 골관절염이다. 골관절염이 주로 침범되는 부위는 손가락, 무릎, 고관절 및 요추이며 침범 관절에 따라 조금씩 다르지만 통증과 운동제한이 공통적인 증상이다. 골관절염의 치료 목표는 통증을 완화시키며, 관절의 운동성을 유지하고 개선함으로써 장애를 최소화하는 것이다(이충기, 2000).
골관절염은 만성질환으로, 기대수명의 증가와 함께 장기간의 치료를 필요로 한다. 치료의 선택은 크게 비약물적 보존적 치료, 약물요법 및 수술적 치료로 크게 나눌 수 있고, 치료 계획은 증상의 정도 및 기간, 방사선학적 소견, 환자의 나이 및 동반질환, 생활양식 및 사회경제적 수준, 발병 전 활동도 등에 따라 개별적으로 수립되어야 한다(Lee S.C., et al., 2010; Yoon J.P., et al., 2012).
골관절염은 다른 관절 질환들과는 다르게 관절강 내 약물 투여가 가능한 질환이다. 히알루론산(hyaluronic acid, HA)은 다당류로서 관절 활액의 중요한 구성성분 중 하나로 히알루론산의 존재는 활액의 점탄성에 기여하여 활액이 윤활제와 충격흡수제의 역할을 할 수 있도록 해준다(Balazs E.A., et al., 1993). 이뿐만 아니라 고분자량의 히알루론산은 염증성 관절에 소염작용과 진통작용을 가지고 있다(Kikuchi T., et al., 1996; Yoshimi T., et al., 1994; Sakakibara Y., et al., 1994). 따라서 현재 골관절염 치료를 위해 히알루론산의 관절강 내 투여가 여러 나라에서 승인되어져 사용되고 있다.
관절강 내 약물 투여는 적은 양으로도 적절한 약물 농도에 도달시킬 수 있고 전신적 부작용을 최소화 할 수 있다는 장점이 있다. 하지만 활액에서 투여된 약물이 머무르는 시간이 매우 짧기 때문에 관절 내에서 지속적으로 약물을 방출할 수 있는 지속 방출 제형의 개발이 요구된다(Gerwin N., et al., 2006).
이에, 본 발명자는 관절강 주사용 조성물을 연구하는 과정에서, 핵산 및 키토산을 포함하는 조성물을 주입하여 관절강의 통증을 완화시키고 연골 재생 효과를 확인함으로써 본 발명을 완성할 수 있었다.
종래 선행기술로서 일본공개특허 제2010-531863호에는 히알루론산 및 천연 유래의 다른 다당류 일종 이상을 포함하는 겔 형태의 관절강 주사용 물성 제제를 기재하고 있어 본 발명의 구성과 유사하나, 핵산이 기재된 바가 없다. 또한, 중국공개특허 제104546691호에는 키토산을 포함하는 관절강 주사용 온도감응성 인-시츄 겔 조성물을 기재하고 있어 본 발명의 구성과 유사하나, 핵산이 기재된 바가 없어 본 발명의 구성과 차이가 있다. 한국공개실용신안 제20-2009-0011604호에는 히알루론산을 포함하는 관절강내주사를 기재하고 있으나, 핵산 및 키토산이 기재되어 있지 않아 본 발명의 구성과 차이가 있다.
일본공개특허 제2010-531863호, 관절 변성 치료를 위한 주사용 제제의 제조를 위한 천연 폴리사카라이드 겔의 사용, 2010. 09. 30. 공개. 중국공개특허 제104546691호, Temperature-sensitive in-situ gel preparation composition for anticular injection and preparation method thereof, 2015. 01. 28. 공개. 한국공개실용신안 제20-2009-0011604호, 무통 관절강내주사, 2009. 11. 16. 공개.
이충기, 골관절염, 대한내과학회지, 59(2), 246-249, 2000. Balazs E.A., et al., Viscosupplementation: a new concept in the treatment of osteoarthritis, J. Rheumatol. Suppl., 39, 3-9, 1993. Gerwin N., et al., Intraarticular drug delivery in osteoarthritis, Adv. Drug Deliv. Rev., 58, 226-242, 2006. Kikuchi T., et al., Effect of high molecular weight hyaluronan on cartilage degeneration in a rabbit model of osteoarthritis, Osteoarthritis Cartilage, 4(2), 99-110, 1996. Lee S.C., et al., The short-term follow-up results of open wedge high tibial osteotomy with using an Aescula open wedge plate and an allogenic bone graft: the minimun 1-year follow-up results, Clin. Orthop. Surg., 2, 47-54, 2010. Sakakibara Y., et al., Effect of hight-molecular-weight sodium hyaluronate on immobilized rabbit knee, Clin. Orthop. Relat. Res., 299, 282-292, 1994. Yoon J.P., et al., What do the patients want and worry in Korean patients who undergo arthroscopic rotator cuff surgery?, Clin. Orthop. Surg., 4, 278-283, 2012. Yoshimi T., et al., Effect of hight-molecular-weight sodium hyaluronate on experimental osteoarthrosis induced by the resection of rabbit anterior cruciate ligament, Clin. Orthop. Relat. Res., 298, 296-304, 1994.
본 발명의 목적은 핵산 및 키토산을 포함하는 관절강 주사용 조성물을 제공하는 데 있다.
또한, 본 발명의 목적은 핵산 및 키토산을 포함하는 관절강 주사용 조성물의 제조방법을 제공하는 데 있다.
본 발명은 핵산 및 키토산을 포함하는 관절강 주사용 조성물에 관한 것이다.
상기 핵산은 함량이 조성물 총 중량을 기준으로 0.1중량% 내지 3중량%일 수 있다.
상기 키토산은 함량이 조성물 총 중량을 기준으로 0.001중량% 내지 0.1중량%일 수 있다.
상기 핵산 및 키토산은 1:1 내지 3000:1 중량비율일 수 있다.
상기 핵산은 디옥시리보핵산(deoxyribonucleic acid, DNA), 리보핵산(ribonucleic acid, RNA) 또는 이들의 혼합물일 수 있다. 바람직하게는 디옥시리보핵산(deoxyribonucleic acid, DNA)이다.
상기 디옥시리보핵산은 올리고뉴클레오타이드(oligonucleotide), 폴리뉴클레오타이드(polynucleotide) 및 폴리디옥시리보뉴클레오타이드(polydeoxyribonucleotide)에서 선택될 수 있다.
상기 핵산은 분자량이 1kDa 내지 100,000kDa일 수 있다. 바람직하게는 10kDa 내지 10,000kDa이고, 더욱 바람직하게는 50kDa 내지 3,500kDa이다.
상기 키토산은 분자량이 3kDa 내지 1,000kDa일 수 있다.
상기 조성물은 수용성 고분자를 추가성분으로 함유할 수 있다.
상기 수용성 고분자는 히알루론산(hyaluronic acid), 콘드로이틴황산(chondroitin sulfate), 글리코겐(glycogen), 덱스트린(dextrin), 덱스트란(dextran), 덱스트란 황산(dextran sulfate), 히드록시프로필메틸셀룰로스(hydroxypropyl methylcellulose), 알긴산(alginic acid), 키틴(chitin), 풀루란(pullulan), 콜라겐(collagen), 젤라틴(gelatin) 및 이들의 가수분해물, 폴리비닐알코올(polyvinyl alcohol), 폴리비닐피롤리돈(polyvinyl pyrrolidone), 폴리아크릴산(polyacrylic acid) 및 카르복시비닐 중합체(carboxylvinylpolymer)로 이루어진 군 중에서 선택되는 1종 이상일 수 있다. 바람직하게는 히알루론산(hyaluronic acid)이다.
상기 조성물은 온도에 따라 졸-겔 전이가 일어나는 하이드로겔 일 수 있다.
상기 관절강 주사는 척추 간판 탈출증, 오십견, 어깨관절 충돌 증후군, 손목터널 증후군, 변형성 관절증, 테니스/골프 엘보, 복합적인 부위별 동통 증후군, 기타 건염 및 만성 관절류머티즘으로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 증상에 투여될 수 있다.
이하 본 발명을 상세하게 설명한다.
상기 핵산 및 키토산을 포함하는 관절강 주사용 조성물은 i) 핵산을 완충용액(buffer)에 넣고 40℃ 내지 70℃에서 교반하면서 30분 내지 1시간 동안 용해시켜 핵산 저장용액을 제조하는 단계; ii) 키토산을 산성 완충용액에 용해시켜 키토산 저장용액을 제조하는 단계; iii) 상기 i) 단계의 핵산 저장용액 및 상기 ii) 단계의 키토산 저장용액을 핵산 및 키토산의 중량비율이 1:1 내지 3000:1이 되도록 혼합하여 40℃ 내지 70℃에서 30분 내지 1시간 동안 교반하는 단계; 및 iv) 상기 iii) 단계의 핵산-키토산 혼합액을 교반하면서 상온으로 낮추는 단계; 를 포함할 수 있다.
상기 핵산 저장용액 제조 시 이용할 수 있는 완충용액으로는 소듐 포스페이트 디베이직 도데카하이드레이트(sodium phosphate dibasic dodecahydrate), 염화나트륨(sodium chloride), 염화마그네슘(magnesium chloride), 염화칼륨(potassium chloride), 인산 완충 식염수(phosphate buffer saline) 또는 HEPES(N-(2-hydroxyethyl)-piperazine-N′-2-ethanesulfonic acid) 완충용액이 있으며, 바람직하게는 소듐 포스페이트 디베이직 도데카하이드레이트(sodium phosphate dibasic dodecahydrate)이며, 가장 바람직하게는 5~300mM의 소듐 포스페이트 디베이직 도데카하이드레이트를 이용할 수 있으나, 이에 한정하는 것은 아니다.
상기 키토산 저장용액 제조 시 이용할 수 있는 산성 완충용액으로는 아세트산(acetic acid), 염산(hydrochloric acid), 아스코르브산(ascorbic acid), 젖산(lactic acid), 질산(nitric acid), 글루탐산(glutamic acid) 또는 포름산(formic acid)이 있으며, 바람직하게는 아세트산(acetic acid)이며, 가장 바람직하게는 10~300mM의 아세트산을 이용할 수 있으나, 이에 한정하는 것은 아니다.
상기 핵산 및 키토산을 포함하는 관절강 주사용 조성물은 온도에 따라 졸-겔 전이가 일어나는 온도감응성 하이드로겔 일 수 있다.
상기 온도감응성 하이드로겔은 온도에 따라 졸(sol)이 겔(gel)로 또는 겔이 졸로 상전이(phase transition)가 일어나는 것으로, 졸이 겔로 변하는 현상을 겔화(gelation)라고 하며, 본 발명에서의 겔화는 점탄성을 가지며 온도가 증가함에 따라 고분자가 3차원 그물 구조를 형성하여 용매에 녹지 않고 잔류하는 상태가 되는 것으로 정의한다.
상기 온도감응성 하이드로겔 성질을 가지고 있는 관절강 주사용 조성물을 관절강 내에 주입하여 체온에 의해 점탄성이 회복되어 겔화시킴으로써 관절강 내에 상기 조성물의 분해 속도를 늦추고, 잔류 시간이 증가되어, 지속적인 윤활작용과 충격흡수를 통해 관절을 보호하고 손상된 연골조직 수복 효과를 증진 시킬 수 있다.
상기 핵산 및 키토산을 포함하는 관절강 주사용 조성물은 균일한(homogeneous) 상태를 유지하면서 층 분리가 일어나지 않는 안정성(stability)이 높은 것으로, 핵산 및 키토산은 1:1 내지 3000:1 중량비율일 수 있다. 바람직하게는 10:1 내지 300:1 이다. 더욱 바람직하게는 10:1 내지 100:1 이다.
상기 핵산 함량이 조성물 총 중량을 기준으로 0.1중량% 내지 3중량%일 수 있다. 바람직하게는 1중량% 내지 2중량%이다.
상기 핵산은 분자량이 10kDa 내지 100,000kDa일 수 있고, 바람직하게는 10kDa 내지 10,000kDa이고, 가장 바람직하게는 50kD 내지 3,500kDa이다. 핵산의 분자량이 10kDa 미만인 경우에는 겔의 분해 속도를 조절하기가 어려우며, 100,000kDa 초과인 경우에는 겔의 점성 조절이 어려워 사용에 문제가 있다.
상기 핵산은 디옥시리보핵산(deoxyribonucleic acid, DNA), 리보핵산(ribonucleic acid, RNA) 또는 이들의 혼합물일 수 있다. 바람직하게는 디옥시리보핵산이다.
또한, 상기 디옥시리보핵산은 올리고뉴클레오타이드(oligonucleotide), 폴리뉴클레오타이드(polynucleotide) 및 폴리디옥시리보뉴클레오타이드(polydeoxyribonucleotide)일 수 있다.
또한, 상기 키토산의 함량은 조성물의 총 중량을 기준으로 0.001중량% 내지 0.1중량%일 수 있고, 바람직하게는 0.01중량% 내지 0.1중량%이다.
상기 키토산은 분자량이 3kDa 내지 1,000kDa인 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.
상기 핵산 및 키토산의 혼합은 핵산 및 키토산의 중량비율이 1:1 내지 3000:1이 되도록 혼합하며, 이때, 핵산의 함량이 조성물의 총 중량을 기준으로 0.1중량% 내지 3중량%가 되고, 키토산의 함량이 조성물의 총 중량을 기준으로 0.001중량% 내지 0.1중량%이 되도록 하는 것이 바람직하다.
상기 핵산 및 키토산을 포함하는 관절강 주사용 조성물은 수용성 고분자를 추가성분으로 함유할 수 있다.
상기 수용성 고분자는 핵산 및 키토산을 포함하는 관절강 주사용 조성물의 분해 속도 조절과 윤활작용 및 치료 효과를 공고히 하기 위해 추가할 수 있다.
상기 수용성 고분자는 생체 내에서 용해 또는 분해 가능한 것으로, 히알루론산(hyaluronic acid), 콘드로이틴황산(chondroitin sulfate), 글리코겐(glycogen), 덱스트린(dextrin), 덱스트란(dextran), 덱스트란 황산(dextran sulfate), 히드록시프로필메틸셀룰로스(hydroxypropyl methylcellulose), 알긴산(alginic acid), 키틴(chitin), 풀루란(pullulan) 등의 다당류나 콜라겐(collagen), 젤라틴(gelatin) 및 이들의 가수분해물 등의 단백질, 폴리비닐알코올(polyvinyl alcohol), 폴리비닐피롤리돈(polyvinyl pyrrolidone), 폴리아크릴산(polyacrylic acid), 카르복시비닐 중합체(carboxylvinylpolymer) 등의 합성 고분자 화합물을 사용할 수 있으며, 바람직한 것은 히알루론산이다.
상기 수용성 고분자를 추가 성분으로 포함하는 핵산 및 키토산을 포함하는 관절강 주사용 조성물은 핵산, 키토산 및 수용성 고분자가 1~3000 : 1 : 1~3000 중량비율로 혼합된 것일 수 있다. 바람직하게는 10~1,000 : 1 : 10~1,000 중량비율이고, 더 바람직하게는 25~100 : 1 : 25~100 중량비율이다.
상기 히알루론산은 선형 또는 가교된 형태를 포함하며, 분자량이 20kDa 내지 10,000kDa일 수 있으며, 500kDa 내지 3,000kDa이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.
상기 핵산 및 키토산을 포함하는 관절강 주사용 조성물은 관절강 내 주사를 통해 관절강의 통증을 완화시키고, 염증을 감소시킬 수 있으며, 연골 재생을 유도할 수 있다.
상기 핵산 및 키토산을 포함하는 관절강 주사용 조성물은 척추 간판 탈출증, 오십견, 어깨관절 충돌 증후군, 손목터널 증후군, 변형성 관절증, 테니스/골프 엘보, 복합적인 부위별 동통 증후군, 기타 건염 및 만성 관절류머티즘으로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 증상에 투여될 수 있다.
본 발명은 핵산 및 키토산을 포함하는 관절강 주사용 조성물에 관한 것으로, 보다 자세하게는 핵산 및 키토산의 혼합을 통해 제조된 관절강 주사용 조성물이 생체적합적이며, 온도에 따라 졸-겔 전이가 일어나는 것을 확인하였다. 또한, 본 발명의 조성물 주입에 따라 연골조직의 프로테오글리칸 생합성이 증가되어 연골 조직의 수복이 나타나고, 통증의 감소로 인해 관절의 운동성과 관련되어 있는 보행 속도 및 보폭이 향상된 것을 확인하였다.
따라서, 본 발명의 관절강 주사용 조성물은 통증 완화 및 치료가 필요한 관절강 내 주입이 가능하고, 주입된 관절강 내에서 겔화를 통해 조성물의 분해 속도를 늦추고, 약물의 체류 시간이 증가함에 따라 지속적인 윤활작용과 충격완화로 관절강의 연골 조직 수복 효과가 충분히 발휘될 수 있어 뛰어난 치료 효과를 얻을 수 있을 것으로 기대된다.
도 1은 본 발명의 관절강 주사용 조성물의 물성 상태를 확인한 결과이다. 각각의 관절강 주사용 조성물을 제조한 후 3일 동안 방치한 후, 조성물의 투명도와 침전물 생성 및 층 분리 여부를 확인하였다.
도 2는 본 발명의 실시예 1-1의 관절강 주사용 조성물의 온도에 따른 졸-겔 전이가 일어나는 하이드로겔 형성을 확인한 결과를 보여주고 있다.
도 3은 관절강 주사용 조성물 투여에 의한 염증반응 유도 여부를 통해 생체적합성을 확인한 결과를 보여주고 있다.
도 4는 관절염 유발 후, 본 발명의 관절강 주사용 조성물(실시예 1-1, 실시예 2-1 및 실시예 2-7) 주입에 따른 쥐의 보행 속도(도 4A) 및 보폭(도 4B)을 확인한 결과를 보여주고 있다.
도 5는 관절염 유발 후, 본 발명의 관절강 주사용 조성물(실시예 1-1 및 실시예 2-1) 주입에 따른 프로테오글리칸의 생합성 정도를 확인한 결과를 보여주고 있다.
이하 본 발명의 바람직한 실시예를 상세히 설명하기로 한다. 그러나, 본 발명은 여기서 설명되는 실시예에 한정되지 않고 다른 형태로 구체화될 수도 있다. 오히려, 여기서 소개되는 내용이 철저하고 완전해지고, 당업자에게 본 발명의 사상을 충분히 전달하기 위해 제공하는 것이다.
<실시예 1. 핵산 및 키토산을 포함하는 관절강 주사용 조성물 제조>
핵산 저장용액(stock solution)의 경우 핵산을 190mM 소듐 포스페이트 디베이직 도데카하이드레이트(sodium phosphate dibasic dodecahydrate) 완충용액에 넣고 70℃의 열교반기를 이용하여 30분 이상 용해하여 제조하였다.
키토산 저장용액은 100mM 아세트산(acetic acid)을 이용하여 제조하였다.
제조한 핵산 및 키토산 저장용액을 혼합하여 70℃의 열교반기에서 30분 동안 교반하였다. 그 후 온도를 상온으로 낮추며 1시간 동안 교반하여 핵산 및 키토산을 포함하는 관절강 주사용 조성물을 제조하였다. 이때, 핵산 및 키토산의 농도가 하기 표 1의 농도가 되도록 혼합하였다.
구성 최종 농도(중량%) 혼합비율(중량비율)
핵산 키토산 핵산 키토산
실시예 1-1 1.5 0.015 100 1
실시예 1-2 0.1 0.001 100 1
실시예 1-3 0.1 0.1 1 1
실시예 1-4 3 0.001 3000 1
실시예 1-5 3 0.1 30 1
< 실시예 2. 핵산, 키토산 및 히알루론산을 포함하는 관절강 주사용 조성물 제조>
핵산 저장용액의 경우 핵산을 190mM 소듐 포스페이트 디베이직 도데카하이드레이트(sodium phosphate dibasic dodecahydrate) 완충용액에 넣고 70℃의 열교반기를 이용하여 30분 이상 용해하여 제조하였다.
키토산 저장용액은 100mM 아세트산(acetic acid)을 이용하여 제조하였다.
제조한 핵산 및 키토산 저장용액을 혼합하여 70℃의 열교반기에서 30분간 교반하였다. 핵산 및 키토산 혼합 용액에 히알루론산 원료를 추가 혼합하여 60℃의 열교반기에서 1시간 교반 후, 3시간 동안 상온에서 교반하여 핵산, 키토산 및 히알루론산을 포함하는 관절강 주사용 조성물을 제조하였다. 이때, 핵산, 키토산 및 히알루론산의 농도가 하기 표 2의 농도가 되도록 혼합하였다.
구성 최종 농도(중량%) 혼합비율(중량비율)
핵산 키토산 히알루론산 핵산 키토산 히알루론산
실시예 2-1 1.5 0.03 1.5 50 1 50
실시예 2-2 0.1 0.001 0.1 100 1 100
실시예 2-3 0.1 0.001 3 100 1 3000
실시예 2-4 0.1 0.1 0.1 1 1 1
실시예 2-5 0.1 0.1 3 1 1 30
실시예 2-6 3 0.001 0.1 3000 1 100
실시예 2-7 3 0.001 3 3000 1 3000
실시예 2-8 3 0.1 0.1 30 1 1
실시예 2-9 3 0.1 3 30 1 30
상기 히알루론산은 분자량이 1,000kDa인 것을 사용하였으나, 분자량이 20kDa 내지 10,000kDa 인 것을 사용해도 무방하다.
<비교예 1. 비교 대상의 관절강 주사용 조성물 제조>
하기 표 3에 해당되는 성분 및 함량에 해당되는 혼합비율에 따라 비교대상의 관절강 주사용 조성물을 제조하였다. 제조방법은 상기 실시예 1 및 실시예 2와 동일한 방법을 이용하였다.
구성 최종 농도(중량%) 혼합비율 (중량비율)
핵산 키토산 히알루론산 핵산 키토산 히알루론산
비교예 1-1 2 0 0 1 0 0
비교예 1-2 0 1 0 0 1 0
비교예 1-3 0 0 2 0 0 1
비교예 1-4 1.5 0 1.5 1 0 1
비교예 1-5 1.5 0.0001 0 15000 1 0
비교예 1-6 1.5 1 0 1.5 1 0
비교예 1-7 0.001 0.0001 0.001 10 1 10
비교예 1-8 0.001 0.000001 0.001 1000 1 1000
비교예 1-9 1.5 0.5 1.5 3 1 3
비교예 1-10 1.5 0.00075 1.5 2000 1 2000
비교예 1-11 6 0.03 1.5 200 1 50
비교예 1-12 6 0.03 6 200 1 200
비교예 1-13 0 0.03 1.5 0 1 50
비교예 1-14 0 0.03 6 0 1 200
< 실험예 1. 관절강 주사용 조성물의 물성 확인>
상기 실시예 1(실시예 1-1 내지 실시예 1-5), 실시예 2(실시예 2-1 내지 실시예 2-9) 및 비교예 1(비교예 1-1 내지 비교예 1-14)의 관절강 주사용 조성물을 이용하여 겔화, 겔의 안정성 및 용해성 여부를 확인하였다.
각각의 조성물을 혼합하고 3일 동안 방치한 후 투명도와 겔화 상태를 육안으로 관찰하였고, 겔화 정도는 레오미터를 이용하여 24℃부터 40℃까지 1℃씩 올려주면서 1분간 유지시켜 점탄성 측정값의 증가 변화로 확인하였으며, 겔의 안정성은 침전물 생성 및 층 분리 여부로 확인하였다. 겔의 용해성 여부는 37.5℃의 수용액에 실시예 1, 실시예 2 및 비교예 1의 관절강 주사용 조성물을 점적하여 겔화시킨 후 온도를 37.5℃로 유지하면서, 400rpm으로 5분 동안 교반하면서 겔의 용해 여부를 확인하였고, 그 결과를 표 4 및 도 1에 나타내었다.
구성 3일 경과 후 결과 37.5℃에서 5분 동안
교반 결과
점탄성 침전물 생성 층 분리 겔의 용해
실시예 1-1 ○ × × ×
실시예 1-2 ○ × × ×
실시예 1-3 ○ × × ×
실시예 1-4 ○ × × ×
실시예 1-5 ○ × × ×
실시예 2-1 ○ × × ×
실시예 2-2 ○ × × ×
실시예 2-3 ○ × × ×
실시예 2-4 ○ × × ×
실시예 2-5 ○ × × ×
실시예 2-6 ○ × × ×
실시예 2-7 ○ × × ×
실시예 2-8 ○ × × ×
실시예 2-9 ○ × × ×
비교예 1-1 ○ × × ○
비교예 1-2 × × × ○
비교예 1-3 ○ ○ ○ ○
비교예 1-4 ○ × × ○
비교예 1-5 ○ × × ○
비교예 1-6 × ○ × ○
비교예 1-7 × × × ○
비교예 1-8 × × × ○
비교예 1-9 ○ ○ × ○
비교예 1-10 ○ × × ○
비교예 1-11 × ○ × ×
비교예 1-12 × ○ × ×
비교예 1-13 ○ ○ ○ ○
비교예 1-14 ○ ○ ○ ○
상기 표 4 및 도 1을 살펴보면, 실시예 1 및 실시예 2의 관절강 주사용 조성물의 경우에는 3일이 경과하여도 침전물 생성 및 층 분리 현상이 나타나지 않으면서도 점탄성을 유지하고 있는 것을 알 수 있으며, 겔의 용해성의 경우 37.5℃에서 겔을 형성하고, 형성된 겔이 지속적으로 유지되는 것을 관찰하였다.
그러나, 비교예 1의 비교 대상의 관절강 주사용 조성물의 경우에는 침전물이 생성되거나, 층 분리가 일어나거나 부분적으로 덩어리가 생성되어 점탄성의 측정이 불가능하였으며, 겔의 용해성의 경우 37.5℃에서 겔화 되지 않거나 겔화가 되더라도 5분 이내에 모두 용해되는 것으로 확인되었다. 특히나, 비교예 1-13 및 비교예 1-14의 관절강 주사용 조성물과 같이 핵산이 포함되지 않은 경우에는 조성물이 점탄성을 가지지만 침전물 생성 및 층 분리 현상이 나타나며 37.5℃에서 겔이 형성 된 후 5분 이내에 모두 용해되어 안정성이 떨어지는 것을 확인하였다(표 4 참조).
이를 통해, 본 발명의 관절강 주사용 조성물은 온도 변화에 따라 온도감응성을 나타내고, 겔화 된 후에도 겔의 형태를 지속적으로 유지한다는 것을 알 수 있었으며, 이에 따라, 주입된 본 발명의 조성물이 관절강 내에서 겔화 되어 점성과 탄성이 회복되어 지속적인 윤활작용과 함께 충격을 흡수함으로써 관절을 보호할 수 있고, 약물 체류성이 증가되어 손상된 연골조직의 수복 효과를 증대시킴으로써 우수한 관절염 치료 효과를 나타낼 수 있음을 예상할 수 있다.
< 실험예 2. 온도에 따른 졸-겔 전이(sol-gel transition) 확인>
상기 실시예 1, 실시예 2 및 비교예 1의 관절강 주사용 조성물의 온도 변화에 따른 졸-겔 전이가 일어나는 하이드로겔 형성을 확인하였다.
졸-겔 전이를 확인하기 위해서 레오미터(rheometer)를 이용하였다. 이때 사용한 측정조건은 PU20, 간격(Gap) 0.5㎜, 0.1Hz, 1% 응력-변형률(stress strain)로 24℃부터 40℃까지 1℃씩 올려주면서 1분간 유지시켜 G'(탄성) 및 G"(점성)의 변화를 측정하였다. 또한, 각각의 조성물에 온도를 가하여 36℃ 전·후의 졸-겔 상변화를 육안으로 관찰하여 도 2에 나타내었다.
도 2에서 보여주듯이, 실시예 1-1의 관절강 주사용 조성물이 36℃ 미만의 온도에서는 졸의 형태를 띠는 반면에 36℃가 넘으면 겔화 되는 것을 관찰하였다. 이러한 결과는 실시예 1 및 실시예 2의 관절강 주사용 조성물 모두에서 동일하게 나타나는 것을 확인하였다.
이를 통해 본 발명의 관절강 주사용 조성물이 온도에 따라 졸-겔 전이가 일어나는 온도감응성 하이드로겔 성질을 나타낸다는 것을 알 수 있었다.
<실험예 3. 실험 동물의 준비>
동물실험은 7주령의 Sprague-Dawley계 수컷 쥐(Rat)를 영바이오(성남시, 대한민국)로부터 구입하여 사용하였다. 사료는 실험동물용 고형사료(Harlan laboratories, Inc., USA)를 사용하였고 급이기에 고형사료를 넣어 자유섭취 시켰다. 음수는 수돗물을 필터유수살균기로 여과한 후 자외선을 조사하였고, 자동급수장치로 자유섭취 시켰다. 실험동물 사육실의 환경은 온도 23±3℃, 상대습도 55±15%, 조명시간 12시간(오전 8시 점등~오후 8시 소등) 및 조도 150~300Lux로 유지하였다.
<실험예 4. 관절강 주사용 조성물의 생체적합성 확인>
상기 실험예 3의 쥐를 이소플루란(Isoflurane)을 이용하여 호흡마취 시켰다. 마취한 쥐의 오른쪽 무릎 부위의 털을 깎고 베타딘 솜으로 주사부위를 소독한 다음 멸균된 1cc의 인슐린 주사기와 30게이지(gauge)의 바늘을 이용하여 상기 실시예 1-1 및 실시예 2-1의 관절강 주사용 조성물 0.05cc를 오른쪽 무릎에 주사하였고, 대조군으로서 식염수(Saline)를 동일한 방법으로 주사하였다.
관절강 주사용 조성물 주입 후 CO2 가스로 쥐를 희생시킨 후, 오른쪽 무릎 조직을 잘라 포르말린으로 고정하였고, 일련의 탈수 작업을 거쳐 파라핀에 심어 파라핀 블록을 제작하였다. 이때, 정상군으로 아무것도 처리하지 않은 쥐의 왼쪽 무릎의 조직도 함께 파라핀 블록을 제작하였다. 제작한 파라핀 블록을 5㎛ 두께로 조직 절편하고, 조직 절편을 Mayer's hematoxyline(Sigma, USA) 용액에 1초간 반응 시킨 후, 흐르는 물에서 10분간 세척하였다. 이후 eosin(Sigma, USA) 용액에 3초간 반응시켰다. 염색이 완료된 조직은 탈수과정을 거쳐 Permount®(Fischer scientific, USA)로 봉입하였다. H&E 염색한 조직 절편을 현미경을 이용하여 조직병리학적 변화의 유무를 관찰함으로써 생체적합성을 확인하였고, 그 결과를 도 3에 나타내었다.
도 3에서 보여주듯이, H&E로 염색한 조직 절편을 살펴보면, 실시예 1-1 및 실시예 2-1의 관절강 주사용 조성물을 주입한 경우에 식염수를 주입한 대조군 및 아무것도 처리하지 않은 정상군과 동일하게 염증반응이 나타나지 않았다.
이를 통해, 본 발명의 관절강 주사용 조성물이 조직에서의 면역반응이나 염증을 일으키지 않는 생체적합적인 조성물임을 확인하였다.
<실험예 5. 관절강 주사용 조성물의 통증 완화 효과 확인>
상기 실험예 3의 쥐를 이소플루란(Isoflurane)을 이용하여 호흡마취 시켰다. 마취한 쥐의 오른쪽 무릎 부위의 털을 깎고 베타딘 솜으로 주사부위를 소독한 다음 멸균된 1cc의 인슐린 주사기와 30게이지(gauge)의 바늘을 이용하여 0.9% 염화나트륨(sodium chloride, NaCl)에 희석한 MIA(modosodium iodoacetate) 1㎎/50㎕를 관절강 내 주사 요법(intra-articular injection)을 통해 무릎에 1회 주입한 후 1주일 동안 사육하여 관절염을 유발하였다.
관절염을 유도시킨 쥐를 이소플루란(Isoflurane)을 이용하여 호흡마취 시켰다. 마취한 쥐의 오른쪽 무릎 부위의 털을 깎고 베타딘 솜으로 주사부위를 소독한 다음 멸균된 1cc의 인슐린 주사기와 30게이지(gauge)의 바늘을 이용하여 상기 실시예 1, 실시예 2 및 비교예 1의 관절강 주사용 조성물을 주 1회, 총 4번을 주사하였다. 조성물은 1회에 0.05cc씩 주사하였다. 이때, 대조군으로서 식염수를 오른쪽 무릎에 주사하였고, 정상군으로서 관절염을 유도하지 않은 쥐를 이용하였다.
통증 완화 효과는 관절강 주사용 조성물을 4회 주입 후, 쥐가 플라스틱 케이지(150㎝×13㎝×16㎝)를 통과할 때, 케이지 바닥면을 비디오카메라를 통해 촬영하여 쥐의 움직임을 관찰하고, 쥐의 발바닥을 인식하는 프로그램을 통해 촬영한 영상을 이용하여 쥐의 보행속도와 보폭을 분석함으로써 확인하였다. 그 결과를 도 4에 나타내었다.
도 4의 쥐의 보행 속도(도 4A) 및 보폭(도 4B)을 확인한 결과에서 보여주듯이, 식염수를 주사한 대조군의 경우, 정상군에 비해 쥐의 보행 속도 및 보폭이 감소된 반면에, 실시예 1-1, 실시예 2-1 및 실시예 2-7의 관절강 주사용 조성물을 주사한 경우에 관절염에 의해 감소된 보행 속도 및 보폭이 회복되어 정상군과 비슷한 것으로 나타났다. 이는 실시예 1 및 실시예 2의 관절강 주사용 조성물 모두에서 비슷한 효과가 나타나는 것을 확인하였다. 그러나, 도 4에 표기한 비교예 1-1, 비교예 1-3, 비교예 1-4 및 비교예 1-12의 관절강 주사용 조성물을 비롯한 나머지 비교예 1의 조성물에서 쥐의 보행 속도 및 보폭이 대조군과 비슷한 것으로 나타났다.
이는, 관절강 내에 주사된 본원발명의 관절강 주사용 조성물에 의해 관절염이 치료됨으로써 관절염에 의한 통증이 완화되어 쥐의 보행 속도 및 보폭이 증가된 것으로 사료된다. 또한, 본원발명의 관절강 주사용 조성물은 온도감응성을 갖고 있으며, 체온에 의해 겔화되어 점탄성을 갖는 특성으로 인해 관절의 윗뼈와 아랫뼈 간의 마찰을 줄이고, 충격을 흡수함으로써 통증을 완화시키는 효과를 증가시키는 것으로 예측된다.
< 실험예 6. 관절강 주사용 조성물의 연골 재생 효과 확인>
실험예 6-1. 관절염 동물 모델 제조 및 조성물 주입
상기 실험예 3의 쥐를 이소플루란(Isoflurane)을 이용하여 호흡마취 시켰다. 마취한 쥐의 오른쪽 무릎 부위의 털을 깎고 베타딘 솜으로 주사부위를 소독한 다음 멸균된 1cc의 인슐린 주사기와 30게이지(gauge)의 바늘을 이용하여 0.9% 염화나트륨(sodium chloride, NaCl)에 희석한 MIA(modosodium iodoacetate) 1㎎/50㎕를 관절강내 주사 요법(intra-articular injection)을 통해 무릎에 1회 주입한 후, 관절염이 유발되도록 1주일 동안 사육하였다. 관절염의 유도가 성공적으로 이루어졌음은 쥐의 보행속도 저하와 보폭이 감소된 것으로 확인하였다.
관절염이 유도된 쥐의 오른쪽 무릎에 상기 실시예 1, 실시예 2, 및 비교예 1의 관절강 주사용 조성물 및 대조군인 식염수(saline)를 주사한 후 케이지 안에 넣고 안정한 환경 속에서 사육하였다. 이때, 관절강 주사용 조성물 및 식염수는 0.05cc씩 1주일마다 1회씩 총 4회 주사하였다.
실험예 6-2. 관절강 주사용 조성물의 연골재생 효과 확인
상기 실험예 6-1에서 본 발명의 관절강 주사용 조성물을 4회 주입한 후, CO2 가스로 쥐를 희생시키고, 각 실험군에 대해 아무것도 처리하지 않은 왼쪽 무릎 조직(정상)과 비교예 및 실시예의 약물을 주사한 오른쪽 무릎의 양쪽 무릎 연골 조직을 잘라 연골 재생 효과를 확인하였다.
연골 재생 효과는 프로테오글리칸(proteoglycan) 염색을 통해 확인하였다. 프로테오글리칸은 연골아세포 증식에 관여하는 물질로 연골아세포의 증식은 연골 생성에 필수적인 과정 중 하나이다.
무릎 연골 조직을 포르말린으로 고정하고 일련의 탈수 작업을 거쳐 파라핀에 심어 파라핀 블록을 제작하였다. 제작한 파라핀 블록을 5㎛ 두께로 조직 절편하고, 프로테오글리칸(proteoglycan)을 사프라닌 O(Safranin O) 염색 방법을 이용하여 염색하고, 프로테오글리칸의 양을 비교하였다. 이때 정상군으로 관절염을 유도하지 않은 쥐의 왼쪽 무릎 조직을 이용하였고, 대조군으로 관절염을 유도시킨 후 식염수를 처리한 쥐의 무릎 조직을 이용하였다. 프로테오글리칸의 양은 정상군 조직의 프로테오글리칸 양을 100% 기준으로 하여 상대적인 염색면적 비율로 계산하였고, 그 결과를 도 5 및 표 5에 나타내었다.
구성 프로테오글리칸 (%)
정상군 100
대조군 42
실시예 1-1 83
실시예 1-3 81
실시예 1-4 84
실시예 2-1 88
비교예 1-1 59
비교예 1-2 47
비교예 1-5 60
비교예 1-10 62
도 5에서 보여주듯이, 사프라닌 O 염색에 의해 붉은 색으로 염색된 연골 표면의 프로테오글리칸(화살표로 표시)을 살펴보면, 대조군의 경우, 정상군과 대비하여 연골 표면에 붉은 색으로 염색된 부분이 감소된 것을 통해 관절염 유발에 의해 프로테오글리칸의 양이 감소된 것을 알 수 있다. 이에 반해, 실시예 1-1 및 실시예 2-1의 관절강 주사용 조성물을 주사한 경우에는 대조군에 비해 연골 표면의 프로테오글리칸의 양이 증가되어 붉은 색으로 염색된 부분이 증가한 것을 확인하였다.
상기 표 5의 프로테오글리칸의 상대적인 염색면적 비율을 계산한 결과를 살펴보면, 정상군에 비해 대조군의 수치가 42%로 나타나는 반면에, 실시예 1-1, 실시예 1-3, 실시예 1-4 및 실시예 2-1의 관절강 주사용 조성물을 주사한 경우에는 80% 이상의 수치를 나타내고 있다. 그러나 비교예 1-1, 비교예 1-2, 비교예 1-5 및 비교예 1-10의 관절강 주사용 조성물을 주사한 경우에는 실시예 1 및 실시예 2의 관절강 주사용 조성물을 주사한 경우보다 그 수치가 낮은 것을 알 수 있다.
이를 통해, 본원발명의 실시예 1 및 실시예 2의 관절강 주사용 조성물의 관절강 내 주사에 의해 관절염이 유도된 관절강 내의 연골에서 프로테오글리칸의 발현이 증가됨으로써 연골 재생 수복이 일어남을 알 수 있습니다.

Claims (16)

  1. 조성물 총 중량을 기준으로 핵산 0.1중량% 내지 3중량% 및 키토산 0.001중량% 내지 0.1중량%를 포함하며,
    상기 핵산 및 키토산의 중량비율이 1:1 내지 3000:1인 것을 특징으로 하는 통증 완화를 위한 관절강 주사용 조성물.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. 제1항에 있어서,
    상기 핵산은 디옥시리보핵산(deoxyribonucleic acid, DNA), 리보핵산(ribonucleic acid, RNA) 또는 이들의 혼합물인 것을 특징으로 하는 통증 완화를 위한 관절강 주사용 조성물.
  6. 제5항에 있어서,
    상기 핵산은 디옥시리보핵산(deoxyribonucleic acid, DNA) 인 것을 특징으로 하는 통증 완화를 위한 관절강 주사용 조성물.
  7. 제6항에 있어서,
    상기 디옥시리보핵산은 올리고뉴클레오타이드(oligonucleotide), 폴리뉴클레오타이드(polynucleotide) 및 폴리디옥시리보뉴클레오타이드(polydeoxyribonucleotide)에서 선택되는 것을 특징으로 하는 통증 완화를 위한 관절강 주사용 조성물.
  8. 제1항에 있어서,
    상기 핵산은 분자량이 1kDa 내지 100,000kDa인 것을 특징으로 하는 통증 완화를 위한 관절강 주사용 조성물.
  9. 제8항에 있어서,
    상기 핵산은 분자량이 10kDa 내지 10,000kDa인 것을 특징으로 하는 통증 완화를 위한 관절강 주사용 조성물.
  10. 제9항에 있어서,
    상기 핵산은 분자량이 50kDa 내지 3,500kDa인 것을 특징으로 하는 통증 완화를 위한 관절강 주사용 조성물.
  11. 제1항에 있어서,
    상기 키토산은 분자량이 3kDa 내지 1,000kDa인 것 특징으로 하는 통증 완화를 위한 관절강 주사용 조성물.
  12. 제1항에 있어서,
    상기 조성물은 수용성 고분자를 추가성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는 통증 완화를 위한 관절강 주사용 조성물.
  13. 제12항에 있어서,
    상기 수용성 고분자는 히알루론산(hyaluronic acid), 콘드로이틴황산(chondroitin sulfate), 글리코겐(glycogen), 덱스트린(dextrin), 덱스트란(dextran), 덱스트란 황산(dextran sulfate), 히드록시프로필메틸셀룰로스(hydroxypropyl methylcellulose), 알긴산(alginic acid), 키틴(chitin), 풀루란(pullulan), 콜라겐(collagen), 젤라틴(gelatin) 및 이들의 가수분해물, 폴리비닐알코올(polyvinyl alcohol), 폴리비닐피롤리돈(polyvinyl pyrrolidone), 폴리아크릴산(polyacrylic acid) 및 카르복시비닐 중합체(carboxylvinylpolymer)로 이루어진 군 중에서 선택되는 1종 이상인 것을 특징으로 하는 통증 완화를 위한 관절강 주사용 조성물.
  14. 제13항에 있어서,
    상기 수용성 고분자는 히알루론산(hyaluronic acid)인 것을 특징으로 하는 통증 완화를 위한 관절강 주사용 조성물.
  15. 제1항에 있어서,
    상기 조성물은 온도에 따라 졸-겔 전이가 일어나는 하이드로겔인 것을 특징으로 하는 통증 완화를 위한 관절강 주사용 조성물.
  16. 제1항에서 있어서,
    상기 관절강 주사는 척추 간판 탈출증, 오십견, 어깨관절 충돌 증후군, 손목터널 증후군, 변형성 관절증, 테니스/골프 엘보, 복합적인 부위별 동통 증후군, 기타 건염 및 만성 관절류머티즘으로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 증상에 투여되는 것을 특징으로 하는 통증 완화를 위한 관절강 주사용 조성물.
KR1020160179457A 2016-08-25 2016-12-26 핵산 및 키토산을 포함하는 관절강 주사용 조성물 KR101916193B1 (ko)

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