TW201322988A - 關節炎之治療注射劑 - Google Patents
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Abstract
本發明係關於用於關節性疾病之治療或癥狀性改良的關節內注射劑組成物,其係包含與伸烷基二胺交聯之玻尿酸水凝膠。根據本發明之組成物係顯示良好之生物相容性、由於優異之體內滯留而藉由一次注射達成之長期的關節鎮痛效果、軟骨保護效果及對於滑膜炎之抑制效果。結果,根據本發明之組成物可有效地用作關節炎之治療性注射劑。
Description
本發明係關於一種注射劑組成物,其可用作關節炎之治療性注射劑,以一次注射於關節處顯示長期的鎮痛效果、軟骨保護效果及滑膜炎抑制效果;以及包含該組成物之套組。
骨關節炎(Osteoarthritis,OA),其係顯示功能異常性且係由關節疼痛及退化所造成,係老年人之常見疾病,且由於全球之老齡化趨勢,業經逐漸變得更加普遍。骨關節炎之成因仍未得以明確界定,但其癥狀如疼痛、水腫及有限之關節移動係二級發炎反應之結果,其中,往復之破壞及再生係出現於透明軟骨、滑膜及骨組織中。迄今為止,骨關節炎注射劑之治療性目的係聚焦於癥狀之緩解,以藉由減輕疼痛與延緩疾病之進展來維持關節功能及生活品質,而非恢復關節之結構性損傷。作為對患有骨關節炎之患者的一種治療,業經施行玻尿酸-治療性注射,其中,玻尿酸係相繼注射入關節中。
玻尿酸係生物聚合物,其中,由N-乙醯基-D-葡萄糖胺與D-葡萄糖醛酸組成之重複單元係線性鏈結,且係富含於眼球之玻璃體液、關節之滑液等中。當將玻尿酸注射入關節中時,其藉由作為潤滑劑及減震劑而緩解關節疼痛並改良關節功能。舉例而言,
Synvisc®、Hyalgan®等可於美國商購之。惟,因為此等製劑本質上由玻尿酸本身所構成,而玻尿酸係具有於投藥至人體之後僅幾小時之短半衰期,於一段時間內顯示對於骨關節炎之效能,不可避免的要進行一系列三(3)至五(5)次注射。惟,因為多次注射對於患者及醫生兩者皆繁複且沒效率,故需要具有相同效能之一次注射。如是,在歐洲及美國主要發展一次注射,其中,藉由玻尿酸之交聯而增加半衰期(體內滯留)。舉例而言,若干文獻業經報導經交聯之玻尿酸衍生物的合成,其中,具有兩(2)個官能基之化合物如二乙烯基碸、雙過氧化物、雙鹵化物、甲醛等係用作交聯劑,且基於此等製備方法之產物係可商購之作為退化性關節炎的治療性注射劑(黏彈性補充劑(viscosupplement))。
舉例而言,美國專利第4,582,865號係揭露經交聯之玻尿酸衍生物,其中,二乙烯基碸(DVS)係用作交聯劑,且其水凝膠複合物係可於Synvisc-one®商標商購之。美國專利第5,827,937號係揭露用於製備經交聯之玻尿酸衍生物的製程,其中,多官能環氧化合物係用作交聯劑。他們之中,Durolane®,其藉由使用1,4-丁二醇二環氧丙基醚(BDDE)作為多功能環氧化合物之交聯劑而製備之水凝膠製劑,得到歐洲CE認證且可於多個國家商購之。彼等產物全部係藉由在玻尿酸之羥基與交聯劑之間交聯而製備。儘管彼等產物之體內滯留相較於未交聯之玻尿酸有所增加,仍存在體內滯留之問題,事實上,他們仍於六(6)個月內降解。如是,基於玻尿酸降解酶之識別位點係玻尿酸之羧基的概念,本發明之申請人遞交了韓國專利申請案第10-2008-0074260號,其係關於藉由使用己二酸二醯肼(ADH)作為交聯劑而製備玻尿酸-ADH之交聯產物
的方法,其中,該ADH係鏈結至玻尿酸之羧基。惟,其具有低生物相容性之問題。同時,GEL-ONE®業經於近期獲得U.S.FDA之PMA認可,由於其係採用與上述可商購之產物相反的方式,將交聯劑鏈結至羧基(美國專利第6,031,017號),預期其顯示良好之體內滯留。
同時,因為玻尿酸之經交聯產物係藉由使用於體內可能被識別為外來物質之化學品作為交聯劑而製備,可能存在生物相容性之問題,故,於投藥至體內後降解的例子中,可能藉由殘留之交聯劑而造成免疫反應。結果,對於具有更優異之生物相容性的交聯產物存在需求。
如上述解釋者,對於可用作關節炎治療性注射劑且藉由一次注射而於關節處顯示長期鎮痛效果、軟骨保護效果及滑膜炎抑制效果,並且具有體內長期滯留及高生物相容性的注射劑組成物具有強烈需求。
美國專利第4,582,865號(於1986年4月15日揭露)
美國專利第5,827,937號(於1998年10月27日揭露)
韓國專利申請案第10-2008-0074260號(於2009年2月5日揭露)
美國專利第6,031,017號(於2000年2月29日揭露)
本發明係欲以解決上述先前技術之問題。本發明之目標係提
供具有優異之體內滯留以及生物相容性的注射劑組成物,其係用作關節炎之一次治療性注射劑,以及製備該組成物之方法。
為實現上述目標,本發明係提供用於關節性疾病之治療或癥狀性改良的關節內注射劑組成物,其係包含作為活性組分之下述式1之與伸烷基二胺交聯的玻尿酸水凝膠:[式1][HA]m-C(O)-NH-R1-NH-C(O)-[HA]n
其中,HA係表示除去一個羧基之玻尿酸,或其鹽,R1 係表示未經或經羥基、C1-C6烷基或C1-C6烷氧基取代之C3-C10伸烷基,以及m及n係彼此獨立表示10,000至4,000,000之整數。
較佳地,於本發明之組成物中所使用之玻尿酸的分子量係20,000至4,000,000道爾頓(Da)。
較佳地,於本發明之組成物中,伸烷基二胺係1,6-己二胺。
較佳地,於本發明之組成物中,該經交聯之水凝膠的交聯率係5至35%。
較佳地,於本發明之組成物中,該經交聯之水凝膠係佔,基於該注射劑之總重,0.4至3.0(w/w)%之量。
較佳地,於本發明之組成物中,以一次注射投藥之後,其鎮痛效果係持續兩週或更長時間。
較佳地,本發明之組成物復包含未改質之玻尿酸。
於該例中,其中,本發明之組成物復包含未改質之玻尿酸,與伸烷基二胺交聯之玻尿酸水凝膠與未改質之玻尿酸的重量比較
佳係5:5至9.5:0.5,更佳係7:3至9.5:0.5.。
較佳地,本發明之組成物係顯示緩解由關節性疾病造成之關節疼痛的鎮痛效果、對由關節性疾病造成之軟骨退化的抑制效果、以及對由關節性疾病造成之滑膜炎的抑制效果,因此,其有用於作為關節性疾病之治療或癥狀性改良的治療性注射劑。
較佳地,本發明之組成物有用於作為骨關節炎之治療或癥狀性改良的一次治療性注射劑。
本發明之組成物的剩餘部份係由藥學上可接受之載劑如水、生理食鹽水等構成。
此外,於本說明書中,術語「玻尿酸」係用以指玻尿酸之鹽或衍生物以及玻尿酸本身。因此,後文中所使用之術語「玻尿酸水溶液」係包括下列之全部:玻尿酸水溶液、玻尿酸之鹽的水溶液、及其混合水溶液。
第1圖係HA-HMDA交聯產物之合成過程的示意圖以及所合成之交聯產物結構。
第2圖係表示根據本發明之實施例1至4之組成物投藥之群組與負控制群組的大鼠關節疼痛緩解效果之比較圖。
第3圖係表示根據本發明之實施例1之組成物投藥之群組與傳統製劑投藥之比較性群組及負控制群組的大鼠關節疼痛緩解效果的比較圖。
第4圖係表示根據本發明之實施例1、3及4之組成物投藥之群組與負控制群組的大鼠關節之輕微軟骨損傷表面的比較圖。
第5圖係表示根據本發明之實施例1、3及4之組成物投藥之
群組與負控制群組的大鼠關節之重大軟骨損傷表面的比較圖。
第6圖係表示根據本發明之實施例1之組成物投藥之群組與傳統製劑投藥之比較性群組及負控制群組的大鼠關節之重大軟骨損傷率(%)的比較圖。
第7圖係表示根據本發明之實施例1之組成物投藥之群組與傳統製劑投藥之比較性群組及負控制群組的兔膝關節股骨之軟骨損傷率的比較圖。
第8圖係表示將根據本發明之實施例1之組成物投藥之群組與傳統製劑投藥之比較性群組及負控制群組的兔膝關節脛骨之軟骨損傷率的比較圖。
第9圖係各群組之真皮組織標本於H&E染色後的光學顯微照片,以比較包含本發明之HA-HMDA交聯水凝膠之組成物與正常群組對組織的效果。所標記之條柱係表示10μm。((A):正常群組;(B)投藥實施例1之HA-HMDA水凝膠的群組;E:表皮;D:真皮;H:下皮)。
第10圖係表示根據本發明之實施例2之組成物與比較性產物藉由玻尿酸酶造成之降解與彈性模數(G’)的關聯圖(○:實施例2;●:比較性產物)。
第11圖係用於觀察根據本發明之實施例2之組成物與比較性產物於股骨之損傷、軟骨厚度以及是否降低軟骨細胞,且所標記之條柱係表示220 μm。((A):正常控制;(B):骨關節炎控制;(C)比較實施例:控制製劑群組;(D):實施例2投藥群組)。點狀線係表示用於製備組織學檢查之部位,而箭頭係表示該軟骨之厚度。
第12圖係表示根據本發明之實施例2之組成物以及比較實施
例之控制製劑於股骨及脛骨軟骨處之總Mankin分數。
後文中,詳細解釋用於製備根據本發明之注射劑組成物中使用之與伸烷基二胺交聯之玻尿酸水凝膠的方法。
於本發明中使用之與伸烷基二胺交聯之玻尿酸水凝膠係藉由在羧基活化劑與肽鍵結催化劑之存在下使玻尿酸與伸烷基二胺化合物反應而製備。
使用具有10,000至4,000,000 Da,更佳20,000至4,000,000 Da之分子量的玻尿酸(HA)。可藉由調節HA之分子量或濃度而控制所製備之經交聯之水凝膠的降解速率。通常,若HA之初始濃度較高,則所製備之經交聯之水凝膠的交聯率較高。據此,經交聯之水凝膠係顯示低體內降解速率。較佳地,HA可以1.0至3.5(w/w)%,更佳3.0(w/w)%之濃度使用。若該濃度低於1.0(w/w)%,可能難以獲得所欲之體內降解速率。若該濃度高於3.5(w/w)%,所製備之水凝膠可能乾燥且容易破裂。
該伸烷基二胺化合物可係未經或經羥基、C1-C6烷基或C1-C6烷氧基取代之C3-C10伸烷基二胺化合物,較佳係C3-C7伸烷基二胺,更佳係C4-C6伸烷基二胺,且最佳係C6伸烷基二胺(1,6-己二胺)。該伸烷基二胺化合物,以玻尿酸之重複單元為基準計,可以3.5至80 mol%,較佳10至30 mol%,且最佳10至25 mol%使用。
作為該羧基活化劑,可使用水溶性碳二亞胺之碳二亞胺,如1-烷基-3-(3-二甲基胺基丙基)碳二亞胺如1-乙基-3-(3-二甲基胺基丙基)碳二亞胺(EDC),1-烷基-3-(3-(三甲基銨基)丙基)碳二亞胺如1-乙基-3-(3-(三甲基銨基)丙基)碳二亞胺(ETC),以及1-環烷基
-3-(2-N-嗎啉基乙基)碳二亞胺如1-環己基-3-(2-N-嗎啉基乙基)碳二亞胺(CMC),更佳係1-乙基-3-(3-二甲基胺基丙基)碳二亞胺(EDC)。每1莫耳玻尿酸,該羧基活化劑較佳係以1至5倍之莫耳比率使用。
作為該肽鍵結催化劑,可使用,舉例而言,1-羥基苯并三唑(HOBt)、3,4-二氫-3-羥基-4-側氧基-1,2,3-苯并三(HOOBt)、1-羥基-7-氮雜苯并三唑(HOAt)、磺基-N-羥基磺基琥珀醯亞胺(Sulfo-NHS)、四氟硼酸O-(1H-苯并三唑-1-基)-N,N,N',N'-四甲基脲鹽(TBTU),更佳係1-羥基苯并三唑(HOBt)。每1莫耳玻尿酸,該肽鍵結催化劑較佳係以1至5倍之莫耳比率使用。
較佳地,藉由使用1,6-己二胺(HMDA)作為伸烷基二胺化合物製備之玻尿酸-1,6-己二胺交聯產物係於第1圖中表述。如自第1圖可見者,玻尿酸之羧基係於羧基活化劑與肽鍵結催化劑之存在下經由醯胺鍵而與伸烷基二胺化合物之胺基交聯。玻尿酸羧基係涉及於玻尿酸酶(一種玻尿酸降解酶)之識別的重要基團。於本發明之與伸烷基二胺交聯之玻尿酸水凝膠中,玻尿酸之羧基係用於交聯,故可藉由最小化在投藥至體內之後由降解酶造成之玻尿酸的降解而增加體內滯留。
上述交聯反應通常係於水中施行。可將玻尿酸、伸烷基二胺化合物、羧基活化劑及肽鍵結催化劑分別溶解於水中並隨後混合,或者,可將玻尿酸及伸烷基二胺化合物之溶液與溶解有羧基活化劑及肽鍵結催化劑之溶液混合。具體而言,於使用EDC作為羧基活化劑之例中,其可於弱酸條件下變為N-乙基-N-(3-二甲基胺基丙基)脲(EDU)。結果,若將溶解於水中之EDC向玻尿酸與待
交聯之伸烷基二胺之混合物中的加入延遲,所製備之交聯產物之物理特性可能出現劣化,如於殺菌後降低組成物之彈性模數。較佳地,自溶解至加入所需的時間可為10至30分鐘內,更佳係10至20分鐘內。此外,反應溫度可維持於30至50℃,更佳係43至45℃。於上述溫度,水凝膠化反應係有效進行,因此,水凝膠通常於30分鐘內形成。再者,可藉由在上述溫度保持至少9小時而製備具有良好黏彈性之水凝膠。於這期間,保持但不攪拌係較佳者。隨著額外反應時間的增加,物理特性如黏彈性增加。惟,超過9小時後,所製備之水凝膠的物理特性如黏彈性有輕微改變。此外,所製備之交聯水凝膠的交聯率可根據製備時之pH而變,其係物理特性改變之結果。該pH可藉由將NaOH水溶液加入反應溶液中而調節,且pH較佳可係5.5至6.5,更佳係6.0至6.3。具體而言,藉由將pH調節為5.5至6.5,甚至於使用相對小量之交聯劑(如,1,6-己二胺)及反應催化劑(如,羧基活化劑如EDC及肽鍵結催化劑如HOBt)可製備與伸烷基二胺交聯之水凝膠,該水凝膠係具有良好之物理特性如黏彈性且甚至於殺菌之後無物理化學特性如黏彈性之改變。於低於pH 5.5之酸性環境中製備之水凝膠係顯示相對低之彈性模數(G’),且彈性可於殺菌時進一步降低。藉由穿行通過篩子或藉由使用均質機,將所製備之水凝膠作成均勻之顆粒。具體而言,較佳係採用使用篩子之均質過程,以獲得具有窄粒徑分佈及低壓出力之水凝膠。於交聯反應之後,可藉由使用透析膜於PBS中透析24小時至3天或藉由使用乙醇水溶液及/或緩衝液移除未反應之材料,將該材料降至偵檢極限(2 ppm)之下。惟,具有更易溶解於有機溶劑中之趨勢的催化劑如HOBt
未能藉由使用透析膜及PBS之透析方法得以良好純化,但其可藉由使用乙醇水溶液及/或緩衝液輕易移除至偵檢極限之下。此時,緩衝劑較佳可係PBS溶液或氯化鈉(NaCl)溶液,更佳係氯化鈉(NaCl)溶液。若所使用之NaCl的濃度較高,則純化較容易,且NaCl之濃度較佳係0.5至1.5%,更佳係1至1.3%。此外,於加入乙醇水溶液如80%乙醇水溶液之例中,水凝膠顆粒係作為沉澱物形成,且未反應之材料於此步驟中得以輕易移除。可使用氮氣將所沉澱之水凝膠乾燥為粉體形式,且該粉體水凝膠可使用生理學可接受之水溶液復水。此時,該生理學可接受之水溶液較佳係PBS或生理食鹽水,且可使用20至30倍(體積比)(以該與伸烷基二胺交聯之水凝膠粉體為基準計)的生理學可接受之水溶液進行復水。
本發明之玻尿酸-伸烷基二胺交聯水凝膠係具有5至35%,較佳10至20%之交聯率。若該交聯率低於5%,由於該水凝膠可輕易地被玻尿酸酶(一種玻尿酸降解酶)因增加未涵蓋於玻尿酸之交聯中之未反應-COOH基的比例而降解,可能難以獲得所欲之體內滯留。若該交聯率大於35%,可能難以顯示達到通常保護關節所需之水凝膠的溶脹能力及黏彈性,且生物相容性低,如由於在體內降解之後殘留之交聯劑的含量高所致高發炎反應之風險。此外,若水凝膠之交聯率低,則物理特性如殺菌之後的黏彈性可能劣化。本發明之玻尿酸-伸烷基二胺交聯產物的交聯率係指,參與交聯之玻尿酸含量與全部玻尿酸含量之百分比。可藉由調節用作交聯劑之伸烷基二胺與全部玻尿酸之使用比或調節製備時之pH來控制該交聯率。交聯率之量測可輕易地藉由該技藝之習知方法實施,如NMR分析及TNBS檢測(Habeeb,A.F.S.A.,Determination of
free amino groups in proteins by trinitrobenzenesulfonic acid.Anal.Biochem.,1966.14:pp.328-333)。與使用DVS作為交聯劑之HA-二乙烯基碸(DVS)交聯水凝膠相比,本發明之由玻尿酸-伸烷基二胺產物構成的上述水凝膠係顯示極低之降解速率,且與使用ADH作為交聯劑之HA-己二酸二醯肼(ADH)交聯水凝膠相比,本發明之水凝膠係顯示良好之物理特性如溶脹能力。
本發明之組成物較佳係包含,以該組成物之總重為基準計,0.4至3.0(w/w)%,更佳1.0至2.0 w/w(%)之上述與伸烷基二胺交聯之玻尿酸水凝膠。若該水凝膠之含量低於0.4(w/w)%,所製備之組成物可能不具有所欲之體內滯留及壓出力(extrusion force)。若該水凝膠之含量大於3.0(w/w)%,其可能由於該組成物之壓出力過高而難以注射入組織中。
同時,本發明之組成物除了包含該玻尿酸-伸烷基二胺交聯水凝膠之外,可復包含未改質(亦即,未交聯)之玻尿酸。未改質之HA通常係與玻尿酸-伸烷基二胺交聯水凝膠之製備中所使用者相同。未改質之HA係作為潤滑劑以減小該組成物之壓出力,因此,當將該組成物充填入注射器中時,其可以低壓力注射入組織中。於本發明之組成物復包含未改質之玻尿酸之例中,玻尿酸-伸烷基二胺交聯水凝膠與未改質之玻尿酸的重量比較佳係5:5至9.5:0.5,更佳係7:3至9.5:0.5。此外,該未改質之玻尿酸的含量,以該組成物之總重為基準計,較佳係0.1至2.0(w/w)%,更佳係0.15(w/w)%。若該未改質之玻尿酸的含量低於0.1(w/w)%,壓出力可能無法降至所欲之程度。若該水凝膠之含量大於2.0(w/w)%,由於物理特性在殺菌之後劣化如彈性模數過低,體內滯
留可能下降。
該組成物之剩餘部份係由藥學上可接受之載劑如水、生理食鹽水等構成。
該關節內注射劑組成物,其係包含根據本發明之與伸烷基二胺交聯之玻尿酸水凝膠,更佳係包含重量比為5:5至9.5:0.5的與伸烷基二胺交聯之玻尿酸水凝膠以及未改質之玻尿酸,藉由顯示保護關節所需之生物相容性及潤滑作用、保護關節表面所需之優異之物理特性、減震性等以及長期之體內滯留,其可適宜地用作良好之一次治療性注射劑用於關節炎之治療或癥狀性改良。
將分子量約為230 kDa之玻尿酸(HA,製造商:Lifecore Co.)以1(w/w)%之濃度完全溶解於蒸餾水中,隨後將1,6-己二胺(HMDA)加入其中,藉由與HA之羧基反應而進行交聯。將HMDA以HA之重複單元的72 mol%之量加入。將1.4倍於該HA重複單元之量的1-乙基-3-(3-二甲基胺基丙基)碳二亞胺(EDC)(一種羧基活化劑)及1-羥基苯并三唑(HOBt)溶解於蒸餾水中,並隨後將之加入至上述之HA與HMDA的混合溶液中。為了HA-HMDA交聯產物之完全交聯反應,上述混合溶液係於37℃反應1小時。該溶液之pH係5.0至5.5。隨後,以預先洗滌之透析膜(截留分子量為7 kDa)密封HA-HMDA水凝膠,並以0.01M PBS(磷酸鹽緩衝生理食鹽水,pH 7.4)透析24小時,以移除殘留之EDC、HOBt及HMDA。所製
備之HA-HMDA水凝膠的交聯率為8至9%。
將分子量約為1,000 kDa之玻尿酸(HA,製造商:Lifecore Co.)以1(w/w)%之濃度完全溶解於蒸餾水中,隨後將1,6-己二胺(HMDA)加入其中,藉由與HA之羧基反應而進行交聯。將HMDA以HA之重複單元的72 mol%之量加入。將1.4倍於該HA重複單元之量的1-乙基-3-(3-二甲基胺基丙基)碳二亞胺(EDC)(一種羧基活化劑)及1-羥基苯并三唑(HOBt)溶解於蒸餾水中,並隨後將之加入至上述之HA與HMDA的混合溶液中。為了HA-HMDA交聯產物之完全交聯反應,上述混合溶液係於37℃反應1小時。該溶液之pH係5.0至5.9。隨後,以預先洗滌之透析膜(截留分子量為7 kDa)密封HA-HMDA水凝膠,並以0.01M PBS(磷酸鹽緩衝生理食鹽水,pH 7.4)透析24小時,以移除殘留之EDC、HOBt及HMDA。所製備之HA-HMDA水凝膠的交聯率為11至13%。
將分子量約為1,000 kDa之玻尿酸(HA,製造商:Lifecore Co.)以3(w/w)%之濃度完全溶解於蒸餾水中,隨後將1,6-己二胺(HMDA)加入其中,藉由與HA之羧基反應而進行交聯。將HMDA以HA之重複單元的20 mol%之量加入。藉由加入0.25 N NaOH水溶液將pH調節為6.0至6.5。將1.0倍於該HA重複單元之量的1-乙基-3-(3-二甲基胺基丙基)碳二亞胺(EDC)(一種羧基活化劑)及1-羥基苯并三唑(HOBt)溶解於水中,並隨後將之加入至上述之HA與HMDA
的混合溶液中。為了HA-HMDA交聯產物之完全交聯反應,該混合溶液係於45℃攪動30分鐘,隨後於45℃於不攪動下保持10小時。首先將所製備之HA-HMDA水凝膠破碎,隨後使其穿行通過200 μm孔徑之篩,以獲得均質水凝膠。藉由加入80%乙醇,獲得呈沉澱物之水凝膠粉體,隨後將100倍體積之1.3% NaCl溶液加入其中,攪動1小時。再次加入80%乙醇以獲得沉澱物,隨後將所獲水凝膠沉澱物加入100%乙醇中10分鐘,並於減壓下乾燥以移除殘留之EDC、HOBt及HMDA。藉由LC分析,可證實未反應之材料係控制為低於2 ppm之偵檢極限。所製備之HA-HMDA水凝膠的交聯率為10至14%。
將根據製備實施例3之方法製備並乾燥的玻尿酸-伸烷基二胺水凝膠、未改質之玻尿酸以及生理食鹽水以下表1之比例混合,於121℃殺菌15分鐘以獲得關節內注射劑。
根據韓(Hahn)等人(Hahn SK et al.,Int.J.Biol.Macromol.,2007;
40;pp.374-380),將100 mg分子量約為234 kDa之玻尿酸(HA,製造商:Lifecore Co.)溶解於20ml水中,以製備HA水溶液(5 mg/ml)。將以HA為基準計之莫耳比為40倍過量之己二酸二醯肼(ADH)粉體(1.736 g)加至該HA水溶液中,並完全溶解10分鐘。使用1 N HCl水溶液將所獲HA/ADH混合水溶液之pH調節至4.8,並完全攪動該溶液。於攪動下將莫耳比為4倍過量之1-乙基-3-(3-二甲基胺基丙基)碳二亞胺(EDC,0.191 g)加入其中,以活化HA之羧基。將1 N HCl水溶液加至該水溶液中,以將pH維持為4.8,進行該反應2小時。2小時之後,藉由加入1 N NaOH水溶液將pH增至7.0,以終止反應。為了降低黏度及雜質(未交聯之ADH),將所獲產物以預先洗滌之透析膜(截留分子量為7 kDa)密封,並隨後以100 mM NaCl水溶液透析60小時。隨後,分別以乙醇及蒸餾水重複透析。透析之後,將該水溶液冷凍乾燥3天以獲得HA-ADH衍生物。將根據上述方法獲得之HA-ADH於0.01 M PBS(pH 7.4)中溶解2小時。將醯肼專用交聯劑雙[磺基琥珀醯亞胺基]辛二酸鹽(BS3)溶解於PBS中,隨後加至該HA-ADH溶液。此時,BS3之加入量係HA-ADH之醯肼的20 mol%。將該水溶液完全混合,隨後反應1小時進行完全之交聯反應,以獲得HA-ADH交聯水凝膠。
根據Oh等人所述(Oh EJ et al.,J.Biomed.Mater.Res A.,2008;86;pp.685-693),將68 mg分子量約為230 kDa之玻尿酸(HA,製造商:Lifecore Co.)溶解於1.68 ml之0.2 N NaOH水溶液(pH 13)中。於完全溶解後,將二乙烯基碸(DVS)加入其中,藉由與HA之
羥基反應而進行交聯。此時,玻尿酸之羥基與所加入之DVS的莫耳比為1:1。該溶液於37℃反應1小時以獲得HA-DVS水凝膠。以預先洗滌之透析膜(截留分子量為7 kDa)密封所製備之水凝膠,隨後以PBS透析24小時,使得離子(Na+及OH-)透過透析膜擴散而出,從而中和所密封之HA-DVS交聯產物。
作為根據本發明之注射劑組成物的控制製劑,係使用可作為關節炎用三次注射劑而商購之HYALFORTE INJ.TM(Shin Poong Pharmaceutical Co.,Ltd.,1%玻尿酸鈉)。
為了預測用於本發明之玻尿酸交聯水凝膠的體內滯留,實施製備實施例1、製備比較實施例1及2之玻尿酸交聯水凝膠之藉由玻尿酸降解酶造成的降解。
將相同質量之製備實施例1、製備比較實施例1及2的玻尿酸交聯水凝膠合併入各小瓶中。將包含50 U之玻尿酸降解酶(來自鏈黴菌(Streptomyces hyalurolyticus)之玻尿酸酶,Sigma-Aldrich)的0.2 M PBS(pH 6.2)加入該等小瓶中。將該混合物於37℃反應預定之48小時。隨後完全移除上清液,量測剩餘之玻尿酸交聯產物的質量。係以剩餘之交聯產物與初始之交聯產物的重量比(%)計算該交聯產物之降解。根據經過時間之降解率(%)係表示於表2中。自表2可見,HA-DVS交聯產物係於約25小時內完全降解,其中,玻尿酸-伸烷基二胺交聯水凝膠甚至於40小時之後僅部份降解。自此結果可證實,根據本發明之玻尿酸-伸烷基二胺交聯水凝膠具
有比可商購之水凝膠優越之體內滯留。
此外,與顯示類似之降解率之製備比較實施例1之HA-ADH交聯產物相比,根據本發明之玻尿酸-伸烷基二胺交聯水凝膠係顯示兩(2)倍或更高之溶脹能力。自此可知,根據本發明之玻尿酸-伸烷基二胺交聯水凝膠係顯示高體內滯留及優異之溶脹能力。
為了預測本發明之包含玻尿酸交聯水凝膠之組成物符合注射器及注射針頭的壓出力,實施此測試。
使用萬用測試器(Universal Tester,EZ-S-500N,SHIMADZU Corp.,Japan)量測實施例1至4之組成物以及比較實施例1之控制製劑的壓出力。將樣本充填至3 ml之玻璃注射器中,隨後將通常用於注射關節炎用治療性注射劑之18G(guage)、20G及22G注射針頭連結至該注射器。以1 mm/分鐘之速度量測壓出力。結果係表示於表3中。
自上述結果可見,僅有實施例1之包含玻尿酸-伸烷基二胺交聯水凝膠的組成物顯示相當高之壓出力。咸信,此結果可能由於該組成物中所使用之水凝膠的高黏彈性。同時,其中混合有未改質之玻尿酸的實施例2至4係顯示相較於實施例1之組成物降低相當多之壓出力。具體言之,若未改質之玻尿酸的比例較高,則壓出力降低。自此結果可知,可藉由調節未改質之玻尿酸的混合比來控制該組成物之物理特性,使具有根據從業者之實際方便性以及患者之安全性使用於注射器及注射針頭之適當壓出力。
流變特性係代表交聯水凝膠之物理特性的最重要因素之一。以根據Ghosh等人之敘述(Biomacromolecules,2005;6:pp.2857-2865),使用AR 2000控制應力流變儀(T.A.Instruments Ltd.,USA)以及4-cm、2°-錐體及平板幾何於0.1至20 Hz以1%應變及振盪模式量測實施例1至4之組成物的彈性模數。於3 Hz量測之彈性模數(G’)係表示於表4中。
自上述結果可見,若未改質之玻尿酸的混合比較高,該彈性模數係顯示變得較低之趨勢。若該彈性模數降低,注射進入該關節時之壓出力降低,且潤滑效果增加。惟,體內滯留縮短。因此可知,未改質之玻尿酸的混合比應以多種因素之觀點決定。
根據實驗實施例2及3之結果,於實施例1之例中,與體內滯留相關之彈性模數最高,但由於未加入未改質之玻尿酸,壓出力相當高。於實施例3及4之例中,由於彈性模數低,壓出力低,但體內滯留可能不好。於實施例2之例中,該組成物係顯示適當之彈性模數及壓出力。
藉由使用通常用作關節炎模型之MIA誘發大鼠關節炎模型測試實施例1至4之組成物的關節疼痛緩解效能。於乾淨地移除大鼠右後腿膝蓋周圍的毛髮之後,藉由使用Hamilton注射器將25μl之骨關節炎誘發劑MIA(碘乙酸單鈉)注射入右後腿之膝關節腔內,以誘發骨關節炎(Bove S.E et al.,Osteoarthritis and Cartilage.11:821-830;Combe R et al.,Neurosci.Lett.370(2-3):236-240)。於注射MIA 7天後,將35μl之實施例1至4之組成物注射進入膝關節腔內。
為了評估關節疼痛緩解效果,使用雙足平衡測痛儀
(incapacitance tester,Linton Instrument Co.,UK,Model No.600R)於誘發骨關節炎後之第1天、第7天、第14天及第21天量測左爪及右爪之重量(g),隨後計算左後爪重量分佈之改變(HPWD,%)。
左後爪重量分佈之改變(%)=[左後爪負載之重量/(左後爪負載之重量+右後爪負載之重量)]×100
所量測之值係表示為均值(%)±藉由計算左後爪與兩隻後爪之重量之重量比的標準偏差。
左後爪重量分佈之改變係表示,以百分比計算之由於誘發關節炎造成的右膝疼痛而左後爪更多負載之重量程度。量測值為50%係無關節炎之正常狀態。
作為測試之結果,於負控制群組之例中,自第14天至21天,左後爪重量分佈之改變係維持於75%或更高,然而,於投藥實施例1、2、3及4之組成物的群組中,與該負控制群組相比,左後爪重量分佈之改變於第14天係分別降低14.0%、13.8%、10.8%及10.8%。因此,全部測試群組係顯示顯著之藥效。此外,於投藥後第21天,與該負控制群組相比,投藥實施例1、2及4之組成物之群組的左後爪重量分佈之改變係分別降低17.0%、15.7%及11.5%。此等結果證實顯著之藥效(參見表5及第2圖)。
藉由使用MIA誘發大鼠關節炎模型,將實施例1之組成物與比較實施例之控制製劑的骨關節炎疼痛緩解效能作比較。全部測試方法係與上述實驗實施例4中相同,但下述者除外。實施例1之組成物係僅於關節炎誘發後第7天投藥一次,但比較實施例之製劑係於關節炎誘發之後第7天、第17天及第27天投藥三(3)次。投藥之後,經過1週至7週,量測左後爪重量分佈之改變並表示於表6中。
全部群組於關節炎誘發之前的左後爪重量分佈之改變係49至50%,其係顯示兩隻後爪處於平衡狀態。惟,於藉由MIA誘發骨關節炎之後第7天,全部群組之左後爪重量分佈之改變皆增加。自投藥之後第7天至第21天,實施例3之組成物係顯示相較於負控制群組言低的左後爪重量分佈改變。此結果證實顯著之藥效。於投藥之後第35天,實施例2與比較實施例兩者係顯示顯著之藥效(p<0.01)。甚至於投藥之後第49天,實施例2與比較實施
例兩者係顯示顯著之藥效(p<0.05)(表6,第3圖)。自上述結果可見,本發明之組成物僅一次投藥即顯示長達7週之疼痛緩解效果,並顯示比在相同時間段內投藥三(3)次之比較實施例來得更好的疼痛緩解效果。
藉由使用通常用作關節炎模型之MIA誘發大鼠關節炎模型測試實施例1、3及4之組成物的關節疼痛緩解效能。以上述實驗實施例4中揭示之方法誘發大鼠關節炎。於誘發關節炎之後第21天,通過腹部大動脈收集全血,於右膝切口以分離股骨與脛骨。以顯微鏡(VHX-600,20倍放大)對所分離之脛骨的軟骨損傷面積拍照,並使用圖像分析器量測。軟骨之全面積(WA)係指該膝關節之軟骨分佈於脛骨處的整體面積,白色粗糙面積(WRA)係指小(minor)軟骨損傷面積,該處之軟骨係損傷為沒有光澤及粗糙,而中空面積(HA)係指大(major)軟骨損傷面積,該處之軟骨係損傷為曝露之軟骨基底的海綿質骨。
1)軟骨損傷面積之量測
於投藥實施例1之組成物的群組中,觀察到輕微軟骨損傷面積及重大軟骨損傷面積係分別比負控制群組顯著降低(p<0.05)38.5%及67.7%(表7,第4圖)。同時,於投藥實施例3及4之組成物的群組中,觀察到重大軟骨損傷面積降低。
2)輕微軟骨損傷率
輕微軟骨損傷率係指軟骨之白色粗糙面積(WRA)與全面積(WA)的比。亦即,輕微軟骨損傷率(%)係表示為WRA/WA×100。
於投藥實施例1、3及4之組成物的群組中,輕微軟骨損傷率係分別比負控制群組降低40.3%、15.8%及12.0%(表8,第4圖)。
3)重大軟骨損傷率
重大軟骨損傷率係指軟骨之中空面積(HA)與全面積(WA)的比。亦即,重大軟骨損傷率(%)係表示為HA/WA×100。於投藥實施例1、3及4之組成物的群組中,重大軟骨損傷率係分別比負控制群組降低39.1%、26.5%及35.2%(表9,第5圖)。
藉由使用MIA誘發大鼠關節炎模型測試實施例1之組成物與比較實施例之控制製劑的軟骨保護效果。全部測試方法係與上述實驗實施例5相同,但下述者除外。實施例1之組成物係僅於關節炎誘發之後第7天投藥一次,但比較實施例之控制製劑係於關節炎誘發之後第7天、第17天及第27天投藥三(3)次。所計算之重大軟骨損傷率係表示於第6圖中。
自第6圖可見,投藥實施例1之組成物的群組以及投藥比較實施例之控制製劑的群組兩者皆顯示降低重大軟骨損傷面積的效果。同時,一次注射之實施例1組成物群組以及三次注射之比較性製劑群組係顯示,其對重大軟骨損傷比負控制群組分別降低24%與19%的效果。僅一次注射根據本發明之實施例1之組成物的群組係顯示比投藥比較實施例之控制製劑的群組來得更好的軟骨保護效果。
使用藉由兔半月板切除術誘發之骨關節炎的模型測試實施例1之組成物與比較實施例之控制製劑的骨關節炎軟骨保護效果。
將兔子的一條腿進行無菌處理並切口之後,自前部至中部切割約二分之一(1/2)之內側半月板。於鎮痛注射之後,藉由使得兔子在跑步機上自主運動而誘發關節炎。於手術之後第5週,將0.3 ml之實施例1之組成物與比較實施例之控制製劑注射入膝關節腔中,而比較實施例之控制製劑的第二次及第三次投藥係分別於第7週與第9週進行。最終,於關節炎誘發之後第7週,對兔子進
行屍體解剖,並量測股骨及脛骨處之軟骨損傷面積。結果係分別表示於表10及第7圖以及表11及第8圖中。
自上表之結果可見,投藥實施例1之組成物的群組與投藥比較實施例之控制製劑的群組兩者皆顯示降低膝關節中軟骨損傷面積的效果。亦即,於一次注射實施例1組成物之群組以及三次注射比較製劑之群組兩者中,股骨處之軟骨損傷面積均比負控制群組下降。於脛骨處,實施例1組成物之群組與比較製劑之群組兩者中的軟骨損傷面積亦降低。具體言之,投藥根據本發明之實施例1之組成物的群組係顯示相較於投藥比較實施例之控制製劑之群組顯著優異的軟骨保護效果。
評估本發明中使用之實施例1之玻尿酸交聯水凝膠組成物的生物相容性。
根據藤村(Fujimura)等人(Fujimura T et al.,J.Dermatol.Sci.,
2000;24;pp.105-111)之敘述,於六週大之雌性無毛小鼠(SKH型,Jung-Ang Lab Animal Inc.,Korea)背上刺出矩形(1.5×1.5 cm2)紋身,隨後,將實施例1之玻尿酸交聯水凝膠經皮下注射入該矩形紋身中。藉由使用27G針頭將0.4 ml之本發明之玻尿酸交聯水凝膠注射入該小鼠之矩形紋身內的背側皮下層中。於投藥玻尿酸交聯水凝膠之後第12週,藉由使用蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin,H&E)染色進行組織學測試。自各小鼠獲取皮膚樣本,隨後以10%(v/v)緩衝甲醛固定該皮膚樣本,以乙醇脫水,包埋入石蠟中以作成標本,以4μm厚度切片,並以H&E染色。以光學顯微鏡拍攝經染色之標本的照片,並表示於第9圖中。自第9圖可見,投藥實施例之水凝膠的小鼠顯示無染色反應,與控制小鼠相同(於H&E之例中,於發炎反應下蘇木精係染為藍色,而伊紅則染為作為對比染色之紅色)。亦即,當以HA-HMDA交聯水凝膠處理(第9圖B)時,表皮係以類似於正常小鼠群組的方式改變,而真皮係顯示無溶血或發炎反應,與正常小鼠群組相同。
自上述結果可知,本發明之包含玻尿酸-伸烷基二胺交聯水凝膠的組成物係顯示非常優異之生物相容性及長期之體內滯留,從而在兩週或更長時間內有效地緩解藉由關節炎造成之疼痛,並保護關節軟骨。結果,本發明之包含玻尿酸-伸烷基二胺交聯水凝膠的組成物可用作治療關節炎之有效的關節內注射劑。
為了量測經殺菌之根據本發明之包含玻尿酸交聯水凝膠的組成物對玻尿酸降解酶的敏感性,進行經修改之習知方法(W.E.
Hennink,Rheological monitoring of long-term degrading polymer hydrogels.J.Rheol.,1999.43(4):933-950)以。藉由與可自Q-Med AB商購之比較產物(其中,玻尿酸之羥基係與BDDE(1,4-丁二醇二環氧丙醚)交聯)(20mg/ml)比較而評估與G’值相關聯之對於玻尿酸降解酶的敏感性。將800μl之經殺菌之實施例2之組成物及比較產物分注於1.5ml試管中。將玻尿酸降解酶(源於牛睾丸,Sigma-Aldrich)以2 mg/ml(2,000 U)之濃度溶解於PBS(pH 7.4)中,並將15μl之該酶溶液分注於各試管中。於37℃反應各預設時間之後,於3 Hz量測彈性模數(G’)。彈性模數(G’)之改變係表示於第10圖中。該比較產物於3 Hz之初始彈性模數為620 Pa,而經殺菌之實施例2之組成物的初始彈性模數為330 Pa。於25小時期間內檢查彈性模數之改變。自第10圖可見,於比較產物例中,其初始彈性模數高,但其藉由玻尿酸降解酶迅速降解,直至3小時其顯示非常低之彈性模數。與此相反,經殺菌之實施例2之組成物甚至直至25小時仍顯示對降解的安定性。此外,證實交聯玻尿酸(HA)之降解與初始彈性模數(G’)無關。
藉由使用誘發骨關節炎之兔模型測試實施例2之組成物以及比較實施例之控制製劑的骨關節炎軟骨保護效果,並藉由組織病理性測試評估具體損傷之程度以量測軟骨厚度及軟骨細胞的下降。
經腹膜注射25mg/kg之舒泰(Zoletile)混合物(Zoletile 50;Vibac Lab.,France)而麻醉測試動物,隨後以麻醉氣體維持通常之麻醉,於該氣體中,1.5%異氟烷(Hana Pharm.Co.,Hwasung,Korea)係與
70% N2O及28.5% O2氣體混合。根據先前之方法(Hanashi et al.,2002;Jiang et al.,2010),曝露左膝關節囊,隨後進行前十字韌帶切除以及局部內半月板切除以誘發骨關節炎。於正常控制中,係打開該關節囊以檢查前十字韌帶及內半月板,隨後將其閉合而未進行切除。於關節炎誘發之後第5週,將0.3 ml之實施例2之組成物及比較實施例之控制製劑注射入該膝關節腔,而比較實施例之控制製劑的第二次及第三次投藥係分別於第7週及第9週進行。於正常控制中,係於關節炎誘發之後第5週將0.3 ml之經殺菌之生理食鹽水注射入該膝關節腔中。
對於組織病理學之觀察,係取得膝關節並固定於10%中性福爾馬林緩衝液中。於24小時固定之後,經固定之關節係於脫鈣之溶液(24.4%甲酸與0.5N氫氧化鈉)中放置5天以脫鈣。隨後,分離表面軟骨並沿長度方向切割以進行石蠟固化。將經固化之標本切割為3至4μm厚度並使用番紅O(Safranin O)染色以便於觀察。藉由以電腦圖像分析程式iSolution FL ver 9.1(IMT i-solution Inc.,Vancouver,Canada)分析所染色之標本以進行組織形態測定術(histomorphometry)。藉由使用圖像分析程式於該關節之相同面積內量測軟骨細胞的數目。結果係表示於第11圖中。自第11圖可見,於骨關節炎控制中,觀察到整體股骨之損傷(黑色染色表面)以及軟骨厚度與軟骨細胞的下降。惟,投藥實施例2之組成物的群組與比較實施例之控制製劑係顯示顯著之改良效果。
藉由使用Mankin分數評估實施例2之組成物及比較實施例之
控制製劑損傷兔關節的程度。Mankin分數係用以評估骨關節炎之最基本之組織生理學觀察,且其評估係基於藉由骨關節炎造成之關節軟骨的表面損傷、染色能力、軟骨細胞數目之改變、以及是否形成聚落(clone)。已知該分數越高,則骨關節炎之風險越大(Armstrong等人[1994]及Lovász等人[2001]使用Safranin O染色)。此外,進行股骨及脛骨關節表面軟骨的組織形態測定術。該組織形態測定術之結果以及股骨及脛骨關節表面軟骨之Mankin分數係分別表示於表12及表13中。
自上表之結果可見,投藥實施例2之組成物的群組以及投藥比較實施例之控制製劑的群組係顯示增加軟骨厚度及軟骨細胞的效果。於骨關節炎控制之例中,係識別股骨及脛骨之表面損傷、軟骨細胞數目之降低、聚落之形成及染色強度之降低。結果,係識別出與正常控制相比於股骨及脛骨處關節軟骨的Mankin分數顯著之(p<0.01)增加。惟,於比較實施例之控制製劑之例中及投藥實施例2之組成物的群組中,存在與正常控制相比於股骨及脛骨處關節軟骨的Mankin分數顯著之(p<0.01)降低。亦即,投藥實施例2之組成物的群組以及三次注射比較實施例之控制製劑的群組兩者皆顯示於股骨及脛骨處之軟骨保護效果。此外,觀察到Mankin分數之整體降低。於骨關節炎控制之例中,係識別出與正常控制相比於股骨及脛骨關節軟骨的厚度以及每單元面積之軟骨細胞的數目顯著之(p<0.01)降低。惟,於投藥實施例2之組成物的群組及投藥比較實施例之控制製劑的群組之例中,係識別出與正常控制相比於股骨及脛骨關節軟骨厚度以及每單元面積的軟骨細胞數目顯著之(p<0.01)增加。於骨關節炎控制之例中,股骨關節軟骨之Mankin分數係與正常控制相比改變550.00%,而投藥比較實施例之控制製劑的群組以及投藥實施例2之組成物的群組係分別顯示與骨關節炎控制相比-42.31%及-57.69%之改變。於骨關節炎控制中,脛骨關節軟骨之Mankin分數係與正常控制相比改變507.69%,而投藥比較實施例之控制製劑的群組以及投藥實施例2之組成物的群組係分別顯示與骨關節炎控制相比-50.63%及-65.82%之改變。於該骨關節炎控制中,股骨關節軟骨之厚度係比正常控制改變63.19%及111.34%。於脛骨關節軟骨厚度之例中,
該骨關節炎控制係顯示比正常控制-63.06%之改變,而投藥比較實施例之控制製劑的群組以及投藥實施例2之組成物的群組係分別顯示比骨關節炎控制80.82%及135.40%之改變。於股骨處每單元面積之軟骨細胞數目之例中,該骨關節炎控制係顯示比正常控制-73.61%之改變,而投藥比較實施例之控制製劑的群組以及投藥實施例2之組成物的群組係分別顯示比骨關節炎控制166.67%及209.06%之改變。於脛骨處每單元面積之軟骨細胞數目之例中,該骨關節炎控制係顯示比正常控制-70.97%之改變,而投藥比較實施例之控制製劑的群組以及投藥實施例2之組成物的群組係分別顯示比骨關節炎控制84.40%及127.27%之改變。
此外,所有Mankin分數係表示於第12圖中。於股骨及脛骨處之顯著性係表示,相較於正常控制,ap<0.01且bp<0.05,以及,相較於骨關節炎控制,cp<0.01。
該代表圖無元件符號及其代表之意義。
Claims (15)
- 一種用於關節性疾病之治療或癥狀性改良的關節內注射劑組成物,其係包含作為活性組分之下述式1之與伸烷基二胺交聯之玻尿酸水凝膠:[式1][HA]m-C(O)-NH-R1-NH-C(O)-[HA]n其中,HA係表示除去一個羧基之玻尿酸,或其鹽,R1 係表示未經或經羥基、C1-C6烷基或C1-C6烷氧基取代之C3-C10伸烷基,以及m及n係彼此獨立表示10,000至4,000,000之整數。
- 如申請專利範圍第1項所述之組成物,其中,該玻尿酸之分子量係20,000至4,000,000道爾頓。
- 如申請專利範圍第1項所述之組成物,其中,該伸烷基二胺係1,6-己二胺。
- 如申請專利範圍第1項所述之組成物,其中,該經交聯之水凝膠的交聯率係5至35%。
- 如申請專利範圍第1項所述之組成物,其中,該經交聯之水凝膠係佔,基於該注射劑之總重,0.4至3.0(w/w)%之量。
- 如申請專利範圍第1項所述之組成物,其中,於投藥之後,鎮痛效果係持續兩週或更長時間。
- 如申請專利範圍第1至6項中任一項所述之組成物,其復包含未改質之玻尿酸。
- 如申請專利範圍第7項所述之組成物,其中,該與伸烷基二胺交聯之玻尿酸水凝膠與該未改質之玻尿酸的重量比為5:5至 9.5:0.5。
- 如申請專利範圍第8項所述之組成物,其中,該與伸烷基二胺交聯之玻尿酸水凝膠與該未改質之玻尿酸的重量比為7:3至9.5:0.5。
- 一種用於緩解由關節性疾病造成之關節疼痛的鎮痛組成物,係包含作為活性組分之如申請專利範圍第1項所述之與伸烷基二胺交聯的玻尿酸水凝膠。
- 一種用於抑制由關節性疾病造成之軟骨退化的組成物,係包含作為活性組分之如申請專利範圍第1項所述之與伸烷基二胺交聯的玻尿酸水凝膠。
- 一種用於抑制由關節性疾病造成之滑膜炎的組成物,係包含作為活性組分之如申請專利範圍第1項所述之與伸烷基二胺交聯的玻尿酸水凝膠。
- 如申請專利範圍第1項及第10至12項中任一項所述之組成物,其中,該關節性疾病係骨關節炎。
- 一種套組,係包含充填如申請專利範圍第1項所述之組成物的注射器。
- 一種套組,係包含充填如申請專利範圍第7項所述之組成物的注射器。
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