ES2822649T3

ES2822649T3 - Composiciones de relleno dérmico a base de ácido hialurónico/colágeno y métodos para obtener las mismas

Info

Publication number: ES2822649T3
Application number: ES13762683T
Authority: ES
Inventors: Jacob Pollock; Xiaojie Yu; Nicholas Manesis
Original assignee: Allergan Inc
Current assignee: Allergan Inc
Priority date: 2011-09-06
Filing date: 2013-09-05
Publication date: 2021-05-04
Anticipated expiration: 2033-09-05
Also published as: AU2013312729A1; HK1199273A1; CA2848026A1; AU2018241098B2; JP6784732B2; EP2753647A1; AU2020256324B2; AU2012304607A1; US20130116411A1; AU2018241098A1; AU2020256324A1; HUE051340T2; AU2016216532B2; US20130116188A1; EP2753647B1; AU2022256160A1; WO2013036568A1; JP2018177818A; AU2013312729B2; CA2848026C

Abstract

Matriz macromolecular reticulada como relleno dérmico inyectable que comprende: un componente de ácido hialurónico; un componente de colágeno derivado de colágeno tipo I o colágeno tipo III; en la que el componente de ácido hialurónico se reticula con el componente de colágeno mediante el uso de un agente de acoplamiento a base de carbodiimida, formando de ese modo un componente de reticulación; en la que el componente de reticulación comprende una pluralidad de unidades de reticulación, en la que al menos una parte de las unidades de reticulación comprenden un enlace éster o un enlace amida; y en la que la matriz macromolecular reticulada se dispersa en un líquido acuoso en forma de hidrogel.

Description

DESCRIPCIÓN

Composiciones de relleno dérmico a base de ácido hialurónico/colágeno y métodos para obtener las mismas

Antecedentes

La presente invención se refiere en general a composiciones de relleno dérmico, y más específicamente se refiere a composiciones de relleno dérmico inyectables que incluyen ácido hialurónico y colágeno reticulados. El ácido hialurónico y el colágeno son componentes estructurales clave de los tejidos humanos. Estos biopolímeros se han usado ampliamente para construir estructuras de soporte de ingeniería de tejidos y materiales para cultivo celular y medicina regenerativa.

El envejecimiento de la piel es un fenómeno progresivo, que se produce a lo largo del tiempo y puede verse afectado por factores del estilo de vida, tales como el consumo de alcohol, el tabaco y la exposición al sol. El envejecimiento de la piel facial puede caracterizarse por atrofia, laxitud y engorde. La atrofia corresponde a una reducción masiva del grosor del tejido cutáneo. La laxitud de los tejidos subcutáneos conduce a un exceso de piel y ptosis y conduce a la aparición de pómulos y párpados caídos. El engorde se refiere a un aumento de peso en exceso por la hinchazón de la parte inferior de la cara y el cuello. Estos cambios se asocian normalmente con sequedad, pérdida de elasticidad y textura áspera.

El hialuronano, también conocido como ácido hialurónico (HA) es un glicosaminoglicano no sulfatado que se distribuye ampliamente por todo el cuerpo humano en los tejidos conjuntivos, epiteliales y neurales. El hialuronano es abundante en las diferentes capas de la piel, en las que tiene múltiples funciones tales como, por ejemplo, para garantizar una buena hidratación, para ayudar en la organización de la matriz extracelular, para actuar como material de relleno; y para participar en mecanismos de reparación tisular. Sin embargo, con la edad, disminuye la cantidad de hialuronano, colágeno, elastina y otros polímeros de la matriz presentes en la piel. Por ejemplo, el exponerse de manera repetida a la luz ultravioleta, por ejemplo, del sol, hace que las células dérmicas tanto disminuyan su producción de hialuronano como aumenten su velocidad de degradación. Esta pérdida de hialuronano da como resultado diversos estados de la piel tales como, por ejemplo, imperfecciones, defectos, enfermedades y/o trastornos, y similares. Por ejemplo, existe una fuerte correlación entre el contenido de agua en la piel y los niveles de hialuronano en el tejido dérmico. A medida que la piel envejece, se reducen la cantidad y calidad de hialuronano en la piel. Estos cambios conducen a sequedad y arrugas de la piel.

Los rellenos dérmicos son útiles en el tratamiento de estados de los tejidos blandos y en otras terapias de la piel porque los rellenos pueden reemplazar polímeros de la matriz endógenos perdidos, o mejorar/facilitar la función de polímeros de la matriz existentes, con el fin de tratar estos estados de la piel. En el pasado, tales composiciones se han usado en aplicaciones cosméticas para rellenar arrugas, líneas, pliegues, cicatrices y para mejorar el tejido dérmico tal como, por ejemplo, para rellenar los labios delgados, o rellenar los ojos hundidos o los pómulos poco profundos. Los productos de relleno dérmico anteriores generalmente estaban compuestos por colágenos. Un polímero de la matriz común usado en las composiciones de relleno dérmico actuales es el hialuronano. Debido a que el hialuronano es natural para el cuerpo humano, generalmente es un tratamiento bien tolerado y de riesgo bastante bajo para una amplia variedad de estados de la piel.

Originariamente, las composiciones que comprenden hialuronano estaban compuestas por polímeros que se producen de manera natural, que existen en un estado no reticulado. Aunque presenta una excelente biocompatibilidad y afinidad por las moléculas de agua, el hialuronano que se produce de manera natural presenta propiedades biomecánicas deficientes como relleno dérmico. Un motivo principal es que debido a que este polímero no está reticulado, es altamente soluble y, como tal, se elimina rápidamente cuando se administra en una región de la piel. Este aclaramiento in vivo se logra fundamentalmente mediante la degradación rápida de los polímeros, principalmente degradación enzimática a través de hialuronidasa y degradación química a través de radicales libres. Por tanto, aunque todavía está en uso comercial, las composiciones que comprenden polímeros de hialuronano no reticulados tienden a degradarse en el plazo de unos días después de la administración y, por tanto, requieren una reinyección bastante frecuente para mantener su efecto de mejora de la piel.

Para minimizar el efecto de estas rutas de degradación in vivo, los polímeros de la matriz se reticulan entre sí para formar un hidrogel estabilizado. Debido a que los hidrogeles que comprenden polímeros de la matriz reticulados son una sustancia más sólida, los rellenos dérmicos que comprenden tales hidrogeles permanecen en su lugar en el sitio del implante durante más tiempo. Además, estos hidrogeles son más adecuados como relleno dérmico porque la naturaleza más sólida de los mismos mejora las propiedades mecánicas del relleno, permitiendo que el relleno levante y rellene mejor una región de la piel. Los polímeros de hialuronano se reticulan normalmente con un agente de reticulación para formar enlaces covalentes entre polímeros de hialuronano. Tales polímeros reticulados forman una red de hidrogel menos soluble en agua que es más resistente a la degradación y, por tanto, requiere una reinyección menos frecuente, que las composiciones de hialuronano no reticulado

La presente invención proporciona nuevas composiciones de relleno dérmico inyectables para mejorar el aspecto de la piel.

Sumario

Por consiguiente, se proporcionan nuevas composiciones de relleno dérmico, así como métodos de obtención de las mismas. Algunas realizaciones incluyen composiciones de hidrogel homogéneas preparadas a partir de ácido hialurónico y colágeno. Estas composiciones pueden prepararse mediante un método que comprende reticulación de ácido hialurónico y colágeno. En algunas realizaciones, el ácido hialurónico y el colágeno se reticulan en condiciones en las que ambos componentes son inicialmente solubles en disolución acuosa.

Algunas realizaciones incluyen un método para preparar una matriz macromolecular reticulada tal como se describe en el presente documento, comprendiendo el método: disolver un ácido hialurónico y un colágeno en una disolución acuosa para formar una disolución acuosa previa a la reacción, en el que la disolución acuosa previa a la reacción comprende además una sal o tiene un pH menor de aproximadamente 4; y modificar la disolución acuosa previa a la reacción para formar una mezcla de reacción de reticulación que comprende: el ácido hialurónico; el colágeno; una carbodiimida soluble en agua; una N-hidroxisuccinimida o una N-hidroxisulfosuccinimida; y opcionalmente la sal; y en el que la reacción de reticulación tiene un pH mayor que el de la disolución acuosa previa a la reacción; y permitir que la mezcla de reacción de reticulación reaccione para reticular de ese modo el ácido hialurónico y el colágeno.

Algunas realizaciones incluyen una matriz macromolecular reticulada como relleno dérmico inyectable que comprende: un componente de ácido hialurónico; un componente de colágeno derivado de colágeno tipo I o colágeno tipo III; en el que el componente de ácido hialurónico se reticula con el componente de colágeno mediante el uso de un agente de acoplamiento a base de carbodiimida, formando de ese modo un componente de reticulación; en la que el componente de reticulación comprende una pluralidad de unidades de reticulación, en la que al menos una parte de las unidades de reticulación comprenden un enlace éster o un enlace amida; y en la que la matriz macromolecular reticulada se dispersa en un líquido acuoso en forma de hidrogel.

Algunas realizaciones incluyen un producto estético de tejido blando que comprende: un dispositivo estético que tiene una forma adecuada para inyectarse en tejido humano; y una etiqueta que comprende instrucciones para inyectar el dispositivo estético en tejido humano; en el que el dispositivo estético comprende una matriz macromolecular reticulada descrita en el presente documento.

Algunas realizaciones incluyen un método de mejora de una cualidad estética de una característica anatómica de un ser humano que comprende: inyectar un dispositivo estético en un tejido del ser humano para mejorar de ese modo la cualidad estética de la característica anatómica; en el que el dispositivo estético comprende una composición de matriz macromolecular reticulada descrita en el presente documento, siempre que el método no sea terapéutico.

Breve descripción de los dibujos

La figura 1A es un gráfico de un barrido de frecuencia para el gel del ejemplo 3.

La figura 1B es un gráfico de un barrido de deformación para el gel del ejemplo 3.

La figura 2 es un perfil de extrusión para el gel del ejemplo 3.

La figura 3 representa imágenes de microscopio electrónico de barrido (imágenes de SEM) del gel del ejemplo 4 mostradas a 50X (A), 1.000X (B) y 40.000X (C).

Descripción detallada

El ácido hialurónico reticulado, el colágeno y los hidrogeles de colágeno reticulado, tales como los usados en rellenos dérmicos, no promueven activamente la infiltración celular y el crecimiento tisular. De manera similar, colágeno combinado simplemente en hidrogeles de ácido hialurónico no promueve la integración tisular o la regeneración tisular de novo. Sin embargo, algunas composiciones descritas en el presente documento sí que promueven la migración celular a los hidrogeles y la formación tisular dentro de los geles cuando se implantan in vivo.

Los hidrogeles de ácido hialurónico-colágeno pueden sintetizarse acoplando un ácido hialurónico con un colágeno usando un agente de acoplamiento, es decir una carbodiimida. En estos hidrogeles, el ácido hialurónico puede servir como componente biocompatible que se une al agua, proporcionando una degradación volumétrica e isovolumétrica. Adicionalmente, el colágeno puede conferir dominios de señalización y adhesión celular para promover la unión celular, la migración y otras funciones celulares tales como la deposición de la matriz extracelular. Los biopolímeros forman hidrogeles homogéneos con propiedades ajustables de composición, de hinchamiento y mecánicas. Las composiciones pueden realizarse para que sean inyectables para su implantación mínimamente invasiva a través de jeringa y aguja.

El ácido hialurónico es un glicosaminoglicano no sulfatado que potencia la retención de agua y resiste tensiones hidrostáticas. Es no inmunogénico y puede modificarse químicamente de numerosas maneras. El ácido hialurónico puede ser aniónico a intervalos de pH de alrededor de o por encima del pKa de sus grupos de ácido carboxílico

Ácido hialurónico

El colágeno es una proteína que forma fibrillas y láminas que soporta cargas de tracción. El colágeno también tiene sitios de unión a integrina específicos para la adhesión celular y se sabe que promueve la unión, la migración y la proliferación celulares. Colágeno puede tener carga positiva debido a su alto contenido de residuos de aminoácidos básicos tales como arginina, lisina e hidroxilisina.

Debido a que el ácido hialurónico puede ser aniónico y el colágeno puede ser catiónico, las dos macromoléculas pueden formar complejos poliiónicos en disolución acuosa. Un complejo poliiónico puede ser significativamente menos soluble en agua que cualquiera del ácido hialurónico o el colágeno y, por tanto, puede precipitar de la disolución acuosa cuando las dos macromoléculas están juntas en una mezcla. Además, los colágenos a menudo son solubles solo a pH bajo y pueden precipitar de la disolución cuando se llevan a un pH adecuado para el acoplamiento de carbodiimida.

En determinadas condiciones, puede combinarse un ácido hialurónico y un colágeno en un líquido acuoso en el que ambos componentes son solubles. A continuación, puede reticularse un ácido hialurónico y un colágeno mientras que ambos están disueltos en una disolución acuosa para formar un hidrogel. Las condiciones de reacción tales como la concentración de ácido hialurónico, la concentración de colágeno, el pH de la disolución y la concentración de sal pueden ajustarse para ayudar a prevenir la formación de complejos poliiónicos entre el ácido hialurónico aniónico y el colágeno catiónico. También pueden ayudar a prevenir la formación de microfibrillas de colágeno, lo que da como resultado la precipitación de la disolución y puede prevenir la reticulación.

Algunas realizaciones incluyen un método de reticulación de ácido hialurónico y colágeno. Este método generalmente comprende una etapa de disolución que da como resultado una disolución acuosa previa a la reacción. En una etapa de disolución, el ácido hialurónico y el colágeno se disuelven en una disolución acuosa que tiene un pH bajo y/o una sal para formar una disolución acuosa previa a la reacción.

El método de reticulación de ácido hialurónico-colágeno comprende además una etapa de activación. En una etapa de activación, se modifica la disolución acuosa previa a la reacción añadiendo al menos una carbodiimida soluble en agua y/o aumentando el pH de la disolución. Si es necesario, también puede añadirse una sal para mantener el ácido hialurónico y el colágeno en disolución a un pH mayor. Por tanto, la mezcla de reacción de reticulación comprende ácido hialurónico y colágeno disueltos o dispersos en un medio acuoso, una carbodiimida soluble en agua, una N-hidroxisuccinimida o una N-hidroxisulfosuccinimida, y opcionalmente una sal, y tiene un pH mayor que el de la disolución acuosa previa a la reacción de la que se derivó. Se permite que la mezcla de reacción de reticulación reaccione para reticular de ese modo el ácido hialurónico y el colágeno.

En algunas realizaciones, puede aumentarse el pH de la disolución acuosa previa a la reacción y puede permitirse que se produzca una cantidad sustancial de formación de fibras en la disolución antes de añadir el agente de acoplamiento soluble en agua. En algunas realizaciones, el agente de acoplamiento soluble en agua puede añadirse a la disolución acuosa previa a la reacción antes de que se produzca sustancialmente cualquier formación de fibras.

La mezcla de reacción de reticulación puede reaccionar para formar una matriz macromolecular reticulada. Dado que la reacción se produce en una disolución acuosa, la matriz macromolecular reticulada se dispersa en un líquido acuoso en forma de hidrogel a medida que se forma mediante una reacción de reticulación. La matriz macromolecular reticulada puede mantenerse en forma de hidrogel porque, en muchos casos, puede usarse una matriz macromolecular reticulada en forma de hidrogel.

En algunas realizaciones, la disolución acuosa previa a la reacción o la mezcla de reacción de reticulación puede comprender además de aproximadamente el 10% a aproximadamente el 90% de un disolvente orgánico en el que el ácido hialurónico tiene escasa solubilidad, tal como etanol, metanol, isopropanol, o similares.

Una vez que se ha producido la reacción de reticulación, la matriz macromolecular reticulada puede transformarse en partículas u homogeneizarse a través de una malla. Esto puede ayudar a formar un hidrogel o suspensión inyectable. La malla usada para transformar en partículas una matriz macromolecular reticulada puede tener cualquier tamaño de poro adecuado dependiendo del tamaño de las partículas deseado. En algunas realizaciones, la malla puede tener un tamaño de poro de aproximadamente 10 micrómetros a aproximadamente 100 micrómetros, de aproximadamente 50 micrómetros a aproximadamente 70 micrómetros, o de aproximadamente 60 micrómetros.

Un hidrogel que comprende una matriz molecular reticulada puede tratarse mediante diálisis para esterilización u otros fines. La diálisis puede llevarse a cabo colocando una membrana semipermeable entre el hidrogel y otro líquido para permitir que el hidrogel y el líquido intercambien moléculas o sales que puedan pasar entre la membrana.

Una membrana de diálisis puede tener un punto de corte de peso molecular que puede variar. Por ejemplo, el punto de corte puede ser de aproximadamente 5.000 daltons a aproximadamente 100.0000 daltons, de aproximadamente 10.000 daltons a aproximadamente 30.000 daltons, o de aproximadamente 20.000 daltons.

La diálisis puede llevarse a cabo frente a una disolución tampón, lo que significa que el líquido en el otro lado de la membrana del hidrogel puede ser una disolución tampón. En algunas realizaciones, la disolución tampón puede ser una disolución de tampón fosfato estéril que puede comprender tampón fosfato, cloruro de potasio y/o cloruro de sodio. Una disolución de tampón de fosfato estéril puede ser sustancialmente isosmótica con respecto al fluido fisiológico humano. Por tanto, cuando se completa la diálisis, el componente líquido de un hidrogel puede ser sustancialmente isosmótico con respecto al fluido fisiológico humano.

En algunas realizaciones, un complejo macromolecular reticulado comprende además un líquido acuoso. Por ejemplo, el complejo macromolecular reticulado absorbe el líquido acuoso de modo que se forma un hidrogel. Un líquido acuoso puede comprender agua con una sal disuelta en ella, tal como un tampón fosfato, cloruro de sodio, cloruro de potasio, etc. En algunas realizaciones, un líquido acuoso puede comprender agua, cloruro de sodio a una concentración de aproximadamente 100 mM a aproximadamente 200 mM, cloruro de potasio a una concentración de aproximadamente 2 mM a aproximadamente 3 mM, y tampón fosfato a una concentración de aproximadamente 5 mM a aproximadamente 15 mM, en el que el pH del líquido es de aproximadamente 7 a aproximadamente 8.

Puede usarse un hidrogel en un producto estético de tejido blando. Un producto estético incluye cualquier producto que mejora cualquier propiedad estética de cualquier parte de un animal o ser humano. Un producto estético de tejido blando puede comprender: un dispositivo estético que tiene una forma adecuada para inyectarse en tejido humano; y una etiqueta que comprende instrucciones para inyectar el componente estético en tejido humano; en el que el dispositivo estético comprende una matriz macromolecular reticulada descrita en el presente documento. Algunos productos pueden comprender la matriz macromolecular reticulada en forma de hidrogel.

Algunas realizaciones incluyen un método de mejora de una cualidad estética de una característica anatómica de un ser humano. Mejorar una cualidad estética de una característica anatómica de un ser humano incluye mejorar cualquier tipo de cualidad estética incluyendo el aspecto, la sensación táctil, etc., y mejorar cualquier característica anatómica, incluyendo las de la cara, las extremidades, el pecho, las nalgas, etc. Un método de este tipo puede comprender: inyectar un dispositivo estético en un tejido del ser humano para mejorar de ese modo la cualidad estética de la característica anatómica; en el que el dispositivo estético comprende una composición de matriz macromolecular reticulada descrita en el presente documento. En algunas realizaciones, la matriz macromolecular reticulada usada en el producto puede estar en forma de hidrogel.

En algunas realizaciones, un hidrogel de un complejo macromolecular reticulado puede tener un módulo de almacenamiento de aproximadamente 1 Pa a aproximadamente 10.000 Pa, de aproximadamente 50 Pa a 10.000 Pa, de aproximadamente 500 Pa a aproximadamente 1000 Pa, de aproximadamente 500 Pa a aproximadamente 5000 Pa, de aproximadamente 850 Pa, a aproximadamente 852 Pa, aproximadamente 560 Pa, aproximadamente 556 Pa, aproximadamente 1000 Pa, o cualquier valor en un intervalo limitado por, o entre, cualquiera de estos valores.

En algunas realizaciones, un hidrogel de un complejo macromolecular reticulado puede tener un módulo de pérdida de aproximadamente 1 Pa a aproximadamente 500 Pa, de aproximadamente 10 Pa a 200 Pa, de aproximadamente 100 Pa a aproximadamente 200 Pa, aproximadamente 20 Pa, aproximadamente 131 Pa, aproximadamente 152 Pa, o cualquier valor en un intervalo limitado por, o entre, cualquiera de estos valores.

En algunas realizaciones, un hidrogel de un complejo macromolecular reticulado puede tener una fuerza de extrusión promedio de aproximadamente 10 N a aproximadamente 50 N, de aproximadamente 20 N a 30 N, o aproximadamente 25 N, cuando el hidrogel se fuerza a través de una jeringa de aguja de 30G moviendo el émbolo de una jeringa de 1 ml que contiene el hidrogel a una velocidad de 100 mm/min durante aproximadamente 11 mm, y midiendo la fuerza promedio desde aproximadamente 4 mm hasta aproximadamente 10 mm.

Una matriz macromolecular reticulada puede tener propiedades de hinchamiento ajustables basándose en las condiciones de reacción y la dilución del hidrogel. En algunas realizaciones, una matriz macromolecular reticulada puede tener una razón de hinchamiento de aproximadamente 20 a aproximadamente 200. La razón de hinchamiento es la razón del peso de la matriz macromolecular reticulada después de la síntesis con respecto al peso de la matriz macromolecular reticulada sin agua. La matriz macromolecular reticulada puede tener un poder de hinchamiento de aproximadamente 1 a aproximadamente 7. El poder de hinchamiento es la razón del peso de la matriz macromolecular reticulada cuando se satura con agua con respecto al peso de la matriz macromolecular reticulada después de la síntesis.

En la reacción de reticulación, el peso molecular del ácido hialurónico puede variar. En algunas realizaciones, el ácido hialurónico puede tener un peso molecular de aproximadamente 200.000 daltons a aproximadamente 10.000.000 daltons, de aproximadamente 500.000 daltons a aproximadamente 10.000.000 daltons, de aproximadamente 1.000.000 daltons a aproximadamente 5.000.000 daltons, o de aproximadamente 1.000.000 daltons a aproximadamente 3.000.000 daltons. Cuando se produce la reacción de reticulación, el producto macromolecular reticulado resultante puede tener un componente de ácido hialurónico derivado del ácido hialurónico en la reacción de reticulación. Por tanto, los intervalos citados anteriormente también pueden aplicarse al peso molecular del componente de ácido hialurónico, por ejemplo, de aproximadamente 200.000 daltons a aproximadamente 10.000.000 daltons, de aproximadamente 500.000 daltons a aproximadamente 10.000.000 daltons, de aproximadamente 1.000.000 daltons a aproximadamente 5.000.000 daltons, o de aproximadamente 1.000.000 daltons a aproximadamente 3.000.000 daltons. El término “peso molecular” se aplica en esta situación a una parte de la matriz, aunque el componente de ácido hialurónico no puede ser realmente una molécula independiente debido a la reticulación. En algunas realizaciones, un ácido hialurónico de peso molecular mayor puede dar como resultado una matriz molecular reticulada que puede tener un módulo de volumen mayor y/o menos hinchamiento.

La concentración de ácido hialurónico en una disolución acuosa previa a la reacción o una mezcla de reacción de reticulación puede variar. En algunas realizaciones, el ácido hialurónico está presente en de aproximadamente 3 mg/ml a aproximadamente 100 mg/ml, de aproximadamente 6 mg/ml a aproximadamente 24 mg/ml, de aproximadamente 1 mg/ml a aproximadamente 30 mg/ml, aproximadamente 6 mg/ml, aproximadamente 12 mg/ml, aproximadamente 16 mg/ml, o aproximadamente 24 mg/ml En algunas realizaciones, una concentración mayor de ácido hialurónico puede conducir a mayor rigidez y/o más hinchamiento en la matriz macromolecular reticulada.

El componente de colágeno derivado del colágeno tipo I o el colágeno tipo III se usa en los métodos y composiciones descritos en el presente documento. Se usa colágeno tipo I, o colágeno tipo III, o una combinación de los mismos. Un colágeno puede derivarse de cultivo celular, tejido animal o medios recombinantes, y puede derivarse de fuentes humanas, porcinas o bovinas. Algunas realizaciones comprenden colágeno derivado de cultivo de fibroblastos humanos. Algunas realizaciones comprenden colágeno que se ha desnaturalizado para dar gelatina.

La concentración de colágeno en una disolución acuosa previa a la reacción o una mezcla de reacción de reticulación puede variar. En algunas realizaciones, el colágeno puede estar presente a una concentración de aproximadamente 1 mg/ml a aproximadamente 40 mg/ml, de aproximadamente 1 mg/ml a aproximadamente 15 mg/ml, de aproximadamente 3 mg/ml a aproximadamente 12 mg/ml, aproximadamente 1,7 mg/ml, aproximadamente 3 mg/ml, aproximadamente 6 mg/ml, aproximadamente 8 mg/ml, o aproximadamente 12 mg/ml.

En algunas realizaciones, la razón en peso de ácido hialurónico con respecto a colágeno en una disolución acuosa previa a la reacción o una disolución acuosa previa a la reacción o una mezcla de reacción de reticulación (por ejemplo [peso de ácido hialurónico]/[peso de colágeno]) puede ser de aproximadamente 0,5 a aproximadamente 7, de aproximadamente 1 a aproximadamente 5, o de aproximadamente 1 a aproximadamente 3, o de aproximadamente 1 a aproximadamente 2, o aproximadamente 1, o aproximadamente 2. Cuando se produce la reacción de reticulación, el producto macromolecular reticulado resultante puede tener un componente de colágeno derivado del colágeno en la reacción de reticulación. Por tanto, la matriz macromolecular reticulada resultante puede tener una razón en peso de componente de ácido hialurónico con respecto a componente de colágeno que corresponde a la razón en peso en la reacción de reticulación, por ejemplo, de aproximadamente 0,5 a aproximadamente 7, de aproximadamente 1 a aproximadamente 3, de aproximadamente 1 a aproximadamente 2, aproximadamente 1, o aproximadamente 2. Una razón en peso mayor de ácido hialurónico con respecto a colágeno puede dar como resultado una matriz macromolecular reticulada con hinchamiento aumentado, rigidez disminuida y/o adhesión celular disminuida.

Un aumento en la cantidad tanto de ácido hialurónico como de colágeno puede dar como resultado una matriz macromolecular reticulada con rigidez aumentada.

Una sal puede ayudar a filtrar las cargas negativas del ácido hialurónico de las cargas positivas del colágeno, y por tanto puede impedir la precipitación de un complejo de ion poliiónico de la disolución. Sin embargo, altas concentraciones de sal pueden reducir la solubilidad de algunos componentes en disolución. Por tanto, en algunas realizaciones, la concentración de sal de una disolución acuosa previa a la reacción o una mezcla de reacción de reticulación puede ser lo suficientemente alta como para filtrar las cargas, de modo que no se forma el complejo de ion poliiónico, pero también lo suficientemente baja de modo que los componentes de la mezcla permanezcan en disolución. Por ejemplo, la concentración total de sal de algunas disoluciones acuosas previas a la reacción o mezclas de reacción de reticulación pueden ser de aproximadamente 10 mM a aproximadamente 1 M, de aproximadamente 100 mM a aproximadamente 300 mM, o aproximadamente 150 mM. En algunas realizaciones, una concentración de sal mayor puede aumentar la eficacia de una reacción de reticulación, lo que puede dar como resultado menor hinchamiento y/o mayor rigidez.

Algunas sales en la disolución acuosa previa a la reacción o la mezcla de reacción de reticulación pueden ser tampones no de coordinación. Puede usarse cualquier tampón no de coordinación que sea capaz de tamponar la mezcla y que no forme complejos de coordinación con agentes de acoplamiento o átomos metálicos. Los ejemplos de tampón no de coordinación adecuados pueden incluir, pero sin limitarse a, ácido 2-(N-morfolino)etanosulfónico (MES), ácido 3-(N-morfolino)propanosulfónico (MOPS), ácido 4-(2-hidroxietil)-1-piperazinil)etanosulfónico (HEPES), ácido 3-[4-(2-hidroxietil)-1-piperazinil]propanosulfónico (HEPPS), ácido N-ciclohexil-2-aminoetanosulfónico (CHES), ácido N-ciclohexil-3-aminopropanosulfónico (CAPS), etc.

La concentración del tampón no de coordinación puede variar. Por ejemplo, algunas disoluciones acuosas previas a la reacción o mezclas de reacción de reticulación pueden tener una concentración de tampón en un intervalo de aproximadamente 10 mM a aproximadamente 1 M, de aproximadamente 10 mM a aproximadamente 500 mM, de aproximadamente 20 mM a aproximadamente 100 mM, o de aproximadamente 25 mM a aproximadamente 250 mM. Algunas disoluciones acuosas previas a la reacción o mezclas de reacción de reticulación comprenden MES a una concentración de aproximadamente 20 mM a aproximadamente 200 mM, de aproximadamente 20 mM a aproximadamente 100 mM, aproximadamente 100 mM, o aproximadamente 180 mM.

También pueden incluirse sales no tamponantes en la disolución acuosa previa a la reacción o la mezcla de reacción de reticulación como alternativa a, o además de, las sales tamponantes. Algunos ejemplos pueden incluir sales inorgánicas tales como cloruro de sodio, cloruro de potasio, cloruro de litio, bromuro de potasio, bromuro de sodio, bromuro de litio, y similares. La concentración de la sal no tamponante puede variar. Por ejemplo, algunas mezclas pueden tener una concentración de sal no tamponante en un intervalo de aproximadamente 10 mM a aproximadamente 1 M, de aproximadamente 30 mM a aproximadamente 500 mM, o de aproximadamente 50 mM a aproximadamente 300 mM. En algunas realizaciones, el cloruro de sodio puede estar presente a una concentración en un intervalo de aproximadamente el 0,5% p/v a aproximadamente el 2% aproximadamente el 0,9% p/v, aproximadamente el 1,6% p/v, de aproximadamente 20 mM a aproximadamente 1 M, de aproximadamente 40 mM a aproximadamente 500 mM, de aproximadamente 50 a 300 mM, de aproximadamente 80 mM a aproximadamente 330 mM, aproximadamente 150 mM, o aproximadamente 270 mM.

El pH de una disolución acuosa previa a la reacción puede ser menor que el pH de una mezcla de reacción de reticulación. Si el contenido en sal de la disolución acuosa previa a la reacción es bajo, el pH puede ser inferior para potenciar la solubilidad del ácido hialurónico y el colágeno. Si el contenido en sal es mayor, el pH puede ser mayor en la disolución acuosa previa a la reacción. En algunas realizaciones, el pH de la mezcla acuosa previa a la reacción es de aproximadamente 1 a aproximadamente 8, de aproximadamente 3 a aproximadamente 8, de aproximadamente 4 a aproximadamente 6, de aproximadamente 4,7 a aproximadamente 7,4, o aproximadamente 5,4. Para concentraciones bajas de sal, el pH puede ser de aproximadamente 1 a aproximadamente 4 o de aproximadamente 1 a aproximadamente 3. En algunas realizaciones, un pH de aproximadamente 5,4 puede dar como resultado una matriz macromolecular reticulada que tiene mayor rigidez y/o menor hinchamiento.

En algunas realizaciones, el pH puede ajustarse a neutro para permitir la gelificación del colágeno o la formación de fibras antes de añadir un agente de acoplamiento.

En algunas realizaciones, el pH puede ajustarse a neutro inmediatamente antes de, en torno al tiempo de, o después de añadir un agente de acoplamiento, de manera que la gelificación del colágeno se reduce o sustancialmente no se produce.

El agente de acoplamiento soluble en agua usado puede reticular ácido hialurónico con colágeno. El agente de acoplamiento es un agente de acoplamiento a base de carbodiimida tal como N,N’-diciclohexilcarbodiimida (DCC), N,N’-diisopropilcarbodiimida (DIC), o 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida (EDC), etc. Los agentes de acoplamiento de carbodiimida pueden facilitar la formación de enlaces éster o amida sin llegar a formar parte del enlace. Dicho de otro modo, un enlace éster o un enlace amida puede comprender átomos procedentes de un grupo carboxilato de uno de ácido hialurónico o colágeno, y un grupo hidroxilo grupo o un grupo amina del otro. La concentración de un agente de acoplamiento puede variar. En algunas realizaciones, el agente de acoplamiento puede estar presente a de aproximadamente 2 mM a aproximadamente 150 mM, de aproximadamente 2 mM a aproximadamente 50 mM, de aproximadamente 20 mM a aproximadamente 100 mM, o aproximadamente 50 mM. En algunas realizaciones, el agente de acoplamiento es EDC que está presente a una concentración de aproximadamente 20 mM a aproximadamente 100 mM, de aproximadamente 2 mM a aproximadamente 50 mM, o aproximadamente 50 mM. El aumento de la concentración de carbodiimida hasta aproximadamente 50 mM puede dar como resultado una matriz macromolecular reticulada con mayor rigidez de hidrogel y/o menor hinchamiento.

EDC

Una reacción de reticulación incluye cualquier reacción en la que el ácido hialurónico se una covalentemente al colágeno en una pluralidad de (por ejemplo, más de 1) posiciones. En algunas realizaciones, la reacción de reticulación puede representarse por el esquema 1 a continuación.

Matriz macromo ecu ar

reticu ada

Acido hialuromco Colágeno de acido Componente hialuromco

reticu ación

colágeno Esquema 1

En el esquema 1, solo se representan algunos de los grupos funcionales que reaccionan, y no se muestran muchos grupos funcionales que pueden reaccionar en una reacción de reticulación, pero que también pueden permanecer sin reaccionar. Por ejemplo, OH, CO²H, -NHCOCH³, y otros grupos en el ácido hialurónico que no se muestran pueden reaccionar, pero también pueden permanecer sin reaccionar. De manera similar, el colágeno puede tener grupos adicionales que pueden reaccionar, pero también pueden permanecer sin reaccionar, tales como ^{O h ,}SH, CO²H, NH², etc. Además, pueden reaccionar menos grupos de los que se muestran.

En el esquema 1, grupos funcionales tales como CO²H en el ácido hialurónico pueden reaccionar con grupos funcionales en el colágeno tales como el NH²y OH para formar varias unidades de reticulación. Las unidades de reticulación constituyen juntas el componente de reticulación. En el esquema 1, un componente de acoplamiento no pasa a formar parte de una unidad de reticulación. Sin embargo, para algunos agentes de acoplamiento, al menos parte de un agente de acoplamiento puede incorporarse en una unidad de reticulación. El componente de ácido hialurónico incluye ácido hialurónico que ha reaccionado para convertirse en una matriz macromolecular reticulada. El componente de colágeno incluye colágeno que ha reaccionado para convertirse en parte de una matriz macromolecular reticulada. Además de la reticulación entre el ácido hialurónico y el colágeno, el ácido hialurónico o el colágeno pueden autorreticularse parcialmente. Por tanto, el esquema 1 se presenta por motivos de conveniencia para comprender la reacción de reticulación, pero no refleja necesariamente una estructura química real. Por ejemplo, una matriz molecular reticulada puede ser una red de macromoléculas de ácido hialurónico y macromoléculas de colágeno, con muchas macromoléculas reticuladas a más de una macromolécula.

Como resultado de una reacción de reticulación, una matriz macromolecular reticulada puede comprender un componente de reticulación que se reticula con o conecta covalentemente el componente de ácido hialurónico al componente de colágeno. Como se explicó anteriormente, un componente de reticulación comprende una pluralidad de unidades de reticulación, o uniones de enlace covalente individuales, entre el componente de ácido hialurónico y el componente de colágeno. Una unidad de reticulación puede ser simplemente un enlace directo entre un componente de ácido hialurónico y un componente de colágeno, de modo que el agente de acoplamiento puede no incorporarse en la matriz macromolecular reticulada. Alternativamente, una unidad de reticulación puede contener átomos o grupos adicionales del agente de acoplamiento de manera que al menos una parte del agente de acoplamiento pueda convertirse en parte de la matriz macromolecular reticulada. Al menos una parte de las unidades de reticulación puede comprender un enlace éster o un enlace amida. En algunas realizaciones, al menos una parte de las unidades de reticulación puede ser -CON- o -CO²-, donde el N es un nitrógeno de un residuo de aminoácido.

Puede usarse un agente de activación para aumentar la velocidad de la reacción de reticulación y el número de unidades de reticulación en el producto final. En algunas realizaciones, un agente de activación puede ser un triazol tal como hidroxibenzotriazol (HOBT) o 1-hidroxi-7-azabenzotriazol (HOAT); un fenol fluorado tal como pentafluorofenol; una succinimida tal como N-hidroxisuccinimida (NHS) o N-hidroxisulfosuccinimida (sulfoNHS), y similares.

La concentración del agente de activación puede variar. En algunas realizaciones, el agente de activación puede tener una concentración de aproximadamente 2 mM a aproximadamente 200 mM, de aproximadamente 2 mM a aproximadamente 50 mM, de aproximadamente 20 mM a aproximadamente 100 mM, o aproximadamente 50 mM. En algunas realizaciones, el agente de activación puede ser NHS o sulfoNHS a una concentración de aproximadamente 2 mM a aproximadamente 50 mM. En algunas realizaciones, el agente de activación puede ser sal sódica de N-hidroxisulfosuccinimida, a una concentración de aproximadamente 20 mM a aproximadamente 100 mM, o aproximadamente 50 Mm.

En algunas realizaciones, una mezcla de reacción de reticulación puede comprender un agente de acoplamiento de carbodiimida y un agente de activación. En algunas realizaciones, el agente de acoplamiento es EDC y el agente de activación es NHS o sulfoNHS. En algunas realizaciones, EDC está presente a una concentración de aproximadamente 2 mM a aproximadamente 50 mM y NHS o sulfoNHS está presente a de aproximadamente 2 mM a aproximadamente 50 mM.

En algunas realizaciones, una mezcla de reacción de reticulación puede comprender ácido hialurónico a una concentración de aproximadamente 3 mg/ml, colágeno humano tipo III a una concentración de aproximadamente 3 mg/ml, ácido 2-(N-morfolino)etanosulfónico a una concentración de aproximadamente 100 mM, cloruro de sodio a una concentración de aproximadamente el 0,9% en peso o aproximadamente 150 mM, 1 -etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida a una concentración de aproximadamente 50 mM y sal sódica de N-hidroxisulfosuccinimida a una concentración de aproximadamente 50 mM, en la que la disolución tiene un pH de aproximadamente 5,4.

En algunas realizaciones, una mezcla de reacción de reticulación puede comprender ácido hialurónico a una concentración de aproximadamente 6 mg/ml, colágeno humano tipo III a una concentración de aproximadamente 6 mg/ml, ácido 2-(N-morfolino)etanosulfónico a una concentración de aproximadamente 180 mM, cloruro de sodio a una concentración de aproximadamente el 0,9% en peso o aproximadamente 150 mM, 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida a una concentración de aproximadamente 50 mM y sal sódica de N-hidroxisulfosuccinimida a una concentración de aproximadamente 50 mM, en la que la disolución tiene un pH de aproximadamente 5,4.

En algunas realizaciones, una mezcla de reacción de reticulación puede comprender ácido hialurónico a una concentración de aproximadamente 16 mg/ml de, colágeno de rata tipo I a una concentración de aproximadamente 8 mg/ml, ácido 2-(N-morfolino)etanosulfónico a una concentración de aproximadamente 100 mM, cloruro de sodio a una concentración de aproximadamente el 0,9% en peso o aproximadamente 150 mM, 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida a una concentración de aproximadamente 50 mM y sal sódica de N-hidroxisulfosuccinimida a una concentración de aproximadamente 50 mM, en la que la disolución tiene un pH de aproximadamente 5,4.

En algunas realizaciones, una mezcla de reacción de reticulación puede comprender ácido hialurónico a una concentración de aproximadamente 12 mg/ml, colágeno de rata tipo I a una concentración de aproximadamente 12 mg/ml, ácido 2-(N-morfolino)etanosulfónico a una concentración de aproximadamente 100 mM, cloruro de sodio a una concentración de aproximadamente el 0,9% en peso o aproximadamente 150 mM, 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida a una concentración de aproximadamente 50 mM y sal sódica de N-hidroxisulfosuccinimida a una concentración de aproximadamente 50 mM, en la que la disolución tiene un pH de aproximadamente 5,4.

En algunas realizaciones, una mezcla de reacción de reticulación puede comprender ácido hialurónico a una concentración de aproximadamente 12 mg/ml, colágeno de cola de rata tipo I a una concentración de aproximadamente 12 mg/ml, ácido 2-(N-morfolino)etanosulfónico a una concentración de aproximadamente 100 mM, cloruro de sodio a una concentración de aproximadamente el 0,9% en peso o aproximadamente 150 mM, 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida a una concentración de aproximadamente 50 mM y sal sódica de N-hidroxisulfosuccinimida a una concentración de aproximadamente 50 mM, en la que la disolución tiene un pH de aproximadamente 5,3.

En algunas realizaciones, una mezcla de reacción de reticulación puede comprender ácido hialurónico a una concentración de aproximadamente 3 mg/ml, colágeno humano tipo I a una concentración de aproximadamente 3 mg/ml, ácido 2-(N-morfolino)etanosulfónico a una concentración de aproximadamente 100 mM, cloruro de sodio a una concentración de aproximadamente el 0,9% en peso o aproximadamente 150 mM, 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida a una concentración de aproximadamente 50 mM y sal sódica de N-hidroxisulfosuccinimida a una concentración de aproximadamente 50 mM, en la que la disolución tiene un pH de aproximadamente 5,4.

En algunas realizaciones, una mezcla de reacción de reticulación puede comprender ácido hialurónico a una concentración de aproximadamente 12 mg/ml, colágeno humano tipo I a una concentración de aproximadamente 6 mg/ml, ácido 2-(N-morfolino)etanosulfónico a una concentración de aproximadamente 100 mM, cloruro de sodio a una concentración de aproximadamente el 0,9% en peso o aproximadamente 150 mM, 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida a una concentración de aproximadamente 50 mM y sal sódica de N-hidroxisulfosuccinimida a una concentración de aproximadamente 50 mM, en la que la disolución tiene un pH de aproximadamente 5,4.

En algunas realizaciones, una mezcla de reacción de reticulación puede comprender ácido hialurónico a una concentración de aproximadamente 16 mg/ml, colágeno humano tipo I a una concentración de aproximadamente 8 mg/ml, ácido 2-(N-morfolino)etanosulfónico a una concentración de aproximadamente 100 mM, cloruro de sodio a una concentración de aproximadamente el 0,9% en peso o aproximadamente 150 mM, 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida a una concentración de aproximadamente 50 mM y sal sódica de N-hidroxisulfosuccinimida a una concentración de aproximadamente 50 mM, en la que la disolución tiene un pH de aproximadamente 5,4.

En algunas realizaciones, una mezcla de reacción de reticulación puede comprender ácido hialurónico a una concentración de aproximadamente 12 mg/ml, colágeno humano tipo I a una concentración de aproximadamente 12 mg/ml, ácido 2-(N-morfolino)etanosulfónico a una concentración de aproximadamente 100 mM, cloruro de sodio a una concentración de aproximadamente el 0,9% en peso o aproximadamente 150 mM, 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida a una concentración de aproximadamente 50 mM y sal sódica de N-hidroxisulfosuccinimida a una concentración de aproximadamente 50 mM, en la que la disolución tiene un pH de aproximadamente 5,4.

En algunas realizaciones, una mezcla de reacción de reticulación puede comprender ácido hialurónico a una concentración de aproximadamente 24 mg/ml, colágeno humano tipo I a una concentración de aproximadamente 12 mg/ml, ácido 2-(N-morfolino)etanosulfónico a una concentración de aproximadamente 100 mM, cloruro de sodio a una concentración de aproximadamente el 0,9% en peso o aproximadamente 150 mM, 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida a una concentración de aproximadamente 50 mM y sal sódica de N-hidroxisulfosuccinimida a una concentración de aproximadamente 50 mM, en la que la disolución tiene un pH de aproximadamente 5,4.

En algunas realizaciones, una mezcla de reacción de reticulación puede comprender ácido hialurónico a una concentración de aproximadamente 16 mg/ml, colágeno a una concentración de aproximadamente 8 mg/ml, ácido 2 (N-morfolino)etanosulfónico a una concentración de aproximadamente 100 mM, cloruro de sodio a una concentración de aproximadamente el 0,9% en peso o aproximadamente 150 mM, 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida a una concentración de aproximadamente 50 mM y sal sódica de N-hidroxisulfosuccinimida a una concentración de aproximadamente 50 mM, en la que la disolución tiene un pH de aproximadamente 5,4.

En algunas realizaciones, una mezcla de reacción de reticulación puede comprender ácido hialurónico a una concentración de aproximadamente 1 mg/ml a aproximadamente 20 mg/ml, colágeno porcino tipo I a una concentración de aproximadamente 1 mg/ml a aproximadamente 15 mg/ml, ácido 2-(N-morfolino)etanosulfónico a una concentración de aproximadamente 20 mM a aproximadamente 200 mM, cloruro de sodio a una concentración de aproximadamente el 0,5% en peso a aproximadamente el 2% en peso o de aproximadamente 80 mM a aproximadamente 330 mM, 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida a una concentración de aproximadamente 20 mM a aproximadamente 100 mM y sal sódica de N-hidroxisulfosuccinimida a una concentración de aproximadamente 20 mM a aproximadamente 100 mM, en la que la disolución tiene un pH de aproximadamente 4 a aproximadamente 6.

Ejemplo 1

Se creó una disolución de ácido hialurónico y colágeno disolviendo 30 mg de sal sódica de ácido hialurónico 2 MDa (Corneal) en 10 ml de disolución de colágeno tipo III 3 mg/ml en HCl 10 mM (Fibrogen). Se añadió sal de tampón ácido 2-(N-morfolino)etanosulfónico (195,2 mg) a la disolución junto con 90 mg de NaCl para formar una disolución previa a la reacción a pH 2,5. Entonces se ajustó el pH a 5,4 mediante la adición de 200 |il de NaOH 1 N. A continuación, se añadieron 95,9 mg de HCl de 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida y 108,6 mg de sal sódica de N-hidroxisulfosuccinimida a la disolución de ácido hialurónico/colágeno(III) y se mezcló a fondo. La reacción de reticulación avanzó durante 18 h antes de que el gel se transformara en partículas a través de una malla de 60 micrómetros de tamaño de poro. Tras el dimensionamiento, se esterilizó el gel mediante diálisis a través de una membrana de éster de celulosa de 20 kDa de punto de corte de peso molecular frente al 70% de isopropanol / el 30% de agua durante 3 horas a 4°C. Entonces se continuó la diálisis frente a tampón fosfato estéril durante 72 h a 4°C con cuatro cambios de tampón. Entonces se dispensó el gel en jeringas en condiciones asépticas.

Ejemplo 2

Se creó una disolución de ácido hialurónico disolviendo 60 mg de sal sódica de ácido hialurónico 2 MDa (Corneal) en 20 ml de tampón ácido 2-(N-morfolino)etanosulfónico 100 mM con NaCl al 0,9% en peso a pH 4,7. Tras la hidratación y disolución completas del ácido hialurónico, se mezcló esta disolución con 20 ml de disolución de colágeno humano (III) 3 mg/ml en HCl 10 mM (Fibrogen). Se ajustó el pH de la disolución resultante de ácido hialurónico/colágeno (III) a 5.4 con NaOH 1 N. Entonces se liofilizó la disolución a una esponja seca y se reconstituyó en 10 ml de agua destilada para obtener una disolución de ácido hialurónico 6 mg/ml y colágeno (III) 6 mg/ml. A continuación, se añadieron 192 mg de HCl de 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida y 217 mg de sal sódica de N-hidroxisulfosuccinimida a la disolución de ácido hialurónico/colágeno (III) y se mezclaron a fondo. La reacción de reticulación avanzó durante 18 h antes de que el gel se transformara en partículas a través de una malla de 60 micrómetros de tamaño de poro. Tras el dimensionamiento, se esterilizó el gel mediante diálisis a través de una membrana de éster de celulosa de 20 kDa de punto de corte de peso molecular frente al 70% de isopropanol / el 30% de agua durante 3 h a 4°C. Entonces se continuó la diálisis frente a tampón fosfato estéril durante 72 h a 4°C con cuatro cambios de tampón. Entonces se dispensó el gel en jeringas en condiciones asépticas.

Ejemplo 3

Se disolvió colágeno de cola de rata (I) (Roche) a 20 mg/ml en ácido clorhídrico 0,01 N. Se disolvió ácido hialurónico, peso molecular de 2 MDa, (Corneal) a 40 mg/ml en sal de tampón ácido 2-(N-morfolino)etanosulfónico (MES) 100 mM con NaCl al 0,9% en peso a pH 4,7. El tampón MES (500 mM) a pH 6,3 se obtuvo disolviendo 43 mg de NaCl y 95 mg de sal de tampón MES en tampón MES 100 mM con NaCl al 0,9% en peso a pH 4,7. Se creó una disolución de reacción previa mezclando 4,2 g de la disolución de colágeno de rata (I), 4,2 g de la disolución de ácido hialurónico y 1.05 ml del tapón MES. Se obtuvo una disolución de activación de 114 mg de sal sódica de N-hidroxisulfosuccinimida en 530 |il de tampón MES 100 mM con NaCl al 0,9% en peso a pH 5,2. Se obtuvo una disolución de acoplamiento de 100,6 mg de HCl de 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil) carbodiimida en 530 |il de tampón MES 100 mM con NaCl al 0,9% en peso a pH 5,2. Entonces se creó la mezcla de reacción mediante la adición de 500 |il de disolución de activación, seguido por 500 |il de disolución de acoplamiento a 9 g de disolución de ácido hialurónico/colágeno. Se transfirió la mezcla de reacción a un vial de vidrio y se centrifugó durante 5 min a 4000 RPM para retirar las burbujas de aire. La reacción avanzó durante 18 h a 4°C. Entonces se transformó el gel en partículas a través de una malla de 100 micrómetros de tamaño de poro. Tras el dimensionamiento, se esterilizó el gel mediante diálisis a través de una membrana de éster de celulosa de 20 kDa de punto de corte de peso molecular frente al 70% de isopropanol / el 30% de agua durante 3 h a 4°C. Entonces se continuó la diálisis frente a tampón fosfato estéril durante 72 h a 4°C con cuatro cambios de tampón. Entonces se dispensó el gel en jeringas en condiciones asépticas.

Ejemplo 4

Se concentró colágeno de cola de rata (I) en ácido clorhídrico 0,01 N desde 5 mg/ml hasta 12 mg/ml usando un dispositivo de filtración centrífuga con 20 kDa de punto de corte de peso molecular. Se añadió ácido hialurónico (120 mg, 2 MDa) a 10 ml de la disolución de colágeno y se dejó que se hidratara durante 60 minutos. Entonces se homogeneizó la disolución pasándola de jeringa a jeringa a través de un conector de tipo Luer-Luer. A continuación, se añadieron a la disolución 90 mg de NaCl (el 0,9% en peso) y 200 mg de sal de tampón ácido 2-(N-morfolino)etanosulfónico (100 mM) y se mezclaron. Entonces, se añadieron a la disolución 98 mg de HCl de 1 -etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida y 111 mg de sal sódica de N-hidroxisulfosuccinimida (50 mM cada uno) y se mezclaron rápidamente. Finalmente, se añadieron a la disolución 200 |il de NaOH 1 N que se mezclaron pasando de jeringa a jeringa. Se transfirió la disolución de reacción a un vial de vidrio y se centrifugó durante 5 min a 4000 RPM para retirar las burbujas de aire. La reacción avanzó durante 18 h a 4°C. Entonces se transformó el gel en partículas a través de una malla de 100 micrómetros de tamaño de poro. Tras el dimensionamiento, se esterilizó el gel mediante diálisis a través de una membrana de éster de celulosa de 20 kDa de punto de corte de peso molecular frente al 70% de isopropanol / el 30% de agua durante 3 h a 4°C. Entonces se continuó la diálisis frente a tampón fosfato estéril durante 72 h a 4°C con cuatro cambios de tampón. Entonces se dispensó el gel en jeringas en condiciones asépticas.

Ejemplo 5

Se usó reología de placas paralelas oscilatorias para caracterizar las propiedades mecánicas de los geles usando un dispositivo Anton Paar MCR 301. Se usó un diámetro de placa de 25 mm a una altura de hueco de 1 mm. Se aplicó un barrido de frecuencia desde 0,1 hasta 10 Hz a una deformación fija del 2% con aumento logarítmico en frecuencia, seguido por un barrido de deformación de entre el 0,1% y el 300% a una frecuencia fija de 5 Hz con aumento logarítmico en la deformación. El módulo de almacenamiento (G') y el módulo de pérdida (G'') se determinaron a partir de las mediciones de barrido de frecuencia a 5 Hz.

El gel del ejemplo 1 tenía un módulo de almacenamiento (G') de 505 Pa y un módulo de pérdida (G'') de 70 Pa.

El gel del ejemplo 3 tenía un módulo de almacenamiento (G') de 2.580 Pa y módulo de pérdida (G'') de 155 Pa.

Los barridos de frecuencia y deformación para el gel del ejemplo 3 se muestran en la figura 1.

Ejemplo 6

Para determinar la fuerza requerida para extruir los geles, se expulsaron de jeringas BD de 1 ml a través de agujas de 30G usando un dispositivo Instron 5564 con software Bluehill 2. Se empujó el émbolo a una velocidad de 100 m/min durante 11,35 mm y se registró el perfil de extrusión.

En la figura 2 se muestra el perfil de extrusión a través de una aguja de 30G para gel del ejemplo 3. El gel tenía una fuerza de extrusión promedio de 12,2 N desde 4 hasta 10 mm.

Ejemplo 7

Los geles se ultracongelaron en nitrógeno líquido y se secaron mediante liofilización. Entonces se obtuvieron imágenes de la muestra seca usando un microscopio electrónico de barrido (SEM) Hitachi S - 4500. En la figura 3 se muestran las imágenes de SEM del gel del ejemplo 4 a 50X (A), 1.000X (B) y 40,000X (C). La naturaleza fibrilar del colágeno (I) se preserva parcialmente en el hidrogel.

Ejemplo 8

Se concentró colágeno de cola de rata (I) en ácido clorhídrico 0,01 N desde 5 mg/ml hasta 12 mg/ml usando un dispositivo de filtración centrífuga con 20 kDa de punto de corte de peso molecular. Se añadió sal sódica de ácido hialurónico (120 mg, 2 MDa) a 10 ml de la disolución de colágeno y se dejó que se hidratara durante 60 minutos. Entonces se homogeneizó la disolución pasándola de jeringa a jeringa a través de un conector de tipo Luer-Luer, y se añadieron a la disolución 93 mg de NaCl, 201 mg de sal de tampón ácido 2-(N-morfolino)etanosulfónico y 200 |il de NaOH 1 N y se mezclaron. Entonces se añadieron HCl de 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida (98 mg) y 111 mg de sal sódica de N-hidroxisulfosuccinimida y se mezcló la disolución final pasando de jeringa a jeringa. Se transfirió la disolución de reacción a un vial de vidrio y se centrifugó durante 5 min a 4000 RPM para retirar las burbujas de aire. La reacción avanzó durante 16 h a 4°C. Entonces se transformó el gel en partículas a través de una malla de 60 micrómetros de tamaño de poro. Tras el dimensionamiento, se esterilizó el gel mediante diálisis a través de una membrana de éster de celulosa de 20 kDa de punto de corte de peso molecular frente al 70% de isopropanol / el 30% de agua durante 3 h a 4°C. Entonces se continuó la diálisis frente a tampón fosfato estéril durante 72 h a 4°C con cuatro cambios de tampón. Entonces se dispensó el gel en jeringas en condiciones asépticas.

Ejemplo 9

Se sometió a prueba la biocompatibilidad de los geles con una inyección de muestra intradérmica de 50 |il en ratas Sprague-Dawley. Se retiraron los implantes a la semana y se analizaron los explantes mediante histología con tinción con H&E y el marcador de macrófagos CD68. Se puntuaron tres imágenes 20X de la tinción de CD68 desde 0 hasta 4 basándose en el grado de tinción. Entonces se promediaron estos valores para dar una puntuación de muestra. Se analizaron cuatro muestras para cada gel. Los resultados de las pruebas de biocompatibilidad de los ejemplos 3, 4 y 8 junto con varios rellenos dérmicos disponibles comercialmente se presentan en la tabla 1.

Tabla 1: Puntuaciones de tinción de CD68 para los ejemplos 3, 4 y 8 así como rellenos dérmicos comerciales.

Ejemplo 10

Se determinó la citotoxicidad del gel del ejemplo 4 mediante NAMSA según el método de recubrimiento de agarosa de la norma ISO 10993-5: Biological Evaluation of Medical Devices (Evaluación biológica de dispositivos médicos) -Parte 5: Tests for In vitro Cytotoxicity (Pruebas para citotoxicidad in vitro). Se dosificó en pocillos por triplicado, 0,1 ml del gel colocado en discos de filtro, así como 0,1 ml de disolución al 0,9% de NaCl colocada en discos de filtro y polietileno de alta densidad de 1 cm de longitud como controles negativos, y una porción de látex de 1 cm x 1 cm como control positivo. Se colocó cada uno sobre una superficie de agarosa recubriendo directamente una monocapa subconfluyente de células de fibroblasto de ratón L929. Tras la incubación a 37°C en el 5% de CO²durante 24 horas, se examinaron los cultivos macroscópica y microscópicamente para determinar cualquier morfología anómala de las células y la lisis celular. Los artículos de prueba se puntuaron desde 0 hasta 4 basándose en la zona de la lisis celular en proximidad a la muestra.

El gel del ejemplo 4 no mostró ninguna evidencia de causar lisis o toxicidad celulares y se puntuó un grado 0 para citotoxicidad.

Ejemplo 11

Se evaluó la reactividad intracutánea del gel en conejos del ejemplo 4 mediante NAMSA según la norma lSO 10993-10L Biological Evaluation of Medical Devices (Evaluación biológica de dispositivos médicos) - Parte 10: Tests for Irritation and Delayed-Type Hypersensitivity. Se preparó un extracto del gel en disolución de NaCl al 0,9% (razón de gel:solución salina 4:20) y se inyectaron 0,2 ml de extracto por vía intracutánea en cinco sitios independientes en el lado derecho del lomo de cada uno de tres animales. El control del extracto se inyectó de manera similar en el lado izquierdo del lomo de cada animal. Se observaron los sitios de inyección a las 24, 48 y 72 horas tras la inyección para determinar signos de eritema y edema. El eritema y el edema se puntuaron cada uno en una escala de 0-4 en cada sitio para cada punto de tiempo en cada animal. La puntuación media general se determinó dividiendo la suma de las puntuaciones entre el número total de puntuaciones.

El gel del ejemplo 4 tuvo una puntuación media general de 0, la misma que la puntuación general del grupo de control. Esto no indicó signos de eritema ni edema del extracto de gel.

Ejemplo 12

Se disolvió sal sódica de ácido hialurónico, 2 MDa de peso molecular, en disolución de colágeno humano (I) en ácido clorhídrico 0,01 N (Advanced BioMatrix). Se añadió cloruro de sodio al 0,9% en peso y se añadió MES a 100 mM a la disolución y se mezcló. Se dejó que el ácido hialurónico se hidratara durante 1 h y se homogeneizó la disolución mediante mezclado de jeringa a jeringa. Se ajustó el pH de la disolución a 5,4 mediante la adición de hidróxido de sodio 1 N. Se añadieron HCl de 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida (50 mM) y sal sódica de N-hidroxisulfosuccinimida (50 mM) a la disolución de ácido hialurónico / colágeno y se mezclaron rápidamente mediante transferencia de jeringa a jeringa. Se transfirió la disolución a un vial de vidrio y se centrifugó durante 5 min a 4000 RPM para retirar las burbujas de aire. Se dejó que el gel resultante reaccionara durante 16 h a 4°C. Entonces se transformó el gel en partículas a través de una malla de 100 micrómetros de tamaño de poro. Tras el dimensionamiento, se esterilizó el gel mediante diálisis a través de una membrana de éster de celulosa de 20 kDa de punto de corte de peso molecular frente al 70% de isopropanol / el 30% de agua durante 3 h a 4°C. Entonces se continuó la diálisis frente a tampón fosfato estéril, pH 7,4, durante 72 h a 4°C con cuatro cambios de tampón. Entonces se dispensó el gel en jeringas en condiciones asépticas.

Este procedimiento se usó para producir hidrogeles con concentraciones variables de ácido hialurónico y colágeno. Cuando fue necesario, se concentró colágeno humano (I) en ácido clorhídrico 0,01 N desde 3 mg/ml hasta la concentración de reacción deseada en dispositivos de filtración centrífuga de 20 kDa de punto de corte de peso molecular. Se sintetizó una muestra de 50 ml de cada gel, se esterilizó mediante exposición a isopropanol al 70%, y se purificó mediante diálisis frente a tampón fosfato, pH 7,4. Los geles sintetizados se describen en la tabla 2, junto con sus propiedades reológicas. Se usó reología de placas paralelas oscilatorias para caracterizar las propiedades reológicas de los geles usando un dispositivo Anton Paar MCR 301. Se usó un diámetro de placa de 25 mm a una altura de hueco de 1 mm. Se determinaron el módulo de almacenamiento (G') y el módulo de pérdida (G”) a una deformación del 2% y 5 Hz.

Tabla 2: Concentraciones de síntesis de hidrogel de ácido hialurónico-colágeno humano (I) y propiedades reológicas

Ejemplo 13

Con el fin de determinar la concentración de biopolímero en geles, se comparó el peso del gel hidratado con el del gel seco. Se pesó una muestra de 2 ml y se secó mediante ultracongelación en nitrógeno líquido seguido por liofilización a -50°C y 0,02 Torr. También se pesó una disolución del tapón apropiado y se secó de la misma forma para tener en cuenta el contenido en sal del gel. Se calculó el contenido en sólidos totales del gel dividiendo el peso seco entre el volumen húmedo, suponiendo una densidad de 1 g/ml para el gel húmedo, para dar un valor en mg/ml. Entonces se restó el contenido en sólidos de la sal de este valor para determinar la concentración de biopolímero concentración en el gel.

Tabla 3: Concentraciones finales de hidrogeles de ácido hialurónico-colágeno humano (I)

Ejemplo 14

Se determinaron las razones de hinchamiento para los geles en relación con el contenido inicial de agua y se midieron monitorizando el aumento en la masa del gel después del equilibrio con tampón fosfato. Para cada gel, se inyectó aproximadamente 1 ml en un tubo Falcon de 15 ml y se pesaron después de la adición de 10 ml de solución salina tamponada con fosfato, pH 7,4. Se mezclaron a fondo los geles con el tampón y se agitaron con vórtex durante 30 segundos. Entonces se dejó que los geles se equilibraran en el tampón durante 48 h a 4°C. Tras este tiempo, se centrifugaron las suspensiones a 4000 RPM en un rotor de cubeta oscilante durante 5 minutos. Entonces se decantó el tampón sobrenadante y se midió el peso del gel hinchado. Se determinó la razón de hinchamiento dividiendo el peso final del gel hinchado entre el peso del gel inicial.

Tabla 4: Razones de hinchamiento de hidrogeles de ácido hialurónico-colágeno humano (I)

Ejemplo 15

Se disolvió ácido hialurónico (800 mg, 2 MDa de peso molecular) en 50 ml de disolución de colágeno porcino (I) 8 mg/ml en ácido clorhídrico 0,01 N. Se añadió cloruro de sodio al 0,9% en peso y se añadió ácido 2-[morfolino]etanosulfónico a 100 mM a la disolución y se mezcló. Se dejó que el ácido hialurónico se hidratara durante 1 h y se homogeneizó la disolución mediante mezclado de jeringa a jeringa. Se ajustó el pH de la disolución a 5,4 mediante la adición de hidróxido de sodio 1 N. Se añadieron HCl de 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida (50 Mm) y sal sódica de N-hidroxisulfosuccinimida (50 mM) a la disolución de ácido hialurónico/colágeno y se mezclaron rápidamente mediante transferencia de jeringa a jeringa. Se transfirió la disolución a un vial de vidrio y se centrifugó durante 5 min a 4000 RPM para retirar las burbujas de aire. Se dejó que el gel resultante reaccionara durante 16 h a 4°C. Entonces se transformó el gel en partículas a través de una malla de 100 micrómetros de tamaño de poro. Tras el dimensionamiento, se esterilizó el gel mediante diálisis a través de una membrana de éster de celulosa de 20 kDa de punto de corte de peso molecular frente al 70% de isopropanol / el 30% de agua durante 3 h a 4°C. Entonces se continuó la diálisis frente a tampón fosfato estéril, pH 7,4, durante 72 h a 4°C con cuatro cambios de tampón. Entonces se dispensó el gel en jeringas en condiciones asépticas.

Ejemplo 16

Se realizaron inyecciones en bolo subcutáneas (1 ml) de hidrogeles de muestra por medio de cánulas a través de una pequeña incisión en el dorso de ratones desnudos. Las muestras inyectadas consisten en ácido hialurónico reticulado a 16 mg/ml, colágeno humano (I) reticulado a 16 mg/ml, y la muestra B el hidrogel de ácido hialurónico-colágeno humano (I) reticulado del ejemplo 12. A las seis semanas, se determina la duración volumétrica de las muestras junto con evaluación histológica del crecimiento infiltrante celular y la infiltración tisular. Se encuentra que el ácido hialurónico reticulado tiene un 90% de duración de volumen, el colágeno humano (I) reticulado tiene un 30% de duración de volumen, y el ácido hialurónico-colágeno humano (I) reticulado tiene un 85% de duración de volumen. La evaluación histológica indicó que el ácido hialurónico reticulado y el colágeno reticulado tienen de poco a ningún crecimiento infiltrante de tejido, mientras que se encuentran células y matriz extracelular recién depositada por toda la muestra de ácido hialurónico-colágeno humano (I).

Claims

REIVINDICACIONES

i. Matriz macromolecular reticulada como relleno dérmico inyectable que comprende:

un componente de ácido hialurónico;

un componente de colágeno derivado de colágeno tipo I o colágeno tipo III;

en la que el componente de ácido hialurónico se reticula con el componente de colágeno mediante el uso de un agente de acoplamiento a base de carbodiimida, formando de ese modo un componente de reticulación; en la que el componente de reticulación comprende una pluralidad de unidades de reticulación, en la que al menos una parte de las unidades de reticulación comprenden un enlace éster o un enlace amida; y en la que la matriz macromolecular reticulada se dispersa en un líquido acuoso en forma de hidrogel.
2. Matriz macromolecular reticulada según la reivindicación 1, que tiene una razón en peso del componente de ácido hialurónico con respecto al componente de colágeno de aproximadamente 0,5 a aproximadamente 7, de aproximadamente 1 a aproximadamente 3, de aproximadamente 1 a aproximadamente 2, de aproximadamente 1 a aproximadamente 1, o de aproximadamente 2 a aproximadamente 1.
3. Matriz macromolecular reticulada según la reivindicación 1, que tiene una razón en peso del componente de ácido hialurónico con respecto al componente de colágeno de aproximadamente 1 a aproximadamente 1, o de aproximadamente 2 a aproximadamente 1.
4. Matriz macromolecular reticulada según la reivindicación 1, en la que el líquido acuoso comprende agua, cloruro de sodio a una concentración de aproximadamente 100 mM a aproximadamente 200 mM, cloruro de potasio a una concentración de aproximadamente 2 mM a aproximadamente 3 mM, y tampón fosfato a una concentración de aproximadamente 5 mM a aproximadamente 15 mM, en la que el pH del líquido es de aproximadamente 7 a aproximadamente 8.
5. Método para preparar la matriz macromolecular reticulada según una cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en el que el método comprende las siguientes etapas:

disolver un ácido hialurónico y un colágeno en una disolución acuosa para formar una disolución acuosa previa a la reacción, en el que la disolución acuosa previa a la reacción comprende además una sal o tiene un pH menor de aproximadamente 4; y

modificar la disolución acuosa previa a la reacción para formar una mezcla de reacción de reticulación que comprende:

el ácido hialurónico;

el colágeno;

una carbodiimida soluble en agua;

una N-hidroxisuccinimida o una N-hidroxisulfosuccinimida; y

opcionalmente la sal; y

en el que la reacción de reticulación tiene un pH mayor que el de la disolución acuosa previa a la reacción; y permitir que la mezcla de reacción de reticulación reaccione para reticular de ese modo el ácido hialurónico y el colágeno.
6. Método según la reivindicación 5, en el que modificar la disolución acuosa previa a la reacción para formar una mezcla de reacción de reticulación comprende (i) aumentar el pH de la disolución acuosa previa a la reacción y permitir que se produzca la formación de fibras antes de añadir la carbodiimida soluble en agua; o (ii) añadir la carbodiimida soluble en agua a la disolución acuosa previa a la reacción antes de que se produzca la formación de fibras.
7. Método según la reivindicación 5, en el que la sal comprende cloruro de sodio a una concentración de aproximadamente 80 mM a aproximadamente 330 mM en la mezcla de reacción de reticulación.
8. Método según la reivindicación 5, en el que la carbodiimida soluble en agua es 1-etil-3-(3 dimetilaminopropil)carbodiimida a una concentración de aproximadamente 20 mM a aproximadamente 100 mM en la mezcla de reacción de reticulación.
9. Método según la reivindicación 5, en el que la mezcla de reacción de reticulación comprende además un tampón no de coordinación que tiene una concentración de aproximadamente 10 mM a aproximadamente 1 M.
10. Método según la reivindicación 5, que comprende además transformar en partículas la matriz macromolecular reticulada a través de una malla que tiene un tamaño de poro de aproximadamente 10 micrómetros a 100 micrómetros.
11. Método según la reivindicación 5, que comprende además esterilizar la matriz molecular reticulada mediante diálisis;

en el que la diálisis es frente a una disolución de tampón fosfato estéril que comprende tampón fosfato, cloruro de potasio y cloruro de sodio, en el que la disolución de tampón fosfato estéril es sustancialmente isosmótica con respecto al fluido fisiológico humano; y

en el que la diálisis es a través de una membrana que tiene un punto de corte de peso molecular de aproximadamente 5.000 daltons a aproximadamente 100.0000 daltons.
12. Matriz macromolecular reticulada preparada mediante el procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 5-11.
13. Producto estético de tejido blando que comprende:

un dispositivo estético que tiene una forma adecuada para inyectarse en tejido humano; y

una etiqueta que comprende instrucciones para inyectar el dispositivo estético en tejido humano;

en el que el dispositivo estético comprende la matriz macromolecular reticulada según una cualquiera de las reivindicaciones 1-4 o la reivindicación 12.
14. Producto según la reivindicación 13, en el que la matriz macromolecular reticulada tiene una razón en peso del componente de ácido hialurónico con respecto al componente de colágeno de aproximadamente 1 a aproximadamente 3.
15. Método de mejora de una cualidad estética de una característica anatómica de un ser humano que comprende:

inyectar un dispositivo estético en un tejido del ser humano para mejorar de ese modo la cualidad estética de la característica anatómica;

en el que el dispositivo estético comprende la matriz macromolecular reticulada según una cualquiera de las reivindicaciones 1-4 o la reivindicación 12;

siempre que el método no sea terapéutico.