ES2871020T3

ES2871020T3 - Quitosano con carga aniónica

Info

Publication number: ES2871020T3
Application number: ES18799772T
Authority: ES
Inventors: Mickaël Chausson; Pierre Douette; Sandrine Emilia Gautier; Philippe Vaesen; Houtaï Choumane; Guillermo Rocasalbas
Original assignee: Kiomed Pharma
Current assignee: Kiomed Pharma
Priority date: 2017-11-28
Filing date: 2018-11-09
Publication date: 2021-10-28
Anticipated expiration: 2038-11-09
Also published as: CL2020001322A1; WO2019105718A1; BR112020010205A2; CN114634585A; EP3851460A1; JP2021504529A; KR20230107717A; US11896607B2; EP3510050A1; US20200390799A1; JP2023118972A; LT3510050T; MA49865A1; PL3510050T3; HUE054336T2; FR3074043B1; PE20210947A1; HRP20210574T1; SI3510050T1; CY1124077T1

Abstract

Carboxialquil-quitosano que presenta unidades de glucosamina, unidades de N-acetil-glucosamina y unidades de glucosamina sustituidas por un grupo carboxialquilo, presentando dicho carboxialquil-quitosano un potencial zeta, medido a pH 7,5 inferior o igual a -18 mV, presentando el carboxialquil-quitosano un grado de acetilación comprendido entre el 40 % y el 80 %, expresado en número de moles de unidades de N-acetil-glucosamina con respecto al número de moles de unidades totales, y que presenta un grado de sustitución por un grupo carboxialquilo superior al 50 %, expresado en número de moles del sustituyente con respecto al número de moles de unidades totales.

Description

DESCRIPCIÓN

Quitosano con carga aniónica

[0001] La presente invención se refiere a un carboxialquil-quitosano, a composiciones que lo comprenden, a su procedimiento de fabricación y a sus diferentes aplicaciones, en particular en el campo terapéutico, reumatológico, oftalmológico, de medicina estética, de cirugía plástica, de cirugía interna, dermatológico o cosmético.

Estado de la técnica

[0002] Se conocen derivados de quitosano, especialmente a partir de las solicitudes de Kiomed Pharma publicadas con los números WO 2016/016463 y WO 2016/016464 y las patentes correspondientes. Estas solicitudes se concentran en las propiedades físicas, químicas o fisicoquímicas de los derivados de quitosano. Estas composiciones exigen mejoras adicionales, en particular en el marco de un tratamiento terapéutico de manera que se procure a los pacientes que puedan verse instados a usar dichas composiciones un beneficio terapéutico optimizado, y en particular un aumento de la relación beneficio/riesgo.

[0003] Se puede obtener un quitosano soluble por aumento del grado de acetilación (GA) por reacetilación del quitosano fúngico. De hecho se pueden obtener formulaciones solubles a pH fisiológico por reacetilación del quitosano fúngico, aunque se constata:

- una degradación muy rápida in vivo o condiciones similares,

- una reacción inmunitaria que aparece en el sujeto en el que se inyecta o se implanta este quitosano, por ejemplo, por inyección o implantación intraarticular,

- el quitosano no es adecuado para las aplicaciones pretendidas, y por tanto no permite un uso terapéutico suficientemente satisfactorio del quitosano, en particular por inyección o implantación intraarticular.

[0004] Existen diferentes publicaciones relativas a la carboxialquilación del quitosano, y en particular a la carboximetilación del quitosano, esencialmente con el fin de solubilizar el quitosano. En teoría, un quitosano presenta una fórmula sin unidad de N-acetil-glucosamina, pero en la práctica, el quitosano se obtiene de la quitina, que comprende unidades de N-acetil-glucosamina, y el quitosano presenta un cierto grado de acetilación (GA), que es la proporción de unidades de N-acetil-glucosamina del quitosano. El GA del quitosano es en general bajo. Más allá, sobre todo por encima del 30 %, se trata en general de quitosano reacetilado.

[0005] Además, la solicitud de patente china CN1431229A se refiere a derivados de quitosano carboximetilado por su capacidad hidratante, pero se limita a esta característica.

[0006] La técnica anterior ha planteado asimismo la carboximetilación de la quitina de origen animal, en particular de crustáceos. Sin embargo, la quitina de origen de crustáceos es difícil de sustituir, y en particular es necesario congelarla y alcalinizarla para poder sustituirla (véase, por ejemplo, la solicitud de patente china CN106474569). El procedimiento es difícil de implementar y en particular de industrializar. Por otra parte, dicho procedimiento de sustitución a partir de quitina de origen de crustáceos es caro en energía, poco reproducible y con el riesgo de degradar el polímero y de hidrolizar los grupos acetilo de las unidades de N-acetil-glucosamina de manera significativa y difícilmente controlable.

Objetos de la invención

[0007] La invención tiene por objeto resolver el problema técnico que consiste en suministrar un derivado de quitosano adecuado para su uso en un ser humano o animal, en particular en el campo terapéutico, reumatológico, oftalmológico, de medicina estética, de cirugía plástica, de cirugía interna, dermatológico o cosmético.

[0008] Más en particular, la invención tiene por objeto resolver el problema técnico que consiste en suministrar un derivado de quitosano adecuado para su uso en un ser humano o animal en el campo terapéutico, en particular utilizable a modo de viscosuplemento, y en particular en poder inyectarlo en, o en mezcla con, un líquido sinovial.

[0009] La invención tiene especialmente por objeto resolver el problema técnico que consiste en suministrar un líquido sinovial reconstruido, es decir, una composición que restaura las propiedades de una articulación, como, por ejemplo, aportándole una capacidad para lubricar las superficies de cartílago.

[0010] La invención tiene además por objeto resolver el problema técnico que consiste en suministrar un derivado de quitosano, o una composición que lo comprende, que presente buenas propiedades y compatibilidad en mezcla con un líquido sinovial, y en particular un líquido sinovial de un ser humano o animal, por ejemplo, para tratar una patología articular o la degeneración del líquido sinovial en cuestión.

[0011] La invención tiene además por objeto resolver el problema técnico que consiste en suministrar un derivado de quitosano, o una composición que lo comprende, limitando la reacción inmunitaria de un sujeto, y en particular de un ser humano o animal, que recibe una administración, por ejemplo, por inyección, de un derivado de quitosano o una composición que lo comprende.

[0012] La invención tiene además por objeto resolver el problema técnico que consiste en suministrar un derivado de quitosano, o una composición que lo comprende, que presente características poco variables según el pH.

[0013] La invención tiene además por objeto resolver el problema técnico que consiste en suministrar un derivado de quitosano, o una composición que lo comprende, que presente una osmolalidad y un pH adaptado a su uso en contacto con un tejido de un ser humano o animal, y aceptable en términos de tiempo de vida in situ, reacción inmunológica y/o reacción a un cuerpo extraño y propiedades biomecánicas, según la indicación terapéutica pretendida, en particular en el contexto de la medicina regenerativa.

Descripción de la invención

[0014] Se ha descubierto de manera sorprendente que un derivado de quitosano según la presente invención permite resolver al menos uno, y preferentemente el conjunto, de los problemas técnicos descritos anteriormente.

[0015] En particular se ha descubierto que un derivado de quitosano que presenta una carga electrostática (caracterizada por su potencial zeta) en un intervalo de pH en torno al pH del medio en el que se administra, y especialmente a pH igual a 7,5, inferior a un cierto valor permitía resolver al menos uno, y preferentemente el conjunto, de los problemas técnicos descritos o sugeridos. Especialmente, dicho derivado de quitosano permite limitar la respuesta inmunitaria de un sujeto al que se ha administrado, normalmente por inyección o implantación, el derivado de quitosano o una composición que lo comprende.

[0016] La presente invención se refiere según un segundo aspecto a un derivado de quitosano que presenta unidades de glucosamina, unidades de N-acetil-glucosamina y unidades de glucosamina sustituidas por un grupo carboxialquilo, presentando dicho carboxialquil-quitosano un potencial zeta, medido a pH 7,5, inferior o igual a -10 mV, y preferentemente inferior o igual a -15 mV.

[0017] En particular se ha descubierto también que un derivado de quitosano de origen fúngico permitía resolver al menos uno, y preferentemente el conjunto, de los problemas técnicos descritos o sugeridos. Especialmente, un derivado de quitosano de origen fúngico permite limitar la respuesta inmunitaria de un sujeto al que se ha administrado, normalmente por inyección o implantación, el derivado de quitosano o una composición que lo comprende.

[0018] La presente invención se refiere según un primer aspecto a un carboxialquil-quitosano de origen fúngico que presenta unidades de glucosamina, unidades de N-acetil-glucosamina y unidades de glucosamina sustituidas por un grupo carboxialquilo, presentando dicho carboxialquil-quitosano preferentemente un grado de sustitución por un grupo carboxialquilo superior al 20 %, expresado en número de moles del sustituyente con respecto al número de moles de unidades totales.

[0019] Se habla asimismo de derivado de quitosano o de quitosano sustituido.

[0020] El quitosano se refiere, por ejemplo, con el número CAS 9012-76-4.

[0021] El quitosano usado para la invención tiene ventajosamente un origen fúngico, y preferentemente se obtiene del micelo de un hongo de tipo Ascomycetes, y en particular Aspergillus niger, y/o de un hongo Basidiomycetes, y en particular Lentinula edodes (shiitake) y/o Agaricus bisporus (hongo de París). Preferentemente, el quitosano se obtiene de Agaricus bisporus. El quitosano es preferentemente muy puro, es decir, que contiene pocas impurezas derivadas de su origen fúngico o del procedimiento de fabricación, y de una calidad microbiológica compatible con su uso como implante o composición farmacéutica. Se describe un procedimiento de preparación del quitosano en las patentes WO 03/068824 (EP 1483299; US 7556946).

[0022] En general, la quitina se pone en suspensión acuosa en presencia de hidróxido de sodio, y después se lleva el medio a alta temperatura durante un tiempo variable según la masa molecular deseada. A continuación, el quitosano se purifica por solubilización en medio ácido y se precipita en medio alcalino, se lava y se seca.

[0023] Preferentemente, el quitosano es de grado suficientemente puro para un uso farmacéutico.

[0024] Ventajosamente, el quitosano se purifica y a continuación preferentemente se seca. Después de la purificación, el procedimiento de la invención puede comprender una etapa de secado del carboxialquil-quitosano, y después opcionalmente de trituración del mismo para obtener un polvo. Se puede secar el carboxialquil-quitosano, por ejemplo, por evaporación del agua, por ejemplo, por un procedimiento de spray-drying (atomización), de lecho fluidizado o por secado al calor al vacío o a presión atmosférica, o bien por liofilización.

[0025] El carboxialquil-quitosano puede solubilizarse en una solución acuosa y, por ejemplo, en un agua de calidad farmacéutica aceptable para una inyección o implantación en un cuerpo, y en particular un cuerpo humano.

[0026] El quitosano preparado puede tener diferentes masas moleculares, comprendidas generalmente entre 10.000 y 500.000.

[0027] Según una variante, la masa molecular media está comprendida entre 20.000 y 60.000.

[0028] Según otra variante, la masa molecular media está comprendida entre 60.000 y 100.000.

[0029] Según otra variante, la masa molecular media está comprendida entre 100.000 y

20.000.

[0030] Según otra variante, la masa molecular media está comprendida entre 120.000 y 150.000.

[0031] Según otra variante, la masa molecular media está comprendida entre 150.000 y 220.000.

[0032] Según otra variante, la masa molecular media está comprendida entre 220.000 y 300.000.

[0033] Según otra variante, la masa molecular media está comprendida entre 300.000 y 500.000.

[0034] Cuando el quitosano es reticulado, la masa molecular del polímero reticulado puede ser mucho más elevada.

[0035] Es posible hidrolizar el quitosano para reducir su masa molecular.

[0036] Preferentemente en este caso, la masa molecular media es la masa molecular media en viscosidad (Mv), calculada a partir de la viscosidad intrínseca según la ecuación de Mark-Houwink. La viscosidad intrínseca se mide por viscosimetría capilar, con un viscosímetro capilar de tipo Ubbelohde, según el procedimiento de la monografía 2.2.9 de la Farmacopea Europea. Se mide el tiempo de flujo de la solución a través de un tubo capilar adaptado (Lauda, por ejemplo, el tubo capilar Ubbelohde 51001 de diámetro 0,53 mm) con ayuda de un viscosímetro automático I-Visc (Lauda), primero a la concentración inicial en quitosano, y después para varias diluciones, por ejemplo, según las recomendaciones de la monografía 2.2.9. De ello se deduce la viscosidad intrínseca reducida para cada una de las concentraciones. Se anota la viscosidad reducida en función de la temperatura, y se extrapola el valor a la concentración 0 para deducir la viscosidad intrínseca. Por ejemplo, es preciso llevar la viscosidad reducida (hred en mL/g) de las i diluciones en función de la concentración C de las i diluciones (g/mL) según la fórmula 5.

Fórmula 2. [hred] = (ti -fe) -(1 - C).

[0037] Para calcular la masa viscosimétrica media, se aplica la ecuación de Mark-Houwink con las constantes k y alfa recomendadas por Rinaudo y col. (in: Int J Biol Macromol, 15, 281, 1993), según el grado de acetilación (GA) del quitosano, de acuerdo con una de las tres fórmulas siguientes.

Fórmula 3. Mv = ([h]/0,082)(1/°,76>

para un GA del 2 %;

Fórmula 4. Mv = ([h]/0,076)(1/°,76>

para un GA del 10 % (por ejemplo, el 11,5 %);

Fórmula 5 Mv = ([h]/0,074)(1/°,76>

para un valor de GA del 20 % (por ejemplo, 21 %).

[0038] Para los valores de GA intermedios, se realiza una interpolación lineal para calcular la masa viscosimétrica media (Mv).

[0039] Preferentemente, el quitosano usado tiene una masa molecular media comprendida entre 120.000 y 150.000 o bien comprendida entre 150.000 y 220.000 o bien comprendida entre 220.000 y 300.000, o bien por encima de 300.000, y en general hasta 500.000.

[0040] También se puede medir la masa molecular final del carboxialquil-quitosano: por ejemplo, se puede medir su viscosidad intrínseca por viscosidad capilar, deducir de ella su masa molecular media (Mw) (determinando antes los parámetros K y alfa del carboxialquil-quitosano), o por un procedimiento por cromatografía, por ejemplo, por permeación de gel.

[0041] Normalmente, en el carboxialquil-quitosano según la invención las unidades de glucosamina son unidades de D-glucosamina (estando las unidades de D-glucosamina, las unidades de N-acetil-D-glucosamina, y al menos una de entre las unidades de D-glucosamina y las unidades de N-acetil-D-glucosamina sustituidas).

[0042] Según una variante, un quitosano sustituido presenta una sustitución de las unidades de D-glucosamina únicamente.

[0043] Según otra variante, un quitosano sustituido presenta una sustitución de las unidades de D-glucosamina y N-acetil-D-glucosamina simultáneamente, y en el que el grupo carboxialquilo está enlazado de manera covalente, según una variante únicamente a los grupos amina del quitosano, o según otra variante a los grupos amina e hidroxilo del quitosano simultáneamente.

[0044] La sustitución es en general solo parcial, y no todas las unidades están necesariamente sustituidas.

[0045] Según una realización, el grado de sustitución de las unidades de D-glucosamina expresado en número de moles de unidades de D-glucosamina con respecto al número de moles de unidades totales (unidades de D-glucosamina y N-acetil-D-glucosamina, sustituidas o no) del quitosano sustituido, está comprendido entre el 30 % y el 250 %.

[0046] Según una realización, el grado de sustitución por un grupo carboxialquilo es superior al 50 %, expresado en número de moles del sustituyente con respecto al número de moles de unidades totales.

[0047] Según una realización, el grado de sustitución de las unidades de D-glucosamina expresado en número de moles de unidades de D-glucosamina con respecto al número de moles de unidades totales (unidades de D-glucosamina y N-acetil-D-glucosamina, sustituidas o no) del quitosano sustituido, está comprendido entre el 50 % y el 200 %, y es preferentemente superior al 70 %.

[0048] Según una realización, el grado de sustitución por un grupo carboxialquilo es inferior al 80 %, expresado en número de moles del sustituyente con respecto al número de moles de unidades totales.

[0049] Normalmente, la sustitución se realiza por enlace covalente.

[0050] Según una variante, el carboxialquil-quitosano es un N,O-carboxialquil-quitosano. La proporción de unidades sustituidas por un grupo carboxialquilo en posición O (bien O3 o bien O6 de las unidades de glucosamina y/o N-acetil-glucosamina) y/o en posición N (de las unidades de glucosaminas) varía. El grado de sustitución puede ser así superior al 100 %.

[0051] Ventajosamente, el grado de sustitución (GS) y el grado de acetilación (GA) del carboxialquil-quitosano se miden por RMN de carbono 13 en fase sólida, con ayuda de un espectrómetro Bruker (Avance II1HD 400 MHz), equipado con una sonda PH MAS VTN 400SB BL4 N-P/H. Por ejemplo, el espectro se registra a temperatura ambiente, un tiempo de relajación comprendido entre 1 y 8 segundos y un número de exploraciones comprendido entre 64 y 512. Las áreas de las señales de los carbonos se determinan después de desconvolución. Los carbonos considerados son los siguientes: «CH3 acetilo» (carbono del metilo del grupo acetilo de las unidades de N-acetil-glucosamina, sustituidas o no), «C1» (carbono en posición 1 de las unidades de glucosamina y N-acetil-glucosamina) y «C=O» (carbono del carbonilo del sustituyente carboximetilo y carbono del carbonilo C=O del grupo acetilo de las unidades de N-acetilglucosamina, sustituidas o no). Para determinar el GS de un carboxialquil-quitosano dado, es preciso también registrar el espectro RMN de carbono 13 del quitosano precursor de este carboxialquil-quitosano. A partir del espectro del quitosano precursor, se calcula la «proporción CSU», es decir, la relación entre el área de la señal del grupo «CH3 acetilo» (carbono del metilo del grupo acetilo de las unidades de N-acetil-glucosamina) y el área de la señal del «C=O» (carbono carbonilo del grupo acetilo de las unidades de N-acetil-D-glucosamina). El ^gA del carboxialquil-quitosano se calcula según la Fórmula 1, y el GS según la Fórmula 2, en la que I representa el área de la señal del carbono considerada.

[0052] Se puede determinar el GA y el GS con ayuda de otros procedimientos conocidos para los carboxialquilquitosanos, por ejemplo, por RMN del protón en medio acuoso, con ayuda de un espectrómetro de resonancia magnética, por ejemplo, según el procedimiento descrito por Liu y col. (in: Carb Polym 137, 600, 2016), por ejemplo, con una hidrólisis previa del carboxialquil-quitosano y añadiendo una solución concentrada de ácido clorhídrico deuterado antes del análisis.

[0053] Si existe otro procedimiento RMN y más ventajoso para estimar el grado de sustitución de manera fiable, conviene usar dicho procedimiento. Los procedimientos anteriores deben ser adaptados por el experto en la materia en lo que se refiere a la preparación de la muestra y las señales para integrar, especialmente en función de la resolución, de la robustez y de la posición de los protones de las señales que se utilizarán para el cálculo del grado de sustitución.

[0054] El grado de carboxialquilación del quitosano puede variar del 50 al 200% y, por ejemplo, del 70 al 170 %, expresado en número de moles de carboxialquilo con respecto al número de moles de unidades totales.

[0055] Según una variante, el grado de carboxialquilación del quitosano puede variar del 70 al 130%, expresado en número de moles de carboxialquilo con respecto al número de moles de unidades totales.

[0056] El grado de sustitución del quitosano está correlacionado normalmente con la proporción en masa de los reactivos con respecto al quitosano al principio de la reacción. Como agentes carboxialquilantes se pueden citar los cloruros de ácido (o sus sales, por ejemplo, el monocloroacetato de sodio), como por ejemplo los que llevan uno o varios grupos carboximetilo, carboxietilo, carboxipropilo, carboxibutilo, etc.

[0057] Según una variante, la presente invención se refiere a un carboxialquil-quitosano en el que la parte alquilo del carboxialquilo es en C1-C5, lineal o ramificada.

[0058] Según una variante, la presente invención se refiere a un carboximetilo quitosano.

[0059] Según esta variante, el quitosano sustituido es un quitosano N-carboxialquilado.

[0060] Según esta variante, el quitosano sustituido es un quitosano O-carboxialquilado.

[0061] Según esta variante, el quitosano sustituido es un quitosano N-carboxialquilado y O-carboxialquilado.

[0062] Ventajosamente, el potencial zeta, medido a pH 7,5, es inferior o igual a -18 mV.

[0063] Ventajosamente, el carboxialquil-quitosano presenta un potencial zeta, medido a pH 7,5, inferior o igual a -22 mV, y preferentemente inferior o igual a -24 mV.

[0064] Según una variante específica, el quitosano sustituido presenta preferentemente una masa molecular media de 150.000 a 220.000 y un grado de sustitución que está comprendido entre el 50 y el 200 %, de manera que la masa molecular se expresa preferentemente antes de la sustitución.

[0065] Según otra variante específica, el quitosano sustituido presenta una masa molecular media de 120.000 a 150.000 y un grado de sustitución que está comprendido entre el 70 y el 200 %, de manera que la masa molecular se expresa preferentemente antes de la sustitución.

[0066] Según una variante específica, el quitosano sustituido presenta preferentemente una masa molecular media de 220.000 a 300.000 y un grado de sustitución que está comprendido entre el 70 y el 200 %, de manera que la masa molecular se expresa preferentemente antes de la sustitución.

[0067] Según otra variante específica, el quitosano sustituido presenta una masa molecular media de 220.000 a 300.000 y un grado de sustitución que está comprendido entre el 50 y el 200 %, de manera que la masa molecular se expresa preferentemente antes de la sustitución.

[0068] Según otra variante específica, el quitosano sustituido presenta una masa molecular media de 300.000 a 500.000 y un grado de sustitución que está comprendido entre el 50 y el 200 %, de manera que la masa molecular se expresa preferentemente antes de la sustitución.

[0069] Según otra variante específica, el quitosano sustituido presenta una masa molecular media de 300.000 a 500.000 y un grado de sustitución que está comprendido entre el 70 y el 200 %, de manera que la masa molecular se expresa preferentemente antes de la sustitución.

[0070] Según una variante específica, el quitosano sustituido presenta un grado de sustitución que está comprendido entre el 50 y el 200 %, y preferentemente entre el 70 y el 200 %, y un grado de acetilación del 20 al 80 %, y preferentemente del 30 al 75 %.

[0071] Según una variante específica, el quitosano sustituido presenta un grado de sustitución que está comprendido entre el 50 y el 200 %, y preferentemente entre el 70 y el 200 %, y un grado de acetilación del 20 al 50 %, y preferentemente del 20 al 40 %.

[0072] Según una variante específica, el quitosano sustituido presenta un grado de sustitución que está comprendido entre el 50 y el 200 %, y preferentemente entre el 70 y el 200 %, y un grado de acetilación del 50 al 75 %.

[0073] Según otra variante específica, el quitosano sustituido presenta un grado de sustitución que está comprendido entre el 90 y el 200 %, y preferentemente entre el 90 y el 150 %, y un grado de acetilación del 20 al 80 %, de manera que la masa molecular se expresa preferentemente antes de la sustitución.

[0074] Según una variante específica, el quitosano sustituido presenta un grado de sustitución que está comprendido entre el 90 y el 200 %, y preferentemente entre el 90 y el 150 %, y un grado de acetilación del 20 al 50 %, y preferentemente del 20 al 40 %.

[0075] Según una variante específica, el quitosano sustituido presenta un grado de sustitución que está comprendido entre el 90 y el 200 %, y preferentemente entre el 90 y el 150 %, y un grado de acetilación del 50 al 75 %.

[0076] Según una variante específica, el quitosano sustituido presenta preferentemente una masa molecular media de 220.000 a 300.000, un grado de sustitución que está comprendido entre el 90 y el 200 %, y preferentemente entre el 90 y el 150 %, y un grado de acetilación del 50 al 75 %, de manera que la masa molecular se expresa preferentemente antes de la sustitución.

[0077] Según una variante, el carboxialquil-quitosano es reticulado. Así pueden reticularse varias cadenas de quitosano, por ejemplo, por reacción con un agente de reticulación, como, por ejemplo, agentes de reticulación usados para la reticulación de polisacáridos, como, por ejemplo, genipina, éter butilbiglicidílico, glutaraldehído, epiclorohidrina, 1-bromo-3,4-epoxibutano, 1-bromo-4,5-epoxipentano, 1-cloro-2,3-epitiopropano, 1-bromo-2,3-epitiopropano, 1-bromo-3,4-epitiobutano, 1-bromo-4,5-epitiopentano, 2,3-dibromopropanol, 2,4-dibromobutanol, 2,5-dibromopentanol, 2,3-dibromopropanotiol, 2,4-dibromobutanotiol y 2,5-dibromopentanotiol epiclorohidrina, 2,3-dibromopropanol, 1-cloro-2,3-epitiopropano, dimetilaminopropilcarbodiimida, dextrano oxidado, ácido gálico, galato de epigalocatequina, curcumina, ácido tánico o compuestos diisocianato tales como diisocianato de hexametileno o diisocianato de tolueno.

[0078] Con un carboxialquil-quitosano reticulado la masa molecular puede ser muy elevada.

[0079] Sustituyendo el quitosano, ha sido posible preparar una solución de un carboxialquil-quitosano soluble en una solución acuosa cuyo pH varía en una amplia gama, mientras que el quitosano no sustituido solo es soluble a pH por debajo de 5,5 a 6,5. El carboxialquil-quitosano presenta así una capacidad de solubilizarse a diferentes pH gracias a la presencia de grupos carboxialquilo que modifican su perfil de solubilidad, y en particular al pH fisiológico o al pH de los fluidos fisiológicos modificados por una patología, por ejemplo, una patología inflamatoria. Se sabe que el pH de los fluidos fisiológicos como el líquido sinovial de una articulación, el humor acuoso, el humor vítreo y las lágrimas, pueden variar de manera significativa entre individuos, debido a diferentes factores como la edad, la patología, etc. Por tanto, es ventajoso que el carboxialquil-quitosano pueda mantenerse soluble en una amplia gama de pH, por ejemplo, de 6,0 a 8,5, o bien de 5,0 a 8,5, o bien de 4,5 a 8,5.

[0080] Según una realización, la formulación de quitosano sustituido presenta una osmolalidad de 100 a 700 mosm/kg, preferentemente de 200 a 500 mosm/kg.

[0081] Ventajosamente, la osmolalidad de la formulación de quitosano sustituido está comprendida entre 250 y 400 mosm/kg, y preferentemente de 275 a 325 mosm/kg.

[0082] Según una variante, la formulación de quitosano sustituido presenta una osmolalidad compatible con una articulación.

[0083] Según una variante, la formulación de quitosano sustituido presenta una osmolalidad compatible con una superficie ocular o intraocular.

[0084] Es preferible que la osmolalidad de la formulación de quitosano sustituido esté comprendida entre 250 y 400, y más específicamente entre 250 y 380 mosm/kg.

[0085] Por «soluble en agua», se entiende que el carboxialquil-quitosano no presenta problemas a simple vista cuando se pone en solución acuosa. Más específicamente, se puede confirmar la solubilidad, es decir, la ausencia de problemas, de una solución de carboxialquil-quitosano a una concentración, por ejemplo, del 1 % (m/m) en agua o un tampón, por ejemplo, un tampón fosfato, por una densidad óptica inferior a 0,5, y preferentemente inferior a 0,2, medida por espectrometría UV-visible a la longitud de onda de 500 nm en referencia a un recipiente de referencia que solo comprende el disolvente acuosa usado para la muestra medida, pero en ausencia del quitosano sustituido. Otro procedimiento consiste en una inspección visual según la monografía 2.9.20 de la Farmacopea Europea. Cuando el quitosano no está sustituido suficientemente, la composición no es soluble en una gama de pH satisfactoria, por ejemplo, que va del pH 6,0 al pH 8,5, a temperatura ambiente.

[0086] El grado de acetilación (GA) del quitosano se determina, por ejemplo, tal como se describe en las solicitudes de patente WO 2017009335 y WO 2017009346 por titulación potenciométrica. El GA puede medirse alternativamente por otros procedimientos conocidos para el quitosano, como RMN de protones, RMN de carbono 13 en fase sólida o espectrometría infrarroja.

[0087] Ventajosamente, el carboxialquil-quitosano presenta un grado de acetilación comprendido entre el 5 y el 80 %, expresado en número de moles de unidades de N-acetil-glucosamina con respecto al número de moles de unidades totales. El grado de acetilación se expresa en número de unidades de N-acetil-D-glucosamina con respecto al número de unidades totales de N-acetil-D-glucosamina y D-glucosamina presentes.

[0088] Ventajosamente, el carboxialquil-quitosano presenta un grado de acetilación comprendido entre el 40 y el 80 %, expresado en número de moles de unidades de N-acetil-glucosamina con respecto al número de moles de unidades totales.

[0089] Según una variante, el grado de acetilación está comprendido entre el 40 y el 50 %.

[0090] Según una variante, el grado de acetilación está comprendido entre el 50 y el 60 %.

[0091] Según una variante, el grado de acetilación está comprendido entre el 60 y el 75 %.

[0092] El grado de acetilación se determina por RMN de carbono 13 o por RMN de protón, según el mismo procedimiento que para la determinación del GS. El carboxialquil-quitosano presenta ventajosamente un grado de acetilación controlado. Por los términos «quitosano que tiene un grado de acetilación controlado» se entiende un producto cuyo grado de acetilación, es decir, la proporción de unidades de N-acetil-glucosamina, puede ajustarse de manera controlada, especialmente por una reacción de acetilación.

[0093] Según una variante, una composición según la invención puede presentarse en forma de una solución y puede no estar gelificada por variación de la temperatura (no termogelificable).

[0094] Según una variante, las características reológicas de una solución según la invención pueden evolucionar con la temperatura, pero sin pasar por una transición sol-gel. Las características reológicas de una solución según la invención pueden constatarse especialmente por el módulo de elasticidad (G') y/o el módulo de pérdida (G"), o el módulo complejo G*.

[0095] Según una variante, las características reológicas de una solución según la invención son sustancialmente constantes con independencia de la temperatura.

[0096] Según una variante, una composición según la invención puede presentarse en forma de una solución y ser termogelificable.

[0097] Según una variante, una composición según la invención puede presentarse en forma de un gel y no ser termogelificable.

[0098] La invención permite así, según una variante, preparar una composición termogelificable fluida a una temperatura inferior a la de uso, normalmente a una temperatura inferior a la temperatura fisiológica, por ejemplo, de 37 °C, pero que esté en forma de gel a la temperatura de uso, normalmente a la temperatura fisiológica, por ejemplo, de 37 °C, a pH neutro (pH 7) o a pH fisiológico y, por ejemplo, de 7 a 8,5, con una osmolalidad conveniente para el uso contemplado. Se trata, por ejemplo, de una osmolalidad fisiológica.

[0099] Según una variante, la composición termogelificable presenta una transición sol-gel termorreversible.

[0100] Ventajosamente, la presente invención permite suministrar una composición a baja concentración de quitosano sustituido.

[0101] Ventajosamente, la concentración de carboxialquil-quitosano es inferior al 10 %, por ejemplo, inferior o igual al 5 %, en masa con respecto a la masa total de la composición (m/m).

[0102] Según una variante, la concentración de quitosano es inferior al 4 %, por ejemplo, inferior o igual al 3 % o, por ejemplo, inferior o igual al 2 % en masa con respecto a la masa total de la composición (m/m).

[0103] Ventajosamente, la composición de la invención puede comprender igualmente otro biopolímero distinto al quitosano sustituido. Según una variante ventajosa, el biopolímero es un polisacárido, oxidado o no, reticulado por enlaces covalentes o no, por ejemplo, ácido hialurónico o hialuronato de sodio.

[0104] El ácido hialurónico puede presentar una masa molecular hasta 5 millones de Da. La masa molecular del ácido hialurónico puede reflejarse por su viscosidad intrínseca o por su viscosidad dinámica en solución. El ácido hialurónico puede presentar una densidad comprendida entre de 1 y 4 m3/kg y, por ejemplo, caracterizarse como masa molecular baja (por ejemplo, aproximadamente 1 a 2 m3/kg) o alta (por ejemplo, aproximadamente 2 a 4 m3/kg).

[0105] Ventajosamente, la concentración de ácido hialurónico es inferior al 4 %, por ejemplo, inferior o igual al 3 % o, por ejemplo, inferior o igual al 2 % en masa con respecto a la masa total de la composición (m/m).

[0106] Según una variante específica, la concentración de ácido hialurónico es inferior al 1,9% (m/m), expresada en masa con respecto a la masa de la composición final. Ventajosamente, la concentración de ácido hialurónico está comprendida entre el 0,5 y el 1,5% (m/m), expresada en masa con respecto a la masa de la composición final. Según una variante particular, la concentración de ácido hialurónico es aproximadamente del 0,9 %, del 1,0%, del 1,1 %, del 1,2%, del 1,3% y del 1,5% (m/m), expresada en masa con respecto a la masa de la composición final.

[0107] La proporción entre el quitosano y el ácido hialurónico puede variar, por ejemplo, del 5 al 95 %, por ejemplo, del 10 al 90 % y, por ejemplo, del 30 al 70 % de quitosano sustituido y del 5 al 95 %, por ejemplo, del 10 al 90 % y, por ejemplo, del 30 al 70 % respectivamente, de ácido hialurónico, con los porcentajes expresados por la relación: masa seca de quitosano sustituido/masa seca de ácido hialurónico. Según una variante, esta proporción entre quitosano y ácido hialurónico es de 1/1 (el 50 % de quitosano y el 50 % de ácido hialurónico). Según otra variante, la proporción entre el quitosano y el ácido hialurónico es de 1,5/0,5 (es decir, el 75 % de quitosano y el 25 % de ácido hialurónico).

[0108] Según una variante, el ácido hialurónico puede estar reticulado entre diferentes cadenas de ácido hialurónico.

[0109] La presente invención se refiere también a un procedimiento de preparación del carboxialquil-quitosano.

[0110] Según una variante, el procedimiento de preparación del carboxialquil-quitosano según la invención comprende la preparación de un quitosano de origen fúngico, la reacetilación del quitosano y la carboxialquilación del quitosano reacetilado. Así, la invención se refiere a un quitosano reacetilado o un carboxialquil-quitosano reacetilado.

[0111] Según una realización, de este modo se puede disolver el quitosano en un medio acuoso, preferentemente ligeramente acidificado (pH 6, por ejemplo). Se puede añadir anhídrido acético a la solución de quitosano en una o varias veces. A continuación, se añade un agente básico como, por ejemplo, sosa y/o urea. A continuación, se añade un agente de alquilación como, por ejemplo, monocloroacetato de sodio (es decir, sal de sodio del ácido cloroacético) o ácido cloroacético. A continuación, el quitosano sustituido se purifica, se recupera y se seca.

[0112] Según una variante, el procedimiento de preparación del carboxialquil-quitosano según la invención comprende la preparación de un quitosano, la carboxialquilación del quitosano, y después la reacetilación del quitosano carboxialquilado. Ventajosamente, dicho procedimiento permite un control preciso del grado de acetilación del carboxialquil-quitosano final, y en particular obtener un grado de acetilación elevado, por ejemplo, por encima del 40 %. Así, la invención se refiere a un quitosano reacetilado y después carboxialquilado o a un carboxialquil-quitosano reacetilado.

[0113] Según una variante, el procedimiento de preparación del carboxialquil-quitosano según la invención comprende la preparación de una quitina de origen fúngico, la carboxialquilación de la quitina y, opcionalmente, la reacetilación de la quitina carboxialquilada para obtener el carboxialquil-quitosano según la invención.

[0114] Según una variante, el procedimiento de preparación del quitosano carboxialquilado según la invención comprende la preparación de una quitina de origen fúngico, una desacetilación de la quitina, la carboxialquilación de la quitina y opcionalmente la reacetilación de la quitina carboxialquilada para obtener el carboxialquil-quitosano según la invención.

[0115] Según una realización, la etapa de carboxialquilación comprende una etapa de alcalinización de los grupos hidroxilos del quitosano, para favorecer un grado de sustitución elevado y, por ejemplo, a la vez en posición N-de las unidades de glucosamina y las unidades de glucosamina y N-acetil-glucosamina.

[0116] Según una realización, el procedimiento de la invención comprende una etapa de alcalinización que comprende la dispersión de quitosano en una solución de alcohol, como, por ejemplo, isopropanol en presencia de un agente básico como por ejemplo la sosa, y la agitación durante un tiempo de al menos una hora a una temperatura como mínimo -32 °C y preferentemente como máximo 15 °C. A esta suspensión se le añade a continuación un agente de alquilación como, por ejemplo, ácido monocloroacético. A continuación, el quitosano sustituido se purifica, se recupera y después se seca.

[0117] Según una variante, el procedimiento de preparación del quitosano carboxialquilado según la invención comprende la preparación de un quitosano, la carboxialquilación del quitosano y después la reacetilación del quitosano carboxialquilado.

[0118] Según una realización, la etapa de carboxialquilación no comprende etapa de alcalinización.

[0119] La etapa de reacetilación de un carboxialquil-quitosano puede comprender, por ejemplo, una o varias adiciones de anhídrido acético a la solución de carboxialquil-quitosano.

[0120] Las etapas finales de purificación, filtración y secado para recoger el carboxialquil-quitosano purificado se realizan según procedimientos conocidos con el fin de obtener un carboxialquil-quitosano según el grado de pureza deseado, que depende en general de la aplicación planteada, como, por ejemplo, por ciclos de precipitación y solubilización o por diálisis.

[0121] Según una variante, la proporción anhídrido acético/quitosano (volumen/masa) varía entre 0,1 y 10, y preferentemente entre 0,1 y 2, durante la etapa de reacetilación.

[0122] Según una variante, la proporción en masa agente carboxialquilante/quitosano varía entre 1 y 50, y preferentemente entre 2,5 y 25, durante la etapa de carboxialquilación.

[0123] Según una variante, se usa una proporción en masa de los reactivos que aportan al quitosano el grupo carboxialquilo (es decir, el agente de alquilación) con respecto al agente básico necesario y suficiente para obtener el grado de sustitución deseado. Por ejemplo, la proporción en masa del agente de alquilación con respecto al agente básico es superior a 1 e inferior a 10, y preferentemente está comprendida entre 1,4 y 3,3.

[0124] La invención se refiere también a un procedimiento de preparación de una composición según la invención.

[0125] Según una variante, el procedimiento comprende normalmente:

- la disolución de un quitosano sustituido en una solución acuosa, preferentemente en una solución tamponada a pH preferentemente comprendido entre 6,2 y 8,5 y preferentemente entre 6,5 y 7,5;

- el ajuste opcional del pH a un pH deseado, en general al pH fisiológico para la aplicación pretendida, por ejemplo, por adición de un agente de amortiguación, de un ácido o de una base;

- la adición opcional de otros excipientes, como, por ejemplo, un azúcar reductor, por ejemplo, sorbitol o manitol; - el ajuste opcional de la osmolalidad final de la composición.

[0126] Ventajosamente, el procedimiento comprende también una etapa ulterior de llenado de un dispositivo de inyección o de implantación, como, por ejemplo, una jeringa, con carboxialquil-quitosano o la composición que lo comprende. Ventajosamente, el dispositivo de inyección, como, por ejemplo, una jeringa, puede someterse a continuación a una esterilización al vapor. Este dispositivo, por ejemplo, una jeringa, puede ser empaquetado a continuación, preferentemente de manera estéril. También puede ser una bolsa, un vial o un frasco que permite la instilación de la solución de carboxialquil-quitosano.

[0127] Resulta ventajoso usar un quitosano que presenta un grado de pureza suficiente para la aplicación planteada.

[0128] Ventajosamente, el procedimiento comprende también una etapa ulterior de llenado de un dispositivo de inyección, de implantación o de instilación, como, por ejemplo, una jeringa, con la composición según la invención. Ventajosamente, el dispositivo de inyección, como, por ejemplo, una jeringa puede someterse a continuación a una esterilización al vapor. Este dispositivo, por ejemplo, una jeringa, puede envasarse a continuación, preferentemente de manera estéril.

[0129] Según una variante, el carboxialquil-quitosano según la invención se esteriliza por filtración y/o por esterilización al vapor, antes del llenado de un dispositivo de inyección, de implantación o de instilación, como, por ejemplo, una jeringa o un frasco.

[0130] Resulta ventajoso usar un quitosano que presenta un grado de pureza suficiente para la aplicación planteada.

[0131] La presente invención se refiere más en particular a una composición inyectable que comprende el carboxialquil-quitosano según la invención.

[0132] La invención se refiere también a una composición farmacéutica que comprende al menos un carboxialquil-quitosano definido según la invención.

[0133] Según una variante, el carboxialquil-quitosano o la composición que lo comprende se usa como composición farmacéutica inyectable, implantable o apta para la instilación, o dispositivo médico inyectable o implantable o apto para la instilación.

[0134] La invención cubre además un carboxialquil-quitosano o una composición que lo comprende, en una forma seca, especialmente en una forma liofilizada. En particular se puede (re)dispersar, y preferentemente solubilizar, el producto liofilizado antes de uso.

[0135] La presente invención se refiere más en particular a una composición según la invención para un uso para un tratamiento terapéutico, por ejemplo, que comprende la inyección por vía subcutánea, intradérmica, intraocular o intraarticular, de dicha composición, por ejemplo, para la reparación, la regeneración o el llenado de al menos un tejido corporal que necesita una reparación o un llenado.

[0136] Ventajosamente, según una realización, un carboxialquil-quitosano según la invención presenta una inmunocompatibilidad de las formulaciones de carboximetil-quitosano de origen fúngico con ayuda del modelo de bolsa de aire en ratón, 24 horas después de la inyección expresada en número de glóbulos blancos inferior a 10 * 106 células/ mL, y preferentemente inferior a 8 * 106 células/ mL.

[0137] Ventajosamente, según una realización, un carboxialquil-quitosano según la invención presenta una inmunocompatibilidad de las formulaciones de carboximetil-quitosano de origen fúngico con ayuda del modelo de bolsa de aire en ratón, 24 horas después de la inyección expresada en concentración de IL1-beta inferior a 10 * 10'9 g/mL, y preferentemente inferior a 5 * 10'9 g/mL.

[0138] Ventajosamente, según una realización, un carboxialquil-quitosano según la invención presenta una inmunocompatibilidad de las formulaciones de carboximetil-quitosano de origen fúngico con ayuda del modelo de bolsa de aire en ratón, 24 horas después de la inyección expresada en concentración de KC/CXCL1 inferior a 50 * 10'9 g/mL, y preferentemente inferior a 30 * 10'9 g/mL.

[0139] Ventajosamente, según una realización, un carboxialquil-quitosano según la invención presenta una inmunocompatibilidad de las formulaciones de carboximetil-quitosano de origen fúngico con ayuda del modelo de bolsa de aire en ratón, 24 horas después de la inyección expresada en concentración de TNF-alfa inferior a 150 * 10'9 g/mL, y preferentemente inferior a 125 * 10'9 g/mL.

[0140] Ventajosamente, según una realización, un carboxialquil-quitosano según la invención presenta una inmunocompatibilidad de las formulaciones de carboximetil-quitosano de origen fúngico con ayuda del modelo de bolsa de aire en ratón, 24 horas después de la inyección expresada en concentración de KC/CXCL1 inferior a 50 * 10'9 g/mL, y preferentemente inferior a 30 * 10'9 g/mL.

[0141] Ventajosamente, según una realización, un carboxialquil-quitosano según la invención presenta una inmunocompatibilidad de las formulaciones de carboximetil-quitosano de origen fúngico con ayuda del modelo de bolsa de aire en ratón, 24 horas después de la inyección, que satisface simultáneamente los límites máximos expresados anteriormente en número de glóbulos blancos y concentraciones en IL1-beta, KC/CXCL1 y TNF-alfa.

[0142] Las medidas del número de glóbulos blancos y de las concentraciones en IL1-beta, KC/CXCL1 y TNF-alfa se realizan según los protocolos de los ejemplos.

[0143] Ventajosamente, según una realización, un carboxialquil-quitosano según la invención presenta un tiempo de semivida en presencia de una mezcla de enzimas lisozima y hialuronidasa a 37 °C superior a 500 minutos, según el protocolo de medida del ejemplo 6.

[0144] Ventajosamente, según una realización, en particular en aplicación intraarticular, un carboxialquilquitosano según la invención presenta un coeficiente de fricción (COF⁰) inferior a 5, y preferentemente inferior o igual a 4 (según el protocolo del ejemplo 9).

[0145] La presente invención se refiere especialmente a una composición según la invención para un uso para un tratamiento reumatológico, oftalmológico, en medicina estética, en cirugía plástica, en cirugía interna, por ejemplo, para la prevención de las adherencias tisulares posquirúrgicas, dermatológico o en cosmética.

[0146] Según una variante, el tejido corporal se elige entre los tejidos que pertenecen a las cuerdas vocales, los músculos, los ligamentos, los tendones, los cartílagos, los órganos sexuales, los huesos, las articulaciones, los ojos, la dermis epidérmica, una o varias capas de la piel, el mesodermo, o cualquiera de sus combinaciones, y más en particular a los ojos, la dermis y las articulaciones.

[0147] La presente invención se refiere también a una composición según la invención para un uso para un tratamiento terapéutico de un síndrome del ojo seco, una lesión de córnea o una inflamación articular.

[0148] La presente invención se refiere además a la aplicación de una composición según la invención por instilación en la superficie ocular para prevenir o luchar contra una lesión de córnea, o síndrome del ojo seco, en particular con el fin de lubricar o regenerar la superficie ocular.

[0149] Así, la invención se refiere también a una composición de gotas oftálmicas que comprende un carboxialquil-quitosano definido según la presente invención.

[0150] Según una variante, el sujeto está afectado por una patología inflamatoria (por ejemplo, osteoartrosis).

[0151] La presente invención se refiere más en particular a una composición según la invención para el tratamiento de una artrosis, una artritis, o la reparación de un defecto del cartílago, por ejemplo, por inyección en la cavidad sinovial o por implantación en el defecto del cartílago.

[0152] La presente invención se refiere más en particular a un dispositivo médico, por ejemplo, un implante médico, caracterizado porque comprende o consiste en una composición según la invención.

[0153] Según una variante preferida, la invención se refiere así a un dispositivo médico que comprende una cámara que contiene un carboxialquil-quitosano en una forma seca, especialmente en una forma liofilizada, y opcionalmente una o varias cámaras más que contienen uno o varios productos activos, aditivos o excipientes.

[0154] La composición según la presente invención puede comprender también uno o varios aditivos o excipientes que permiten modular sus propiedades.

[0155] La presente invención se refiere también a una composición según la invención para un uso en un procedimiento de tratamiento terapéutico, por ejemplo, que comprende la instilación o la inyección por vía subcutánea, intradérmica, ocular, intraocular o intraarticular, de dicha composición, por ejemplo, para la reparación o el llenado de al menos un tejido corporal que necesita una reparación o un llenado.

[0156] La presente invención se refiere también a una composición según la invención para su uso en un procedimiento de tratamiento de una artrosis, o la reparación de un defecto del cartílago, por ejemplo, por inyección en el líquido sinovial o después se mezcla con la sangre e implantación en el cartílago.

[0157] La presente invención se refiere también a una composición según la invención para un uso en un procedimiento de tratamiento o de cuidados estéticos por llenado de la dermis («dermal filling»). Se trata especialmente, por ejemplo, de inyectar una composición según la invención de forma subcutánea o intradérmica.

[0158] La presente invención se refiere también a una composición según la invención para un uso en un procedimiento de tratamiento superficial de la piel por inyección múltiple por vía intradérmica. Dichas composiciones pueden usarse normalmente en dermatología, como tratamientos estéticos. Dicho procedimiento tiene por objeto, por ejemplo, esponjar la piel para hacerle perder un aspecto arrugado (tratamiento de las arrugas grandes y/o pequeñas). Dicho tratamiento puede aplicarse a un sujeto que desee dar a su piel un aspecto rejuvenecido.

[0159] La presente invención se refiere también a una composición según la invención para un uso en un procedimiento de tratamiento en el que la composición es un agente de viscosuplementación. En este caso se trata, por ejemplo, de inyectar en el nivel intraarticular la composición de la invención especialmente para limitar los rozamientos de las superficies de cartílago de la articulación.

[0160] La presente invención se refiere también a una composición según la invención para un uso como vector celular, de uno o varios tipos celulares, y/o uno o varios agentes activos. Puede tratarse de agentes activos desde un punto de vista farmacéutico o biológico. La composición de la invención puede ser compatible en la práctica con la presencia de células, preferentemente de células vivas. Entre las células vivas de interés se puede citar por ejemplo: condrocitos (cartílago articular), fibrocondrocitos (menisco), fibroblastos de ligamento (ligamento), fibroblastos de piel (piel), tenocitos (tendones), miofibroblastos (músculo), células madre mesenquimatosas, glóbulos rojos (sangre) y queratinocitos (piel). La composición de la invención puede concebirse igualmente como vector terapéutico para el suministro guiado y/o de liberación controlada de al menos un agente terapéutico.

[0161] Según una variante, se añade sangre, o plasma, o un lisado plaquetario, o plasma rico en plaquetas, o cualquier fluido biológico con la composición de la invención que permita, por ejemplo, aumentar los rendimientos del producto.

[0162] Según una variante, la composición según la invención se formula en una forma sólida (por ejemplo, una película o una espuma porosa), que se solubiliza una vez implantada.

[0163] Según una variante, la composición se formula en forma de una composición nebulizable (spray).

[0164] La presente invención se refiere igualmente a una composición según la invención para un uso en un procedimiento terapéutico o estético de uno o varios tejidos u órganos afectados por una temperatura excesiva, como en el caso de una quemadura.

[0165] La presente invención se refiere también a una composición según la invención para un uso en un procedimiento de tratamiento de reparación del cartílago (por ejemplo, por implantación en un defecto del cartílago con vistas a promover su regeneración).

[0166] La presente invención se refiere también a una composición según la invención para un uso en un procedimiento de tratamiento de prevención de adherencias tisulares después de cirugía: el producto se aplica en los tejidos al final de la cirugía, por ejemplo, ginecológica, abdominal, etc.

[0167] La presente invención se refiere también a una composición a modo de líquido sinovial artificial que comprende un carboxialquil-quitosano según la invención.

[0168] La composición según la presente invención permite emular un líquido sinovial sano o mejorar un líquido sinovial sano o defectuoso buscando, por ejemplo, mejorar su capacidad lubricante para reducir las fricciones en la articulación, y/o sus propiedades de absorción de los golpes (identificable por el módulo de elasticidad G'), a la vez que es fácil de inyectar para llenar una jeringa, por ejemplo, o ser inyectada en el cuerpo humano o animal. Por indicación, el módulo elástico G' del líquido sinovial sano está comprendido entre 40 y 100 Pa, y su módulo de pérdida G" está comprendido entre 1 y 10 Pa.

[0169] Según una variante, el carboxialquil-quitosano, o la composición que lo comprende, se inyecta en forma de solución. Ventajosamente, según esta variante, el carboxialquil-quitosano, o la composición que lo comprende, es fácilmente inyectable a través de una aguja fina, por ejemplo, una aguja de diámetro 21 Gauge, a temperatura ambiente. Por inyección «fácil», se entiende preferentemente que la fuerza que debe ejercerse en dicha jeringa es inferior a 50 Newton para hacer fluir una composición según la invención a través de una aguja de 21 Gauge, preferentemente una fuerza inferior a 20 Newton.

[0170] La presente invención se refiere también a una composición a modo de lágrimas artificiales que comprende un carboxialquil-quitosano según la invención.

[0171] En general, los intervalos de valores de osmolalidad y de pH buscados en las aplicaciones biomédicas son cercanos a los intervalos siguientes:

-Osmolalidad:

[0172]

- Iso-osmolar con el plasma: 285 a 295 mosm/kg;

- Iso-osmolar con el líquido sinovial: - Iso-osmolar con el líquido sinovial: 404 ± 57 mosml/kg, según «Clin Orthop Relat Res, 235, 289-95, 1988» y «Biochem Biophys Res Comm, 422, 455-461, 2012»;

- De 280 a 350 mosm/kg.

-p H

[0173] Un pH fisiológico es en general superior a 6,8, en particular superior a 7,0 y, en particular, de 7,4 (por ejemplo, para el plasma o un líquido sinovial).

[0174] El pH del plasma es en general de 7,4. El pH del líquido sinovial es en general de 7,768 /- 0,044 según «J Bone Joint Surg Br, 41-B(2), 388-400, 1959»; o de 7,3 según «Acta Orthop Scand 634-641, 1969», o según «Clin Rheumatol 25, 886-888, 2006».

[0175] El pH sinovial en los casos de osteoartrosis o de artritis se considera en general más bajo que el del líquido sinovial sano.

[0176] Así, la presente invención se refiere a una mezcla de un líquido sinovial con una composición según la presente invención, por ejemplo, según una proporción de volumen entre (i) el carboxialquil-quitosano, o la composición que lo comprende, y (ii) el líquido sinovial que está comprendida entre 20/80 y 80/20 (v/v), y es, por ejemplo, de 50/50 (v/v).

[0177] Ventajosamente, la composición según la presente invención es estéril. Muy ventajosamente, la composición según la presente invención se esteriliza por aumento de la temperatura, preferentemente en autoclave.

[0178] Según una variante, las composiciones de la invención son transparentes o translúcidas.

[0179] Por «translúcido» se entiende que se puede distinguir un objeto cuando su composición se coloca entre el ojo del observador y el objeto. Por «transparente» se entiende que se pueden distinguir caracteres alfanuméricos cuando se coloca la composición entre el ojo del observador y los caracteres observados. En general esta evaluación se realiza con un grosor de composición de aproximadamente 1 cm. También se puede seguir el procedimiento de la monografía 2.9.20 de la Farmacopea Europea para la inspección visual. Asimismo, se puede medir la densidad óptica de la composición, por ejemplo, por espectrometría UV-visible a 500 nm y asegurarse de que la densidad óptica es inferior a 0,5, preferentemente 0,2 con respecto a un disolvente de referencia.

[0180] Según una variante, las composiciones de la invención son poco o nada opalescentes.

[0181] Por «opalescente» se entiende que la solución conlleva una difracción de la luz visible a simple vista, por ejemplo, por inspección visual según un procedimiento tal como la monografía 2.9.20 de la Farmacopea Europea y por comparación con soluciones de referencia de niveles de opalescencia diferentes de la Farmacopea Europea. Según una variante, la composición de la invención es incolora, lo que significa en particular que un observador a simple vista no atribuye un color específico a la composición. Según una variante, la opalescencia es inferior al máximo tolerado para la aplicación planteada.

[0182] La invención se refiere en particular a artículos o elementos de empaquetado, preferentemente estériles, que comprenden uno o varios dispositivos de instilación o de inyección recargados con una composición según la invención. Se trata normalmente de dispositivos que permiten instilar el producto en forma de gotas o de jeringas precargadas.

[0183] La composición de la invención puede ventajosamente estar esterilizada. Así, la invención se refiere a un carboxialquil-quitosano esterilizado. El carboxialquil-quitosano es por tanto estéril, especialmente para aplicaciones que lo necesitan.

[0184] Según una variante, la composición de la invención se esteriliza al vapor, por ejemplo, por una elevación de la temperatura a una temperatura superior a 100 °C, y preferentemente superior a 120 °C, por ejemplo, entre 121 y 138 °C, en autoclave, durante un tiempo suficiente para la esterilización, por ejemplo, en general de 15 a 20 minutos. Según otra variante, la composición puede esterilizarse por filtración con ayuda de filtros previstos para este fin, por ejemplo, filtros de porosidad inferior o igual a 0,2 pm.

[0185] Ventajosamente, según una realización preferida, la pérdida en viscosidad intrínseca del carboxialquilquitosano durante una esterilización al vapor es inferior al 40 %.

[0186] La invención cubre además una composición de la invención en una forma seca, especialmente en una forma liofilizada.

[0187] En particular se puede (re)dispersar esta composición liofilizada antes de su uso.

[0188] La presente invención cubre también un procedimiento de tratamiento terapéutico que comprende la inyección de una composición según la invención.

[0189] La presente invención cubre igualmente el uso de una composición según la invención para la preparación de una composición farmacéutica, en particular para un tratamiento terapéutico, por ejemplo, tal como se define más específicamente por la invención.

[0190] La presente invención cubre igualmente un procedimiento de cuidados estéticos, en otros términos no terapéutico, que comprende la inyección de una composición según la invención. Se trata, por ejemplo, del relleno de arrugas o del relleno de una o varias zonas de tejido visible dañadas, por ejemplo, a consecuencia de un accidente o de una intervención quirúrgica, con fines estéticos.

[0191] Un tejido es un conjunto de células semejantes y del mismo origen, agrupadas en conjunto funcional, es decir, que participan en una misma función. Entre los tejidos se puede citar: el tejido epitelial, el tejido conjuntivo, el tejido muscular y el tejido nervioso.

[0192] Por «composición según la invención» o términos equivalentes se entiende una composición definida como en la presente invención, lo que incluye cualquiera de las variantes, realizaciones particulares o específicas, independientemente o según cualquiera de sus combinaciones, lo que incluye según las características preferidas.

[0193] A partir de la lectura de la descripción explicativa que hace referencia a ejemplos que se proporcionan exclusivamente a título ilustrativo y que no limitarían en ningún modo el alcance de la invención, el experto en la materia deducirá claramente otros objetos, características y ventajas de la invención.

[0194] Los ejemplos forman parte integral de la presente invención y cualquier característica que parezca novedosa con respecto a un estado de la técnica anterior cualquiera a partir de la descripción tomada en su conjunto, incluidos los ejemplos, forma parte integral de la invención en su función y en su generalidad.

[0195] Así, todos los ejemplos tienen un alcance general.

[0196] Por otra parte, en los ejemplos, todos los porcentajes se expresan en masa, salvo que se indique lo contrario, y la temperatura se expresa en grados Celsius salvo que se indique lo contrario, y la presión es la presión atmosférica, salvo que se indique lo contrario.

Ejemplos

[0197] Los quitosanos precursores de los quitosanos sustituidos según la invención presentan una masa molecular media en viscosidad (determinada por viscosimetría capilar) y un grado de acetilación (GA, proporción de unidad de N-acetil-D-glucosamina, determinada por titulación potenciométrica) comprendida en los intervalos de la Tabla 1. La masa molecular de un quitosano también puede definirse por la viscosidad dinámica de una solución de concentración 1 % (m/m) en quitosano en el ácido acético de concentración 1 % (v/v), medida por viscosimetría móvil de rotación, por ejemplo, con un viscosímetro Brookfield, como se describe en la Tabla 1.

[0198] En la presente invención se usan los procedimientos siguientes, salvo mención en sentido contrario: Procedimiento de medida del potencial zeta

[0199] La formulación que se va a analizar se diluye en un tampón de fosfato para obtener una concentración final de polímero del 0,05 %, y después se agita ligeramente hasta homogeneización. A continuación la solución se separa en diferentes fracciones, y se ajusta el pH de cada una de las fracciones al valor deseado, entre pH 4 y 8, bien por adición de hidróxido de sodio a 0,1 N o bien por adición de ácido clorhídrico a 0,1 N. El potencial zeta de cada fracción se mide con ayuda de un aparato «Nano-Z» (gama Zeta-Sizer, Malvern Instruments).

Procedimiento de medida del intervalo de solubilidad de los polímeros de quitosano

[0200] El intervalo de solubilidad se establece preparando una solución del polímero para ensayo a una concentración del 1 % y un pH de 9, fraccionándolo en varias fracciones cuyo pH se ajusta a diferentes pH en un intervalo de 9 a 1. Se verifica para cada fracción que el polímero es soluble, es decir, que no forma turbiedad, según el procedimiento de inspección visual de la monografía 2.9.20 de la Farmacopea Europea. Se anota el intervalo de pH en el que el polímero es soluble o insoluble.

Modelo de bolsa de aire subcutánea en el ratón

[0201] Se usó un modelo de bolsa de aire subcutánea en el ratón para evaluar la reacción a un cuerpo extraño y la inmunocompatibilidad de diferentes polímeros derivados de quitosano de origen fúngico. En este modelo se produce una cavidad de bolsa de aire mediante inyecciones subcutáneas repetidas de aire estéril en el dorso de un ratón. La bolsa generada por el inflado del aire imita la cavidad sinovial, suministrando un entorno localizado en el que es posible estudiar la estimulación de una respuesta inflamatoria en el líquido extraído de la bolsa de aire y los tejidos circundantes, tal como se describe en Segwick y col. (in: J Pathol 141,483, 1983) y Sin y col. (in: Ann Rheum Dis 45, 873, 1986). La cavidad de la bolsa de aire permite inyectar hasta 1 mL de producto en un animal de aproximadamente 30 g. Según el protocolo descrito por Dawson y col. (in: Int J Tiss Reac 8, 171, 1991), la bolsa de aire se establece en ratones CD-1 Swiss albinos machos no consanguíneos (exentos de patógenos, peso corporal a la recepción 25 a 35 g) en los tiempos Día 0 y Día 4 mediante la inyección repetida de 5 mL y después 3 mL de aire estéril. En el Día 7, se efectúa una inyección subcutánea única de 1 mL de producto directamente en la cavidad de la bolsa de aire. Unas inyecciones de 1 mL de suero salino y de una solución al 1 % de carragenano sirven respectivamente de control negativo y positivo. Se lleva un seguimiento regular de los animales en las horas posteriores a la inyección para detectar posibles signos clínicos de toxicidad sistémica o local, y se mide la ganancia de peso corporal y la temperatura en el momento de la inyección y del sacrificio. Los animales son sacrificados después de un periodo de contacto con el producto de 24 horas (3 animales por producto). Las evaluaciones inmunológicas del fluido de lavado recuperado de la bolsa incluyen el análisis citológico (recuento y distribución en glóbulos blancos y rojos) y la cuantificación de los principales mediadores inflamatorios (IL-1-beta, TNF-alfa y KC/CXCL1) por medio de kits 'ELISA' (AbCam), realizados según las instrucciones. Se lleva a cabo el análisis macroscópico y la histopatología por coloración de hematoxilina/eosina de los tejidos cutáneos circundantes. Se presta una atención especial a la localización del producto en los tejidos circundantes así como a su reabsorción en el fluido.

Modelo de evaluación de la tolerancia local intraarticular en un modelo ovino

[0202] Según la bibliografía y las recomendaciones de la OARSI, el cordero es reconocido como un modelo bien caracterizado para evaluar los efectos de la inyección intraarticular de tratamientos innovadores (Little y col. in: Osteoarthritis Cartilage 18, S80, 2010; Edouard y col. in: Phys Ther Sport 14, 116, 2013; McCoy y col. in: Vet Pathol 52, 803, 2015). El modelo de cordero permite inyectar por vía intraarticular un volumen de formulación que simula el uso clínico de la viscosuplementación en el ser humano (Fraser y col. in: Semin Arthritis Rheum 22, 9, 1993). Las medidas de tolerabilidad local comprenden los signos clínicos de inflamación sinovial (derrame, cojera, comodidad) por medio de escalas clínicas semicuantitativas validadas, descritas por Shafford y col. (in: Vet Anaesth Analg 31, 20, 2004) y Kaler y col. (in: Vet J 180, 189, 2009), así como la evaluación citológica del líquido sinovial. En algunos casos, estos análisis pueden completarse con la evaluación anatómica e histológica del miembro inyectado. Se inyecta un volumen de 2 mL de formulación en la articulación (babilla) de ovejas en buen estado de salud (edad 2 a 6 años; peso 60 a 80 kg). Después de la inyección, se registran los signos clínicos de los animales cotidianamente durante un periodo de 15 días, según una escala semicuantitativa de 0 a 4 para el derrame (por palpación de la babilla) y la cojera. Se refiere el número de signos encontrados para cada una de las puntuaciones en todo el tiempo de observación. Para evaluar los efectos de una inyección repetida de una misma formulación, se realiza una segunda inyección después de 1 mes en la articulación de los mismos, y se lleva un seguimiento de los animales según el mismo protocolo que para la primera inyección. Además, se realiza una punción del líquido sinovial en el día 15, y se determinan los parámetros macroscópicos (color, viscosidad), citológicos (recuento y distribución en glóbulos blancos y rojos), así como la cantidad de proteínas séricas totales según procedimientos clásicos. El líquido sinovial se considera normal si su aspecto es claro, viscoso y ligeramente amarillento, y el análisis citológico indica que el número de glóbulos blancos es inferior a 1 * 105 células/mL y que la concentración en proteínas totales es de aproximadamente 25 mg/mL.

Ejemplo 1 - N-succinil-quitosanos (no reivindicados)

[0203] Se prepararon N-succinil-quitosanos de diferente masa molecular y estructura molecular (grado de acetilación (GA) y grado de sustitución por el grupo succinilo (GS)) y se caracterizaron según el procedimiento general descrito en las solicitudes WO 2016/016463 o W^o2016/016464 (patente EP 3016663). Se llevó a cabo una primera etapa de acetilación mediante la adición de anhídrido acético con el fin de aumentar el grado de acetilación, salvo para el polímero CSS-1 (Tabla 1a).

[0204] Se prepararon formulaciones con estos N-succinil-quitosanos (CSS) a una concentración del 2 % a pH y osmolaridad fisiológicos, y se acondicionaron en una jeringa de vidrio. Las jeringas se esterilizan por autoclave con un ciclo estándar (15 minutos a 121 °C). Se verifica que las formulaciones no presenten partes insolubles o turbiedad en un gran intervalo de pH alrededor del pH fisiológico (pH 6,5 a 7,5), por inspección visual según el procedimiento EP 2.9.20. Se controla que el nivel de endotoxinas bacterianas de las formulaciones sea inferior a 20 EU/mL según el procedimiento de la monografía 2.6.14(D) de la Farmacopea Europea y que la carga microbiológica es inferior a 100 cfu/g según el procedimiento 2.6.12 de la Farmacopea Europea, antes de realizar una evaluación de su inmunocompatibilidad in vivo.

[0205] La inmunocompatibilidad de las formulaciones de CSS se evalúa con ayuda del modelo de la bolsa de aire subcutánea en el ratón (Tabla 1b). La reacción observada se compara con la observada después de la inyección de una solución de suero salino (control negativo), de un control positivo muy reactivo (solución al 1 % de carragenano) y de un producto comercial a base de Hylan GF-20, un ácido hialurónico parcialmente reticulado (Synvisc®, Sanofi).

[0206] De una manera general, se desprende que estas formulaciones a base de CSS conllevan una reacción inmunológica de tipo reacción a un cuerpo extraño, puesto de relieve por un número de glóbulos blancos en el infiltrado celular más elevado que para el control negativo, no obstante, menos elevado que para el control positivo (1 % carragenano). La reacción inducida por las formulaciones se caracteriza por una activación de los neutrófilos, puesta de relieve por una concentración en marcador KC/CXCL1 más elevada que las del control negativo y del producto Synvisc®. Por su parte, los niveles de los marcadores IL1-beta y TNF-alfa son bajos.

[0207] El hecho de modificar el GA y/o el GS de los CSS o bien de modificar su masa molecular no conllevan diferencia de reacción inmunológica. Aunque las formulaciones de CSS no causan un efecto perjudicial en los tejidos a nivel local, es necesario poder obtener un nivel de inmunocompatibilidad más elevado en el caso de aplicaciones terapéuticas dirigidas a tejidos fragilizados por la patología en cuestión, como, por ejemplo, el síndrome del ojo seco, las lesiones de córnea o las inflamaciones de las patologías articulares.

Ejemplo 2 - Carboximetil-quitosanos de origen animal

[0208] Pudieron obtenerse dos carboximetil-quitosanos de origen animal, de uso farmacéutico o médico e implantables o inyectables (CC-1 y CC-2 de la Tabla 2a).

[0209] Se sometieron a ensayo otros dos carboximetil-quitosanos:

- Un CC obtenido por carboximetilación de quitina de origen animal (CC-3),

- Un CC obtenido por carboximetilación de quitosano de origen animal, de manera que el quitosano se preparó por desacetilación de una quitina de origen animal (CC-4).

[0210] Los carboximetil-quitosanos (CC) se caracterizaron por RMN de carbono 13 para confirmar su identidad y determinar los valores de GA (grado de acetilación) y GS (grado de sustitución por el grupo carboximetilo), con un margen de error estimado en aproximadamente ±10 % (Tabla 2a). Se caracteriza la carga electrostática del polímero midiendo su potencial zeta a una concentración del 0,05 % (m/m) en un intervalo de pH comprendido entre pH 8 y pH 4, y se refiere el valor del potencial zeta a pH 7,5 (Tabla 2a). Se observa que el valor del potencial zeta a pH 7,5 está relativamente bien correlacionado con el valor del GS determinados por RMN de carbono 13. Por ejemplo, el polímero CC-3 está más sustituido que el polímero CC-4 por el grupo aniónico carboximetilo (en forma de carboxilato a pH 7,5) y presenta un GA similar, por lo que su carga global negativa es mayor (-28 mV frente a -11 mV a pH 7,5).

[0211] Se observa que los polímeros CC-1 y CC-2 no se solubilizan bien en el intervalo de pH fisiológico (pH 6,5 a 7,5). No se puede evaluar su inmunocompatibilidad con ayuda del modelo de bolsa de aire en ratón. Los polímeros CC-3 y CC-4 se solubilizan bien en todo el intervalo de pH alto, de 1 a 9.

[0212] A continuación, se prepararon las formulaciones de CC-3 (2%) y CC-4 (1,5%) según el mismo procedimiento que el del ejemplo 1, acondicionadas en jeringa de vidrio y después esterilizadas por autoclave según un ciclo estándar de 15 minutos a 121 °C (Tabla 2a). Se constata que la formulación al 2 % del polímero CC-3 no resiste la esterilización final por autoclave, como se pone de relieve por una pérdida de su viscosidad intrínseca de aproximadamente el 60 % que se traduce en hidrólisis del polímero, así como por una pérdida del 98 % de su módulo de conservación G'. Alternativamente a la esterilización final por autoclave, la formulación de CC-3 se filtra antes de ser acondicionada en jeringa con el fin de producir una formulación que pueda ser evaluada con ayuda del modelo de bolsa de aire en ratón.

[0213] Las formulaciones de CC-3 (2 %, filtrada) y CC-4 (1,5 %, esterilizada por autoclave) son controladas para verificar que el nivel de endotoxinas y la carga microbiológica son inferiores a 20 EU/mL y 100 cfu/g, y después se evalúa su inmunocompatibilidad con ayuda del modelo de bolsa de aire en ratón (Tabla 2b).

[0214] La formulación de CC-4 conlleva una reacción no despreciable, caracterizada por una concentración elevada de los dos marcadores KC/CXCL1 (activación de los neutrófilos) y TNF-alfa en el infiltrado, simultáneamente. El marcador TNF-alfa no se detectó después de la inyección de las formulaciones de CSS del ejemplo 2 ni de Synvisc® (Hylan GF-20). Ahora bien, no se desea inducir una reacción caracterizada por el marcador TNF-alfa. Como se desea disponer de una buena inmunocompatibilidad en el caso de las aplicaciones terapéuticas para las cuales la formulación estaría en contacto con tejidos fragilizados por la patología, como, por ejemplo, el síndrome del ojo seco, las lesiones de córnea o las inflamaciones articulares, y evitar la activación de los neutrófilos y de TNF-alfa, el carboximetilquitosano de origen animal CC-4 no es apropiado.

[0215] La formulación de CC-3 induce una reacción más débil, caracterizada por un número de glóbulos blancos y una concentración de marcador KC/CXCL1 moderados, similares a los niveles del producto comparador Synvisc® pero más elevados que los del control negativo (suero salino). La formulación de ^cC-3 parece, por tanto, menos inmunorreactiva que las formulaciones de CSS y que la formulación de CC-4. Sin embargo, la formulación de CC-3 presenta la desventaja de una concentración de marcador KC/CXCL1 que podría revelarse inadaptada para un procedimiento de tratamiento terapéutico en el que el sujeto necesita una inmunocompatibilidad muy buena y someterse a una intensa hidrólisis de las cadenas macromoleculares bajo el efecto del calor, lo que hace imposible su esterilización por autoclave durante una etapa final en fin de procedimiento de producción, es decir, después del llenado de la jeringa por la formulación.

Ejemplo 3 - Carboximetil-quitosanos de origen fúngico

[0216] Con el fin de obtener los carboximetil-quitosanos de las Tablas 3a y 3b a partir de quitina o de quitosano de origen fúngico, se realizan las reacciones siguientes:

- Reacetilación y después carboximetilación de quitosano fúngico de masa molecular «ultra-high» (CC-5 de la Tabla 3a);

- Carboximetilación y después reacetilación de quitosano fúngico de masa molecular «ultra-high» (CC-5 a CC-9); - Carboximetilación de quitosano fúngico de masa molecular «ultra-high» (CC-11);

- Carboximetilación de quitina fúngica (CC-10).

[0217] A modo de ejemplo, la preparación del CC-8 se desarrolla de la manera siguiente:

Se dispersan 10 g de quitosano «ultra-high» en 220 mL de isopropanol y 68 mL de hidróxido de sodio al 40 % (m/v). Se disuelven 45 g del agente de alquilación ácido monocloroacético (MCA) en 45 mL de isopropanol, y se añaden a la suspensión de quitosano. Se mantiene la reacción durante 16 horas a 25 °C. Se recupera el polímero por precipitación en etanol, y después se purifica mediante ciclos de solubilización/precipitación en etanol. Se seca el precipitado en una estufa ventilada. Se dispersa en agua una masa de 15 g del precipitado, y se añaden a la misma 3,75 mL de anhídrido acético. Después de 30 minutos de agitación a temperatura ambiente, se ajusta el pH del medio a 6, y se añaden 3,75 mL de anhídrido ácido (AC). Después de 30 minutos de agitación a temperatura ambiente, se neutraliza el medio y se precipita en etanol. El precipitado así obtenido se vuelve a poner en solución y después se precipita de nuevo. El precipitado final de carboximetil-quitosano (CC-8) se seca en una estufa ventilada.

[0218] Los parámetros de síntesis aplicados para preparar los otros CC se describen en las Tablas 3a y 3b.

Tabla 3a - Parámetros de síntesis de carboxial uil- uitosano a artir de uitosano fún ico

[0219] Los carboximetil-quitosanos (CC) de origen fúngico obtenidos se caracterizan por RMN de carbono 13 para confirmar su estructura y determinar el valor del GA y del GS (Tabla 3c). Teniendo en cuenta la desviación típica inherente al procedimiento de espectrometría RMN de carbono 13 (aproximadamente ±10 %), se observa que el valor del potencial zeta a pH 7,5 está correlacionado con la estructura molecular, en particular con el GS.

continuación

[0220] Los CC obtenidos son todos solubles en un amplio intervalo de pH, en particular en el intervalo de pH de 4,0 a 8,5, sin opalescencia.

[0221] Las formulaciones se preparan a una concentración en CC del 1,5 o el 2 %, se acondicionan en una jeringa de vidrio, y después se esterilizan por autoclave según un ciclo estándar de 15 minutos a 121 °C. Con el fin de evaluar si las formulaciones son esterilizables por autoclave, se mide la viscosidad intrínseca de los polímeros antes y después de autoclave por viscosimetría capilar, después de dilución de un factor de 25 mediante un tampón de fosfato. La pérdida de viscosidad intrínseca de los CC es inferior al 40 %, lo que deja ver una resistencia aceptable, al contrario que la formulación CC-3 del ejemplo 2 (que ha experimentado una pérdida de aproximadamente el 60 % de su viscosidad intrínseca).

[0222] La inspección visual de las formulaciones esterilizadas de la Tabla 3c indica que son transparentes y no opalescentes. A continuación, se controlan para verificar que el nivel de endotoxinas y la carga microbiológica son inferiores a 20 EU/mL y 100 cfu/g, y después se evalúa su inmunocompatibilidad con ayuda del modelo de bolsa de aire en ratón.

[0223] De una manera general, se constata una buena inmunocompatibilidad de las formulaciones de CC de origen fúngico, con una atenuación e incluso una supresión de la reacción inmune con respecto a las formulaciones de N-succinil-quitosano del ejemplo 1 y a las formulaciones de carboximetil-quitosano de origen animal del ejemplo 2.

[0224] Se constata que una baja concentración en marcador KC/CXCL1 es inducida por las formulaciones de Cc de origen fúngico, al mismo nivel que la del control negativo (suero salino) y más baja que para el producto Synvisc®. Esto deja ver una activación de los neutrófilos despreciable e incluso ausente, al contrario de lo que se ha comunicado después de la inyección de las formulaciones de CSS (Ejemplo 1) y de CC de origen animal (Ejemplo 2).

[0225] Además, se constata que para algunas de las formulaciones de CC de origen fúngico (en concreto, CC-8 y c C-10), los cuatro parámetros de la reacción inmune se atenúan o se suprimen simultáneamente, es decir, a la vez el número total de glóbulos blancos, el marcador IL1-beta, el marcador KC-CXCL1 y el marcador TNF-alfa. Esto no se produce con las formulaciones de CSS ni con las formulaciones de CC de origen animal.

[0226] Al parecer, para los CC de origen fúngico, las formulaciones que presentan esta atenuación simultánea de los cuatro parámetros son aquellas cuya carga negativa es más elevada (por ejemplo, -26 mV para CC-8 y -24,5 mV para CC-10 a pH 7,5).

[0227] Se observa que las formulaciones de CC-4 de origen animal del ejemplo 2 y de CC-5 de origen fúngico débilmente sustituidos por el grupo carboxialquilo conllevan una cierta activación del marcador TNF-alfa, y que, por el contrario, solo la formulación de CC-4 de origen animal conlleva una secreción no despreciable del marcador KC/CXCL1. Se observa también que la formulación de CC-10 (de origen fúngico) no conllevó activación de los neutrófilos, al contrario que la formulación de CC-3 de origen animal del ejemplo 2.

Ejemplo 4 - Evaluación de la tolerancia local intraarticular de formulaciones de carboximetil-quitosano de origen fúngico con ayuda de un modelo ovino

[0228] Se preparan formulaciones al 2 % de dos carboximetil-quitosanos de origen fúngico (CC-8 y CC-10) del ejemplo 3 para evaluar su potencial para un uso por inyección intraarticular, con ayuda de un modelo ovino. Se administra un volumen de 2 mL de las dos formulaciones en la oveja, y se evalúa la reacción local inducida por su inyección intraarticular durante un periodo de 2 semanas. Se evalúan también los efectos de una segunda inyección de la formulación CC-8 en la misma articulación, 1 mes después de la fecha de la primera inyección. El producto Synvisc® se administra de la misma manera, con un volumen de 1 mL o de 2 mL.

[0229] Se lleva un seguimiento cotidiano de los signos clínicos por palpación de la articulación y observación de la cojera durante un tiempo de 15 días y se valoran según una puntuación semicuantitativa de 0 (sin señal) a una puntuación máxima de 3 para el derrame y 5 para la cojera. El resultado clínico global en el periodo de 15 días se refiere en términos de incidencia por puntuación (Tabla 4), así como la caracterización del líquido sinovial realizada en el día 15.

continuación

Ejemplo 5 - Evaluación de la tolerancia local de formulaciones de carboximetil-quitosano de origen fúngico después de la inyección intradérmica en el conejo

[0230] Se prepara una formulación a pH y osmolalidad fisiológicos de carboximetil-quitosano de origen fúngico con vistas a evaluar su potencial para la administración intradérmica, con ayuda de un modelo de conejo (Tabla 5a). Se prepara CC-15 de origen fúngico por carboximetilación y después reacetilación según el procedimiento general descrito en el ejemplo 3 para el CC-8, modulando los parámetros de síntesis para hacer variar el GA y el GS (Tabla 5a).

[0231] Se acondiciona la formulación en una jeringa de vidrio de 1 mL, y después se esteriliza por autoclave según un ciclo estándar (15 minutos a 121 °C). La formulación resiste a la esterilización por autoclave, siendo la pérdida de viscosidad intrínseca inferior al 40 %. Finalmente, se controla la formulación para verificar que el nivel de endotoxinas bacterianas es inferior a 40 EU/mL y la carga microbiológica inferior a 100 cfu/mL.

[0232] Se administra un volumen de 200 pL de formulación por inyección intradérmica en el conejo mediante una aguja de diámetro 27 Gauge (aguja de diámetro muy bajo), según un protocolo que cumple con la norma ISO10993 (parte 10) para la evaluación de la irritación primaria inducida por un implante intradérmico. Seis conejos reciben cada uno tres inyecciones de la formulación. Se inyecta también un producto de llenado cutáneo comercial a base de ácido hialurónico reticulado, Juvéderm® Voluma (Allergan), mediante una aguja de diámetro 27 Gauge. Se comunican las señales macroscópicas de irritación cutánea para todos los animales y los sitios inyectados a 12, 24 y 48 horas con vistas a determinar la puntuación de irritación primaria, evaluando la aparición en su caso de eritema, de escara, de edema y de induración en una escala semicuantitativa, según una puntuación de 0 (sin señal) a 4 (señal máxima). La puntuación de irritación primaria de cada producto se determina de la manera siguiente: se suma la media de las puntuaciones de eritema de los 18 sitios inyectados a 24 h, 48 h y 72 h. Se calcula de la misma forma la suma de las medias de la puntuación de edema. Se añaden las 2 sumas (eritema y edema), y después se divide por 54 para obtener la puntuación media de irritación primaria. Se procede de la misma forma con el producto comparador. Las puntuaciones de irritación se refieren en la Tabla 5b. Se observa que la formulación de c C no ha conllevado ningún signo de edema y pocos signos de eritema, de puntuación inferior a las inducidas por Juvéderm® Voluma en todos los casos. Se concluye que la formulación es no irritante y menos irritante que Juvéderm® Voluma.

[0233] A continuación, se prolonga el periodo de observación hasta 2 semanas después de la inyección, con una evaluación de las señales clínicas en los días 5, 7, 9, 11 y 14. Con vistas a realizar un posible análisis histológico, se sacrifican 2 animales en el Día 3, el Día 7 y el Día 14 después de la inyección.

Las puntuaciones macroscópicas se refieren en la Tabla 5c. Se observa que la formulación presenta una excelente tolerancia local en un periodo de 2 semanas después de la inyección intradérmica, con puntuaciones inferiores a las observadas con el producto Juvéderm® Voluma para todos los signos macroscópicos, y ningún signo de escara ni de edema.

Ejemplo 6 - Susceptibilidad a la degradación enzimática in vitro

[0234] En este ejemplo, se compara la velocidad a la que se degrada una formulación en presencia de una mezcla de las dos enzimas lisozima y hialuronidasa presentes en los fluidos biológicos (por ejemplo, el líquido sinovial, las lágrimas o el fluido intersticial de los tejidos conjuntivos). La enzima lisozima es reconocida en general por su capacidad para hidrolizar los biomateriales a base de quitosano.

[0235] Un carboximetil-quitosano fúngico CC-16 se prepara de la misma manera que el CC-8 del ejemplo 3, modulando los parámetros de síntesis para ajustar el GA y el g S. Se preparan formulaciones al 2 % de CC-16, de CC-8 (Ejemplo 3) y de CC-10 (Ejemplo 3) en un tampón de fosfato con el 3,5 % de sorbitol. Se evalúa asimismo una formulación al 2% del CC-3 de origen animal (Ejemplo 2), y dos productos de viscosuplementación comerciales a base de ácido hialurónico no reticulado (HA-1 y HA-2).

[0236] Se diluye la formulación en un factor 25 en un tampón de fosfato. A continuación se agita la solución durante 12 horas y se añade una mezcla de enzimas lisozima y hialuronidasa a la solución diluida, en dosis de 184 unidades/mL y 2,6 unidades/mL, respectivamente. La medida de viscosidad intrínseca se lleva a cabo a intervalos regulares, con ayuda de un viscosímetro capilar automático I-Visc (Lauda) provisto de un capilar de tipo Ubbelohde (modelo 0a). A continuación se calcula el tiempo de semivida de cada formulación, es decir, el tiempo necesario para que la viscosidad intrínseca del polímero alcance la mitad de su valor inicial (Tabla 6).

[0237] A partir de los resultados se comprende que las formulaciones de carboximetil-quitosano son hidrolizadas por la mezcla lisozima/hialuronidasa, y que se puede modular la cinética de hidrólisis por medio de la estructura molecular del carboximetil-quitosano. Esto permite ajustar el tiempo de residencia del producto en función de la aplicación terapéutica pretendida. Se deduce también que los carboximetil-quitosanos de origen fúngico se degradan con menor rapidez que el carboximetil-quitosano de origen animal (CC-3) y que los dos productos comerciales a base de ácido hialurónico. Ejemplo 7 - Impacto del calor

[0238] En este ejemplo, se colocan jeringas que contienen las formulaciones en una estufa a temperatura controlada a 60 °C durante un tiempo de 11 días, lo que permite evaluar su resistencia al calor a una temperatura más elevada que una temperatura de almacenamiento habitual. En cada plazo, se extrae una jeringa y se mide la viscosidad intrínseca del polímero según el procedimiento descrito al ejemplo 6. Se refiere la proporción entre la viscosidad en el plazo y la viscosidad inicial (en % de la viscosidad inicial).

[0239] Se evalúa una formulación al 2 % del CC-3 de origen animal del ejemplo 2 (con el 3,5 % de sorbitol), así como el producto de viscosuplementación comercial a base de ácido hialurónico no reticulado del ejemplo 6 (HA-2).

[0240] Se concluye que las formulaciones de carboximetil-quitosano de origen fúngico son resistentes al calor, y menos sensibles que la formulación de origen animal (CC-3) y que un producto comercial a base de ácido hialurónico.

Ejemplo 8 - Procedimientos de reducción de la carga microbiológica de carboximetil-quitosano

[0241] Se produce un carboximetil-quitosano de origen fúngico, CC-19, según el procedimiento usado para preparar el CC-8 del ejemplo 3, a partir de un quitosano «ultra-high». Sus características son las siguientes: GA 67 % y GS 115 % (medidos por RMN de carbono 13), soluble para cualquier pH, transparente, no opalescente. El potencial zeta a pH 7,5 de la formulación se estima en -27 mV (a partir de la regresión polinómica de la curva del potencial zeta en función del GS). Se prepara una formulación de CC-19 al 2 % en un tampón de fosfato con el 3,5 % de sorbitol, como se describe en el ejemplo 3. Sus características son las siguientes: pH 7,3 y osmolalidad 279 mOsm/kg. Para probar su viabilidad y el impacto en las características finales de la formulación, se implementan dos procedimientos conocidos para poder reducir la carga microbiológica de formulaciones acuosas, y se compara la viscosidad intrínseca de la formulación (diluida en un factor de 25), con ayuda de un viscosímetro capilar I-Visc (Lauda, capilar 0a) y su índice de refracción medido con ayuda de un refractómetro HI88713 (Hanna) antes y después del procedimiento (Tabla 8). Los dos procedimientos son los siguientes:

- Autoclave: la formulación se introduce en jeringa de vidrio, y después la jeringa se somete a autoclave según un procedimiento estándar (15 minutos a 121 °C);

- Filtración: se filtra un volumen de 300 mL de formulación con ayuda de un filtro de porosidad 0,2 mm (Preflow capsule filter, Pall).

[0242] El procedimiento de filtración en filtro de 0,2 pm se desarrolla de manera adecuada, con una presión constante de 2 bares y un caudal constante de aproximadamente 6 litros por hora.

[0243] Se concluye que los dos procedimientos tienen un impacto bajo en términos de reducción de material (índice de refracción) y de degradación del polímero (viscosidad intrínseca). Por tanto, pueden aplicarse industrialmente para obtener dispositivos médicos y productos farmacéuticos a base de las formulaciones de carboximetil-quitosano.

Ejemplo 9 - Capacidad lubricante de las formulaciones de carboximetil-quitosano de origen fúngico, in vitro [0244] Este ejemplo pretende ilustrar la capacidad lubricante de formulaciones de dos carboximetil-quitosanos de origen fúngico, CC-8 del ejemplo 3 (2 % y 1 %) y CC-19 del ejemplo 8 (2 %), con vistas a un uso opcional como viscosuplemento intraarticular o como gota oftálmica para la superficie ocular. La capacidad lubricante se evalúa con ayuda de un modelo in vitro que permite evaluar la reducción de las fricciones entre dos superficies. También se caracteriza la formulación de CC-3 (2 %) de origen animal del ejemplo 2 y de los productos comerciales a base de ácido hialurónico:

- Viscosuplementos intraarticulares: Synvisc® (Sanofi) y dos viscosuplementos a base de ácido hialurónico no reticulado, HA-2 de los Ejemplos 6 y 7) y HA-3.

- Gotas oftálmicas: dos productos a base de ácido hialurónico no reticulado (HA-4 y HA-5).

[0245] Además, se extrae el líquido sinovial de la rodilla de un paciente que sufre osteoartrosis, antes de una intervención quirúrgica para la colocación de una prótesis de rodilla. El fluido se conserva a -20 °C, y después se coloca a 25 °C antes del análisis del coeficiente de fricción.

[0246] La medida del coeficiente de fricción se realiza según el procedimiento siguiente. Dos discos a base de un biomaterial de tipo poliacrilato usado para la fabricación de lentillas intraoculares hidrófobas (tal como se describe en la patente EP 1830898) de diámetro 16,15 mm se hidratan previamente por inmersión en agua a 60 °C durante aproximadamente 2 horas, y después se fijan en las geometrías superior e inferior de un reómetro DHR-2 (TA Instruments). Se coloca un volumen de aproximadamente 100 pL del fluido para ensayo en el disco inferior, y después se hace descender la geometría superior hasta el contacto entre los dos discos, hasta una fuerza normal impuesta de 5 Newton. Las medidas del coeficiente de fricción se realizan a 25 °C durante un tiempo de 150 segundos, a fuerza normal constante (5N), frecuencia de oscilación de 1,256 rad/s y ángulo de deformación de aproximadamente 0,05 radianes, según un protocolo adaptado del protocolo descrito por Waller y col. (in: J Rheumatol 39, 7, 1473, 2012). Se activa la opción «respeto del punto cero de partida del movimiento oscilatorio». En cada punto de medida, se registra el valor del par de torsión, y después se calcula el coeficiente de fricción (COF) según la fórmula: COF = par de torsión / (1/3 x diámetro del disco x fuerza normal). Para cada formulación, la medida se reproduce 5 veces. Se refiere el valor del coeficiente de fricción por extrapolación de la ordenada en el origen a partir de cada curva COF en función del tiempo (COF0, Tabla 7).

continuación

[0247] En presencia de las formulaciones de carboximetil-quitosano al 2 % y al 1 %, el coeficiente de fricción es bajo, del mismo orden de magnitud e incluso más bajo que los productos comerciales de uso intraarticular y oftálmico, y significativamente más bajo que el de un líquido sinovial artrósico, en las condiciones de medida. De ello se deduce que las formulaciones de carboximetil-quitosano presentan el potencial de actual como lubricante reduciendo las fricciones entre dos superficies, por ejemplo, las superficies de cartílago de una articulación después de la inyección intraarticular o la superficie ocular después de instilación en forma de gotas. Las formulaciones de los CC de origen fúngico son más eficaces para reducir una reducción de las fricciones que la formulación de CC-3 de origen animal.

Ejemplo 10 - Uso de agujas finas para la administración de una formulación de carboximetil-quitosano de origen fúngico por vía intradérmica

[0248] Este ejemplo pretende mostrar que una formulación del 2 % de carboximetil-quitosano de origen fúngico puede inyectarse fácilmente en la dermis, en particular con ayuda de agujas muy finas diseñadas para la inyección en las capas superficiales de la dermis. La prueba consiste en medir la fuerza necesaria para eyectar el producto fuera de la jeringa equipada con una aguja, a una velocidad de eyección dada, con ayuda de un banco de compresión. Se considera de manera empírica que la inyección del producto es sencilla y cómoda para el médico y el paciente cuando la fuerza de eyección medida por esta prueba es inferior a 50 Newton, y que la eyección se realiza de manera regular y sin sacudidas. Resulta ventajoso poder administrar el producto con ayuda de agujas de diámetro inferior a 0,3 mm (30G) con el fin de reducir al mínimo el dolor y el sangrado en el punto de inyección así como el riesgo ulterior de hematomas y de enrojecimiento cutáneo.

[0249] Se produce un carboximetil-quitosano de origen fúngico de referencia CC-20 según el procedimiento general del CC-8 del ejemplo 3, a partir de un quitosano de tipo «ultra-high», con las modificaciones siguientes: para 10 g de quitosano, se usan 228 ml de isopropanol, 57 ml de hidróxido de sodio al 40 % y 47 g de MCA. La reacción se lleva a 35 °C durante 23 horas. Para 15 g de carboximetil-quitosano intermedio, se usan 7,5 ml de anhídrido acético en cada adición, y se aplican 3 ciclos suplementarios de purificación antes de secado y recuperación del carboximetilquitosano final. Las características de CC-20 son las siguientes: GA al 53 % y GS al 85 % (determinados por RMN de carbono 13), soluble en agua para cualquier pH (según el procedimiento descrito anteriormente), formando una solución transparente y no opalescente, de potencial zeta a pH 7,5 estimado a -24 mV (a partir de la regresión polinómica de la curva del potencial zeta en función del GS).

[0250] Se prepara una formulación de CC-20 al 2 % (m/m) como se describe en el ejemplo 3. La formulación se acondiciona en una jeringa de vidrio de 1 mL (BD-Medical) en la que se adapta la aguja. Con ayuda de un banco de compresión MultiTest 2.5-i (Mecmesin) equipado con una célula de compresión de 100 N, se mide la fuerza necesaria para la eyección del producto aplicando una velocidad de eyección constante de 80 mm/min. La fuerza máxima tolerada por el equipo es de aproximadamente 70 Newton. Se prueban las agujas siguientes: 30G, 32G, 33G e Invisible Needle™ (TSK Laboratory), cuyas dimensiones (diámetro exterior x longitud) se refieren en la Tabla 10.

[0251] A modo de comparación, se evalúan productos comerciales a base de ácido hialurónico no reticulado (referencias HA-6, HA-7) y reticulado (HA-8), indicados para el rejuvenecimiento cutáneo por vía intradérmica, según el mismo procedimiento, en su jeringa de origen. Los resultados se refieren en la Tabla 10.

Ejemplo 11 - Formulaciones de carboximetil-quitosano de origen fúngico de baja concentración con vistas a una indicación como gotas oftálmicas

[0252] Este ejemplo pretende mostrar que una solución de carboximetil-quitosano de origen fúngico de baja concentración puede aplicarse para la preparación de gotas oftálmicas con vistas a reducir los síntomas de los trastornos de la superficie ocular o a protegerla. Además de características fisiológicos, es decir, preferentemente un pH de aproximadamente 7,2 y una osmolalidad de aproximadamente 200 mOsm/kg, las gotas oftálmicas deben presentar preferentemente las propiedades fisicoquímicas siguientes: índice de refracción bajo (cercano a 1,33) y capacidad de minimizar las fricciones entre la superficie ocular y la conjuntiva y los párpados (capacidad lubricante). Finalmente, su perfil reológico es tal que el producto no es demasiado fluido para poder depositarse sobre el ojo, sino que se extiende de manera homogénea y no es adherente. Su perfil reológico debe ser también de tal forma que se facilita el parpadeo, sin acumulación, es decir, una viscosidad baja para una tasa elevada de cizalla. En particular, Orobia y col. consideran que la viscosidad durante el movimiento ocular (fuera de parpadeo) es ventajosamente superior a 10 mPa.s, por ejemplo, de aproximadamente 20 mPa.s (in: Clinical Ophthalmology 12, 453, 2018). En este caso debe observarse que el valor de la viscosidad puede variar según el procedimiento de medida, en particular el equipo, el modo de medida y los parámetros, la temperatura y la tasa de cizalla aplicada al producto sometido a ensayo.

[0253] Se produce un carboximetil-quitosano de origen fúngico de referencia CC-21 según el mismo procedimiento que el CC-20 del ejemplo 10. Se compara la estructura molecular de CC-20 y CC-21 en forma ácida, por espectrometría de infrarrojo de transformada de Fourier con ayuda de un espectrómetro Nicolet iS5 equipado con un ID7-ATR (Thermo Scientifics), según el procedimiento descrito por Chen y col. (Carbohydrate Polymers 53, 355, 2003). Se determina que su estructura molecular es idéntica al 99 % en la región de longitud de onda de 1.200 a 1.800 cm'1, y en consecuencia que sus GA y GS son similares.

Se preparan dos formulaciones del carboximetil-quitosano CC-21, de concentración 0,7% y 0,4% (m/m), en un tampón de fosfato con glicerol. Se ajusta el pH a 7,2 ± 0,2 y la osmolalidad a 200 ± 20 mOsm/kg, y después se filtran las formulaciones, y después se caracteriza su capacidad lubricante y su perfil de viscosidad según los procedimientos descritos a continuación. Se caracterizan gotas oftálmicas a base de ácido hialurónico (HA) de composición variable, disponibles comercialmente, según los mismos procedimientos (HA-5 a HA-9). Los resultados se refieren en la Tabla 11b.

Procedimiento de medida del coeficiente de fricción (adaptado a las gotas oftálmicas)

[0254] La capacidad de lubricar, es decir, de reducir las fricciones entre dos superficies en contacto, se evalúa mediante la medida del coeficiente de fricción entre dos discos de biomaterial de poliacrilato idénticos a los del ejemplo 9. Se fijan los dos discos en las geometrías superior e inferior de un reómetro DHR-2 (TA Instruments), se coloca un volumen de aproximadamente 100 pL del producto para ensayo en el disco inferior y después se hace descender la geometría superior hasta el contacto entre los dos discos, hasta una fuerza normal impuesta de 5 Newton. La medida del coeficiente de fricción se realiza a 25 °C durante un tiempo de 60 segundos, a fuerza normal constante (5 N), frecuencia de oscilación de 6 rad/s y ángulo de deformación de aproximadamente 1,71 radianes, según un protocolo adaptado de Waller y col. (J Rheumatol 39, 7, 1473, 2012) y parámetros que emulan las condiciones cinemáticas de parpadeo descritas por Kwon y col. (J Royal Society Interface 10, 2, 2013). Se activa la opción «respeto del punto cero de partida del movimiento oscilatorio». En cada punto de medida, se registra el valor del par de torsión, y después se calcula el coeficiente de fricción (COF) según la fórmula: COF = par de torsión / (1/3 x diámetro del disco x fuerza normal). Se determina el valor medio del COF entre 0 y 60 s. Se calcula así el coeficiente de fricción medio y la desviación típica de 5 medidas consecutivas. El valor mínimo del COF es de 52 en el caso en que las dos superficies no están en contacto. El límite superior de COF corresponde al caso en que los dos discos ya no están en movimiento uno con respecto al otro.

[0255] Dado que el valor de COF es variable de una serie a otra, es preciso caracterizar los productos para comparar en una misma serie, con ayuda de los mismos discos y en un orden aleatorio. Así se usa una escala de puntuaciones relativas para clasificar los productos sometidos a ensayo en una misma serie, del más eficaz (puntuación 1) al menos eficaz (puntuación 3), según los criterios de la Tabla 11a. Los límites «COF^a» y «COF^b» son definidos por el COF de dos gotas oftálmicas comerciales tomadas como referencia en cada serie: gotas A (compuestas por el 0,15 % de HA y el 0,25 % de carbómero) y gotas B (0,15 % de HA). Según esta escala, resulta ventajoso que la puntuación de reducción de las fricciones sea de 1 o 2, y preferentemente de 1, para un uso como gota lubricante de la superficie ocular. Para los productos de puntuación 3, la capacidad lubricante no es satisfactoria y la variación en la medida es im ortante.

Procedimientos de medida de la viscosidad en función de la cizalla

[0256] Simmons y col. determinaron que la tasa de cizalla durante los movimientos del ojo abierto es de aproximadamente 10 s-1 y la tasa de cizalla durante el parpadeo es de aproximadamente 10.000 s-1 (in: Clinical Ophthalmology 11, 1637, 2017). Se selecciona el procedimiento de medida reométrico en función del intervalo de tasa cizalla para estudiar y teniendo en cuenta que los productos son soluciones fluidas de baja viscosidad:

- Intervalo de cizalla correspondiente al movimiento ocular. Se mide la viscosidad en modo giratorio con una prueba de barrido de flujo con ayuda de un reómetro DHR-2 con regulación de esfuerzo (TA Instruments) equipado con un Peltier plano y una geometría de tipo «cono» de 60 mm de diámetro y un ángulo de truncamiento de 2°. Se equilibra el producto durante 1 minuto a 37 °C, de manera que la temperatura es controlada por el Peltier. Para evitar la evaporación, el sistema está equipado con una trampa de disolvente y una cobertura metálica. A continuación, se inicia la prueba de barrido de flujo y se mide la viscosidad en función de la tasa de cizalla, de 0,001 s-1 a 100 s-1. Se refiere el valor de viscosidad a 10 s-1.

- Intervalo de cizalla correspondiente al parpadeo. Se mide la viscosidad en modo giratorio con una prueba de barrido de flujo con ayuda de un reómetro DHR-3 con regulación de esfuerzo (TA Instruments) equipado con una geometría de tipo «Couette de doble pared» y de un Peltier en cilindro concéntrico, y equipado con una trampa de disolvente y una cobertura metálica. El producto se equilibra durante 1 minuto a 37 °C, y después se aplica una tasa de cizalla variable de 0,001 s-1 a 10.000 s-1. Entonces se compara el valor de viscosidad a 10.000 s-1 con respecto al valor a 10 s-1.

[0257] Los resultados confirman que las dos formulaciones de carboximetil-quitosano fúngico CC-21 responden al documento técnico de gotas oftálmicas: presentan un índice de refracción bajo, un coeficiente de fricción que satisface (puntuación 1, es decir, tan eficaz como las gotas comerciales más lubricantes), una viscosidad de 10 a 30 mPa.s en las condiciones de movimiento ocular y una viscosidad más baja en las condiciones de parpadeo. Sin el carboximetil-quitosano, el tampón de fosfato con suplemento de glicerol no permite responder al documento técnico de las gotas oftálmicas. Finalmente, se constata que la viscosidad puede disminuirse reduciendo la concentración de carboximetil-quitosano (por ejemplo, de 0,7 a 0,4 %) sin alterar la capacidad de reducir las fricciones (puntuación 1).

Claims

REIVINDICACIONES

1. Carboxialquil-quitosano que presenta unidades de glucosamina, unidades de N-acetil-glucosamina y unidades de glucosamina sustituidas por un grupo carboxialquilo, presentando dicho carboxialquil-quitosano un potencial zeta, medido a pH 7,5 inferior o igual a -18 mV, presentando el carboxialquil-quitosano un grado de acetilación comprendido entre el 40 % y el 80 %, expresado en número de moles de unidades de N-acetil-glucosamina con respecto al número de moles de unidades totales, y que presenta un grado de sustitución por un grupo carboxialquilo superior al 50 %, expresado en número de moles del sustituyente con respecto al número de moles de unidades totales.

2. Carboxialquil-quitosano según la reivindicación 1, caracterizado porque dicho carboxialquil-quitosano presenta un potencial zeta, medido a pH 7,5, que es inferior o igual a -20 mV, y preferentemente inferior o igual a -22 mV.

3. Carboxialquil-quitosano quitosano según la reivindicación 1 o 2, presentando dicho carboxialquilquitosano un grado de sustitución por un grupo carboxialquilo superior al 70 %, por ejemplo, inferior al 200 %, expresado en número de moles del sustituyente con respecto al número de moles de unidades totales.

4. Carboxialquil-quitosano según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque el quitosano se obtiene del micelio de un hongo del tipo Ascomycetes, y en particular de Aspergillus niger, y/o de un hongo Basidiomycetes, y en particular Lentinula edodes (shiitake) y/o Agaricus bisporus (hongo de París). Preferentemente, el quitosano se obtiene de Agaricus bisporus.

5. Carboxialquil-quitosano según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque el carboxialquil-quitosano es un quitosano N-carboxialquilado y O-carboxialquilado.

6. Carboxialquil-quitosano según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado porque el carboxialquil-quitosano es reacetilado.

7. Carboxialquil-quitosano según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizado porque está esterilizado.

8. Composición caracterizada porque comprende al menos un carboxialquil-quitosano definido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7.

9. Composición, según la reivindicación 8, caracterizada porque la composición comprende también un biopolímero distinto de dicho carboxialquil-quitosano.

10. Composición, según la reivindicación 9, caracterizada porque el biopolímero es un polisacárido, oxidado o no, reticulado o no por enlaces covalentes.

11. Composición, según la reivindicación 9, caracterizada porque el biopolímero es ácido hialurónico o hialuronato de sodio, reticulado o no por enlaces covalentes.

12. Composición inyectable caracterizada porque comprende al menos un carboxialquil-quitosano definido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7.

13. Composición farmacéutica caracterizada porque comprende al menos un carboxialquil-quitosano definido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7.

14. Composición, según la reivindicación 12 o 13, caracterizada porque la composición comprende también un biopolímero distinto de dicho carboxialquil-quitosano.

15. Composición, según la reivindicación 14, caracterizada porque el biopolímero es un polisacárido, oxidado o no, reticulado o no por enlaces covalentes.

16. Composición, según la reivindicación 14, caracterizada porque el biopolímero es ácido hialurónico o hialuronato de sodio, reticulado o no por enlaces covalentes.

17. Composición, según cualquiera de las reivindicaciones 12 a 16, caracterizada porque la composición se usa como composición farmacéutica inyectable, implantable o apta para la instilación, o dispositivo médico inyectable o implantable o apto para la instilación.

18. Composición según la reivindicación 17, para un uso en un procedimiento de tratamiento terapéutico, por ejemplo, que comprende la instilación o la inyección por vía subcutánea, intradérmica, ocular, intraocular o intraarticular, de dicha composición, por ejemplo, para la reparación o el llenado de al menos un tejido corporal que necesita una reparación o un llenado.

19. Composición, según la reivindicación 18, caracterizada porque el tejido corporal se elige entre los tejidos que pertenecen a las cuerdas vocales, los músculos, los ligamentos, los tendones, los cartílagos, los órganos sexuales, los huesos, las articulaciones, los ojos, la dermis o cualquiera de sus combinaciones, y más en particular a las articulaciones.

20. Composición según la reivindicación 18 o 19, para su uso en un procedimiento de tratamiento de una artrosis, o la reparación de un defecto de cartílago, por ejemplo, por inyección en el líquido sinovial o después de la mezcla con la sangre y la implantación en el cartílago.

21. Dispositivo médico, por ejemplo, implante médico, caracterizado porque comprende o consiste en una composición tal como se define en cualquiera de las reivindicaciones 8 a 20.

22. Procedimiento de preparación de una composición que comprende un carboxialquil-quitosano definido según cualquiera de las reivindicaciones 8 a 20, comprendiendo dicho procedimiento:

- la disolución de un carboxialquil-quitosano definido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 en una solución acuosa, preferentemente agua, opcionalmente tamponada, preferentemente a un pH comprendido entre 6,2 y 8,5 y preferentemente entre 6,5 y 7,5;

- el ajuste opcional del pH a un pH deseado, en general al pH fisiológico para la aplicación pretendida, por ejemplo, por adición de un agente de amortiguación, una base o un ácido;

- la adición opcional de otros excipientes, como, por ejemplo, un azúcar reductor, por ejemplo, sorbitol o manitol; - el ajuste opcional de la osmolalidad de la composición.