CN107325306B - 壳聚糖或其衍生物多重交联凝胶和制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种壳聚糖或其衍生物多重交联凝胶和制备方法。通过对壳聚糖或其衍生物进行多重交联，在不提高凝胶交联度的情况下，提高了凝胶的弹性模量、粘性模量并减少了凝胶的溶涨度。多重交联的过程中每增加一重交联，可进一步提高壳聚糖凝胶的弹性模量与粘性模量，在交联度相同的情况下，多次交联可增加凝胶的粘弹性模量。通过不同组织部位的粘弹性模量的特点，选择壳聚糖凝胶的交联次数，使得壳聚糖凝胶的粘弹性模量与相关组织相匹配，以提高凝胶在该组织内的组织相容性，同时可以减少对人体有刺激性或毒性的交联剂的使用量。本发明应用于组织工程中的软组织领域，包括组织填充与修复，关节粘弹性补充剂，生物支架，抗瘢痕防粘连以及生物胶等。

Description

壳聚糖或其衍生物多重交联凝胶和制备方法

技术领域

本发明涉及一种壳聚糖或其衍生物多重交联凝胶和制备方法。采用该方法，形成交联壳聚糖凝胶的速度较快，保证壳聚糖在交联反应中的降解较慢，同时提高了交联剂的利用率，在交联度相同的情况下，多次交联可以增加凝胶的粘弹性模量，可以减少对人体有刺激性或毒性的交联剂的使用。采用本方法制备的壳聚糖凝胶，具有与人体软组织相似的机械性能与流变学性能，且具有生物相容性好，生物安全性高，体内可降解等优点。本发明可应用于组织工程中的软组织领域，包括组织填充与修复，关节粘弹性补充剂，生物支架，抗瘢痕防粘连以及生物胶等。

背景技术

壳聚糖（又称葡糖胺聚糖，英文名及简称：chitosan，CS）是甲壳素经过脱乙酰处理后得到的产物，所以又被称为：“脱乙酰甲壳素”。壳聚糖是由N-乙酰-D-氨基葡萄糖单体通过β-l,4-糖苷键连接起来的直链状高分子化合物，难溶于水，却易溶于酸。壳聚糖具有良好的生物相容性和生物可降解性，无毒，物理和化学性质相对稳定，粘合性好，成纤维及成膜性能优良，是一种可被生物体降解吸收的天然高分子材料。壳聚糖具有非常高的医用价值：壳聚糖可降低体内的胆固醇；还具有良好的抑菌效果，能够不利于细菌生长的环境；壳聚糖可以吸附和排泄体内重金属；还有能预防高血压，提高人体免疫力等功效。研究表明溶菌酶（一种人体体液中含量较高的抗菌物质，泪液中的含量最多，大约占人体泪液蛋白含量的40%），可以催化水解壳聚糖的β-1,4-氨基葡萄糖苷键成为氨基葡萄糖，因此壳聚糖在体内可被降解吸收。此外，体内的多种活性物质，如活性氧簇自由基以及甲壳素酶、葡萄糖酶、蛋白酶、脂酶、纤维素酶、半纤维素酶和果胶酶等30多种酶制剂也促进壳聚糖的降解代谢。酶对多糖的水解具有高度的选择性，而无其它副反应。因此，壳聚糖作为一种非常安全的天然高分子多糖，已经广泛的应用在生物医药，组织工程等领域。

此外，壳聚糖还有多种衍生产物。由于壳聚糖结构中的2位NH₂基团与6位OH基团可作为壳聚糖中的两个反应位点，可以通过此两个反应位点对壳聚糖进行改性修。例如，2位NH₂与6位OH被羧甲基化后得到的羧甲基壳聚糖，为水溶性可壳聚糖衍生物，也是最为广泛应用的壳聚糖衍生物，已经应用于防粘连，止血以及关节腔粘弹性补充剂等方面；此两个位点被环氧丁烷羟丁基化后得到的羟丁基壳聚糖，羟丁基壳聚糖溶液具有温敏特性，在低温下溶液状态，升高温度后可形成凝胶态，据文献报道（魏长征等，中国脊柱脊髓杂志，2009，10，769-773）已经应用于防粘连领域；此外，还有针对2位NH₂进行季铵化改性的季铵化壳聚糖，据文献报道（王凤菊等，化工新型材料，2011，11，13-15）已经应用于抑菌材料领域。

在壳聚糖的交联领域，更多的都是采用醛基化合物或其衍生物（如甲醛、戊二醛、京尼平等）、卤代烃（如环氧氯丙烷等）交联剂对壳聚糖进行交联。中国专利CN201410141716.3中公开了壳聚糖双网络快速响应可注射水凝胶的制备方法，该专利采用β-甘油磷酸钠与戊二醛共用，通过β-甘油磷酸钠的物理交联与戊二醛的化学交联双重网络制备了快速响应水凝胶，该凝胶同时具备物理与化学双重交联网络，其中戊二醛与壳聚糖是通过形成席夫碱而完成交联。CN 201610613687.5公开了一种采用环氧氯丙烷作为主要交联剂的壳聚糖微球的制备方法，作为吸附材料使用。CN 201610495286.4公开了一种采用环氧氯丙烷作为交联剂制备壳聚糖微球的制备方法，也同样作为吸附材料使用。

传统的壳聚糖交联剂主要用于制作交联壳聚糖微球，包括戊二醛交联壳聚糖微球（李湛勇等，离子交换与吸附，1999, 15(5), 425）与环氧氯丙烷交联的壳聚糖微球（上文提到的发明专利）。由此可见，传统交联剂交联得到的交联壳聚糖具有较高的机械强度，可以填充在离子交换柱中，作为吸附材料使用，并不太适合于组织工程中的软组织领域。而CN201410141716.3虽然公开了可注射水凝胶的制备方法，但该凝胶依旧采用了传统的戊二醛交联剂。对于有一定生物毒性的戊二醛，若作为交联剂进入体内，其对生物体造成的不良反应就必须考虑在内。这是由于醛基与氨基形成的席夫碱是动态可逆的，壳聚糖主体在体内降解之后，会有一定量的戊二醛以原型状态进入到体内，造成一定的不良反应。因此，采用新型交联剂对壳聚糖进行交联是非常必要的。

当前在多糖交联领域广泛应用的交联剂为多元环氧类交联剂，此类交联剂已经广泛地应用于透明质酸的交联之中，包括1,4-丁二醇二缩水甘油醚（BDDE）对透明质酸进行交联（周奎等，安徽化工，2014，06，44-45），以及1,2,7,8-二环氧丁烷（DEO）对透明质酸进行交联（CN201110289906.6）。环氧化合物对透明质酸的交联机理包括在强碱性环境下，透明质酸的羟基对环氧基团进行开环反应，或者在强酸性环境下由透明质酸的羧基对环氧基团进行开环反应而达到交联的目的。

然而，将多元环氧类交联剂应用于壳聚糖的交联却鲜有报道，因为上述透明质酸的交联条件难以应用于环氧基团对壳聚糖的交联反应中，理由如下：首先，壳聚糖在强碱性环境下会非常快速的被水解，在交联反应完成之前，壳聚糖就被水解成小分子，难以形成较量凝胶；其次，壳聚糖虽然在酸性环境下较为稳定，但壳聚糖中却没有可以与环氧基团反应的官能团（羟基与氨基均无法在酸性环境下对环氧基团进行开环）；再次，中性环境下，由于壳聚糖中部分氨基会被质子化，导致反应速率较慢，时间较长，会造成环氧基团的水解而导致交联效率不高。因此，环氧基团对壳聚糖的交联需要在特定的条件下进行。此外，CN201410141716.3虽然提出了可以采用水溶性环氧化合物如1,4-丁二醇二缩水甘油醚或1,2,7,8-二环氧辛烷作为化学交联剂，但该专利更侧重于物理与化学双重交联网络，化学交联仅为单次交联并不存在多重交联的情况，其生物相容性和软组织的匹配性并不会强于多重交联的壳聚糖凝胶。

发明内容

本发明的目的在于提供一种壳聚糖或其衍生物多重交联凝胶和制备方法。采用多元环氧化合物对壳聚糖进行多重交联，形成凝胶的速度较快，保证壳聚糖在交联反应中的降解较慢，同时提高了交联剂的利用率，在交联度相同的情况下，多次交联可以增加凝胶的粘弹性模量。因为壳聚糖不溶于水，所以壳聚糖的交联方法与水溶性壳聚糖衍生物的交联方法稍有差别。本发明制备的壳聚糖凝胶，具有与人体软组织相似的机械性能与流变学性能，且生物相容性好，安全性高，体内可降解等优点。本发明具有反应条件简单，响应时间短，所形成的凝胶热稳定性较好且机械强度较高，生物相容性好等优点。本发明可应用于组织工程中的软组织领域，包括组织填充与修复，生物支架，抗瘢痕防粘连以及生物胶等。

本发明提供的一种壳聚糖或其衍生物多重交联凝胶,其制备方法是:将壳聚糖溶解于盐酸溶液中，加入β-甘油磷酸钠并调节至微碱性，加入交联剂多元环氧化合物，搅拌均匀后完成交联；取出交联凝胶块并粉碎成凝胶颗粒，再次将凝胶颗粒投入到壳聚糖与β-甘油磷酸钠的水溶液中，加入多元环氧化合物进行二次交联，取出交联凝胶块并进行粉碎，多次重复上述操作，可得到三次交联或更多次交联的多重交联壳聚糖凝胶。或

将水溶性壳聚糖衍生物的水溶液调节至微碱性，加入多元环氧化合物，搅拌均匀后完成交联；取出交联凝胶块并粉碎成凝胶颗粒，再次将凝胶颗粒投入到壳聚糖衍生物的水溶液中，加入多元环氧化合物进行二次交联，取出交联凝胶块并进行粉碎，多次重复上述操作，可得到三次交联或更多次交联的多重交联壳聚糖凝胶。

本发明中所选用的壳聚糖分子量范围为20 KDa至2 000 KDa，优选分子量范围为100 KDa至800 KDa；脱乙酰度范围为60%至99%，优选80%至95%；

本发明中所选用的水溶性壳聚糖衍生物主要为对壳聚糖进行侧基改性的衍生物，对壳聚糖主链六元糖环进行破坏改性的衍生物则不适用于本专利。壳聚糖的水溶性侧基改性包括：侧基羧基化改性，例如羧甲基壳聚糖等；侧基脂肪链改性，如羟丁基壳聚糖；侧基磺酸化改性，如磺酸化壳聚糖；以及保留伯氨基团或仲氨基团侧基季铵化改性。上述各种侧基改性壳聚糖的侧基取代度范围为0.5至2.0。

本发明中选用的多元环氧化合物交联剂包括二元、三元以及四元环氧化合物，其中，二元环氧化合物包括但不限于1,4-丁二醇二缩水甘油醚（BDDE），1,2,3,4-二环氧丁烷以及1,2,7,8-二环氧辛烷（DEO）等化合物；三元环氧化合物包括但不限于三甲基丙烷三缩水甘油醚等化合物；四元环氧类化合物包括但不限于季戊四醇四缩水甘油醚等化合物。

本发明提供的一种壳聚糖多重交联凝胶的制备方法包括以下步骤：

1）将壳聚糖溶解于0.01~1mol/L的盐酸溶液中，优选0.1mol/L，配置成5~300 mg/mL的壳聚糖盐酸水溶液，在-1~5℃的环境下滴加100~600 mg/mL（优选500 mg/mL）的β-甘油磷酸钠溶液至pH至达到7.2~7.6。

2）向壳聚糖水溶液中加入环氧交联剂，其中，环氧交联剂与溶液中壳聚糖固含量的质量比范围为0.01~0.5:1；同时将温度升至10~15℃，反应时间为18~24小时。

3）取出壳聚糖凝胶，采用分散机对壳聚糖凝胶进行粉碎分散机型号包括但不限于IKA公司T系列分散机，如T 65 basic ULTRA-TURRAX®，T 65 digital ULTRA-TURRAX®Package或T 50 digital ULTRA-TURRAX®等型号的分散机，粉碎后，壳聚糖凝胶颗粒的粒径范围为100~2 000 μm；

4）按照步骤1）中操作，制备同浓度的壳聚糖-β-甘油磷酸钠混合溶液，加入步骤3）中粉碎的壳聚糖凝胶颗粒，搅拌均匀后得到凝胶混合溶液，其中，凝胶颗粒与混合溶液的质量比范围为：0.5~2:1。

5）加入环氧交联剂并搅拌均匀，其中，环氧交联剂的加入量与混合溶液中壳聚糖固含量的比例范围为：0.01~0.5:1，保持10~15℃的条件下，反应18~24小时；反应完毕后，得到二重交联的壳聚糖凝胶。

6）重复步骤3至步骤5的操作，重复至第二次，则可得到三重交联的壳聚糖凝胶，其中所涉及的比例范围均与步骤3）至步骤5）中所涉及的范围一致。重复至第三次步骤3）至步骤5）的操作，可得到四重交联的壳聚糖凝胶。本发明中，步骤3）至步骤5）的重复次数最多为四次，可得到五重交联的壳聚糖凝胶。

本发明提供的一种壳聚糖水溶性衍生物多重交联凝胶的制备方法包括以下步骤：

1）将壳聚糖水溶性衍生物溶解于0.001~0.1mol/L的氢氧化钠溶液中，优选0.01~0.1mol/L，配置成5~300mg/mL的壳聚糖水溶性衍生物碱性水溶液，以对壳聚糖衍生物中的氨基进行脱质子化，在20~30℃的环境下滴加1.0~6.0 mol/L（优选2.0 mol/L）的盐酸溶液将pH值调节至7.2~8.6。

2）向壳聚糖衍生物水溶液中加入环氧交联剂，其中，环氧交联剂与溶液中壳聚糖衍生物固含量的质量比范围为0.01~0.5:1；同时温度保持在20~30℃，反应时间为18~24小时。

3）取出壳聚糖衍生物凝胶，采用分散机对凝胶进行粉碎分散机型号包括但不限于IKA公司T系列分散机，如T 65 basic ULTRA-TURRAX®，T 65 digital ULTRA-TURRAX®Package或T 50 digital ULTRA-TURRAX®等型号的分散机，粉碎后，壳聚糖衍生物凝胶颗粒的粒径范围为100~2 000 μm；

4）按照步骤1）中操作，制备同浓度的壳聚糖衍生物水溶液，加入步骤3）中粉碎的壳聚糖凝胶颗粒，搅拌均匀后得到凝胶混合溶液，其中，凝胶颗粒与混合溶液的质量比范围为：0.5~2:1。

5）加入环氧交联剂并搅拌均匀，其中，环氧交联剂的加入量与混合溶液中壳聚糖衍生物固含量的比例范围为：0.01~0.5:1，保持20~30℃的条件下，反应18~24小时；反应完毕后，得到二重交联的壳聚糖衍生物凝胶。

6）重复步骤3）至步骤5）的操作，重复至第二次，则可得到三重交联的壳聚糖凝胶，其中所涉及的比例范围均与步骤3至步骤5中所涉及的范围一致。重复至第三次步骤3）至步骤5）的操作，可得到四重交联的壳聚糖凝胶。本发明中，步骤3）至步骤5）的重复次数最多为四次，可得到五重交联的壳聚糖凝胶。

本发明提供了一种壳聚糖或其衍生物多重交联凝胶和制备方法。通过对壳聚糖或其衍生物进行多重交联，可在不提高凝胶交联度的情况下，进一步提高凝胶的弹性模量、粘性模量并进一步减少凝胶的溶涨度。多重交联的过程中，每增加一重交联，都可以进一步提高壳聚糖凝胶的弹性模量与粘性模量。可通过不同组织部位的粘弹性模量的特点，选择壳聚糖凝胶的交联次数，使得壳聚糖凝胶的粘弹性模量与相关组织相匹配，以提高凝胶在该组织内的组织相容性。本发明可应用于组织工程中的软组织领域，包括组织填充与修复，关节粘弹性补充剂，生物支架，抗瘢痕防粘连以及生物胶等。

具体实施方式

以下通过实施例对本发明作进一步的详细说明，这并不限制本发明的保护范围。

实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件以及手册中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件；所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可由商业途径获得。

实施例1：二重交联壳聚糖凝胶的制备

称取壳聚糖粉末（脱乙酰度85%，分子量20 KDa）30.0 g，溶解于100 mL 0.1 mol/L的盐酸溶液中，升温至30℃，搅拌1h，得到质量浓度为300 mg/mL的壳聚糖盐酸溶液。将壳聚糖盐酸溶液冷却至0℃，滴加15 mL质量浓度为500 mg/mL的β-甘油磷酸钠溶液，持续搅拌2h，搅拌完成后溶液的pH值为7.3左右。向溶液中加入BDDE(1,4-丁二醇缩水甘油醚)3.0 g（BDDE与壳聚糖的质量比为0.1:1），搅拌30分钟。搅拌完成后，将温度升高至15℃，持续24小时得到交联壳聚糖凝胶。取出交联壳聚糖凝胶，采用IKA公司T 65 basic ULTRA-TURRAX®型分散机在500转/分钟的转数下对壳聚糖凝胶进行粉碎，粉碎时间20分钟，得到颗粒度为500 μm左右的凝胶颗粒，约140 g凝胶颗粒备用，产率98%。按照上述操作，重新配置100 mL壳聚糖浓度为300 mg/mL的壳聚糖-β-甘油磷酸钠混合溶液，并将140 g壳聚糖凝胶颗粒与溶液混合，搅拌30分钟，同时补加BDDE 3.0 g，15℃下反应24小时。反应结束后得到二重交联的壳聚糖凝胶，产量约270 g，产率95%左右。

实施例2：三重交联羧甲基壳聚糖凝胶的制备

称取羧甲基壳聚糖粉末（脱乙酰度85%，羧甲基取代度1.1，分子量80 KDa）25.0 g，溶解于100 mL 0.1 mol/L的氢氧化钠溶液中，搅拌1h，得到质量浓度为250 mg/mL的羧甲基壳聚糖碱性溶液。25℃条件下，用浓度为2.0 mol/L的盐酸溶液，调节羧甲基壳聚糖溶液的pH值至8.0左右。向溶液中加入BDDE 5.0 g（BDDE与壳聚糖的质量比为0.2:1），搅拌30分钟。搅拌完成后，保持温度25℃，持续18小时得到交联羧甲基壳聚糖凝胶。取出交联羧甲基壳聚糖凝胶，采用IKA公司T 65 digital ULTRA-TURRAX® Package型分散机在400转/分钟的转数下对凝胶进行粉碎，粉碎时间20分钟，得到颗粒度为700 μm左右的凝胶颗粒，约130 g凝胶颗粒备用，产率98%。按照之前的操作，重新配置100 mL羧甲基壳聚糖浓度为250 mg/mL的羧甲基壳聚糖溶液，并将130 g羧甲基壳聚糖凝胶颗粒与溶液混合，搅拌30分钟，同时补加BDDE 4.0 g，25℃下反应18小时。反应结束后得到二重交联的羧甲基壳聚糖凝胶，产量约250 g，产率95%左右。再次按照之前的操作，重新配置100 mL羧甲基壳聚糖浓度为250 mg/mL的羧甲基壳聚糖溶液，并将250 g羧甲基壳聚糖凝胶粉碎成颗粒后与溶液混合，搅拌30分钟，同时补加BDDE 3.0 g，25℃下反应18小时。反应结束后得到三重交联的羧甲基壳聚糖凝胶，产量约360 g，产率92%左右。

实施例3：五重交联羟丁基壳聚糖凝胶的制备

称取羟丁基壳聚糖粉末（脱乙酰度90%，羧甲基取代度1.5，分子量100 KDa）20.0g，溶解于100 mL 0.1 mol/L的氢氧化钠溶液中，搅拌1h，得到质量浓度为200 mg/mL的羟丁基壳聚糖碱性溶液。25℃条件下，用浓度为1.0 mol/L的盐酸溶液，调节羟丁基壳聚糖溶液的pH值至7.8左右。向溶液中加入DEO(1,2,7,8-二环氧辛烷)5.0 g（DEO与壳聚糖的质量比为0.4:1），搅拌30分钟。搅拌完成后，保持温度25℃，持续18小时得到交联羟丁基壳聚糖凝胶。取出交联羟丁基壳聚糖凝胶，采用IKA公司T 65 digital ULTRA-TURRAX® Package型分散机在300转/分钟的转数下对凝胶进行粉碎，粉碎时间20分钟，得到颗粒度为900 μm左右的凝胶颗粒，约125 g凝胶颗粒备用，产率98%。按照之前的操作，重新配置100 mL羟丁基壳聚糖浓度为250 mg/mL的羟丁基壳聚糖溶液，并将125 g羟丁基壳聚糖凝胶颗粒与溶液混合，搅拌30分钟，同时补加DEO 4.0 g，25℃下反应18小时。反应结束后得到二重交联的羟丁基壳聚糖凝胶，产量约240 g，产率95%左右。再次按照之前的操作，重新配置100 mL羟丁基壳聚糖浓度为200 mg/mL的羟丁基壳聚糖溶液，并将240 g羟丁基壳聚糖凝胶粉碎成颗粒后与溶液混合，搅拌30分钟，同时补加DEO 3.0 g，25℃下反应18小时。反应结束后得到三重交联的羟丁基壳聚糖凝胶，产量约350 g，产率92%左右。第三次按照之前的操作，重新配置100mL羟丁基壳聚糖浓度为200 mg/mL的羟丁基壳聚糖溶液，并将350 g羟丁基壳聚糖凝胶粉碎成颗粒后与溶液混合，搅拌30分钟，同时补加DEO 2.0 g，25℃下反应18小时。反应结束后得到四重交联的羟丁基壳聚糖凝胶，产量约460 g，产率90%左右。第四次按照之前的操作，重新配置100 mL羟丁基壳聚糖浓度为200 mg/mL的羟丁基壳聚糖溶液，并将460 g羟丁基壳聚糖凝胶粉碎成颗粒后与溶液混合，搅拌30分钟，同时补加DEO 2.0 g，25℃下反应18小时。反应结束后得到五重交联的羟丁基壳聚糖凝胶，产量约570 g，产率87%左右。

实施例4：多重交联羧甲基壳聚糖凝胶的流变学性能检测

分别将交联度为2%、5%、8%、10%、15%、20%采用单次、二重、三重、四重、五重交联的羧甲基壳聚糖凝胶稀释至羧甲基壳聚糖浓度为20 mg/mL的水凝胶，上述四种凝胶各取1mL，采用锥板式旋转流变仪（沃特斯中国有限公司DHR-1）进行流变学性能检测，以确定各四种凝胶的流变学数据，检测时，固定应力应变值为10%，频率值固定为2.5 Hz，检测结果如表1。从表中可以看出，在相同的交联度下，随着交联次数的增多，凝胶的弹性模量与粘性模量均呈上升趋势。

表1、不同交联度的多重交联羧甲基壳聚糖粘弹性模量

Claims (5)

1.一种壳聚糖多重交联凝胶的制备方法，其特征在于：

将壳聚糖溶解于盐酸溶液中，加入β-甘油磷酸钠并调节至微碱性，加入交联剂多元环氧化合物，搅拌均匀后完成交联；取出交联凝胶块并粉碎成凝胶颗粒，再次将凝胶颗粒投入到壳聚糖与β-甘油磷酸钠的水溶液中，加入交联剂多元环氧化合物进行二次交联，取出交联凝胶块并进行粉碎，多次重复上述操作，得到三次交联或更多次交联的多重交联壳聚糖凝胶；

具体包括的步骤：

1）将壳聚糖溶解于0.01~1mol/L的盐酸溶液中，配置成5~300 mg/mL的壳聚糖盐酸水溶液，在-1~5℃的环境下滴加100~600 mg/mL的β-甘油磷酸钠溶液至pH至达到7.2~7.6；

2）向壳聚糖水溶液中加入交联剂多元环氧化合物，其中，交联剂多元环氧化合物与溶液中壳聚糖固含量的质量比范围为0.01~0.5:1；同时将温度升至10~15℃，反应时间为18~24小时；

3）取出壳聚糖凝胶，采用分散机对壳聚糖凝胶进行粉碎，粉碎后，壳聚糖凝胶颗粒的粒径范围为100~2 000 μm；

4）按照步骤1）中操作，制备同浓度的壳聚糖-β-甘油磷酸钠混合溶液，加入步骤3）中粉碎的壳聚糖凝胶颗粒，搅拌均匀后得到凝胶混合溶液，其中，凝胶颗粒与混合溶液的质量比范围为：0.5~2:1；

5）加入交联剂多元环氧化合物并搅拌均匀，其中，交联剂多元环氧化合物的加入量与混合溶液中壳聚糖固含量的比例范围为：0.01~0.5:1，保持10~15℃的条件下，反应18~24小时；反应完毕后，得到二重交联的壳聚糖凝胶；

6）重复步骤3至步骤5的操作，重复至第二次，得到三重交联的壳聚糖凝胶，其中所涉及的比例范围均与步骤3）至步骤5）中所涉及的范围一致；重复至第三次步骤3）至步骤5）的操作，得到四重交联的壳聚糖凝胶；步骤3）至步骤5）的重复次数最多为四次，得到五重交联的壳聚糖凝胶；

所述的交联剂多元环氧化合物为1,4-丁二醇二缩水甘油醚、1,2,3,4-二环氧丁烷、1,2,7,8-二环氧辛烷、三甲基丙烷三缩水甘油醚或季戊四醇四缩水甘油醚。

2.按照权利要求1所述的制备方法，其特征在于所述的壳聚糖分子量范围为20 KDa至2000 KDa；脱乙酰度范围为60%至99%。

3.一种壳聚糖水溶性衍生物多重交联凝胶的制备方法，其特征在于它是将水溶性壳聚糖衍生物的水溶液调节至微碱性，加入交联剂多元环氧化合物，搅拌均匀后完成交联；取出交联凝胶块并粉碎成凝胶颗粒，再次将凝胶颗粒投入到壳聚糖衍生物的水溶液中，加入交联剂多元环氧化合物进行二次交联，取出交联凝胶块并进行粉碎，多次重复上述操作，得到三次交联或更多次交联的多重交联壳聚糖凝胶；

具体包括以下步骤：

1）将壳聚糖水溶性衍生物溶解于0.001~0.1mol/L的氢氧化钠溶液中，配置成5~300mg/mL的壳聚糖水溶性衍生物碱性水溶液，以对壳聚糖衍生物中的氨基进行脱质子化，在20~30℃的环境下滴加1.0~6.0 mol/L的盐酸溶液将pH值调节至7.2~8.6；

2）向壳聚糖衍生物水溶液中加入环氧交联剂，其中，环氧交联剂与溶液中壳聚糖衍生物固含量的质量比范围为0.01~0.5:1；同时温度保持在20~30℃，反应时间为18~24小时；

3）取出壳聚糖衍生物凝胶，采用分散机对凝胶进行粉碎，粉碎后，壳聚糖衍生物凝胶颗粒的粒径范围为100~2000 μm；

4）按照步骤1）中操作，制备同浓度的壳聚糖衍生物水溶液，加入步骤3）中粉碎的壳聚糖凝胶颗粒，搅拌均匀后得到凝胶混合溶液，其中，凝胶颗粒与混合溶液的质量比范围为：0.5~2:1；

5）加入交联剂多元环氧化合物并搅拌均匀，其中，交联剂多元环氧化合物的加入量与混合溶液中壳聚糖衍生物固含量的比例范围为：0.01~0.5:1，保持20~30℃的条件下，反应18~24小时；反应完毕后，得到二重交联的壳聚糖衍生物凝胶；

6）重复步骤3）至步骤5）的操作，重复至第二次，得到三重交联的壳聚糖衍生物凝胶，其中所涉及的比例范围均与步骤3至步骤5中所涉及的范围一致；重复至第三次步骤3）至步骤5）的操作，得到四重交联的壳聚糖衍生物凝胶；步骤3）至步骤5）的重复次数最多为四次，得到五重交联的壳聚糖衍生物凝胶；

所述的交联剂多元环氧化合物为1,4-丁二醇二缩水甘油醚、1,2,3,4-二环氧丁烷、1,2,7,8-二环氧辛烷、三甲基丙烷三缩水甘油醚或季戊四醇四缩水甘油醚。

4.按照权利要求3所述的制备方法，其特征在于所述的水溶性壳聚糖衍生物为对壳聚糖进行侧基改性的衍生物，对壳聚糖主链六元糖环进行破坏改性的衍生物则不适用，壳聚糖的水溶性侧基改性包括：侧基羧基化改性、侧基脂肪链改性、侧基脂肪链改性、侧基磺酸化改性以及保留伯氨基团或仲氨基团侧基季铵化改性；上述各种侧基改性壳聚糖的侧基取代度范围为0.5至2.0。

5.按照权利要求3所述的制备方法，其特征在于所述的水溶性壳聚糖衍生物为羧甲基壳聚糖、羧甲基壳聚糖、羟丁基壳聚糖或磺酸化壳聚糖。