JP2022533772A - キトサンおよびその用途 - Google Patents

Abstract

本発明は、マトリックスを形成する架橋カルボキシアルキルキトサン、それを含む組成物、それを製造するための方法、および特に治療、リウマチ科、眼科、美容医療、形成外科、体内手術（internal surgery）、皮膚科、婦人科または美容（cosmetic）に関する。本発明は、特に、グルコサミン単位、Ｎ－アセチルグルコサミン単位、およびカルボキシアルキル基で置換されたグルコサミン単位を有するカルボキシアルキルキトサンを含むマトリックスに関し、該カルボキシアルキルキトサンは、総グルコサミン単位のモル数に対するＮ－アセチル基のモル数として表され、４０％より大きく最大８０％の範囲のアセチル化度を有し、該カルボキシアルキルキトサンは、カルボキシアルキルキトサン鎖間の共有結合によって架橋されている。

Description

本発明は、マトリックスを形成する架橋カルボキシアルキルキトサン、それを含む組成物、その製造方法、および特に治療、リウマチ科、眼科、美容医療、形成外科、開腹術、皮膚科、婦人科または美容（ｃｏｓｍｅｔｉｃ）の分野に関する。

キトサン誘導体は、特に国際公開第２０１６／０１６４６３号および国際公開第２０１６／０１６４６４号の下で公開されたＫｉｏｍｅｄ Ｐｈａｒｍａの特許出願および対応する特許で知られている。その内容が参照により本発明に組み込まれるＰＣＴ／ＥＰ２０１８／０８０７６３およびＰＣＴ／ＥＰ２０１８／０８０７６７として出願されたＫｉｏｍｅｄ Ｐｈａｒｍａの特許出願およびそれらのファミリーに記載されているカルボキシアルキルキトサン等の有利なキトサン誘導体も、Ｋｉｏｍｅｄ Ｐｈａｒｍａから知られている。

本発明者らによれば、カルボキシアルキルキトサン組成物の生体力学的挙動を調整することができ、あるいはカルボキシアルキルキトサンの存在による治療の存続期間または効果を増加させることができることは有利であろう。しかしながら、特にヒドロゲルを調製することが望まれる場合、改善された生体力学的特性を有するそのような組成物を提供することは当業者には自明ではない。生体高分子組成物、および特に最先端のヒドロゲルの中で、当業者に知られている生体高分子ベースの組成物の技術的問題の一つは、一部の組成物が凝集性ヒドロゲルの形態ではないという事実にある。すなわち、ヒドロゲルは、水性媒体の存在下で自発的に別個の部分に崩壊し、したがって粒子、断片を形成する。これは、断片化されたゲルまたはヒドロゲルとしても知られている。

このような非凝集性ヒドロゲルは、製品がヒトまたは動物の組織に移植された場合、長期の炎症性小結節形成または肉芽腫性反応のリスクを示し、多くの医療用途には望ましくないと考えられていると認識されている（Ｂｅｒｇｅｒｅｙ－Ｇａｌｌｅｙ， Ａｅｓｔｈ Ｓｕｒｆ Ｊ ２４， ３３， ２００４）。したがって、対象または患者の健康上の安全性の観点から、別個の断片の形成を回避し、凝集性ヒドロゲルの形態の組成物を得ることができることが重要である。

さらに、いくつかの理由で、そのような組成物で満たされ、組織に適切に生体組込みがされ（ｂｉｏｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ）、均一な充填を可能にする組織の美的（視覚的および／または触覚的）外観を改善するために、場合によってはそのような凝集体を回避することが望ましい。

したがって、多くの用途では、たとえば、水性媒体がそれに添加された場合に、一つの塊にとどまる凝集性ヒドロゲルが好ましい。これは「均質な」ヒドロゲルとも呼ばれる。さらに、ほとんどの用途では、しこりがないか、またはほとんどないその視覚的外観のために「滑らかな」ヒドロゲルと呼ばれるヒドロゲルが好ましい。

凝集性に加えて、本発明による組成物、特にヒドロゲルは、特に安全性、免疫適合性、生体吸収性、生体力学的特性、および存続期間または活性時間の観点から、ヒトまたは動物における使用に適しているべきである。しかしながら、当技術分野のすべての組成物がそのような特性を十分に示すわけではなく、したがって、本発明に従わないであろう。

カルボキシルアルキルキトサンをヒドロゲル形態にするための様々な方法が知られている。特に、Ｒｕｆａｔｏ ｅｔ ａｌ． （Ｉｎｔｅｃｈｏｐｅｎ ８１８１１， ２０１８）、Ｕｐａｄｈｙａｙａ ｅｔ ａｌ． （Ｊ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ ２０１４）、およびＦｏｎｓｅｃａ－Ｓａｎｔｏｓ ｅｔ ａｌ． （Ｍａｔｅｒ Ｓｃｉ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｃ ７７， １３４９， ２０１７）は、医療または製薬用途用に、カルボキシルアルキルキトサンを含むいくつかのキトサンベースのヒドロゲルを特定した。しかしながら、これらのヒドロゲルのいずれも、凝集性、安全性、免疫適合性、生体力学的特性、生体吸収性、および／または存続期間または活性時間に関して、特に同時に、期待に応えないので、本発明者らが期待しているものではない。前述の特許出願ＰＣＴ／ＥＰ２０１８／０８０７６３およびＰＣＴ／ＥＰ２０１８／０８０７６７によるＫｉｏｍｅｄ Ｐｈａｒｍａの組成物を除いて、最新技術に従って既知のヒドロゲルを調製するために使用されるカルボキシアルキルキトサンはいずれも、発明者によれば良好な免疫適合性を示さない。すべてのキトサンを使用して、ヒトまたは動物での使用に適したヒドロゲルを形成できるわけではない。

現在までに知られているキトサンベースのヒドロゲルは、キトサンまたは誘導体の一つを他のポリマー、たとえば、アルギン酸塩、イソプロピルアクリルアミド、ポリウレタン、ポリアクリロニトリル、ゼラチン、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）と組み合わせることによって調製される。しかしながら、これらのポリマーは、非生体吸収性または免疫反応性のいずれかであり、本発明の目的を満たさない。

たとえば、Ｈｕａｎｇ ｅｔ ａｌ． （ＲＣＳ Ａｄｖ ２０１６ Ｄ０１：１０．１０３９／Ｃ５ＲＡ２６１６０Ｋ）は、グリコールキトサンおよびヒアルロナンのヒドロゲルを調製したが、このようなグリコールキトサンは免疫反応性があるため、ヒトには受容されない。Ｓｏｎｇ ｅｔ ａｌ （Ｓｃｉ Ｒｅｐ ６， ３７６００， ２０１６）は、カルボキシメチルキトサンのアミン基とヒアルロナンのアルデヒドとの間のシッフ塩基反応を介して、カルボキシメチルキトサンと酸化ヒアルロナンに基づくヒドロゲルを調製した。しかしながら、本発明者らの経験では、使用されるカルボキシメチルキトサンは、本発明の目的を満たすために必要な分子構造を有していない。特に、記載されたヒドロゲルは、記載されたｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏ試験によれば、非常に迅速に再吸収する。したがって、そのようなヒドロゲルは、広範囲の適応症に使用するために、特にその存続期間に関して改善される必要がある。

さらに、以前の製品は、多くの場合、様々な適応症、特に様々な治療適応症のニーズを満たすためにあまり用途が広くない。したがって、特性、特に生体力学的特性の点で十分に用途が広く、様々な用途に容易に適応できる製品を提供する必要がある。

たとえば、再生医療または外科手術において、目的は、一般に、変化した組織または体液を修復すること、および／または組織の変化を防止すること、組織を充填すること、または癒着を避けるために組織を分離することである。組織の変化の原因は、自然な老化、外部からの攻撃（外傷、紫外線照射、手術等）、炎症、自己免疫等の病態である場合がある。しかし、ほとんどの組織の変化は、組織または細胞に損傷を与える可能性のある高含有量のフリーラジカル種を特徴とする、酸化ストレス（ｏｘｉｄａｔｉｖｅ ｓｔｒｅｓｓ）と呼ばれることもある酸化ストレス（ｏｘｉｄａｔｉｎｇ ｓｔｒｅｓｓ）に関与している。フリーラジカル種の量を減らすことで、組織は老化を防ぎ／遅らせることができ、その有害な結果を低減することができる。組織内のフリーラジカル種の量を減らすには、たとえば、ビタミンＣ、Ｂ、Ｅ、および／またはユビキノン等の抗酸化物質を投与することによる、いくつかの方法がある。あるいは、フリーラジカルを除去することができる組成物を使用することができ、それにより、それらの含有量および組織内での増殖を低減する。

キトサンおよびその誘導体のいくつかは、Ｎｇｏ ｅｔ ａｌ． （Ａｄｖ Ｆｏｏｄ Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ Ｒｅｓ ７３， １５， ２０１４）によるレビューに記載されているように、生物医学的使用のための多くの製剤について説明されているように、酸化的フリーラジカル種を除去する能力を示す。たとえば、構造および分子量が異なるカルボキシメチルキトサンは、特にＵｊａｎｇ ｅｔ ａｌ． （Ｔｈｅ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ， Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｗａｔｅｒ Ｓｏｌｕｂｌｅ Ｃｈｉｔｏｓａｎ； ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ， ＩｎＴｅｃｈ， ２０１１． ＩＳＢＮ： ９７８－９５３－３０７－１７９－４）によって説明されているように、ｉｎ ｖｉｔｒｏ測定法を使用して様々なタイプのフリーラジカルを除去する能力について研究されている。

しかし、キトサンの有益な効果、特にフリーラジカルを除去する能力を、組織への酸化ストレスの影響の低減、および製品の生体力学的挙動のより良い調整、あるいは、外因性起源のこのポリマーの存在によって、存続期間または治療の効果をさらに高めることの両方を可能にする治療の形で適用するための組成物を提供すること、は困難である。

したがって、最新技術は、本発明で設定された問題を克服するために、当業者が満足のいく組成物を提供することを自明的に可能にしない。

本発明の目的
本発明の目的の一つは、ヒトまたは動物、特に治療、外科および美容の分野での使用に適している、キトサン誘導体またはそれを含む組成物を提供するという技術的問題を解決することである。

本発明の目的の一つは、キトサンの有益な効果、特にフリーラジカルを除去するその能力を、組織への酸化ストレスの影響を低減し、および生体力学的挙動をよりよく調整し、および外因性起源のこのポリマーの存在を通じて、存続期間または治療の効果を高めることの両方を可能にする治療の形で適用するために、キトサン誘導体またはそれを含む組成物を提供することからなる技術的問題を解決することである。

特に、本発明の目的の一つは、特に生体吸収性ヒドロゲルの形態で、ヒトまたは動物の組織との接触での使用に適した、生体力学的特性、ｉｎ ｓｉｔｕでの存続期間または活性時間、良好な健康の安全性（特に、短期および長期における免疫反応および/または異物への反応の欠如）の観点から許容される、および特に再生医療または老化防止医療、たとえば治療、リウマチ科、整形外科、婦人科眼科、美容医療、形成外科、開腹術、皮膚科、または美容（ｃｏｓｍｅｔｉｃ）の分野の文脈で有益な効果をもたらす組成物を提供するという技術的問題を解決することである。

本発明の目的の一つは、良好な生体力学的特性、特にその適応症に従って調整可能な生体力学的特性を有する組成物を提供するという技術的問題を解決することである。

本発明の目的の一つは、意図された各適応症に適合した様々な生体力学的特性を有する一連の製品を調製することを可能にする、キトサン誘導体に基づく製品を提供するという技術的問題を解決することである。

本発明の目的の一つは、好ましくは同時に、凝集性、安全性（免疫適合性を含む）、生体力学的特性、ヒトまたは動物への投与に十分な生体吸収性、および好ましくは適切な存続期間または活性時間を備える組成物を提供するという技術的問題を解決することである。

本発明の目的の一つは、特にキトサン誘導体またはそれを含む組成物を、意図された適応症においてヒトまたは動物に許容されるグレードで提供することによって、本発明に記載された技術的問題を解決することである。

発明の詳細な説明
本発明に記載された技術的問題を解決するために、本発明者らは、ヒトまたは動物における意図された用途のための良好な抗酸化特性および良好な機械的特性（生体力学的特性と呼ばれる）の両方を有するキトサンを開発することを試みた。

本発明者らは、置換キトサン、特にカルボキシアルキルキトサンの利点についての彼ら自身の経験からの知見を有する。特に、Ｋｉｏｍｅｄ ＰｈａｒｍａはＰＣＴ／ＥＰ２０１８／０８０７６３およびＰＣＴ／ＥＰ２０１８／０８０７６７の下で特許出願を行っている。彼らは、本発明で設定された技術的問題を解決するためにこの教示を適用しようと試みてきた。

本発明者らは、イオン性（すなわち、非共有結合性の）架橋によって形成されたカルボキシアルキルキトサンヒドロゲルが、いくつかの意図された用途のために移植後十分に長くその生体力学的特性を保持しないことに気付いた；特に、この技術では、存続期間や活性時間の幅広い調整はできない。さらに、酵素的に触媒された架橋によって形成されたカルボキシアルキルキトサンヒドロゲルは、そのタンパク質性のために酵素免疫反応性のリスクがあり、得られた架橋生成物の最終精製を困難にする。

特許出願ＣＮ１０７３２５３０６（ｌｍｅｉｋ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ）は、いくつかの連続する架橋工程（多重架橋（ｍｕｌｔｉ－ｃｒｏｓｓｌｉｎｋｉｎｇ））でＢＤＤＥと架橋することによる、甲殻類由来のカルボキシメチルキトサンに基づくゲルの調製について記載している。しかし、この方法は、特に、得られるヒドロゲルは、カルボキシメチルキトサンの溶液中に分散される架橋キトサン誘導体の粒子によって形成され、全体が再び架橋されてゲルを形成するため、凝集性ではないために、本発明の基準によるヒドロゲルを提供しない。架橋操作は数回繰り返される（「多重架橋（ｍｕｌｔｉ－ｃｒｏｓｓｌｉｎｋｉｎｇ）」）。そのような製品は肉芽腫を形成する可能性が高く、したがって人体または動物の体との接触後に免疫適合性に悪影響を与える可能性があり、これはまさに本発明が回避しようとしていることである。本発明はさらに有利には、特に凝集性（すなわち、たとえば、水との接触時に断片化せずに一つの塊に留まる）および／または「滑らかな」外観のヒドロゲルが望まれる場合に、適応症のより大きな多様性を可能にする。ＣＮ１０７３２５３０６によると、使用されるカルボキシメチルキトサンのＤＡは低い（脱アセチル化度は６０～９９％、好ましくは８０～９５％、実際にはアセチル化度（ＤＡ）は４０％よりはるかに低い）。アセチル化度の低いカルボキシメチルキトサンヒドロゲルも、Ｃｚｅｃｈｏｗｓｋａ－Ｂｉｓｋｕｐ ｅｔ ａｌ．（Ｄ０１： １０．１５２５９．ＰＣＡＣＤ．２１．０３）によって記載されている。しかし、これらのヒドロゲルは凝集性ではなく、本発明の目的を満たさない。

本発明者らは、本発明による架橋カルボキシアルキルキトサンマトリックスまたは組成物、特にそれを含むヒドロゲルが、本発明に記載された技術的問題の少なくとも一つ、好ましくはすべてを解決することを可能にすることを見出した。

したがって、本発明は、グルコサミン単位、Ｎ－アセチルグルコサミン単位、およびカルボキシアルキル基で置換されたグルコサミン単位を有する少なくとも一つのカルボキシアルキルキトサンを含むマトリックスに関し、該カルボキシアルキルキトサンは、総グルコサミン単位のモル数に対するＮ－アセチル基のモル数として表され、４０％より大きく最大８０％の範囲のアセチル化度を有し、該カルボキシアルキルキトサンは、カルボキシアルキルキトサン鎖間の共有結合によって架橋されている。

実際、ＤＡが４０％未満の架橋カルボキシアルキルキトサンは、加湿中に別々の断片に断片化するという点で、所望の凝集性を有するヒドロゲルを得ることができず、これは多くの用途にとって望ましくないことが見出された。

本発明によれば、凝集性ヒドロゲルは、皮内使用のためにヒドロゲルを特徴づけるために従来から使用される方法、たとえばＭｉｃｈｅｅｌｓ ｅｔ ａｌ （Ｊ Ｃｌｉｎ Ａｅｓｔｈ Ｄｅｒｍａｔｏｌ １０， ２９， ２０１７ ａｎｄ Ｊ Ｄｒｕｇｓ Ｄｅｒｍａｔｏｌ １５， １０９２， ２０１６）によって記載された方法を適応させることによって、「水試験」と呼ばれる以下の凝集試験に従ってその凝集性を保持するヒドロゲルであると理解される：

試験するヒドロゲルの１ｇの塊を、直径５ｃｍのペトリ皿の中央に置く。皿の周囲に１ｍＬの蒸留水を添加する。ペトリ皿を、水がヒドロゲルを覆うまで穏やかに振動し、その後水平位置に戻す。ヒドロゲルがマトリックスと水との接触直後、好ましくは１５～２５秒間の接触後、および好ましくは少なくとも３０秒間の接触後、すなわち、それが単一の断片を形成し、凝集性であるか、またはそれが自発的に別個の部分に分離するかどうか、または肉眼で見える粒子を形成し、非凝集性であるかを観察する。

さらに、本発明によるマトリックスがフリーラジカル種を除去することができることが有利に見出された。このキトサン特性の保持は、当業者には自明ではなかった。カルボキシアルキルキトサンの分子構造（ＤＳ）および分子量がフリーラジカルを除去する能力に影響を与えることが知られているが、矛盾する結果が発表されている。したがって、架橋されたカルボキシアルキルキトサンがフリーラジカル捕捉能力を示すことは明らかではなかった。

さらに、本発明によるヒドロゲルは、適切な凝集性、生体力学的プロファイル、持続期間（ｌｏｎｇｅｖｉｔｙ）および安全性を有しながら、そのような抗酸化活性を示す。

さらに、ヒドロゲルとして製剤化された架橋カルボキシアルキルキトサンが凝集性であり、好ましくは滑らかであり、すなわち、触ると明確な、可視のまたは知覚可能な断片がなく、適切な安全性、特に免疫適合性、生体力学的プロファイルおよび持続期間を有することは明らかではなかった。本発明は、特にヒドロゲルの形態で、そのようなマトリックスまたは組成物を提供することを可能にする。架橋マトリックスが免疫適合性である、すなわち非免疫反応性であり、免疫反応を実質的に活性化しないためには、少なくとも非免疫反応性ポリマー（単数または複数）から調製されるべきである。ポリマーが非免疫反応性であることを確認するために、特定の標準化検査が使用される。たとえば、ヒト全血テスト（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）およびマウスのエアバッグへの皮下注射等である。

本発明によるマトリックスによって形成されたヒドロゲルは、完全に滑らかではなく、たとえば、前述の水試験によると凝集性であるという条件で、触ると可視または知覚可能な塊を有することを認めることができる。

本発明によるマトリックスは、本発明によるマトリックスを形成するために架橋される出発カルボキシアルキルキトサンによって特徴付けることができる。

第一の態様によれば、真菌起源のカルボキシアルキルキトサンは、カルボキシアルキル置換グルコサミン単位、Ｎ－アセチルグルコサミン単位、およびグルコサミン単位を有するものが使用され、上記カルボキシアルキルキトサンは、好ましくは、該カルボキシアルキルキトサンは、総単位のモル数に対する置換基のモル数として表され、２０％を超えるカルボキシアルキル基との置換度を有する。

これは、キトサン誘導体または置換キトサンとも呼ばれる。

カルボキシアルキルキトサンは、キトサンの置換によって調製される。通常、カルボキシアルキルキトサンは、ＰＣＴ／ＥＰ２０１８／０８０７６３およびそのファミリー（特にＦＲ１７６１３１４およびＥＰ１８７９９７７２．１）およびＰＣＴ／ＥＰ２０１８／０８０７６７およびそのファミリー（特にＦＲ１７６１３２３およびＥＰ１８７９９７７３．９）の下で出願されたＫｉｏｍｅｄ Ｐｈａｒｍａの特許出願に従って調製される。これらは、特にカルボキシアルキルキトサンの調製を例示するために参照により本明細書に組み込まれる。

キトサンは、たとえば、ＣＡＳ番号９０１２－７６－４で参照される。

本発明に使用されるキトサンは、有利には真菌起源であり、好ましくは、子嚢菌型の真菌、特にアスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｐｉｇｅｒ）、および／または担子菌真菌（Ｂａｓｉｄｉｏｍｙｃｅｔｅ ｆｕｎｇｕｓ）、特にレンティヌラ・エドデス（Ｌｅｎｔｉｎｕｌａ ｅｄｏｄｅｓ；シイタケ）および／またはアガリクス・ビスポラス（Ａｇａｒｉｃｕｓ ｂｉｓｐｏｒｕｓ；白いマッシュルーム）由来である。好ましくは、キトサンはアガリクス・ビスポラス（Ａｇａｒｉｃｕｓ ｂｉｓｐｏｒｕｓ；白いマッシュルーム）由来である。キトサンは、好ましくは高純度であり、その真菌起源または製造プロセス由来の不純物をほとんど含まず、インプラントまたは医薬組成物としての使用と適合性のある微生物学的グレードのものである。キトサンを調製するための１つの方法は、特許国際公報第０３／０６８８２４号（ＥＰ１４８３２９９；ＵＳ７，５５６，９４６）に記載されている方法である。

一般に、キチンは水酸化ナトリウムの存在下で水性媒体に懸濁され、次に媒体は、所望の分子量に応じて可変の時間、高温で加熱される。次に、キトサンを酸性媒体に可溶化することによって精製し、アルカリ性媒体に沈殿させ、洗浄して乾燥させる。

好ましくは、キトサンは、医薬用途のために十分に純粋なグレードのものである。

キトサンは有利に精製され、次いで好ましくは乾燥される。精製後、本発明のプロセスは、カルボキシアルキルキトサンを乾燥し、次いで、場合によりそれを粉末に粉砕する工程を含んでもよい。カルボキシアルキルキトサンは、たとえば、水を蒸発させることによって、たとえば、噴霧乾燥（微粒化）、流動床（ｆｌｕｉｄｉｚｅｄ ｂｅｄ）プロセスによって、または真空または大気圧下での熱乾燥によって、または凍結乾燥によって乾燥させることができる。

カルボキシアルキルキトサンは、水溶液に可溶化することができ、たとえば、体内、特に人体への注射または移植に許容される医薬品グレードの水に可溶化することができる。

次に、そのようなカルボキシアルキルキトサンを架橋して、本発明によるマトリックスを調製する。

架橋されたカルボキシアルキルキトサンのＤＡおよびＤＳは、架橋時に実質的に変化しないため、架橋されていないカルボキシアルキルキトサンのＤＡおよびＤＳの関数として表すことができる。しかし、架橋剤がＮ－アセチルまたはカルボキシアルキル基を提供する場合、出発非架橋カルボキシアルキルキトサンに対して外因性であるこれらの基は、架橋カルボキシアルキルキトサンのＤＡおよびＤＳにおいて考慮されない。以下に説明するように、ＤＡおよびＤＳの値は当業者に既知である。したがって、ＤＡおよびＤＳは、架橋の前後の両方を指す。

キトサンのアセチル化の程度（ＤＡ）は、たとえば、電位差滴定によって特許出願国際公報第２０１７００９３３５号および国際公報第２０１７００９３４６号に記載されているように決定される。あるいは、ＤＡは、液相プロトンＮＭＲ、固相炭素１３ ＮＭＲ、赤外線分光法等、キトサンに関して知られている他の方法で測定することができる。

有利には、カルボキシアルキルキトサンは、総単位のモル数に対するＮ－アセチルグルコサミン単位のモル数として表され、４０～８０％の間のアセチル化度を有する。アセチル化の程度は、キトサン（Ｎ－アセチル－Ｄ－グルコサミン、置換Ｎ－アセチル－Ｄ－グルコサミン、Ｄ－グルコサミンおよび置換Ｄ－グルコサミン）に存在する総グルコサミン単位数に対する（Ｄ－グルコサミン単位の）Ｎ－アセチル基の数として表される。

有利には、カルボキシアルキルキトサンは、４０～８０％の間のアセチル化度を有し、総グルコサミン単位の数に対するＮ－アセチル基の数として表される。

一つの代替法によれば、アセチル化の程度は４０～５０％の範囲である。一つの代替法によれば、アセチル化の程度は５０～６０％の範囲である。

一つの実施形態では、アセチル化の程度は、６０～７５％の範囲である。

カルボキシアルキルキトサンのアセチル化の程度は、固相炭素１３ ＮＭＲ、固相炭素１３ ＮＭＲ、または液相プロトンＮＭＲによって決定することができる。カルボキシアルキルキトサンは、有利には、制御された程度のアセチル化を有する。「アセチル化度が制御されたキトサン」という用語は、アセチル化度、すなわちＮ－アセチル－グルコサミン単位の割合を、特にアセチル化反応によって制御された方法で調整することができる製品を意味する。

好ましくは、カルボキシアルキルキトサンは再アセチル化される。

一つの代替法によれば、本発明によるカルボキシアルキルキトサンを調製するためのプロセスは、真菌起源のキトサンを調製する工程、キトサンを再アセチル化する工程、そして再アセチル化されたキトサンをカルボキシアルキル化することを含む。したがって、本発明は、再アセチル化されたカルボキシアルキルキトサンに関する。特に、本発明は、アニオン性カルボキシアルキルキトサンに関する。

したがって、一つの実施形態によれば、キトサンは、水性の、好ましくはわずかに酸性化された媒体（たとえば、ｐＨ６）に溶解することができる。無水酢酸は、一つまたは複数の工程でキトサン溶液に加えることができる。次に、ソーダおよび／または尿素等の塩基性薬剤が添加される。次に、たとえば、モノクロロ酢酸ナトリウム（すなわち、クロロ酢酸のナトリウム塩）またはクロロ酢酸等のアルキル化剤が添加される。次に、置換されたキトサンは精製され、回収され、乾燥される。

一つの代替法によれば、本発明によるカルボキシアルキルキトサンを調製するためのプロセスは、キトサンを調製する工程、キトサンをカルボキシアルキル化し、次いで、カルボキシアルキル化されたキトサンを再アセチル化する工程を含む。有利には、そのような方法は、最終的なカルボキシアルキルキトサンのアセチル化の程度の正確な制御を可能にし、特に、たとえば４０％を超える高度のアセチル化を得ることができる。したがって、本発明は、再アセチル化された後にカルボキシアルキル化されたキトサン、または再アセチル化されたカルボキシアルキルキトサンに関する。

一つの代替法によれば、本発明によるカルボキシアルキルキトサンを調製するためのプロセスは、真菌起源のキチンを調製する工程、キチンをカルボキシアルキル化する工程、および任意選択でカルボキシアルキル化されたキチンを再アセチル化して本発明によるカルボキシアルキルキトサンを得る工程を含む。

一つの代替法によれば、本発明によるカルボキシアルキル化されたキトサンを調製するためのプロセスは、真菌起源のキチンを調製する工程、キチンを脱アセチル化する工程、キチンをカルボキシアルキル化する工程、および任意選択でカルボキシアルキル化されたキチンを再アセチル化して本発明によるカルボキシアルキルキトサンを得る工程を含む。

一つの代替法によれば、カルボキシアルキルキトサンの平均分子量は４０万未満である。

一つの代替法によれば、平均分子量は２万～６万の間である。

別の代替法によれば、平均分子量は、６万～１２万の間である。

別の代替法によれば、平均分子量は、１０万～４０万の間である。

別の代替法によれば、平均分子量は、１２万～４０万の間である。

別の代替法によれば、平均分子量は、１８万～４０万の間である。

ここで好ましくは、平均分子量は、固有粘度から計算された粘度平均分子量（ｖｉｓｃｏｓｉｔｙ ａｖｅｒａｇｅ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｗｅｉｇｈｔ；Ｍｖ）である。この表現は当業者にとって慣習的である。固有粘度（ｎ）は、欧州薬局方の研究書２．２．９の方法に従って、ウベローデ型のキャピラリー粘度計を使用したキャピラリー粘度計によって測定される。溶液の流動時間は、自動Ｉ－Ｖｉｓｃ粘度計（Ｌａｕｄａ）を使用して、適合したキャピラリーチューブ（Ｌａｕｄａ、たとえば直径０．５３ｍｍのウベローデ５１０ ０１キャピラリーチューブ）を介して測定される。次に、カルボキシアルキルキトサンの平均粘度測定質量（ａｖｅｒａｇｅ ｖｉｓｃｏｍｅｔｒｉｃ ｍａｓｓ）を計算するために、Ｍａｒｋ－Ｈｏｕｗｉｎｋ方程式（η＝Ｋ＊Ｍｖａ）が適用される。ここで、
－Ｍｖは、カルボキシアルキルキトサンの粘度平均分子量であり、
－ηは、カルボキシアルキルキトサンの固有粘度であり、
－定数Ｋおよびαは、ＭＡＬＬＳ検出器を備えた立体排除クロマトグラフィーによって（非置換）キトサンについて以前に決定されたように、それぞれ０．０６８６および０．７６３８の値を有する。

したがって、カルボキシアルキルキトサンの固有粘度は通常、次のように表すことができる：

キトサンを加水分解して分子量を低下させることができる。

通常、非架橋カルボキシアルキルキトサンでは、グルコサミン単位はＤ－グルコサミン単位（Ｄ－グルコサミン単位、Ｎ－アセチル－Ｄ－グルコサミン単位、および置換されているＤ－グルコサミン単位およびＮ－アセチル－Ｄ－グルコサミンユニットの少なくとも一つ）である。

一つの代替法によれば、置換されたキトサンは、Ｄ－グルコサミン単位のみが置換されている。

別の代替法によれば、置換されたキトサンは、Ｄ－グルコサミンおよびＮ－アセチル－Ｄ－グルコサミン単位の同時の置換を有し、ここでキトサンのみのアミン基のある代替法に従って、またはキトサンのアミン基とヒドロキシル基を同時に有する別の代替法に従って、カルボキシアルキル基が共有結合している。

置換は一般的に部分的であり、すべての単位が必ずしも置換されるわけではない。

一つの実施形態によれば、Ｄ－グルコサミン単位の置換度は、置換されたキトサンの総単位（置換された、または置換されていないＤ－グルコサミンおよびＮ－アセチル－Ｄ－グルコサミン単位）のモル数に対するＤ－グルコサミン単位のモル数として、３０％～２５０％の範囲である。

一つの実施形態によれば、上記カルボキシアルキルキトサンは、２０％を超える、たとえば、５０％を超える、たとえば、２００％未満のカルボキシアルキル基との置換度を有し、総単位のモル数に対する置換基のモル数として表される。

一つの実施形態によれば、カルボキシアルキル基による置換度は、５０％を超え、総単位のモル数に対する置換基のモル数として表される。

一つの実施形態によれば、置換されたキトサンの総単位（置換された、または置換されていないＤ－グルコサミンおよびＮ－アセチル－Ｄ－グルコサミン単位）のモル数として表されるＤ－グルコサミン単位の置換度は、５０％～２００％の範囲であり、なお好ましくは７０％より高い。

一つの実施形態によれば、カルボキシアルキル基による置換度は、８０％未満であり、総単位のモル数に対する置換基のモル数として表される。

通常、置換は、共有結合によって達成される。

一つの代替法によれば、カルボキシアルキルキトサンはＮ，Ｏ－カルボキシアルキルキトサンである。Ｏ位（グルコサミンおよび／またはＮ－アセチルグルコサミン単位のＯ３またはＯ６のいずれか）および／または（グルコサミン単位の）Ｎ位においてカルボキシアルキル基で置換された単位の割合は変化する。したがって、置換度は１００％を超える可能性がある。

有利には、カルボキシアルキルキトサンの置換度（ＤＳ）およびアセチル化度（ＤＡ）は、ＰＨ ＭＡＳ ＶＴＮ ４００ＳＢ ＢＬ４ Ｎ－Ｐ／Ｈ ｐｒｏｂｅを備えたＢｒｕｋｅｒ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ （Ａｖａｎｃｅ ＩＩＩ ＨＤ ４００ＭＨｚ）を使用して、固相炭素１３ＮＭＲによって測定される。たとえば、スペクトルは室温、緩和時間１～８秒の間、スキャン回数６４～５１２の間で記録される。炭素の信号の面積は、逆重畳積分後に決定される。考慮される炭素は、「ＣＨ３アセチル」（置換されているかどうかに関係なく、Ｎ－アセチルグルコサミン単位のアセチル基のメチル炭素）、「Ｃｘ」（グルコサミンおよびＮ－アセチル-グルコサミン単位のｘ位の炭素、ｘは１～６の範囲である）および「Ｃ＝Ｏ」（置換されているかどうかに関係なく、カルボキシアルキル置換基のカルボニル炭素およびＮ－アセチルグルコサミン単位のアセチル基のＣ＝Ｏカルボニル炭素）である。所与のカルボキシアルキルキトサンのＤＳを決定するには、このカルボキシアルキルキトサンの前駆体キトサンの炭素１３ ＮＭＲスペクトルも記録する必要がある。前駆体キトサンのスペクトルから、「ＣＳＵ比」、つまり「ＣＨ３アセチル」基（Ｎ－アセチルグルコサミン単位のアセチル基のメチル炭素）のシグナル面積の、「Ｃ＝Ｏ」（N-アセチル－Ｄ－グルコサミン単位のアセチル基のカルボニル炭素）のシグナル面積に対する比を計算する。カルボキシアルキルキトサンのＤＡは式１に従って計算され、ＤＳは式２に従って計算される。ここで、Ｉは対象としている炭素の信号面積を表す。

式１：

式２：

ＤＡおよびＤＳは、カルボキシアルキルキトサンについて知られている他の方法を使用して、たとえば、磁気共鳴分光計を使用する水性媒体中でのプロトンＮＭＲによって、たとえば、Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ． （Ｃａｒｂ Ｐｏｌｙｍ １３７， ６００， ２０１６）によって記載された方法に従って、たとえば、事前にカルボキシアルキルキトサンを加水分解し、分析前に重水素化塩酸の濃縮溶液を添加することによって決定することができる。

ＤＡおよび／またはＤＳを確実に推定するために別のＮＭＲ法がより有利である場合、そのような方法が使用に適している。上記の方法は、特に置換度を計算するために使用される信号の分解能、強さ、およびプロトン位置に関して、サンプル調製および統合される信号に関して当業者によって適合されるべきである。

キトサンのカルボキシアルキル化の程度は、有利には、２０～２５０％、好ましくは５０～２００％、たとえば７０～１７０％の範囲であってもよく、総単位のモル数に対するカルボキシアルキルのモル数として表される。

一つの代替法によれば、キトサンのカルボキシアルキル化の程度は、有利には、４０～１３０％、たとえば、７０～１３０％の範囲であってもよく、総単位のモル数に対するカルボキシアルキルのモル数として表される。

キトサンの置換度は、通常、反応開始時のキトサンに対する反応物の質量比と相関関係がある。カルボキシアルキル化剤の例は、一つまたは複数のカルボキシメチル、カルボキシエチル、カルボキシプロピル、カルボキシブチル基等を有するもの等の酸塩化物（またはその塩、たとえば、モノクロロ酢酸ナトリウム）を含む。

一つの代替法によれば、本発明は、カルボキシアルキルのアルキル部分が線状または分枝状である、Ｃ１～Ｃ５のカルボキシアルキルキトサンに関する。

一つの実施形態によれば、本発明は、カルボキシメチルキトサンに関する。

この代替法によれば、置換されたキトサンはＮ－カルボキシアルキルキトサンである。

この実施形態によれば、置換されたキトサンはＯ－カルボキシアルキルキトサンである。

この代替法によれば、置換されたキトサンはＮ－カルボキシアルキルキトサンまたはＯ－カルボキシアルキルキトサンである。

第二の態様によれば、本発明は、グルコサミン単位、Ｎ－アセチルグルコサミン単位、およびカルボキシアルキル基で置換されたグルコサミン単位を有するキトサン誘導体に関し、上記カルボキシアルキルキトサンは、ｐＨ７．５で測定され、－１０ｍＶ以下であり、－１５ｍＶ以下が好ましい。特に、そのようなキトサン誘導体は、キトサン誘導体またはそれを含む組成物が、典型的には滴下、注射または移植によって投与された対象の免疫応答を制限することを可能にする。

有利には、ｐＨ７．５で測定されるゼータ電位は、－１８ｍＶ以下である。

有利には、カルボキシアルキルキトサンは、ｐＨ７．５で測定されるゼータ電位が－２２ｍＶ以下、好ましくは－２４ｍＶ以下である。

一つの特定の代替法によれば、置換されたキトサンは、好ましくは、１５万～２２万の平均分子量および５０～２００％の範囲の置換度を有し、分子量は、好ましくは、置換前に表される。

別の特定の代替法によれば、置換されたキトサンは、１２万～１５万の平均分子量および７０～２００％の範囲の置換度を有し、分子量は、好ましくは、置換前に表される。

一つの特定の代替法によれば、置換されたキトサンは、好ましくは、２２万～３０万の平均分子量および７０～２００％の範囲の置換度を有し、分子量は、好ましくは、置換前に表される。

別の特定の代替法によれば、置換されたキトサンは、２２万～３０万の平均分子量および５０～２００％の範囲の置換度を有し、分子量は、好ましくは、置換前に表される。

別の特定の代替法によれば、置換されたキトサンは、３０万～５０万の平均分子量および５０～２００％の範囲の置換度を有し、分子量は、好ましくは、置換前に表される。

別の特定の代替法によれば、置換されたキトサンは、３０万～５０万の平均分子量および７０～２００％の範囲の置換度を有し、分子量は、好ましくは、置換前に表される。

一つの特定の代替法によれば、置換されたキトサンは、好ましくは、１２万～１５万の平均分子量および２０％～５０％の範囲の置換度を有し、分子量は、好ましくは、置換前に表される。

別の特定の代替法によれば、置換されたキトサンは、２２万～３０万の平均分子量および２０％～５０％の範囲の置換度を有し、分子量は、好ましくは、置換前に表される。

別の特定の代替法によれば、置換されたキトサンは、３０万～５０万の平均分子量および２０％～５０％の範囲の置換度を有し、分子量は、好ましくは、置換前に表される。

特定の代替法によれば、置換されたキトサンは、２０～８０％、好ましくは４０～６０％の範囲の置換度、および４０～８０％、好ましくは５０～７５％のアセチル化度を有する。

別の特定の代替法によれば、置換されたキトサンは、９０～２００％、好ましくは９０～１５０％の範囲の置換度、および４０～８０％のアセチル化度を有し、分子量は、好ましくは、置換前に表される。

特定の代替法によれば、置換されたキトサンは、９０～２００％、好ましくは９０～１５０％の範囲の置換度、および４０～６０％、好ましくは５０～６０％のアセチル化度を有する。

一つの特定の代替法によれば、置換されたキトサンは、９０～２００％、好ましくは９０～１５０％の範囲の置換度、および５０～７５％のアセチル化度を有する。

一つの特定の代替法によれば、置換されたキトサンは、好ましくは２２万～３０万の平均分子量、９０～２００％、好ましくは９０～１５０％の範囲の置換度、および５０～７５％のアセチル化度を有し、分子量は、好ましくは、置換前に表される。

キトサンを置換することにより、ｐＨが広範囲で変化する水溶液に可溶なカルボキシアルキルキトサンの溶液を調製することが可能であったが、置換されていないキトサンは、５．５～６．５未満のｐＨでのみ溶解する。したがって、カルボキシアルキルキトサンは、その溶解度プロファイルを変更するカルボキシアルキル基の存在によって、異なるｐＨで、特に生理学的ｐＨまたは病理、たとえば炎症性病態によって変更された体液のｐＨで、可溶化される能力を示す。

「水溶性」とは、カルボキシアルキルキトサンが水溶液中に置かれたときに肉眼で可視の濁りを示さないことを意味する。より具体的には、たとえば、水または緩衝液、たとえば、リン酸緩衝液中の１％（ｍ／ｍ）の濃度のカルボキシアルキルキトサンの溶液の溶解性、すなわち、濁りがないことは、測定された試料に使用された水性溶媒のみを含むが、置換キトサンを含まない参照セルを参照して、波長５００ｎｍでＵＶ－可視分光法によって測定された、０．５未満、好ましくは０．２未満の光学密度によって確認することができる。別の方法は、欧州薬局方の研究書２．９．２０による目視検査である。キトサンが十分に置換されていない場合、組成物は、室温で、満足のいくｐＨ範囲、たとえば、ｐＨ５．５～ｐＨ８．５の範囲で溶解しない。

一つの実施形態では、カルボキシアルキルキトサンは無菌である。

キトサン主鎖（キトサン骨格とも呼ばれる）が一つまたは複数の主キトサン鎖に共有結合していることは、「カルボキシアルキルキトサン鎖間の共有結合によって架橋されている」ことによって特に理解される。有利には、このようにして、キトサン分子の三次元ネットワークが得られる。本発明は、特定の共有結合架橋法に限定されるものではなく、化学分子を架橋剤としても知られている架橋剤（ｃｒｏｓｓｌｉｎｋｉｎｇ ａｇｅｎｔ， ａｌｓｏ ｋｎｏｗｎ ａｓ ａ ｃｒｏｓｓｌｉｎｋｉｎｇ ａgent）として使用する方法もある。

本発明によれば、カルボキシアルキルキトサンは架橋されている。

一つの代替法によれば、架橋は、上記共有結合を形成する架橋剤によって形成される。

したがって、いくつかのキトサン鎖は、たとえば、多糖を架橋するために使用される架橋剤、たとえば１，４ブタンジオールジグリシジルエーテル、１－ブロモ－３，４－エポキシブタン、１－ブロモ－４，５－エポキシペンタン、１－クロロ－２，３－エピチオプロパン、１－ブロモ－２，３－エピチオプロパン、１－ブロモ－３，４－エピチオブタン、１－ブロモ－４，５－エピチオペンタン、２，３－ジブロモプロパノール、２，４－ジブロモブタノール、２，５－ジブロモペンタノール、２，３－ジブロモプロパンチオール－１，２，４－ジブロモブタンチオール、および２，５－ジブロモペンタンチオールエピクロロヒドリン、２，３－ジブロモプロパノール－１，１－クロロ－２，３－エピチオプロパン、ジメチルアミノプロピルカルボジイミド、没食子酸、エピガロカテキンガレート、クルクミン、タンニン酸、ゲニピン、またはヘキサメチレンジイソシアネートまたはトルエンジイソシアネート等のジイソシアネート化合物、またはジビニルスルホンから選択されるような一つまたは複数の架橋剤との反応によって、架橋することができる。

ゲニピンは、多糖類、特にカルボキシメチルキトサンを架橋するために使用される天然に存在する架橋剤である（Ｙａｎｇ ｅｔ ａｌ． Ａｃｔａ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｓｉｎ ３１， １６２５， ２０２０）。ゲニピンはヒドロゲルを濃い青から黒に着色する。これは、一部の適応症では有利な場合がある。

好ましくは、架橋剤は、ポリエポキシタイプ、たとえば二官能性物質である。好ましくは、１，４－ブタンジオールジグリシジルエーテル（ＢＤＤＥ）またはエチレングリコールジグリシジルエーテル（ＥＧＤＥ）は、ヒトに適用される生体材料、特に皮内、関節内、または眼内投与用のヒアルロナンヒドロゲルの調製にすでに使用されているので、架橋剤として使用される。一つの代替法によれば、架橋剤はジビニルスルホンである。

有利には、本発明の組成物はまた、架橋されたカルボキシアルキルキトサン以外の生体高分子を含んでもよい。有利な代替法によれば、生体高分子は、酸化されているかどうかに関わらず、共有結合によって架橋されているかどうかに関わらず、たとえばグリコサミノグリカン、特にヒアルロン酸またはヒアルロン酸ナトリウム等のヒアルロナンである。

架橋されたカルボキシアルキルキトサンを他のいくつかのポリマーと組み合わせたり架橋したりすることの利点は、それらの生物学的特性および物理化学的特性を追加すること、あるいは相乗効果を生み出すことである。

一つの代替法によれば、本発明によるマトリックスは、架橋されたカルボキシアルキルキトサンおよびヒアルロナン、コンドロイチン硫酸および／またはカルボキシメチルセルロースを含む。現在まで、ヒアルロナンと組み合わせた架橋カルボキシアルキルキトサン（本発明で定義されている）のヒドロゲルはない。たとえば、ヒアルロナンの認識された保湿特性をキトサンの酸化ストレスに対する保護特性と組み合わせることができるようにするために、これらの２つのポリマーを組み合わせることが本発明の目的の一つである。

一つの代替法によれば、マトリックスは、少なくとも一つのヒアルロナンを含む。

有利には、本発明によるマトリックスは、架橋されたカルボキシメチルキトサン単独、または架橋されているかどうかに関わらず、ヒアルロナンと組み合わされた架橋されたカルボキシメチルキトサンを含む。これにより、目的の特性を適応させることができる。

上記マトリックスは、少なくとも一つのカルボキシメチルキトサンおよびヒアルロナンを含む。

一つの代替法によれば、ヒアルロナンは、キャピラリー粘度計によって決定されるように、５００万未満、好ましくは１００万を超える、好ましくは２００万を超える平均分子量を有する。ヒアルロナンの分子量は、線形関係を介して相関しているため、密度で表されることがある。ヒアルロナンは、最大４．２５ｍ³／ｋｇの密度を有してもよく、たとえば、低密度（たとえば、約１～２ｍ³／ｋｇ）または高密度（たとえば、約２～４ｍ³／ｋｇ）として指定することができる。

一つの代替法によれば、ヒアルロナンは、たとえば連鎖球菌を用いた発酵によって得られる。別の代替法によれば、それはオンドリのピークからの抽出によって生成される。

一つの代替法によれば、マトリックスは、共有結合によって架橋された少なくとも一つのヒアルロナンを含む。

したがって、架橋されたヒアルロナンは、異なるヒアルロナン鎖間の共有結合を含む。

異なるタイプのヒアルロナンは、異なる分子量または異なるヒアルロナン塩を有するヒアルロナン等と、互いに架橋することができる。

本発明はまた、架橋されたカルボキシアルキルキトサンを調製するためのプロセスに関する。

一つの代替法によれば、本発明によるマトリックスを調製するためのプロセスは、
カルボキシアルキルキトサンを少なくとも一つの架橋剤と接触させ、接触させることは、好ましくはアルカリ相で行われる工程；
カルボキシアルキルキトサンを架橋剤で架橋する工程；および
架橋されたカルボキシアルキルキトサンを含むマトリックスを得る工程
を含む。

一つの代替法によれば、カルボキシアルキルキトサンは、アルカリ性水相、たとえば水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）溶液の存在下で架橋される。

有利には、水相に最初に存在するカルボキシアルキルキトサンの濃度は、アルカリ性水相の体積に対するカルボキシアルキルキトサンの１～３０重量％、好ましくは５～２０重量％（ｗ／ｖ）の範囲である。

有利には、架橋剤とポリマーとの間の質量比は、０．１％～３０％であり、ポリマーの重量に対する架橋剤の重量で表される。

好ましくは、架橋剤とポリマーとの間の質量比は、０．５％～２０％であり、特にＢＤＤＥが使用される場合、ポリマーの重量に対する架橋剤の重量として表される。

典型的には、反応は、例えば２５～６０℃、たとえば５０℃の温度で、たとえば３０分～４８時間の間、たとえば１時間～５時間の間にわたって加熱しながら行われる。一般に、架橋は、たとえば酸を加えることによって、そしてたとえば酢酸または塩酸を加えることによって中和および希釈することによって停止される。

有利には、反応残留物は、リン酸塩緩衝液を使用する透析によって除去される。

このようにして、本発明によるマトリックスを含むヒドロゲルが得られる。

一方、カルボキシアルキルキトサンは外因性の分子であり、体内への移植／注射／点眼後のヒアルロナンよりも分解に対して耐性がある。

したがって、本発明は、異なる分子量を有するこれらの二つのポリマーに基づく三次元ネットワークを含むマトリックスに関する。したがって、有利には、カルボキシアルキルキトサンのフリーラジカル除去力を保持しながら、一連の生体力学的特性、ｉｎ ｓｉｔｕの生成物持続時間、および治療持続時間が提供される。

本発明は、カルボキシアルキルキトサンとの共有結合によって共架橋された少なくとも一つのヒアルロナンを含むマトリックスに関する。

一つの代替法によれば、別の生体高分子、および好ましくはヒアルロナンと共架橋された、好ましくは本発明記載の、カルボキシアルキルキトサンを含むマトリックスを調製するためのプロセスは、
カルボキシアルキルおよび他の生体高分子の混合物、および好ましくはヒアルロナンを、少なくとも一つの架橋剤と接触させ、接触させることは、好ましくはアルカリ相で行われる工程；
カルボキシアルキルキトサンおよび他の生体高分子、および好ましくはヒアルロナンを、架橋剤で架橋する工程；
共架橋されたカルボキシアルキルキトサンおよび他の生体高分子、および好ましくはヒアルロナンのマトリックスを得る工程
を含む。

一つの代替法によれば、本発明によるマトリックスは無菌である。

本発明によるマトリックスからヒドロゲルを提供することは有利である。

したがって、本発明はヒドロゲルに関するものであり、有利には、凝集性ヒドロゲルを形成する。

したがって、本発明は、カルボキシアルキルキトサンが高度のアセチル化度（ＤＡ）（４０％を超える）を有し、好ましくは高度の置換度（ＤＳ）（２０％を超える、好ましくは５０％を超え、通常は２００％未満である）も有する架橋カルボキシアルキルキトサンヒドロゲルに関する。

本発明は、本発明に従って定義された少なくとも一つのマトリックスを含む組成物に関する。

一つの好ましい代替法によれば、本発明によるマトリックスは、水性媒体中で製剤化されて、ヒドロゲルの形態の組成物を形成する。

有利には、組成物、特にヒドロゲルの総質量に対して、ポリマー（たとえば、ヒアルロナン等の別の生体高分子を含むまたは含まない、カルボキシアルキルキトサン）の濃度（ｍ／ｍ）は、質量で１０％未満、たとえば５％以下である。

一つの代替法によれば、組成物、特にヒドロゲルの総質量に対して、ポリマー（たとえば、ヒアルロナン等の別の生体高分子を含むまたは含まない、カルボキシアルキルキトサン）の濃度（ｍ／ｍ）は、質量で４％未満、たとえば３％以下である。

質量比（ｍ／ｍ）［カルボキシアルキルキトサン／ヒアルロナン］は、たとえば、５～９５％、たとえば１０～９０％であり、さらにたとえば３０～７０％である。質量比（ｍ／ｍ）［ヒアルロナン／カルボキシアルキルキトサン］は、たとえば、５～９５％、たとえば１０～９０％であり、さらにたとえば３０～７０％である。一つの代替法によれば、質量比（ｍ／ｍ）［カルボキシアルキルキトサン／ヒアルロナン］は１：１（すなわち、５０％キトサンおよび５０％ヒアルロナン）である。

水性媒体は、水、水溶液であってもよく、そのｐＨおよび浸透圧は、たとえば、塩および／または任意選択でポリオール（ソルビトール、マンニトール、グリセロール）を添加した酸／塩基緩衝系を使用して調整される。

一つの代替法によれば、本発明によるマトリックスは、単一または複数の直接または逆エマルジョン（ｒｅｖｅｒｓｅ ｅｍｕｌｓｉｏｎ）の形成を可能にする親水性脂質媒体中で製剤化される。

一つの実施形態によれば、マトリックスの組成物は、１００～７００ｍｏｓｍ／ｋｇ、好ましくは１２０～５００ｍｏｓｍ／ｋｇの浸透圧を有する。

有利には、有利なことに、マトリックスの組成物の浸透圧は、２５０～４００ｍｏｓｍ／ｋｇ、好ましくは２７０～３３０ｍｏｓｍ／ｋｇである。

一つの代替法によれば、マトリックスの組成物は、関節に適した浸透圧を有する。

一つの代替法によれば、マトリックスの組成物は、眼または眼内表面と適合性のある浸透圧を有する。

一つの代替法によれば、マトリックスの組成物は、真皮または粘膜と適合性のある浸透圧を有する。

一つの代替法によれば、マトリックスの組成の浸透圧は１００～４００ｍｏｓｍ／ｋｇの間、より具体的には１２０～３８０ｍｏｓｍ／ｋｇの間であることが好ましい。

一つの代替法によれば、本発明による組成物は無菌である。

有利には、本発明による組成物は、本発明による組成物は、注射器またはバイアル等の注射、移植、または点眼装置に含まれる。

有利には、次に、たとえば注射器等の注射装置は、蒸気滅菌を受けることができる。次に、注射器等のこの装置を、好ましくは無菌（ａｓｅｐｔｉｃ）または無菌（ｓｔｅｒｉｌｅ）の方法で包装することができる。それはまた、本発明による組成物を滴下するためのバッグ、フラプラ（ｆｌａｐｕｌａ）、またはバイアルであってもよく、製剤を滅菌した後に無菌的に充填されるか、または充填後に直接滅菌される。

一つの代替法によれば、本発明による組成物、特に本発明によるヒドロゲルは、注射器またはバイアル等の注射、移植または点眼装置を充填する前に、濾過および／または蒸気滅菌によって滅菌される。

当業者は、ヒドロゲルを滅菌して所望の滅菌ヒドロゲルを得るための技術を知っている。それらは、熱または蒸気滅菌のためのいくつかのタイプの装置を備えており、微生物負荷を除去するいくつかのタイプの回数を使用することができる。

本発明は、より具体的には、本発明による、好ましくはヒドロゲルの形態の、マトリックスを含む、注射可能な組成物に関する。

本発明はまた、本発明による、好ましくはヒドロゲルの形態の、少なくとも一つのマトリックスを含む医薬組成物に関する。

一つの代替法によれば、本発明による組成物は、注射可能、移植可能または点眼可能な医薬組成物、または注射可能または移植可能または点眼可能な医療機器として使用される。

本発明はさらに、乾燥形態、特に凍結乾燥形態の本発明による組成物をカバーする。凍結乾燥された製品は、使用前に特に（再）分散され、好ましくは可溶化することができる。

本発明は、より具体的には、治療的治療に使用するための本発明による組成物に関し、たとえば、皮下、皮内、眼内、または関節内、粘膜内、筋肉内経路による注射を含み、上記組成物は、たとえばたとえば、修復または充填を必要とする少なくとも一つの体組織／体液の修復、再生または充填用である。

企図される用途に十分な純度を有するキトサンを使用することが有利である。

企図される用途に十分な純度のヒアルロナンを使用することが有利である。

本発明による組成物に必要とされる生体力学的特性は、適応症に応じて、たとえば、ヒドロゲルが組み込まれる組織、作用機序、または患者の利益を確保することを目的とした効果、および効果の持続時間に応じて、性質の範囲が変化し得る。

有利には、本発明による組成物の特性、特に本発明によるヒドロゲルの特性は、適応症に適合している。これらの特性を適応させるために、ポリマー（カルボキシアルキルキトサンおよび／またはヒアルロナン等の他の生体高分子）の最終濃度、および／または、特に架橋剤／ポリマーの質量比を介した架橋の割合、および／または性質および／またはイオンの量、および／またはポリマーの初期分子量は、たとえば、変化する。

具体的には、本発明は、特に皮膚、皮下または骨膜レベル（投影またはリモデリングのため）での持続的な体積の増加を確実にしなければならない場合の高弾性ヒドロゲル、または特に関節レベルでの衝撃吸収および潤滑効果の両方を可能にする粘弾性ゲルに関する。本発明は、特に２つの生物学的表面、たとえば関節の２つの軟骨表面、または眼の表面と眼瞼との間の摩擦を低減する必要がある場合の潤滑性ヒドロゲルに関する。本発明の組成物は、適応症に従って調整された可変の弾性レベルを有することができ、流量計によって弾性係数を測定することによって特徴付けることができる。

好ましくは、マトリックスは、フリーラジカルを除去することによる抗酸化能力、特に０．３０を超える、好ましくは０．５０を超える、さらにより好ましくは０．８０を超える、たとえば０．９０を超える正規化された抗酸化能力を有する。

本発明は、本発明に従って定義された少なくとも一つのマトリックスを含むことを特徴とする注射可能な組成物に関する。

本発明は、本発明に従って定義された少なくとも一つのマトリックスを含むことを特徴とする医薬組成物に関する。

一つの代替法によれば、本発明による組成物は、たとえば治療的治療方法における使用のために、注射可能、移植可能または点眼可能、または局所投与可能な医薬組成物、あるいは注射可能または移植可能または点眼可能、または局所投与可能な医療装置として使用され、たとえば、修復または充填を必要とする少なくとも一つの体組織の修復または充填のために、皮下、皮内、粘膜、眼、眼内、または関節内、骨内経路によって上記組成物を局所的に点眼または投与または注射することを含む。

一つの代替法によれば、本発明による組成物は、修復または充填を必要とする少なくとも一つの体液または組織の治療、修復または充填のための方法で使用され、たとえばその体組織は、声帯、筋肉、靭帯、腱、粘膜、性器、骨、関節、眼、皮膚、またはそれらの任意の組み合わせ、特に皮膚、軟骨、滑膜、皮膚の創傷、または眼の表面に属する組織から選択される。

本発明は、変形性関節症を治療するための方法または軟骨欠損を修復するための方法において、たとえば滑液等の体液への注射によって、または血液等の体液と混合した後に、および軟骨に移植した後に使用するための、本発明による組成物に関する。体液とは、その組成を改変する治療を受けているか受けていないかに関わらず、身体由来の液体を意味する。

本発明は、本発明に従って定義される組成物を含むか、またはそれからなることを特徴とする医療機器、たとえば医療用インプラントに関する。

本発明は、具体的には、特にリウマチ科、眼科、婦人科、美容医学、形成外科、開腹手術、整形外科、婦人科の治療を含む、治療的治療、外科治療、または美容治療における使用のための、術後の組織接着の予防、および皮膚科のための、本発明による組成物に関する。

本発明はまた、ドライアイ症候群、角膜損傷または眼または関節の炎症の治療的治療に使用するための本発明による組成物に関する。

本発明はさらに、特に眼の表面を潤滑する、または再生する目的で、角膜損傷またはドライアイ症候群を予防または闘うために眼の表面に点眼することによる本発明による組成物の投与に関する。

したがって、本発明はまた、本発明に従って定義されるカルボキシアルキルキトサンを含む点眼組成物に関する。

一つの代替法によれば、対象は、炎症性の病状（たとえば、変形性関節症、関節炎、ドライアイ症候群）に苦しんでいる。

本発明は、より具体的には、関節症、関節炎の治療、または軟骨欠損の修復のための、たとえば滑膜腔への注射または軟骨欠損への移植による本発明による組成物に関する。

本発明は、より具体的には、本発明による組成物を含むかまたはそれからなることを特徴とする医療機器、たとえば医療用インプラントに関する。

一つの好ましい代替法によれば、したがって、本発明は、乾燥形態、特に凍結乾燥形態の本発明による組成物を含むチャンバー、および任意選択で、一つまたは複数の活性製品（ａｃｔｉｖｅ ｐｒｏｄｕｃｔ）、添加剤または賦形剤を含む一つまたは複数の他のチャンバーを含む、医療装置に関する。

本発明による組成物はまた、所望の適応症のための一つまたは複数の活性剤、および／または本発明による組成物の特性を調節するための一つまたは複数の添加剤または賦形剤を含んでもよい。

本発明はまた、治療的治療方法で使用するための本発明による組成物に関する。

本発明はまた、関節症を治療するための方法または軟骨欠損を修復するための方法において、たとえば滑膜嚢等への注射によって、または血液等の体液と混合した後に、および軟骨／骨に移植した後に使用するための、本発明による組成物に関する。

本発明はまた、皮膚充填（「皮膚充填」）（ｄｅｒｍａｌ ｆｉｌｌｉｎｇ （”ｄｅｒｍａｌ ｆｉｌｌｉｎｇ”））または唇充填による美容処置（ａｅｓｔｈｅｔｉｃ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）またはケア方法において使用するための本発明による組成物に関する。これは、特に、たとえば、本発明による組成物を皮下、皮内、粘膜内または筋肉内に注射することを含む。

本発明はまた、当業者に周知の従来のメソセラピー法による、複数の皮内注射による皮膚または他の組織の表面治療のための方法において使用するための本発明による組成物に関する。そのような組成物は、通常、美容目的のための治療として、皮膚科で使用することができる。このような方法の目的は、たとえば、皮膚をふっくらさせて、しわのある外観を失わせることである（しわおよび／または小じわの治療）。そのような治療は、彼／彼女の皮膚に若返りの外観を与えたいと望む対象のために意図することができる。

本発明はまた、組成物が粘液補充剤である治療法で使用するための本発明による組成物に関する。ここで、たとえば、本発明の組成物は、特に関節の軟骨表面の摩擦を制限するために、関節内に注射される。

本発明はまた、一つまたは複数の細胞型、および／または一つまたは複数の活性剤の、細胞ベクターとして使用するための本発明による組成物に関する。これらは、製薬的または生物学的観点からの活性剤であってもよい。本発明の組成物は、実際に、細胞、好ましくは生細胞の存在と適合性であってもよい。対象となる生細胞の例は、軟骨細胞（関節軟骨）、線維軟骨細胞（半月板）、靭帯線維芽細胞（靭帯）、皮膚線維芽細胞（皮膚）、腱細胞（腱）、筋線維芽細胞（筋肉）、間葉系幹細胞、赤血球（血液）、およびケラチノサイト（皮膚）を含む。本発明の組成物はまた、少なくとも一つの治療薬の標的化および／または制御放出送達のための治療用ベクターとして標的化することができる。

一つの好ましい代替法によれば、血液、または血漿、または血小板溶解物、または多血小板血漿、または任意の体液が、たとえば、製品の性能を高めるために、本発明の組成物とともに添加される。

一つの代替法によれば、本発明による組成物は、固体形態（たとえば、フィルムまたは多孔質フォーム）で製剤化され、これは、移植されると（たとえば、涙液栓、包帯材（ｄｒｅｓｓｉｎｇ））膨潤／保湿する。

一つの代替法によれば、組成物は、噴霧可能な組成物（スプレー）の形態で製剤化される。

本発明はまた、熱傷の場合のように、過度の温度によって発症する一つまたは複数の組織または器官の治療または美容的ケアのための方法において使用するための本発明による組成物に関する。

本発明はまた、（たとえば、その再生を促進する目的で軟骨欠損に移植することによる）軟骨修復を治療するための方法において使用するための本発明による組成物に関する。

本発明はまた、手術後の組織癒着の予防的治療のための方法において使用するための本発明による組成物に関する： 製品は、手術の終わりに、たとえば、婦人科、腹部、内臓、整形外科等の組織に適用される。

本発明は、酸化ストレスに曝露された一つまたは複数の生体組織と接触するために、注射または移植によって局所的に投与される生理学的組成物に関し、たとえば以下である：
－変形性関節症の治療のための関節内注射（滑液補給、軟骨潤滑、関節レベルでの衝撃吸収、滑膜の再生を介して）；軟骨欠損の修復を促進するための関節内移植；
－骨修復を促進するための骨内移植（骨誘導／骨伝導）；
－脂肪萎縮症の場合に体積を増加させるための、皮膚または毛包を充填または再生するための皮下および／または皮内注射；
－眼表面の症状を緩和し、または変性を予防するための眼への点眼、たとえば、ドライアイおよび角膜病変の治療、および有効成分の投与；
－眼内注射、たとえば、緑内障手術または硝子体補充の有効性を最適化するため、白内障手術のアジュバントとして、前眼部または後眼部組織の再生のため、および有効成分の眼内投与；
－術後癒着を予防するための内部組織および器官への投与（フィルム）；
－修復または再生を促進する目的での皮膚、骨、軟骨、角膜、腱、半月板等の組織および臓器の創傷、ひび、裂傷、空洞への投与；
－外陰部痛の治療のための外陰粘膜への注射。

本発明はまた、人工滑液を形成する本発明による組成物に関する。

本発明による組成物は、たとえば、関節の摩擦を低減するためのその潤滑能力を改善すること、および／またはその衝撃吸収特性（弾性係数Ｇ’で識別可能）を追求することによって、健康な滑液を模倣すること、または健康なまたは欠陥のある滑液を改善することを可能にすると同時に、たとえば注射器に充填したり、ヒトまたは動物の体に注射したりするために、容易に注射することができる。指標として、健康な滑液の弾性率Ｇ’は４０～１００Ｐａの間であり、その損失弾性率Ｇ’’は１～１０Ｐａの間である。

有利には、関節内注射の場合、本発明による組成物は、室温で、細い針、たとえば、直径２１ゲージ径の針を通して容易に注射可能である。「容易な」注射とは、好ましくは、そのような注射器に加えられる力が、本発明による組成物を２１ゲージの針を通して流すために５０ニュートン（１０ｍｍ／分の速度で）未満であり、好ましくは、２０ニュートン未満の力であることを意味する。

有利には、皮内注射の場合、本発明による組成物は、室温で、細い針、たとえば、２５ゲージ以下の直径の針を通して容易に注射可能である。「容易な」注射とは、好ましくは、そのような注射器に加えられて空気中に放出される力が、本発明による組成物を２７ゲージの針を通して流すために３０ニュートン（１０ｍｍ／分の速度で）未満であり、好ましくは２０ニュートン未満の力であることを意味する。

本発明はまた、本発明によるカルボキシアルキルキトサンを含む人工涙液としての組成物に関する。

一般に、組成物の浸透圧およびｐＨ値の範囲が適合され、一般に、本発明による組成物と接触している組織の浸透圧およびｐＨ値に近い。

有利には、本発明による組成物は無菌である。非常に有利には、本発明による組成物は、好ましくはオートクレーブ下で、温度上昇によって滅菌される。

一つの実施形態によれば、本発明の実施例の試験によれば、マトリックスは、低摩擦係数（ＣＯＦ）、たとえば、２０未満、たとえば、１０未満の潤滑能力を有する。

一つの代替法によれば、本発明の組成物は透明または半透明である。

「半透明」とは、その組成物が観察者の目と物体の間に配置されたときに物体を区別できることを意味する。「透明」とは、観察者の目と観察された文字との間に組成物を配置したときに、英数字を区別できることが理解される。一般に、この評価は約１ｃｍの組成物の厚さで行われる。目視検査のための欧州薬局方の研究書２．９．２０の方法も採用することができる。組成物の光学密度はまた、たとえば、５００ｎｍでのＵＶ－可視分光法によって測定することができ、光学密度が、参照溶媒に対して０．５未満、好ましくは０．２未満であることを確認する。

一つの代替法によれば、本発明の組成物は、乳白色ではないか、またはわずかに乳白色である。

「乳白色」とは、たとえば、欧州薬局方の研究書２．９．２０等の方法による目視検査、および欧州薬局方の異なる乳白色レベルの参照溶液との比較によって、溶液が肉眼で可視の光の回折を引き起こすことを意味する。一つの代替法によれば、本発明の組成物は無色であり、すなわち、肉眼で観察する者は、組成物に特定の色を認めない。一つの代替法によれば、乳白光は、企図される用途に対して許容される最大値を下回っている。

本発明は、特に、特にヒドロゲルの形態で、本発明による組成物が事前に充填された一つまたは複数の点眼または注射装置を含む、好ましくは滅菌物品または包装に関する。これらは通常、ドロップ剤またはプレフィルドシリンジの形で製品を点眼するための装置である。

本発明の組成物は、有利には、好ましくはその適応症に適した物品または包装に、好ましくは数ヶ月間保管することができる。

有利には、本発明の組成物を滅菌することができる。したがって、本発明は、滅菌された架橋カルボキシアルキルキトサンに関する。したがって、架橋されたカルボキシアルキルキトサンは、特にそれを必要とする用途では無菌である。

一つの代替法によれば、本発明の組成物は、当業者に知られている方法および／または欧州薬局方によって推奨されている方法に従って、蒸気滅菌される。

別の代替法によれば、組成物は、この目的のために意図されたフィルター、たとえば、０．２μｍ以下の多孔度を有するフィルターを使用する濾過によって滅菌することができる。

有利には、好ましい実施形態によれば、蒸気滅菌時の架橋カルボキシアルキルキトサンの固有粘度の損失は４０％未満である。

本発明はまた、本発明による組成物を注射することを含む治療的治療のための方法をカバーする。

本発明はまた、医薬組成物の調製のための、特に治療的治療のための、たとえば本発明によってより具体的に定義されるような、本発明による組成物の使用をカバーする。

本発明はまた、本発明による組成物を注射することを含む、美容的、すなわち非治療的治療のための方法をカバーし、該治療は、たとえば、美容目的のための、たとえば事故または外科的処置の結果としての、しわの充填または一つまたは複数の損傷した可視組織ゾーンの充填である。

組織は、同じ起源の類似した細胞のグループであり、機能単位に集められている。つまり、それらはすべて同じ機能に寄与している。言及される組織の中には、皮膚組織（たとえば、上皮組織）、結合組織、筋肉組織、および神経組織からなっていてもよい。

「本発明による組成物」または同等の用語とは、代替の方法のいずれか、特定のまたは特定の（ｐａｒｔｉｃｕｌａｒ ｏｒ ｓｐｅｃｉｆｉｃ）実施形態、単独、またはそれらの任意の組み合わせによるものを含み、好ましい特性によるものを含む、本発明におけるように定義される組成物を意味する。

さらなる目的、本発明の特徴および利点は、説明の目的のみのために提供され、本発明の範囲を限定することを決して意図しない実施例を参照する例示的説明を読むことにより、当業者に明らかになるであろう。

実施例は、本発明の不可欠な部分であり、実施例を含む全体としての明細書から任意の先行技術に関して新規であると思われる任意の特徴は、その機能および一般性において本発明の不可欠な部分である。

したがって、各実施例には一般的な範囲がある。

一方、実施例では、特に明記しない限り、すべてのパーセンテージは質量で示され、温度は特に明記しない限り摂氏で表され、圧力は特に明記しない限り大気圧である。

ゼータ電位の測定方法
分析する製剤をリン酸緩衝液で希釈してポリマーの最終濃度を０．０５％にし、均質化するまで穏やかに撹拌する。次に、溶液を異なる画分に分離し、各画分のｐＨを、０．１Ｎ水酸化ナトリウムまたは０．１Ｎ塩酸のいずれかを添加することにより、ｐＨ４～８の間で所望の値に調整する。各核文のゼータ電位は、「Ｎａｎｏ－Ｚ」装置（Ｚｅｔａ－Ｓｉｚｅｒ ｒａｎｇｅ， Ｍａｌｖｅｒｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を使用して測定する。

キトサンポリマーの溶解度範囲を測定する方法
溶解度範囲は、１％の濃度およびｐＨ９で試験するポリマーの溶液を調製することによって確立され、９から１の範囲でｐＨが様々なｐＨ値に調整されたいくつかの画分に分割される。欧州薬局方の研究書２．９．２０の目視検査方法に従って、各画分について、ポリマーの溶解性、つまり、濁りを形成しないことを確認する。ポリマーが可溶性または不溶性であるｐＨ範囲が示されている。

流量計による生体力学的プロファイル
試料の生体力学的プロファイルは、ペルチェから７００μｍの間隔で配置された２０ｍｍの平面形状を備えたＤＨＲ－２ Ｈｙｄｒｉｄ Ｒｈｅｏｍｅｔｅｒ（ＴＡ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ）を使用して、３７℃の温度、３．９８ ｒａｄ／ｓの周波数、および０．１～１０％の範囲の変形振幅で特徴付けられる。各測定は３回行われ、３回の測定の弾性係数（Ｇ’）、粘度（Ｇ’’）、ｔａｎδ（Ｇ’’／Ｇ’）の平均値を計算する。

潤滑能力
潤滑能力は、２つの表面間の摩擦係数（ＣＯＦ）によって特徴付けられる。摩擦係数の測定は以下の方法で行うが、そのパラメータは目的の製品および適応症に応じて選択される。

－関節内補充薬のための方法
直径１６．１５ｍｍの疎水性眼内レンズ（特許ＥＰ１８３０８９８に記載）の製造に使用されるポリアクリレート生体材料に基づく２枚のディスクは、６０℃の水に約２時間浸漬することによって事前に水分補給され、その後、ＤＨＲ－２ ｒｈｅｏｍｅｔｅｒ （ＴＡ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）の上部と下部の配置（ｇｅｏｍｅｔｒｙ）に固定された。試験する試料の約１００μＬの容積を下部ディスクに配置し、次に上部配置を、両方のディスクが接触するまで、負担垂直抗力（ｉｍｐｏｓｅｄ ｎｏｒｍａｌ ｆｏｒｃｅ）５ニュートンまで下げる。摩擦係数の測定は、Ｗａｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．（ｉｎ： Ｊ ４７ Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ ３９， ７， １４７３， ２０１２）によって記述されたプロトコルから適合されたプロトコルに従って、２５℃で１５０秒間、一定の垂直抗力（５Ｎ）、１．２５６ ｒａｄ／ｓの振動周波数、および約０．０５ラジアンの変形角度で行われる。オプション「振動運動のゼロ開始点への粘着性」がアクティブになる。各測定点でトルク値が記録され、摩擦係数（ＣＯＦ）が次の式に従って計算される： ＣＯＦ＝トルク／（１／３×ディスク直径×垂直抗力）。各製剤について、測定は５回繰り返される。摩擦係数の値は、各ＣＯＦ対時間曲線（ＣＯＦ₀）の開始時の切片の外挿５によって報告される。

－人口涙液のための方法
直径１６．１５ｍｍの疎水性眼内レンズ（特許ＥＰ１８３０８９８に記載）の製造に使用されるポリアクリレート生体材料に基づく２枚のディスクは、６０℃の水に約２時間浸漬することによって事前に水分補給され、その後、ＤＨＲ－２ ｒｈｅｏｍｅｔｅｒ （ＴＡ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）の上部と下部の配置（ｇｅｏｍｅｔｒｙ）に固定された。試験する試料の約１００μＬの容積を下部ディスクに配置し、次に上部配置を、両方のディスクが接触するまで、負担垂直抗力（ｉｍｐｏｓｅｄ ｎｏｒｍａｌ ｆｏｒｃｅ）５ニュートンまで下げる。摩擦係数の測定は、Ｗａｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．（ｉｎ： Ｊ ４７ Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ ３９， ７， １４７３， ２０１２）によって記述されたプロトコルから適合されたプロトコルに従って、２５℃で１５０秒間、一定の垂直抗力（５Ｎ）、１．２５６ ｒａｄ／ｓの振動周波数、および約０．０５ラジアンの変形角度で行われる。オプション「振動運動のゼロ開始点への粘着性」がアクティブになる。各測定点でトルク値が記録され、摩擦係数（ＣＯＦ）が次の式に従って計算される： ＣＯＦ＝トルク／（１／３×ディスク直径×垂直抗力）。各製剤について、測定は５回繰り返される。摩擦係数の値は、各ＣＯＦ対時間曲線（ＣＯＦ₀）の開始時の切片の外挿によって報告される。

針による押出力
測定は、１００Ｎ圧縮セルを備えたＭｕｌｔｉＴｅｓｔ ２．５－ｉ圧縮テスター（Ｍｅｃｍｅｓｉｎ）を使用して行われる。適切な針が試料を含む注射器に適合される。注射器をテスターに配置し、注射器のプランジャーを一定の速度（たとえば、１０または８０ｍｍ／分）で押し、押出に必要な力を測定する。装置が許容する最大の力は約７０ニュートンである。

ｉｎ ｖｉｔｒｏ抗酸化能力（ＡＢＴＳ試験）
カルボキシアルキルキトサン製剤の抗酸化活性を測定し、市販の製品と比較するために、ｉｎ ｖｉｔｒｏの「ＡＢＴＳ」試験が適用される。この試験は、２，２’－アジノビス（３－エチルベンゾチアゾリン－６－スルホン酸）（ＡＢＴＳ・１）のカチオンラジカルを捕捉する物質の能力を決定することで構成される。この発色団の最大吸収は、カチオンラジカルの形で波長７３４ｎｍにある。プロトコルは、Ｖａｌｙｏｖａ ｅｔ ａｌ （Ｉｎｔ Ｊ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｒｅｓ Ｎａｔ Ｐｒｏｄ， ５， １９， ２０１２）によって記述された方法を採用し、吸光度測定用にＮｕｎｃｌｏｎ ９６タイプのポリスチレンマイクロプレート（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）およびＩｎｆｉｎｉｔｅ Ｍ２００マイクロプレートリーダー（Ｔｅｃａｎ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して行われる。

各一連の試験は４つの工程で行われる。

１） １ｇの２，２’－アジノビス（３－エチルベンゾチアゾリン－６－スルホン酸）二アンモニウム塩（ＡＢＴＳ）をＫ₂Ｓ₂０₈の均一溶液（ＭｉｌｌｉＱ水中２．４５ｍＭ）で希釈して、７ｍＭ ＡＢＴＳの濃度にする。この混合物は光から保護され、室温で２４時間撹拌される。これは、定義された量のＡＢＴＳ・１ラジカルカチオンを生成するのに必要な時間である。ＡＢＴＳ・１の希釈標準溶液は、後者の混合物６００μＬを取り、この量をＭｉｌｌｉＱ水で４１５μＭの濃度に希釈することによって最終的に得られる。

２） フリーラジカル除去能力の検量線は、参照抗酸化分子（６－ヒドロキシ－２，５，７，８－テトラメチルクロマン－２－カルボン酸）であるトロロクスとの比較によって確立される。３０、６０、９０、１２０、１５０、１８０、および２１０μＭの濃度のトロロクスの溶液は、５ｍＬの１００％メタノール中の１５ｍｇのトロロクスのストック溶液をＭｉｌｌｉＱ水で希釈することによって得られる。吸光度測定は、波長７３４ｎｍで５０μＬのＡＢＴＳ・１の作業溶液と５０μＬの各トロロクス溶液とを混合してから１時間後に行う。直線性ゾーン（ｌｉｎｅａｒｉｔｙ ｚｏｎｅ）における吸光度とトロロクス濃度の関係を読み取る。直線性ゾーンの最小吸光度値は、検出限界に相当する。

３） 試験される製品は、初期濃度でそのように特徴付けられるか、ＭｉｌｌｉＱ水で希釈される（ＡＢＴＳ・１溶液との混合物の吸光度が検出限界より高くなるように試験される製品に従って定義される）。５０μＬの基準希釈溶液と５０μＬの試験製品溶液を混合する。室温で１時間インキュベートした後、波長７３４ｎｍで吸光度を測定する。吸光度値が装置の検出範囲内にある場合、それは保持され、トロロクス均等物は、「トロロクス等価抗酸化能」のＴＥＡＣと記されている検量線を介して計算される。

４） 陽性対照は、０．０２ｍｇ／ｍＬ（２０μｇ／ｍＬ）の濃度の溶液中のアスコルビン酸（ビタミンＣ）で、あるシリーズから別のシリーズに正規化された方法で抗酸化能力を表すために使用される。まず、０．００５～０．０５ｍｇ／ｍＬのアスコルビン酸溶液のＴＥＡＣを測定する。０．０２ｍｇ／ｍＬアスコルビン酸溶液の吸光度が直線性ゾーンにあることを確認する。最後に、試験された製品の正規化された抗酸化能力は、ＴＥＡＣ（製品）／ＴＥＡＣ（０．０２ｍｇ／ｍＬのアスコルビン酸）の比率で表される。

実施例１
カルボキシメチルキトサンは、例として与えられた表１ａの反応パラメータを使用して、以下の方法に従って、カルボキシメチル化およびアセチル化反応を介して生成される。さらに、他の反応パラメータを使用して、カルボキシメチルキトサンの分子構造を調節することができる。
工程１：キトサンのカルボキシメチル化。
アガリクス・ビスポラス（Ａｇａｒｉｃｕｓ ｂｉｓｐｏｒｕｓ；白いマッシュルーム）由来のキトサン３０ｇを、６００ｍＬのイソプロパノール、４１ｍＬの水、および１６３ｍＬの５０％水酸化ナトリウム（ｍ／ｖ）に分散させる。１３５ｇのアルキル化剤モノクロロ酢酸（ＭＣＡ）を１３５ｍＬのイソプロパノールに溶解し、キトサン懸濁液に添加する。反応を３５℃で２３時間継続する。ポリマーをエタノールでの沈殿によって回収し、次に水への可溶化とエタノールでの沈殿のサイクルによって精製する。カルボキシメチルキトサン（参照ＣＣ４、表１ｂ）は、換気オーブンで乾燥した後に収集する。

工程２：カルボキシメチルキトサンのアセチル化。
２１ｇのＣＣ４を５７０ｍＬの水に分注し、溶液のｐＨをｐＨ＞７に調整する。１０ｍＬの無水酢酸を添加し、溶液を２５℃で３０分間撹拌する。溶液のｐＨをｐＨ＞７に調整し、次に１０ｍＬの酸無水物を添加する。均質化後（室温で約３０分間撹拌）、ｐＨを約ｐＨ７．５に調整する。ポリマーをエタノール中での沈殿によって回収し、次に水への可溶化サイクルおよび沈殿によって精製する。カルボキシメチルキトサン（参照ＣＣ３、表１ｂ）を、換気オーブンで乾燥させた後に収集する。

実施例２～１１のマトリックスを調製するために使用されるカルボキシメチルキトサンを表１ｂに記載する。ＣＣ１からＣＣ６は、真菌キトサンに由来するカルボキシメチルキトサンであり、上記の方法に従って調製される。
ＣＣ７は、Ｋｒａｅｂｅｒ Ｃｏｍｐａｎｙ（製品コード５３１３００９９００、Ｅｌｌｅｒｂｅｋ、ドイツ）によって提供されている市販の甲殻類由来のカルボキシメチルキトサンである。

実施例２－カルボキシメチルキトサンのマトリックス
架橋剤である１，４－ブタンジオールジグリシジルエーテル（ＣＡＳ ２４５－７９－８、ＢＤＤＥ）を使用した共有結合架橋により、カルボキシメチルキトサンのマトリックスを提供するための合成試験が行われた。実施例１の方法に従ってＫｉｏｍｅｄ Ｐｈａｒｍａによって製造されたアガリクス・ビスポラス（Ａｇａｒｉｃｕｓ ｂｉｓｐｏｒｕｓ；白いマッシュルーム）由来のいくつかのカルボキシメチルキトサンが使用される。それらの特性を表１に示す。ＢＤＤＥ（９６％、比重１．０４９）は、Ａｌｆａ Ａｅｓａｒ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｃｈｅｒ、カンデル、ドイツ）から提供されている。

実施例２ａ
反応パラメータを調整した後、架橋マトリックスをカルボキシメチルキトサンＣＣ３から調製する（表２ａ、参照Ｍ１－Ａ）。ＣＣ３のアセチル化度は５５％、カルボキシメチル化度は８７％で、炭素１３ ＮＭＲ（式２）で測定する。透析後、マトリックスによって形成されたヒドロゲルは３ｍＬガラスシリンジに移され、ＳＹＳＴＥＣ－ＤＸ－６５オートクレーブ（条件「Ａ２」）で短いサイクルで蒸気滅菌される。得られた滅菌ヒドロゲル（Ｍ１－Ａ）の最終ポリマー濃度は、物質収支によって決定される。ヒドロゲルの凝集特性は水試験によって分析され、その粘弾性レベル（１～４のスケールで）は流量計によって決定される。スコアが高いほど、ヒドロゲルを形成するマトリックスの粘弾性が高くなる。反応パラメータを適合させた後、水試験によれば、凝集性ヒドロゲルを形成するＢＤＤＥ架橋カルボキシアルキルキトサンのマトリックスを得ることが可能であると結論付けられる。ヒドロゲルの弾性スコアは１である。ヒドロゲルは、皮内針（２７Ｇ １３ｍｍ）から注射することができる。

次に、これらの同じ反応パラメータを、分子構造が異なり、アセチル化の程度が４０％未満の２つのカルボキシメチルキトサン（真菌由来のＣＣ４（Ｋｉｏｍｅｄ Ｐｈａｒｍａ）および甲殻類由来のＣＣ７（Ｋｒａｅｂｅｒ））を適用した。

それぞれマトリックスＭ１－Ａ、Ｍ１－Ｂ、およびＭ１－Ｃと同じ条件下で得られたマトリックス（表２ａ）は、水試験によると凝集性ヒドロゲルを形成しなかった。対照的に、マトリックスＭ１－Ａは、凝集性ヒドロゲルを形成することができ、したがって、本発明のこの目的を達成する。

実施例２ｂ
架橋されたカルボキシアルキルキトサンベースのヒドロゲルの生体力学的特性、特にそれらの粘弾性（０～４のスケールで測定）を調節する試みがなされている。このために、マトリックスは、カルボキシアルキルキトサンの分子量（固有粘度として表される）および架橋反応のパラメータを変化させることにより、ＤＡが４０％を超えるＣＣ１、ＣＣ５、およびＣＣ６から調製される（表１ｂ）。架橋剤（ＢＤＤＥ）、媒体、温度、反応時間は、マトリックスＭ１－Ａの場合と同じであり、中和および精製条件も同じである。

反応パラメータ（特に、カルボキシアルキルキトサンの初期濃度または架橋剤／カルボキシアルキルキトサン比、ここではＢＤＤＥ／カルボキシメチルキトサン比）ならびにカルボキシアルキルキトサンの分子量を変えることによって、架橋カルボキシアルキルキトサンベースのヒドロゲルの生体力学的特性、特に粘弾性を変えることができるようである。

実施例３－共架橋されたカルボキシメチルキトサンとヒアルロナンのマトリックス
真菌由来で４０％を超えるＤＡのカルボキシメチルキトサンの混合物（表１ｂ）およびヒアルロナンとＢＤＤＥの混合物を架橋することによってマトリックスを探索する（「共架橋」）。平均粘度分子量が２２０万または２３０万（ＨＡ１型）および４３０万（ＨＡ２型）のヒアルロナン（ＨＡ）を使用している（表３ａ）。

薬剤（ＢＤＤＥ）、媒体、温度および架橋反応の持続時間は、実施例２のマトリックスＭ１－Ａの場合、ならびに中和および精製条件と同じである。マトリックスによって形成されたヒドロゲルは、サイクルＡ１またはＡ２に従って、実施例２に記載されているようにオートクレーブによって滅菌される。他の組み合わせおよび／またはパラメータもまた凝集性ヒドロゲルをもたらす可能性があるため、いくつかのヒドロゲルが例示として記載されている。これらのヒドロゲルはすべて、サイズ２７ゲージ、長さ１３ｍｍの皮内針から容易に注入することができる。

実施例３ａ
カルボキシアルキルキトサン（ＣＣ）をヒアルロナン（ＨＡ）と共架橋して、凝集性ヒドロゲルを形成することができることを実証することが求められる。このために、ＣＣ／ＨＡの質量比が７５：２５のＣＣとＨＡとの混合物からマトリックスが調製される（表３ａ）。ＣＣの参照は、前の実施例に準拠している。さらに、架橋反応のパラメータを調整することにより、弾性レベルを１～３（０～４のスケールで）に調整することが求められる。

同じＢＤＤＥ／ポリマー比（１８％）および２３ｍｇ／ｍＬの同じ最終ポリマー濃度で、２５％ＨＡと共架橋されたＣＣのヒドロゲルＭ２－Ｂは、実施例２のＣＣ単独のヒドロゲルＭ１－Ａよりも弾性が高いことが観察される。また、ＨＡの分子量、ここではＢＤＤＥである架橋剤の割合を変えることにより、共架橋されたカルボキシアルキルキトサンおよびＨＡのヒドロゲルの粘弾性特性を変えることも可能であると結論付けられる。

実施例３ｂ
様々な比率で共架橋されたカルボキシアルキルキトサンとＨＡから凝集性ヒドロゲルを得ることが求められている。

共架橋されたカルボキシアルキルキトサンとＨＡの凝集性ヒドロゲルを様々な比率で得ることが可能であり、それらの弾性レベルはカルボキシアルキルキトサン／ＨＡ比に依存するようである。

実施例４－ヒアルロナンと組み合わせた架橋カルボキシメチルキトサンのマトリックス
この実施例では、ＨＡと組み合わせた架橋カルボキシアルキルキトサンのマトリックスから凝集性ヒドロゲルを形成する可能性を評価することが求められている。カルボキシアルキルキトサンは、最初に実施例１の方法に従ってＢＤＤＥと架橋され、次にＨＡの溶液（ＨＡ１型）がそれに添加される。得られたヒドロゲルは、サイクルＡ２を介してオートクレーブ滅菌される（表４）。

架橋カルボキシアルキルキトサンマトリックスに基づくヒドロゲルにＨＡを組み込むのは簡単である。得られたヒドロゲルは、水試験によると凝集性があり、粘弾性スコアは３であるが、２７ゲージの皮内針から容易に注入することができる。

実施例５－ヒドロゲルの生体力学的特性
この実施例では、実施例２から４までのいくつかの代表的なＣＣヒドロゲルの生体力学的特性は、流量計によって特徴付けられる（表５）。ヒドロゲルは凝集性があり、２７Ｇ針を介して注入可能で、弾性レベルは１～３である。これらは、美容目的のための皮内注射を目的とした３つの市販の架橋ヒアルロナンベースの製品と比較される（表５、参照Ｂ１～Ｂ３）。水試験によると、Ｂ１は粘性溶液（ｔａｎ ｄｅｌｔａ＞１）であり、Ｂ２およびＢ３は凝集性ゲル（ｔａｎ ｄｅｌｔａ＜１）である。

本発明による架橋カルボキシアルキルキトサンベースのヒドロゲルは、美容医学のための皮内注射を目的とした市販の架橋ＨＡベースの製品に匹敵する生体力学的特性、特に弾性係数（Ｇ’）を有することが確認されている。

実施例６－ＡＢＴＳ°１フリーラジカルを除去する能力（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）
架橋カルボキシアルキルキトサン（ＣＣ）のマトリックスが、フリーラジカルＡＢＴＳ°１が形成され、抗酸化物質「トロロクス」を用いて較正が行われる「ＡＢＴＳ」として知られる標準的なｉｎ ｖｉｔｒｏ試験を使用して、酸化的フリーラジカルを除去することができることを確認することが求められる。各試験製品を希釈して、８ｍｇ／ｍＬ、４ｍｇ／ｍＬ、および１ｍｇ／ミルクのポリマーＣｐ（ＣＣ、ＨＡ、またはＣＣおよびＨＡ）の総濃度を取得する。結果は、試験の検出ゾーン内にあることを保証するために確認され、フリーラジカルＡＢＴＳ°１を除去する能力がトロロクス均等物で表される。２０μｇ／ｍＬアスコルビン酸溶液（陽性対照）の抗酸化能も測定される。試験した各製品の抗酸化能は、次の式に従って正規化されている。正規化された抗酸化能＝ＴＥＡＣ（製品）／ＴＥＡＣ（アスコルビン酸２０μｇ／ｍＬ）。

比較のために、溶液中の非架橋カルボキシアルキルキトサンポリマー（ＣＣ２）、および非架橋ＨＡ溶液ベースの市販製品（参照Ｂ６）を試験する。美容目的のための皮内注射を目的とした４つの市販製品も特徴づけられる： 参照Ｂ１～Ｂ３（架橋ＨＡのみをベースとする、実施例５の表５を参照）、およびＢ４、抗酸化分子を含むいくつかの小分子の複合体と組み合わせた架橋ＨＡをベースとするヒドロゲル。

表６は、すべての製品について４ｍｇ／ｍＬの同じ総ポリマー濃度（Ｃｐ）で得られた結果を示している。

すべてのＣＣベースの組成物は、フリーラジカルＡＢＴＳ°１を顕著に除去できるため、非架橋ＣＣ溶液（Ｓ１）または架橋ＣＣヒドロゲル（Ｍ１－ＥおよびＭ２－Ａ）であっても抗酸化物質として機能する。同じ濃度のポリマーでは、市販のＨＡのみの製品（Ｂ６、Ｂ１、Ｂ２、およびＢ３）はこの能力を発揮しない。

驚くべきことに、ヒドロゲルＭ１－Ｅ（ＣＣ）およびＭ２－Ａ（ＣＣ／ＨＡ ７５：２５）は、非架橋ＣＣの溶液Ｓ１と比較して、試験したすべての製品の中で最も高い抗酸化能力を示している。両方のヒドロゲルは、２０μｇ／ミルクでアスコルビン酸と同様の抗酸化能力を有する。

市販のＨＡベースの製品の中で、ラジカルＡＢＴＳ°１を大幅に除去できるのはＢ４だけであるが、能力はＭ１－ＥおよびＭ２－Ａの２分の１である。実際、Ｂ４は、観察された効果の原因となる、抗酸化剤を含むいくつかの小分子の複合体に関連する架橋ヒアルロナンである。しかし、これらの物質は水溶性の小分子であるため、皮内注射後にＢ４ヒドロゲルから急速に拡散し、ヒドロゲルの抗酸化能力が失われる可能性がある。

実施例７－ ｉｎ ｖｉｔｒｏにおける皮膚細胞培養における酸化ストレスを低減するヒドロゲルの能力
架橋ＣＣ（参照Ｍ１－Ｅ、実施例２を参照）および共架橋ＣＣ／ＨＡ（Ｍ２－Ａ、実施例３を参照）に基づく２つのヒドロゲルの、酸化ストレス下の皮膚組織で遭遇するラジカル種である「ＲＯＳ」（活性酸素）フリーラジカルによって引き起こされる損傷からヒト皮膚細胞を保護する能力は、標準的なｉｎ ｖｉｔｒｏ試験で評価される。これは、非架橋カルボキシアルキルキトサン溶液および美容目的のための皮内注射を目的とした架橋ヒアルロン酸に基づく市販製品の溶液と比較される（参照Ｂ３、実施例５を参照）。

ヒト皮膚線維芽細胞（ＮＨＤＦ）は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ増殖能の約４０％で、１０％ウシ胎児血清、ペニシリン、ストレプトマイシンを含むＤＭＥＭ（ダルベッコ改変イーグル培地）の単層で、３７℃、５％ＣＯ２雰囲気中で培養される。培養物を、ウシ胎児血清を含まないＤＭＥＭに移し、ウェルに分画する。試験する製品をＤＭＥＭで希釈してポリマーの総濃度を０．６ｍｇ／ｍＬおよび０．２ｍｇ／ｍＬにし、ウェルに添加する（試験する製品ごとに３つのウェル）。試験する製品と７２時間接触させた後、フリーラジカルの影響下で蛍光を発する２’－７’－ジクロロジヒドロフルオレセインジアセテートプローブを３０分間添加する。次に、各ウェルの培養物をＨＢＳＳでリンスして試験する製品を除去し、細胞をＨＢＳＳに戻し、すべてのウェルに１２．５Ｊ／ｃｍ²のＵＶＡを２０分間照射して、ＲＯＳを生成する。

未処理の照射されていない培養物を参照として使用する。未処理および照射された培養物を陰性対照として使用し、アスコルビン酸処理（５０４／ｍＬ）および照射された培養物を陽性対照として使用する。ＵＶＡ照射の最後に、ＲＯＳ含有量に比例する蛍光強度（励起波長４８５ｎｍ、発光５２０ｎｍ）が測定され、次に照射されていない参照に対する相対ＲＯＳ含有量が計算される（表７）。次に、酸化ストレスを低減する製品の能力を特徴付ける、未処理および照射された対照と比較したＲＯＳ含有量の低減が計算される。

この試験のｉｎ ｖｉｔｒｏ培養条件下で、ＣＣベースの組成物は、架橋（Ｍ１－Ｅ）または非架橋（Ｓ２）のいずれであっても、ＲＯＳ含有量を低減する、すなわち細胞や皮膚組織を変化させる可能性のある酸化ストレスを低減する優れた能力を有すると結論付けられる。この能力はアスコルビン酸（５０４／ｍＬ、ビタミンＣ）と同じレベルであり、市販の架橋ＨＡ製品よりもはるかに高くなっている。ＣＣが７５％であるため、共架橋されたＣＣ／ＨＡの組成物Ｍ２－Ａは、酸化ストレスを低減する優れた能力も備えている。

実施例８－眼投与用のカルボキシアルキルキトサンマトリックスベースの液体ヒドロゲル
この実施例では、眼表面の治療のための人工涙液の適応症に適した優れた潤滑能力を有しながら、粘度のおかげで明確な液滴の形で容易に注入できる架橋ＣＣヒドロゲルを得ることが求められる。

このために、凝集性架橋ＣＣヒドロゲルは、１～６０ｍＰａ．ｓの範囲の動的粘度（１０ｓ－１のせん断速度で）を標的にすることによって調製される（Ｍ８－Ｂ、表８ａ）。その点滴性（ｉｎｓｔｉｌｌａｂｉｌｉｔｙ）を検証し、摩擦係数として表される人工涙液の方法に従って、２つのポリアクリレート表面間の潤滑能力を測定する。

このヒドロゲルの特性は、眼表面の治療を目的とした非架橋ＨＡベースの２つの市販製品の特性と比較される（参照Ｂ７およびＢ８、表８ｂ）。それらの潤滑能力は、Ｍ８－Ｂと同じ一連の試験で測定される。

眼表面の治療用の市販製品に匹敵する潤滑能力を備えた、凝集性、流動性、および点滴可能な架橋ＣＣヒドロゲルが得られると結論付けられる。

実施例９－ウサギの皮内移植後の局所効果（短期）
３つのＣＣマトリックスベースのヒドロゲルがウサギの皮内投与によって評価される： Ｍ１－Ａ（架橋ＣＣ、実施例１を参照）、Ｍ２－ＡおよびＭ２－Ｂ（共架橋ＣＣ／ＨＡ、実施例２を参照）。これらの製剤は、１ｍＬのガラス製注射器（Ｈｙｐａｋ、ＢＤ Ｍｅｄｉｃａｌ）に放送され、滅菌されている。研究書ＥＰ２．６．１４－欧州薬局方の方法Ｄに従って測定されたそれらのエンドトキシン含有量は良好である。美容目的のための皮内注射を目的とした架橋ヒアルロン酸ベースの２つの市販製品も評価される（Ｂ１およびＢ２、実施例５を参照）。

２００μＬの製剤量は、皮内インプラントによって誘発される一次刺激の評価のためのＩＳ０１０９９３－１０基準を満たすプロトコルに従って、２７ゲージ径の針を介してウサギに皮内注射することによって投与される。製品ごとに合計１２回の注射が６匹のウサギに行われた。局所効果は、すべての注射部位、特に紅斑レベルで毎日観察された。

表９は、注射後７日での紅斑の平均レベルを報告している（０～４までのスケールのスコア）。丘疹が７日目に見えるかどうかにも着目している（０～４までのスケールのスコア）。注射後７日目に安楽死させた動物の注射部位の肉眼的分析または顕微鏡的分析（皮膚組織学）を使用して、製品の存在を評価する。

ヒドロゲルの皮内注射は、０～４のスケールで、７日間で平均１の最大スコアを有する紅斑を特徴とする軽度の局所効果の出現と関連している。これは、２つの市販製品で観察されたものに匹敵する軽度の紅斑レベルに相当する。さらに、動物を安楽死させ、７日目に組織学的分析を行ったときに、真皮に製品が存在することが実証された。

実施例１０－関節の粘液補充用のヒドロゲル
この実施例では、架橋ＣＣ（Ｍ１－Ｅ）および共架橋ＣＣ／ＨＡ（Ｍ２－Ｂ）ベースの２つのヒドロゲルの粘弾性特性および潤滑能力を評価し、関節の関節内補充薬による変形性関節症の治療を目的とする、架橋ＨＡベースの２つの市販製品と比較した（Ｂ９およびＢ１０、表１０の組成物を参照）。ヒドロゲルの潤滑特性は、関節内補充薬の方法に従って、流量計に取り付けられた２つのポリアクリレートポリマーディスク間の摩擦係数を低減する能力によって決定される。

架橋されたＣＣおよび共架橋されたＣＣ／ＨＡヒドロゲルの両方が、Ｂ９と同じ範囲の弾性係数Ｇ’を有し、一方、Ｂ１０は、より高い弾性係数を有することが観察される。ＣＣおよびＣＣ／ＨＡヒドロゲルの両方が、架橋ＨＡ関節内補充薬Ｂ１０の摩擦係数に匹敵し、架橋ＨＡ関節内補充薬Ｂ１１の摩擦係数よりも優れている、２つの表面間の摩擦係数が低いことを特徴とする有意な潤滑能力を示すことが観察される。

実施例１１から１４において、使用されるポリマーＣＣおよびＨＡは、表１１ａおよび１１ｂに記載されているものである。

実施例１１－アセチル化度が４０％未満のＣＣおよびＨＡを共架橋する試験
ＤＡが４０％未満のＣＣ（ＣＣ８、表１１ａ）とＨＡ１型のＨＡ（表１１ｂ）から、実施例３の表３ａｔｐ同じ条件を使用して、ＣＣおよびＨＡを架橋することにより、凝集性ヒドロゲルが得られるかどうかを検証することが求められている。条件および得られた製剤の特性を表１１ｃ（参照Ｍ２－Ｉ）に示し、（本発明による）実施例３の参照ヒドロゲルＭ２－Ａのものと比較した。

ＣＣ８では、デルタタンジェント値（流量計で測定されたｔａｎ ｄｅｌｔａ。実際、Ｍ２－Ｉ製剤は１．６のｔａｎ ｄｅｌｔａ値を含む。これは１より高く、ゲルではなく粘性溶液の挙動を示す。逆に、ヒドロゲルＭ２－Ａのｔａｎ ｄｅｌｔａ値は０．４であり、１未満であり、本発明による、ゲルの挙動を示す。

実施例１２－ボリュームの回復または大きな皮膚のくぼみの充填のためのヒドロゲル
この実施例は、顔のボリュームの回復のための、または皮下注射を介したまたは真皮の深層への大きな皮膚のくぼみの充填のための架橋ＣＣベースのヒドロゲルの使用を例示している。これらの２つの適応症では、レベル４の粘弾性ヒドロゲルが求められる。これは、弾性係数Ｇ’が約１５０Ｐａを超え、水試験によると凝集性があり、２７ゲージ径、長さ１３ｍｍの針で容易に注入することができる。これらの適応症では、弾性レベル４の架橋ヒアルロナンベースの凝集性ヒドロゲルである２つの市販製品Ｂ１１およびＢ１２（表１２）が参照として使用される。

ヒドロゲルＭ２－Ｊは、ＣＣ５およびＨＡのタイプＨＡ１（ＣＣ／ＨＡ比 ２５：７５）を１３％ＢＤＤＥで、室温で一晩架橋することによって得られる。それは、意図された適応症に対する期待と一致して、凝集性を維持し、容易に注入できる一方で、所望の弾性レベル４に対応する２９５Ｐａの弾性係数を有する（表１２）。

実施例１３－共架橋されたＣＣ／ＨＡヒドロゲルを１ヶ月間皮内注射した後のボリューム維持
ヒドロゲルは、実施例１２の反応条件に従って、ＣＣ／ＨＡ質量比が４０：６０で、ＣＣ９（表１１ａを参照）およびＨＡ２を共架橋することによって調製される。得られたヒドロゲル（参照Ｍ２－Ｋ）は１ｍＬのガラス注射器（Ｈｙｐａｋ、ＢＤ Ｍｅｄｉｃａｌ）にパッケージ化し、実施例９と同じ方法で滅菌した。ポリマーの最終濃度は２３ｍｇ／ｍＬであり、凝集性であり、２７Ｇ針を介して注射可能であり、粘弾性レベルは３である。

実施例９と同様のプロトコルに従って、同量のヒドロゲルＭ２－Ｋおよび市販製品Ｂ１２（表１２を参照、粘弾性レベル４）を、２７ゲージの針を介してウサギに皮内注射する。一定の間隔でかつ注射後２６日間、局所反応を評価し、注射された製品によって形成され、皮膚の表面に見える丘疹の体積を、以下のスケールでスコアを割り当てることによって推定する。丘疹の体積は、製品の存在、ならびに皮膚組織の体積を局所的に増加させるその能力を示す。

両方の製品の注射は、フォローアップ期間中に有意な局所反応を誘発しない。注射直後に、（評価された２０の注射部位のうち）両方の製品の平均体積スコアが３±０の丘疹が形成される。その後の数日間で、丘疹はわずかに消散するが、実際には存在したままである。注射後２６日で、丘疹はまだ存在しており、平均スコアの量はＭ２－Ｌで２．０±０．０、Ｂ１２で２．４±０．５（評価された２０部位）であり、相対的な弾性レベルと一致している。ヒドロゲルＭ２－ＫおよびＢ１２によって提供される体積スコアの違いは、この時点では重要ではない。

したがって、ヒドロゲルＭ２－Ｋは実際に真皮に存在し続け、ウサギの皮内注射後少なくとも２６日間、皮膚のくぼみを埋める適応症として予想されるように、注射部位の周囲に有意なボリューム効果を維持することが確立されている。

実施例１４－共架橋されたＣＣ／ＨＡヒドロゲルの保存
共架橋されたＣＣ／ＨＡヒドロゲルを保存する可能性は、４０℃のオーブンで加速劣化条件に置き、その生体力学的特性の経過をモニタリングすることによって評価される。ヒドロゲルは、水試験によると凝集性があり、容易に注入できる限り、生体力学的観点から許容されると見なされ、ゲルのような挙動（ｔａｎ ｄｅｌｔａ値が１未満）を含み、粘弾性レベルがｔ０での初期レベルであり、意図した適応症と一致している。

粘弾性レベル２を得ることを目的として、参照ヒドロゲルＭ２－Ｌは、ＣＣ９（表１１ａを参照）およびＨＡ２をＣＣ／ＨＡ比７０：３０で共架橋することにより、実施例１２の反応条件に従って調製される。これは、１ｍＬのガラス製注射器（Ｈｙｐａｋ、ＢＤ Ｍｅｄｉｃａｌ）にパッケージされ、実施例９と同じ方法で滅菌された製品である。注射器は４０℃のオーブンに６ヶ月間配置される。３ヶ月の保管期間で測定された特性を表１３に示す。

４０℃での加速劣化条件下で３ヶ月後、製品Ｍ２－Ｌはヒドロゲルのままであり（ｔａｎ ｄｅｌｔａ＜１であるため）、その凝集性、注入の容易さ、および粘弾性レベル２が維持されている。したがって、外挿により、この共架橋されたＣＣ／ＨＡヒドロゲルは、室温で少なくとも１２ヶ月間、意図された適応症に対して許容される特性を維持するはずであると推定される。

Claims (24)

1. グルコサミン単位、Ｎ－アセチルグルコサミン単位、およびカルボキシアルキル基置換グルコサミン単位を有する少なくとも一つのカルボキシアルキルキトサンを含み、該カルボキシアルキルキトサンは、総グルコサミン単位のモル数に対するＮ－アセチル基のモル数として表され、４０％より大きく最大８０％の範囲のアセチル化度を有し、該カルボキシアルキルキトサンは、カルボキシアルキルキトサン鎖間の共有結合によって架橋されている、マトリックス。
2. 前記カルボキシアルキルキトサンは、総単位（total unit）のモル数に対する置換基のモル数として表され、２０％を超える、たとえば、５０％を超える、たとえば、２００％未満のカルボキシアルキル基との置換度を有することを特徴とする、請求項１に記載のマトリックス。
3. 前記キトサンは、子嚢菌型の真菌、特にアスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｐｉｇｅｒ）、および／または担子菌真菌（Ｂａｓｉｄｉｏｍｙｃｅｔｅ ｆｕｎｇｕｓ）、特にレンティヌラ・エドデス（Ｌｅｎｔｉｎｕｌａ ｅｄｏｄｅｓ；シイタケ）および／またはアガリクス・ビスポラス（Ａｇａｒｉｃｕｓ ｂｉｓｐｏｒｕｓ；白いマッシュルーム）由来であることを特徴とする、請求項１または２に記載のマトリックス。
4. 前記カルボキシアルキルキトサンは、再アセチル化されることを特徴とする、請求項１～３のいずれか一項に記載のマトリックス。
5. 前記マトリックスは、無菌であることを特徴とする、請求項１～４のいずれか一項に記載のマトリックス。
6. 前記マトリックスは、凝集性ヒドロゲルを形成することを特徴とする、請求項１～５のいずれか一項に記載のマトリックス。
7. 前記マトリックスは、少なくとも一つのヒアルロナンを含むことを特徴とする、請求項１～６のいずれか一項に記載のマトリックス。
8. 前記マトリックスは、発酵によって得られた少なくとも一つのヒアルロナンを含むことを特徴とする、請求項１～７のいずれか一項に記載のマトリックス。
9. 前記マトリックスは、共有結合によって架橋された少なくとも一つのヒアルロナンを含むことを特徴とする、請求項１～８のいずれか一項に記載のマトリックス。
10. 前記マトリックスは、カルボキシアルキルキトサンとの共有結合によって共架橋された少なくとも一つのヒアルロナンを含むことを特徴とする、請求項１～９のいずれか一項に記載のマトリックス。
11. 前記架橋は、前記共有結合を形成する架橋剤によって形成されることを特徴とする、請求項１～１０のいずれか一項に記載のマトリックス。
12. 多糖を架橋するために使用される架橋剤、たとえば１，４ブタンジオールジグリシジルエーテル、１－ブロモ－３，４－エポキシブタン、１－ブロモ－４，５－エポキシペンタン、１－クロロ－２，３－エピチオプロパン、１－ブロモ－２，３－エピチオプロパン、１－ブロモ－３，４－エピチオブタン、１－ブロモ－４，５－エピチオペンタン、２，３－ジブロモプロパノール、２，４－ジブロモブタノール、２，５－ジブロモペンタノール、２，３－ジブロモプロパンチオール、２，４－ジブロモブタンチオール、および２，５－ジブロモペンタンチオールエピクロロヒドリン、２，３－ジブロモプロパノ１，１－クロロ－２，３－エピチオプロパン、ジメチルアミノプロピルカルボジイミド、没食子酸、エピガロカテキンガレート、クルクミン、タンニン酸、ゲニピン、またはヘキサメチレンジイソシアネートまたはトルエンジイソシアネート等のジイソシアネート化合物、またはジビニルスルホンから前記架橋剤が選択されることを特徴とする、請求項１１に記載のマトリックス。
13. ヒドロゲルを形成することを特徴とする、請求項１～１２のいずれか一項に記載のマトリックス。
14. 凝集性ヒドロゲルを形成することを特徴とする、請求項１～１３のいずれか一項に記載のマトリックス。
15. 前記マトリックスは、フリーラジカルを捕捉することによる抗酸化能力、特に０．３０を超える、好ましくは０．５０を超える、さらにより好ましくは０．８０を超える、たとえば、０．９０を超える、正規化された抗酸化能力を有することを特徴とする、請求項１～１４のいずれか一項に記載のマトリックス。
16. 請求項１～１５のいずれか一項に従って定義される少なくとも一つのマトリックスを含むことを特徴とする組成物。
17. 請求項１～１５のいずれか一項に従って定義された少なくとも一つのマトリックスを含むことを特徴とする、注射可能な組成物。
18. 請求項１～１５のいずれか一項に従って定義される少なくとも一つのマトリックスを含むことを特徴とする、医薬組成物。
19. 前記組成物は、注射可能、移植可能または点眼可能（instillable）、または局所投与可能な医薬組成物、または注射可能または移植可能または点眼可能、または局所投与可能な医療機器として、たとえば、前記組成物の皮下、皮内、粘膜、眼、眼内、または関節内経路による局所点眼（topical instillation）または投与または注射を含む、治療的治療方法で使用するために、たとえば、修復または充填が必要な少なくとも一つの体組織の修復または充填用に、使用されることを特徴とする、請求項１７または１８に記載の組成物。
20. 修復または充填を必要とする少なくとも一つの体組織の治療、修復または充填のための方法において使用され、たとえば、その体組織が声帯、筋肉、靭帯、腱、粘膜、性器、骨、関節、眼、皮膚、またはそれらの任意の組み合わせ、特に皮膚、軟骨、滑膜、皮膚の創傷、または眼の表面に属する組織から選択されることを特徴とする、請求項１９に記載の組成物。
21. 変形性関節症を治療するための方法または軟骨欠損を修復するための方法において、たとえば滑液等の体液への注射によって、または血液等の体液と混合した後に、および軟骨に移植した後に使用するための、請求項１７または１８に記載の方法。
22. 請求項１６～２１のいずれか一項に記載の組成物を含むか、またはそれからなることを特徴とする、医療機器、たとえば医療用インプラント。
23. 請求項１～１５のいずれか一項に記載のマトリックスを調製するためのプロセスであって、該プロセスは、
    前記カルボキシアルキルキトサンを少なくとも一つの架橋剤と接触させ、接触させることは、好ましくはアルカリ相で行われる工程；
    前記カルボキシアルキルキトサンを前記架橋剤で架橋する工程；
    架橋された前記カルボキシアルキルキトサンを含むマトリックスを得る工程
    を含む、プロセス。
24. 別の生体高分子、および好ましくはヒアルロナンと共架橋された、好ましくは請求項１～１５のいずれか一項に記載のカルボキシアルキルキトサンを含むマトリックスを調製するためのプロセス、であって、該プロセスは、
    カルボキシアルキルおよび他の生体高分子の混合物、および好ましくはヒアルロナンを、少なくとも一つの架橋剤と接触させ、接触させることは、好ましくはアルカリ相で行われる工程；
    前記カルボキシアルキルキトサンおよび他の生体高分子、および好ましくはヒアルロナンを、前記架橋剤で架橋する工程；
    共架橋されたカルボキシアルキルキトサンおよび他の生体高分子、および好ましくはヒアルロナンのマトリックスを得る工程
    を含む、プロセス。