BR112020010205A2 - carboxialquil chitosan, composição, composição injetável, composição farmacêutica, dispositivo médico e método de preparação de composição - Google Patents
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Abstract
A presente invenção refere-se a carboxialquil chitosan que possui potencial zeta, medido sob pH 7,5, que é menor ou igual a -10 mV, composições que o compreendem, método de sua fabricação e várias de suas aplicações, particularmente no campo de terapia, reumatologia, oftalmologia, medicina estética, cirurgia plástica, cirurgia interna, dermatologia ou cosmética.
Description
[001] A presente invenção refere-se a carboxialquil chitosan, composições que o compreendem, método de sua fabricação e várias de suas aplicações, particularmente no campo de terapia, reumatologia, oftalmologia, medicina estética, cirurgia plástica, cirurgia interna, dermatologia ou cosmética.
[002] Derivados de chitosan já são conhecidos e particularmente descritos nos pedidos de patente da Kiomed Pharma publicados com os números WO 2016/016463 e WO 2016/016464 e nas patentes correspondentes. Estes pedidos de patente concentram-se nas propriedades físicas, químicas ou físico-químicas de derivados de chitosan. Permanece, entretanto, a necessidade de aprimoramento dessas composições, particularmente no contexto de tratamento terapêutico, de forma a fornecer aos pacientes que venham a necessitar do uso dessas composições benefício terapêutico otimizado, particularmente para aumentar a relação risco-benefício.
[003] É possível obter chitosan solúvel aumentando-se o grau de acetilação (DA) por meio da reacetilação de chitosan fúngico. De fato, é possível obter formulações solúveis sob pH fisiológico por meio de reacetilação de chitosan fúngico, mas observa-se o seguinte: - degradação muito rápida in vivo ou sob condições similares; - surgimento de reação imunológica do paciente no qual esse chitosan é injetado ou implantado, por exemplo, por meio de injeção ou implante intra-articular; e - o chitosan não é apropriado para as aplicações desejadas e, portanto, não permite uso terapêutico suficientemente satisfatório de chitosan, particularmente por meio de injeção ou implante intra-articular.
[004] Existem diversas publicações referentes à carboxialquilação de chitosan e, particularmente, à carboximetilação de chitosan, essencialmente com o propósito de solubilização de chitosan.
Teoricamente, chitosan possui fórmula sem uma unidade de N- acetilglicosamina, mas, na prática, o chitosan é derivado de chitina que, por sua vez, compreende unidades de N-acetilglicosamina e o chitosan possui um certo grau de acetilação (DA), que é a proporção de unidades de N- acetilglicosamina no chitosan. O DA de chitosan é geralmente baixo. Acima disso, especialmente acima de 30%, trata-se geralmente de chitosan reacetilado.
[005] Além disso, o pedido de patente chinês CN1431229A refere-se a derivados de chitosan carboximetilados com relação à sua capacidade de hidratação, mas é limitado a essa característica.
[006] A carboximetilação de chitina derivada de fontes animais, particularmente com origem em crustáceos, também foi idealizada no estado da técnica. Chitina com origem em crustáceos, entretanto, é de difícil substituição; particularmente, é necessário congelá-la e alcanilizá-la, a fim de poder substituí-la (vide, por exemplo, o pedido de patente chinês CN 106474569). O processo é de difícil implementação, particularmente industrialização. Por outro lado, esse processo de substituição baseado em chitina com origem em crustáceos é caro em termos de energia, possui baixa capacidade de reprodução e é propenso a degradar o polímero e hidrolisar significativamente os grupos acetila das unidades N-acetilglicosamina e de difícil controle.
[007] O objeto da presente invenção é de solucionar o problema técnico de fornecimento de derivados de chitosan apropriados para uso em seres humanos ou animais, particularmente no campo de terapia, reumatologia, oftalmologia, medicina estética, cirurgia plástica, cirurgia interna, dermatologia ou cosmética.
[008] Mais especificamente, o objeto da presente invenção é o de solucionar o problema técnico de fornecer um derivado de chitosan apropriado para uso em seres humanos ou animais no campo terapêutico, particularmente útil como viscossuplemento e, particularmente, que possa ser injetado ou misturado com fluido sinovial.
[009] O objeto da presente invenção é especialmente o de solucionar o problema técnico de fornecimento de fluido sinovial reconstituído, ou seja, uma composição que restaure as propriedades da articulação, por exemplo, fornecendo a capacidade de lubrificar as superfícies de cartilagem.
[0010] Outro objeto da presente invenção é o de solucionar o problema técnico de fornecimento de um derivado de chitosan ou uma composição que o compreende, que exiba boas propriedades e compatibilidade em mistura com fluido sinovial, particularmente fluido sinovial de seres humanos ou animais, por exemplo, a fim de tratar patologia articular ou deterioração do fluido sinovial em questão.
[0011] Outro objetivo da presente invenção é o de solucionar o problema técnico de fornecer um derivado de chitosan ou uma composição que o compreende, que limita a reação imunológica do paciente, particularmente de seres humanos ou animais, que recebe a administração, por exemplo, por meio de injeção de um derivado de chitosan ou composição que o compreende.
[0012] Outro objeto da presente invenção é também o de solucionar o problema técnico de fornecer um derivado de chitosan ou uma composição que o compreende e que apresenta características pouco variáveis conforme o pH.
[0013] O objeto da presente invenção é também o de solucionar o problema técnico de fornecer um derivado de chitosan ou uma composição que o compreende, que possua osmolaridade e pH apropriados para uso em contato com o tecido de seres humanos ou animais e aceitáveis em termos de vida útil in situ, reação imunológica e/ou reação de corpos estranhos e propriedades biomecânicas, dependendo da indicação terapêutica desejada, particularmente no contexto de medicina regenerativa.
[0014] Descobriu-se, surpreendentemente, que um derivado de chitosan de acordo com a presente invenção possibilita a solução de pelo menos um, preferencialmente todos os problemas técnicos descritos acima.
[0015] Descobriu-se particularmente que um derivado de chitosan que exibe carga eletrostática (caracterizada pelo seu potencial zeta) ao longo de faixa de pH em volta do pH do meio no qual é administrado, particularmente sob pH 7,5, que é menor que um certo valor possibilitou a solução de pelo menos um, preferencialmente todos os problemas técnicos descritos ou sugeridos. Particularmente, esse derivado de chitosan permite limitar a reação imunológica de pacientes aos quais o derivado de chitosan ou uma composição que o compreende foi administrado, tipicamente por meio de injeção ou implante.
[0016] A presente invenção refere-se, de acordo com segundo aspecto, a um derivado de chitosan que contém unidades de glicosamina, unidades de N-acetilglicosamina e unidades de glicosamina substituídas por um grupo carboxialquila, em que o mencionado carboxialquil chitosan possui potencial zeta, medido sob pH 7,5, menor ou igual a -10 mV, preferencialmente menor ou igual a -15 mV.
[0017] Descobriu-se particularmente que um derivado de chitosan de origem fúngica possibilita solucionar pelo menos um, preferencialmente todos os problemas técnicos descritos ou sugeridos. Particularmente, um derivado de chitosan de origem fúngica permite limitar a reação imunológica de pacientes aos quais foi administrado, tipicamente por meio de injeção ou implante, o derivado de chitosan ou uma composição que o compreende.
[0018] A presente invenção refere-se, segundo primeiro aspecto, a um carboxialquil chitosan de origem fúngica que contém unidades de glicosamina, unidades de N-acetilglicosamina e unidades de glicosamina substituídas por um grupo carboxialquila, em que o mencionado carboxialquil chitosan possui preferencialmente grau de substituição por um grupo carboxialquila, em que o mencionado carboxialquil chitosan possui preferencialmente grau de substituição por um grupo carboxialquila de mais de 20%, expresso como o número de moles de substituinte com relação ao número de moles de unidades totais.
[0019] Faz-se também referência a um derivado de chitosan ou chitosan substituído.
[0020] O chitosan é indicado, por exemplo, com o número CAS 9012-76-4.
[0021] O chitosan utilizado para a presente invenção é convenientemente de origem fúngica, preferencialmente derivado do micélio de fungo do tipo Ascomycetes, particularmente de Aspergillus niger, e/ou de um fungo Basidiomycetes, particularmente Lentinula edodes (shitake) e/ou Agaricus bisporus (cogumelo de Paris). Preferencialmente, o chitosan é derivado de Agaricus bisporus. O chitosan é preferencialmente muito puro, ou seja, contém teor extremamente baixo de impurezas derivadas da sua origem fúngica ou do processo de fabricação e possui qualidade microbiológica compatível com o seu uso como implante ou composição farmacêutica. Um método de preparação de chitosan é o descrito nas patentes WO 03/068824 (EP 1483299 e US 7.556.946).
[0022] Geralmente, a chitina é colocada em suspensão aquosa na presença de hidróxido de sódio e, em seguida, o meio é trazido para alta temperatura por duração variável de acordo com a massa molecular desejada.
O chitosan é purificado em seguida por meio de solubilização em meio ácido e precipitado em meio alcalino, lavado e seco.
[0023] Preferencialmente, o chitosan possui grau suficientemente puro, apropriado para uso farmacêutico.
[0024] O chitosan é convenientemente purificado e preferencialmente seco em seguida. Após a purificação, o método de acordo com a presente invenção pode incluir uma etapa de secagem do carboxialquil chitosan e, opcionalmente, sua moagem a fim de obter um pó. O carboxialquil chitosan pode ser seco, por exemplo, por meio de evaporação da água, por exemplo, por meio de um processo de secagem por pulverização (atomização), de leito fluidificado, ou por meio de secagem por calor a vácuo ou sob pressão atmosférica, ou mesmo por liofilização.
[0025] O carboxialquil chitosan pode ser solubilizado em solução aquosa e, por exemplo, em água com qualidade farmaceuticamente aceitável apropriada para injeção ou implementação em um corpo e, particularmente, em um corpo humano.
[0026] O chitosan preparado pode possuir diferentes massas moleculares e varia geralmente de 10.000 a 500.000.
[0027] Segundo uma variante, a massa molecular média é de
20.000 a 60.000.
[0028] Segundo outra variante, a massa molecular média é de
60.000 a 100.000.
[0029] Segundo outra variante, a massa molecular média é de
100.000 a 120.000.
[0030] Segundo outra variante, a massa molecular média é de
120.000 a 150.000.
[0031] Segundo outra variante, a massa molecular média é de
150.000 a 220.000.
[0032] Segundo outra variante, a massa molecular média é de
220.000 a 300.000.
[0033] Segundo outra variante, a massa molecular média é de
300.000 a 500.000.
[0034] Quando o chitosan for reticulado, a massa molecular do polímero reticulado pode, de fato, ser muito mais alta.
[0035] É possível hidrolisar chitosan para reduzir a sua massa molecular.
[0036] Preferencialmente neste caso, a massa molecular média é a massa molecular média em viscosidade (Mv), calculada com base na viscosidade intrínseca de acordo com a equação de Mark-Houwink. A viscosidade intrínseca é medida por meio de viscometria capilar, com um viscômetro capilar do tipo Ubbelohde, de acordo com o método da monografia
2.2.9 da Farmacopeia Europeia. O tempo de fluxo da solução através de um tubo capilar adaptado (Lauda, tal como o tubo capilar Ubbelohde 510 01 com diâmetro de 0,53 mm) é medido por meio de um viscômetro automático I-Visc (Lauda), em primeiro lugar na concentração de chitosan inicial, depois por diversas diluições, tal como de acordo com as recomendações da monografia
2.2.9. A viscosidade intrínseca reduzida é deduzida para cada uma das concentrações. A viscosidade reduzida é plotada em função da temperatura e o valor na concentração 0 é extrapolado para deduzir a viscosidade intrínseca. É necessário, por exemplo, plotar a viscosidade reduzida (h red em ml/g) de i diluições em função da concentração C das i diluições (g/ml) de acordo com a Fórmula 5.
[0037] Fórmula 2: [h red] = (t1 - t0) - (1 - C).
[0038] A fim de calcular a massa viscosimétrica média, a equação de Mark-Howink é aplicada com as constantes k e alfa recomendadas por Rinaudo et al (em: Int. J. Biol. Macromol., 15, 281, 1993), segundo o grau de acetilação (DA) de chitosan, de acordo com uma das três fórmulas a seguir: - Fórmula 3: Mv = ([h] / 0,082)(1/0,76), para DA de 2% ; - Fórmula 4: Mv = ([h] /0,076)(1/0,76), para DA de 10% (por exemplo, 11,5%) ; e - Fórmula 5: Mv = ([h] /0,074)(1/0,76), para DA de 20% (por exemplo, 21%).
[0039] Para valores DA intermediários, é conduzida interpolação linear, a fim de calcular a massa viscosimétrica média (Mv).
[0040] Preferencialmente, o chitosan utilizado possui massa molecular média de 120.000 a 150.000, 150.000 a 220.000 ou mesmo de
220.000 a 300.000, ou até acima de 300.000, geralmente até 500.000.
[0041] É também possível medir a massa molecular final do carboxialquil chitosan; é possível, por exemplo, medir sua viscosidade intrínseca por meio de viscosidade capilar, deduzir sua massa molecular média (Mw) (determinando-se antecipadamente os parâmetros K e alfa do carboxialquil chitosan) ou por meio de um método cromatográfico, tal como permeação de gel.
[0042] Tipicamente, no carboxialquil chitosan de acordo com a presente invenção, as unidades de glicosamina são unidades de D-glicosamina (unidades de D-glicosamina, unidades de N-acetil-D-glicosamina e pelo menos uma das unidades de D-glicosamina e unidades de N-acetil-D-glicosamina é substituída).
[0043] Segundo uma variante, o chitosan substituído possui substituição apenas das unidades de D-glicosamina.
[0044] Segundo outra variante, chitosan substituído possui substituição simultânea das unidades de D-glicosamina e N-acetil-D- glicosamina, em que o grupo carboxialquila é ligado covalentemente, segundo uma variante somente dos grupos amina do chitosan ou, segundo outra variante, dos grupos amina e hidroxila do chitosan simultaneamente.
[0045] A substituição geralmente é apenas parcial e nem todas as unidades são necessariamente substituídas.
[0046] Segundo uma realização, o grau de substituição das unidades de D-glicosamina expressas em número de moles de unidades de D- glicosamina com relação ao número de moles de unidades totais (unidades de D-glicosamina e N-acetil-D-glicosamina, substituídas ou não) do chitosan substituído varia de 30% a 250%.
[0047] Segundo uma realização, o grau de substituição por um grupo carboxialquila é de mais de 50%, expresso em número de moles do substituinte com relação ao número de moles de unidades totais.
[0048] Segundo uma realização, o grau de substituição das unidades de D-glicosamina expressas em número de moles de unidades de D- glicosamina com relação ao número de moles de unidades totais (unidades de D-glicosamina e N-acetil-D-glicosamina, substituídas ou não) do chitosan substituído varia de 30% a 250% e, de preferência superior, 70%.
[0049] Segundo uma realização, o grau de substituição por um grupo carboxialquila é de menos de 80%, expresso em número de moles do substituinte com relação ao número de moles de unidades totais.
[0050] Tipicamente, a substituição é conduzida por meio de ligação covalente.
[0051] Segundo uma variante, o carboxialquil chitosan é N,O- carboxialquil chitosan. A proporção de unidades substituídas por um grupo carboxialquila na posição O (O3 ou O6 das unidades de glicosamina e/ou N- acetilglicosamina) e/ou na posição N (unidades de glicosamina) varia. O grau de substituição pode, portanto, ser de mais de 100%.
[0052] Convenientemente, o grau de substituição (DS) e o grau de acetilação (DA) do carboxialquil chitosan são medidos por meio de ressonância magnética nuclear (NMR) de carbono 13 em estado sólido, utilizando um Espectrômetro Bruker (Avance III HD, 400 MHz), equipado com uma sonda PH MAS VTN 400SB BL4 N-P/H. O espectro é registrado, por exemplo, à temperatura ambiente, com tempo de relaxamento que varia de 1 a 8 segundos e número de varreduras que varia de 64 a 512. As áreas dos sinais de carbono são determinadas após desconvolução. Os carbonos considerados são os seguintes: “acetil CH3” (metil carbono do grupo acetila nas unidades de N- acetilglicosamina, substituídas ou não), “C1” (carbono na posição 1 das unidades de glicosamina e N-acetilglicosamina) e “C=O” (carbonil carbono do substituinte carboximetila e carbonil carbono C=O do grupo acetila das unidades de N-acetilglicosamina, substituído ou não). A fim de determinar o DS de um dado carboxialquil chitosan, também é necessário registrar o espectro de NMR de carbono 13 do chitosan precursor desse carboxialquil chitosan.
Com base no espectro de chitosan precursor, é calculada a “razão de CSU”, ou seja, a razão entre a área do sinal do grupo “acetil CH3” (metil carbono do grupo acetila das unidades de N-acetilglicosamina) e a área do sinal de “C=0” (carbonil carbono do grupo acetila das unidades de N-acetil-D-glicosamina). O DA do carboxialquil chitosan é calculado de acordo com a Fórmula 1 e o DS de acordo com a Fórmula 2, em que I indica a área do sinal do carbono considerado.
[0053] Fórmula 1: 𝐼 𝑎𝑐𝑒𝑡𝑖𝑙 𝐶𝐻3 𝐷𝐴 = 𝐼𝐶1
[0054] Fórmula 2: 𝐼 𝐶𝐻3⁄ 𝐼𝐶=𝑂 − 𝐶𝑠𝑈 𝑅𝑎𝑧ã𝑜 𝐷𝑆 = 𝐼𝐶1
[0055] O DA e o DS podem ser determinados utilizando outros métodos conhecidos para carboxialquil chitosanos, tal como por meio de NMR de prótons em meio aquoso, empregando um espectrômetro de ressonância magnética, por exemplo de acordo com o método descrito por Liu et al (em: Carb. Polym. 137, 600, 2016), por exemplo, com hidrólise prévia de carboxialquil chitosan, por meio da adição de uma solução concentrada de ácido clorídrico deuterado antes da análise.
[0056] Caso outro método de NMR seja mais vantajoso para estimar o grau de substituição de forma confiável, convém utilizar esse método alternativo. Os métodos acima devem ser adaptados pelos técnicos no assunto com relação à preparação da amostra e os sinais a serem integrados, particularmente em função da resolução, da robustez e da posição dos prótons dos sinais a serem utilizados para cálculo do grau de substituição.
[0057] O grau de carboxialquilação de chitosan pode variar convenientemente de 20 a 250%, preferencialmente de 50 a 200% e, por exemplo, de 70 a 170%, expresso em número de moles de carboxialquila com relação ao número de moles de unidades totais.
[0058] Segundo uma variante, o grau de carboxialquilação de chitosan pode variar convenientemente de 40 a 130%, por exemplo, de 70 a 130%, expresso em número de moles de carboxialquila com relação ao número de moles de unidades totais.
[0059] O grau de substituição de chitosan é tipicamente correlacionado à razão em massa entre os reagentes e o chitosan no início da reação. Como forma de agentes carboxialquilantes, pode-se fazer menção de cloretos ácidos (ou seus sais, tais como monocloroacetato de sódio), tais como os que contêm um ou mais grupos carboximetila, carboxietila, carboxipropila, carboxibutila etc.
[0060] Segundo uma variante, a presente invenção refere-se a carboxialquil chitosan em que a porção alquila do carboxialquila é C1-C5, linear ou ramificada.
[0061] Segundo uma variante, a presente invenção refere-se a carboximetil chitosan.
[0062] Segundo esta variante, o chitosan substituído é chitosan N- carboxialquilado.
[0063] Segundo esta variante, o chitosan substituído é chitosan O- carboxialquilado.
[0064] Segundo esta variante, o chitosan substituído é chitosan N- carboxialquilado e O-carboxialquilado.
[0065] Convenientemente, o potencial zeta, medido sob pH 7,5, é menor ou igual a -18 mV.
[0066] Convenientemente, o carboxialquil chitosan possui potencial zeta, medido sob pH 7,5, que é menor ou igual a -22 mV e, preferencialmente, menor ou igual a -24 mV.
[0067] Segundo uma variante específica, o chitosan substituído possui preferencialmente massa molecular média de 150.000 a 220.000 e grau de substituição que varia de 50 a 200%, em que a massa molecular é preferencialmente expressa antes da substituição.
[0068] Segundo outra variante específica, o chitosan substituído possui massa molecular média de 120.000 a 150.000 e grau de substituição que varia de 70 a 200%, em que a massa molecular é preferencialmente expressa antes da substituição.
[0069] Segundo uma variante específica, o chitosan substituído possui preferencialmente massa molecular média de 220.000 a 300.000 e grau de substituição que varia de 70 a 200%, em que a massa molecular é preferencialmente expressa antes da substituição.
[0070] Segundo outra variante específica, o chitosan substituído possui massa molecular média de 220.000 a 300.000 e grau de substituição que varia de 50 a 200%, em que a massa molecular é preferencialmente expressa antes da substituição.
[0071] Segundo outra variante específica, o chitosan substituído possui massa molecular média de 300.000 a 500.000 e grau de substituição que varia de 50 a 200%, em que a massa molecular é preferencialmente expressa antes da substituição.
[0072] Segundo outra variante específica, o chitosan substituído possui massa molecular média de 300.000 a 500.000 e grau de substituição que varia de 70 a 200%, em que a massa molecular é preferencialmente expressa antes da substituição.
[0073] Segundo uma variante específica, o chitosan substituído possui preferencialmente massa molecular média de 120.000 a 150.000 e grau de substituição que varia de 20 a 50%, em que a massa molecular é preferencialmente expressa antes da substituição.
[0074] Segundo outra variante específica, o chitosan substituído possui massa molecular média de 220.000 a 300.000 e grau de substituição que varia de 20 a 50%, em que a massa molecular é preferencialmente expressa antes da substituição.
[0075] Segundo outra variante específica, o chitosan substituído possui massa molecular média de 300.000 a 500.000 e grau de substituição que varia de 20 a 50%, em que a massa molecular é preferencialmente expressa antes da substituição.
[0076] Segundo variante específica, o chitosan substituído possui grau de substituição que varia de 20 a 80%, preferencialmente de 40 a 60% e grau de acetilação de 20 a 80%, preferencialmente de 30 a 75%.
[0077] Segundo variante específica, o chitosan substituído possui grau de substituição que varia de 50 a 200%, preferencialmente de 70 a 200% e grau de acetilação de 20 a 80%, preferencialmente de 30 a 75%.
[0078] Segundo variante específica, o chitosan substituído possui grau de substituição que varia de 50 a 200%, preferencialmente de 70 a 200% e grau de acetilação de 20 a 50%, preferencialmente de 20 a 40%.
[0079] Segundo variante específica, o chitosan substituído possui grau de substituição que varia de 50 a 200%, preferencialmente de 70 a 200% e grau de acetilação de 50 a 75%.
[0080] Segundo outra variante específica, o chitosan substituído possui grau de substituição que varia de 90 a 200%, preferencialmente de 90 a 150% e grau de acetilação de 20 a 80%, em que a massa molecular é preferencialmente expressa antes da substituição.
[0081] Segundo variante específica, o chitosan substituído possui grau de substituição que varia de 90 a 200%, preferencialmente de 90 a 150% e grau de acetilação de 20 a 50%, preferencialmente de 20 a 40%.
[0082] Segundo variante específica, o chitosan substituído possui grau de substituição que varia de 90 a 200%, preferencialmente de 90 a 150% e grau de acetilação de 50 a 75%.
[0083] Segundo uma variante específica, o chitosan substituído possui preferencialmente massa molecular média de 220.000 a 300.000, em que o grau de substituição varia de 90 a 200%, preferencialmente de 90 a 150%, grau de acetilação de 50 a 75% e a massa molecular é preferencialmente expressa antes da substituição.
[0084] Segundo uma variante, o carboxialquil chitosan é reticulado. Diversas cadeias de chitosan podem, portanto, ser reticuladas, por exemplo, por meio de reação com agentes reticulantes, tais como agentes reticulantes utilizados para retícula de polissacarídeos, por exemplo, genipin, butil biglicidil éter, glutaraldeído, epicloridrina, 1-bromo-3,4-epoxibutano, 1- bromo-4,5-epoxipentano, 1-cloro-2,3-epitiopropano, 1-bromo-2,3-epitiopropano, 1-bromo-3,4-epitiobutano, 1-bromo-4,5-epitiopentano, 2,3-dibromopropanol,
2,4-dibromobutanol, 2,5-dibromopentanol, 2,3-dibromopropanotiol, 2,4- dibromobutanotiol e 2,5-dibromopentanotiol epicloridrina, 2,3-dibromopropanol, 1-cloro-2,3-epitiopropano, dimetilaminopropilcarbodi-imida, dextrano oxidado, ácido gálico, galato de epigalocatequina, curcumina, ácido tânico ou mesmo compostos de di-isocianato, tais como di-iosocianato de hexametileno ou di- isocianato de tolueno.
[0085] Com carboxialquil chitosan reticulado, a massa molecular pode ser muito alta.
[0086] Substituindo-se o chitosan, foi possível preparar uma solução de carboxialquil chitosan solúvel em solução aquosa cujo pH varia ao longo de ampla faixa, enquanto o chitosan não substituído somente é solúvel sob pH abaixo de 5,5 a 6,5. O carboxialquil chitosan possui, portanto, capacidade de solubilização em diferentes valores de pH graças à presença de grupos carboxialquila que modificam o seu perfil de solubilidade e, particularmente, sob pH fisiológico ou sob o pH de fluidos fisiológicos modificados por uma patologia, tal como patologia inflamatória. Sabe-se que o pH de fluidos fisiológicos tais como o fluido sinovial de uma articulação, o humor aquoso, o humor vítreo e lágrimas pode variar significativamente entre os indivíduos, devido a diversos fatores tais como idade, patologia etc. É, portanto, vantajoso que o carboxialquil chitosan seja capaz de permanecer solúvel ao longo de ampla faixa de pH, tal como de 6,0 a 8,5, 5,0 a 8,5 ou de 4,5 a 8,5.
[0087] Segundo uma realização, a formulação de chitosan substituída possui osmolaridade de 100 a 700 mosm/kg, preferencialmente de 200 a 500 mosm/kg.
[0088] Convenientemente, a osmolaridade da formulação de chitosan substituído é de 250 a 400 mosm/kg, preferencialmente de 275 a 325 mosm/kg.
[0089] Segundo uma variante, a formulação de chitosan substituído possui osmolaridade compatível com uma articulação.
[0090] Segundo uma variante, a formulação de chitosan substituído possui osmolaridade compatível com uma superfície ocular ou intraocular.
[0091] É preferível que a osmolaridade da formulação de chitosan substituído seja compreendida de 250 a 400 e, mais especificamente, 250 a 380 mosm/kg.
[0092] Compreende-se que o termo “hidrossolúvel” indica que o carboxialquil chitosan não exibe turvação visível a olho nu quando colocado em solução aquosa. Mais especificamente, é possível confirmar a solubilidade, ou seja, a ausência de turvação, de uma solução de carboxialquil chitosan em concentração, por exemplo, de 1% (m/m) em água ou tampão, tal como tampão de fosfato, com/para densidade óptica de menos de 0,5 e, preferencialmente, menos de 0,2, medida por meio de espectrometria de UV visível em comprimento de onda de 500 nm com referência a um tanque de referência que compreende apenas o solvente aquoso utilizado para a amostra medida, mas na ausência de chitosan substituído. Outro método consiste de inspeção visual de acordo com a monografia 2.9.20 da Farmacopeia Europeia.
Quando o chitosan não for suficientemente substituído, a composição não é solúvel em faixa de pH satisfatória, por exemplo, que varia de pH 6,0 a pH 8,5, à temperatura ambiente.
[0093] O grau de acetilação (DA) de chitosan é determinado, por exemplo, conforme descrito nos pedidos de patente WO 2017009335 e WO 2017009346 por meio de titulação potenciométrica. O DA pode ser alternativamente medido por meio de outros métodos conhecidos para chitosan, tais como NMR de prótons, NMR de carbono 13 em estado sólido e espectrometria de infravermelho.
[0094] Convenientemente, o carboxialquil chitosan possui grau de acetilação de 5 a 80%, expresso em número de moles de unidades de N- acetilglicosamina com relação ao número de moles de unidades totais. O grau de acetilação é expresso em número de unidades de N-acetil-D-glicosamina com relação ao número de unidades totais de N-acetil-D-glicosamina e D- glicosamina presentes.
[0095] Convenientemente, o carboxialquil chitosan possui grau de acetilação de 40 a 80%, expresso em número de moles de unidades de N- acetilglicosamina com relação ao número de moles de unidades totais.
[0096] Segundo uma variante, o grau de acetilação varia de 5 a 20%.
[0097] Segundo uma variante, o grau de acetilação varia de 15 a 25%.
[0098] Segundo uma variante, o grau de acetilação varia de 20 a 45%.
[0099] Segundo uma variante, o grau de acetilação varia de 20 a 30%.
[00100] Segundo uma variante, o grau de acetilação varia de 25 a 40%.
[00101] Segundo uma variante, o grau de acetilação varia de 40 a 50%.
[00102] Segundo uma variante, o grau de acetilação varia de 50 a 60%.
[00103] Segundo uma variante, o grau de acetilação varia de 60 a 75%.
[00104] O grau de acetilação é determinado por meio de NMR de carbono 13 ou NMR de prótons, segundo o mesmo método da determinação de DS. Carboxialquil chitosan possui convenientemente grau controlado de acetilação. Compreende-se a expressão “chitosan que possui grau controlado de acetilação” como indicando um produto cujo grau de acetilação, ou seja, a proporção de unidades de N-acetilglicosamina, pode ser ajustado de forma controlada, particularmente por reação de acetilação.
[00105] Segundo uma variante, a composição de acordo com a presente invenção pode apresentar-se na forma de solução e não é capaz de ser transformada em gel por meio de variação da temperatura (incapaz da termoformação de gel).
[00106] Segundo uma variante, as características reológicas de uma solução de acordo com a presente invenção podem variar com a temperatura, mas sem passar por transição sol-gel. As características reológicas de uma solução de acordo com a presente invenção podem ser particularmente evidenciadas pelo módulo de elasticidade (G’) e/ou o módulo de perda (G”) ou mesmo o módulo complexo G*.
[00107] Segundo uma variante, as características reológicas de uma solução de acordo com a presente invenção são substancialmente constantes, independentemente de qual seja a temperatura.
[00108] Segundo uma variante, a composição de acordo com a presente invenção pode apresentar-se na forma de solução é é capaz de termoformação de gel.
[00109] Segundo uma variante, a composição de acordo com a presente invenção pode apresentar-se na forma de gel e não é capaz de termoformação de gel.
[00110] A presente invenção possibilita, portanto, de acordo com uma variante, preparar uma composição capaz de termoformação de gel que é fluida sob temperatura abaixo da temperatura de uso, tipicamente sob temperatura abaixo da temperatura fisiológica, por exemplo de 37 °C, mas que se encontra em forma de gel à temperatura de uso, tipicamente, à temperatura fisiológica, por exemplo de 37 °C, sob pH neutro (pH 7) ou pH fisiológico e, por exemplo, de 7 a 8,5, com osmolaridade apropriada para o uso idealizado.
Trata-se, por exemplo, de osmolaridade fisiológica.
[00111] Segundo uma variante, a composição capaz de termoformação de gel possui transição sol-gel termorreversível.
[00112] Convenientemente, a presente invenção possibilita fornecer uma composição com baixa concentração de chitosan substituído.
[00113] Convenientemente, a concentração de carboxialquil chitosan é de menos de 10%, tal como menor ou igual a 5%, em massa com relação à massa total da composição (m/m).
[00114] Segundo uma variante, a concentração de chitosan é de menos de 4%, tal como menor ou igual a 3% ou mesmo, por exemplo, menor ou igual a 2% em massa com relação à massa total da composição (m/m).
[00115] Convenientemente, a composição de acordo com a presente invenção pode também compreender um biopolímero diferente do chitosan substituído. Segundo uma variante conveniente, o biopolímero é polissacarídeo, oxidado ou não, reticulado ou não por ligações covalentes, tal como ácido hialurônico ou hialuronato de sódio.
[00116] O ácido hialurônico pode possuir massa molecular de até 5 milhões de Da. A massa molecular de ácido hialurônico pode ser refletida pela sua viscosidade intrínseca ou sua viscosidade dinâmica em solução. Ácido hialurônico pode possuir densidade que varia de 1 a 4 m3/kg e, por exemplo, ser caracterizado como possuindo massa molecular baixa (por exemplo, cerca de 1 a 2 m3/kg) ou alta (por exemplo, cerca de 2 a 4 m3/kg).
[00117] Convenientemente, a concentração de ácido hialurônico é de menos de 4%, tal como menor ou igual a 3% ou, por exemplo, menor ou igual a 2% em massa com relação à massa total da composição
(m/m).
[00118] Segundo uma variante específica, a concentração de ácido hialurônico é de menos de 1,9% (m/m), expressa em massa com relação à massa da composição final. Convenientemente, a concentração de ácido hialurônico é de 0,5 a 1,5% (m/m), expressa em massa com relação à massa da composição final. Segundo uma variante específica, a concentração de ácido hialurônico é de cerca de 0,9%, 1,0%, 1,1%, 1,2%, 1,3% ou 1,5% (m/m), expressa em massa com relação à massa da composição final.
[00119] A razão entre chitosan e ácido hialurônico pode, por exemplo, variar de 5 a 95%, por exemplo de 10 a 90% e até, por exemplo, 30 a 70% de chitosan substituído e de 5 a 95%, por exemplo de 10 a 90% e ainda, por exemplo, 30 a 70%, respectivamente, de ácido hialurônico, em que os percentuais são expressos com relação à massa seca de chitosan substituído/massa seca de ácido hialurônico. Segundo uma variante, esta razão entre chitosan e ácido hialurônico é de 1:1 (ou seja, 50% de chitosan e 50% de ácido hialurônico). Segundo outra variante, a razão entre chitosan e ácido hialurônico é de 1,5:0,5 (ou seja, 75% de chitosan e 25% de ácido hialurônico).
[00120] Segundo uma variante, o ácido hialurônico pode ser reticulado entre diferentes cadeias de ácido hialurônico.
[00121] A presente invenção também se refere a um método de preparação de carboxialquil chitosan.
[00122] Segundo uma variante, o método de preparação de carboxialquil chitosan de acordo com a presente invenção compreende a preparação de chitosan de origem fúngica, reacetilação do chitosan e carboxialquilação do chitosan reacetilado. A presente invenção refere-se, portanto, a chitosan reacetilado ou carboxialquil chitosan reacetilado.
[00123] Segundo uma realização, é possível, portanto,
dissolver chitosan em meio aquoso, de preferência levemente acidificado (pH 6, por exemplo). Anidrido acético pode ser adicionado à solução de chitosan uma ou mais vezes. Adiciona-se em seguida um agente básico, tal como hidróxido de sódio e/ou ureia. Adiciona-se então um agente alquilante, tal como monocloroacetato de sódio (ou seja, o sal de sódio de ácido cloroacético) ou ácido cloroacético. Em seguida, o chitosan substituído é purificado, recuperado e seco.
[00124] Segundo uma variante, o método de preparação de carboxialquil chitosan de acordo com a presente invenção compreende a preparação de chitosan, carboxialquilação do chitosan e reacetilação do chitosan carboxialquilado. Convenientemente, esse método permite controle preciso do grau de acetilação do carboxialquil chitosan final, particularmente para obter alto grau de acetilação, por exemplo acima de 40%. A presente invenção refere-se, portanto, a chitosan reacetilado e depois carboxialquilado ou carboxialquil chitosan reacetilado.
[00125] Segundo uma variante, o método de preparação de carboxialquil chitosan de acordo com a presente invenção compreende a preparação de chitina de origem fúngica, carboxialquilação da chitina e, opcionalmente, reacetilação da chitina carboxialquilada, a fim de obter o carboxialquil chitosan de acordo com a presente invenção.
[00126] Segundo uma variante, o método de preparação de chitosan carboxialquilado de acordo com a presente invenção compreende a preparação de chitina de origem fúngica, desacetilação da chitina, carboxialquilação da chitina e, opcionalmente, a reacetilação da chitina carboxialquilada, a fim de obter o carboxialquil chitosan de acordo com a presente invenção.
[00127] Segundo uma realização, a etapa de carboxialquilação compreende uma etapa de alcalinização dos grupos hidroxila de chitosan, a fim de promover alto grau de substituição e, por exemplo, na posição N das unidades de glicosamina e na posição O das unidades de glicosamina e N-acetilglicosamina.
[00128] Segundo uma realização, o método de acordo com a presente invenção compreende uma etapa de alcalinização que compreende a dispersão de chitosan em uma solução de álcool, tal como isopropanol na presença de agente básico tal como hidróxido de sódio e agitação por um período de pelo menos uma hora à temperatura mínima de -32 °C, preferencialmente máxima de 15 °C. A essa suspensão, adiciona-se em seguida um agente alquilante, tal como ácido monocloroacético. O chitosan substituído é então purificado, recuperado e seco.
[00129] Segundo uma variante, o método de preparação de chitosan carboxialquilado de acordo com a presente invenção inclui a preparação de chitosan, carboxialquilação do chitosan e reacetilação subsequente do chitosan carboxialquilado.
[00130] Segundo uma realização, a etapa de carboxialquilação não inclui uma etapa de alcalização.
[00131] A etapa de reacetilação de carboxialquil chitosan pode, por exemplo, incluir uma ou mais adições de anidrido acético à solução de carboxialquil chitosan.
[00132] As etapas finais de purificação, filtragem e secagem, a fim de coletar o carboxialquil chitosan purificado, são conduzidas de acordo com métodos conhecidos com vistas à obtenção de carboxialquil chitosan de acordo com o grau de pureza desejado, que depende geralmente da aplicação idealizada, tal como por ciclos de precipitação e solubilização, ou por diálise.
[00133] Segundo uma realização, a razão entre anidrido acético e chitosan (volume/massa) varia de 0,1 a 10, preferencialmente de 0,1 a 2, durante a etapa de reacetilação.
[00134] Segundo uma variante, a razão em massa entre agente carboxialquilante e chitosan varia de 1 a 50, preferencialmente de 2,5 a 25, durante a etapa de carboxialquilação.
[00135] Segundo uma variante, é utilizada razão em massa dos reagentes que fornecem o grupo carboxialquila (ou seja, o agente alquilante) ao chitosan com relação ao agente básico necessário e suficiente para obter o grau de substituição desejado. A razão em massa entre o agente alquilante e o agente básico, por exemplo, é de mais de 1 a menos de 10, preferencialmente de 1,4 a 3,3.
[00136] A presente invenção também se refere a um método de preparação de composições de acordo com a presente invenção.
[00137] Segundo uma realização, o método tipicamente compreende: - dissolução de chitosan substituído em solução aquosa, preferencialmente em solução tamponada, que possui preferencialmente pH de 6,2 a 8,5, preferencialmente de 6,5 a 7,5; - ajuste opcional do pH em pH desejado, geralmente o pH fisiológico para a aplicação desejada, por exemplo, por meio de adição de agente tampão, ácido ou base; - adição opcional de outros excipientes, tais como açúcar redutor, por exemplo sorbitol ou manitol; e - ajuste opcional da osmolaridade final da composição.
[00138] Convenientemente, o método também compreende uma etapa de enchimento adicional para enchimento de um dispositivo de injeção ou implante, tal como seringa, com carboxialquil chitosan ou a composição que o compreende. Convenientemente, o dispositivo de injeção, tal como seringa, pode ser submetido em seguida a esterilização de vapor. Este dispositivo, tal como seringa, pode ser embalado em seguida,
preferencialmente de forma estéril. Ele pode também ser, por exemplo, uma bolsa, ampola ou garrafa que serve para permitir a instilação da solução de carboxialquil chitosan.
[00139] É conveniente utilizar chitosan que possui grau suficiente de pureza para a aplicação pretendida.
[00140] Convenientemente, o método também inclui uma etapa de enchimento adicional de um dispositivo de injeção, implante ou instilação, tal como seringa, com a composição de acordo com a presente invenção. Convenientemente, o dispositivo de injeção, tal como seringa, pode ser submetido em seguida a esterilização de vapor. Este dispositivo, tal como seringa, pode ser embalado em seguida, preferencialmente de forma estéril.
[00141] Segundo uma variante, o carboxialquil chitosan de acordo com a presente invenção é esterilizado por meio de filtragem e/ou esterilização de vapor, antes do enchimento de um dispositivo de injeção, implantação ou instilação, tal como seringa ou ampola.
[00142] É conveniente utilizar chitosan que possui grau suficiente de pureza para a aplicação pretendida.
[00143] A presente invenção refere-se mais especificamente a uma composição injetável que compreende o carboxialquil chitosan de acordo com a presente invenção.
[00144] A presente invenção também se refere a uma composição farmacêutica que compreende pelo menos um carboxialquil chitosan definido de acordo com a presente invenção.
[00145] Segundo uma variante, o carboxialquil chitosan ou a composição que o compreende é utilizado na forma de composição farmacêutica injetável, implantável ou apropriada para instilação, ou dispositivo médico que é injetável, implantável ou apropriado para instilação.
[00146] A presente invenção também inclui carboxialquil chitosan ou uma composição que o compreende, em forma seca, particularmente em forma liofilizada. É particularmente possível (re)dispersar, preferencialmente solubilizar o produto liofilizado antes do uso.
[00147] A presente invenção refere-se mais especificamente a uma composição de acordo com a presente invenção para uso em tratamento terapêutico, por exemplo, que compreende a injeção da mencionada composição por via subcutânea, intradérmica, intraocular ou intra- articular, tal como para o reparo, regeneração ou enchimento de pelo menos um tecido do corpo que necessita de reparo ou enchimento.
[00148] Convenientemente, de acordo com uma realização, carboxialquil chitosan de acordo com a presente invenção exibe imunocompatibilidade das formulações de carboximetil chitosan de origem fúngica utilizando o modelo de bolsa de ar de camundongo, 24 horas após a injeção, expressa em número de glóbulos brancos de menos de 10x10 6 células/ml, preferencialmente menos de 8x106 células/ml.
[00149] Convenientemente, de acordo com uma realização, carboxialquil chitosan de acordo com a presente invenção exibe imunocompatibilidade das formulações de carboximetil chitosan de origem fúngica utilizando o modelo de bolsa de ar de camundongo, 24 horas após a injeção, expressa em concentração de IL1-beta de menos de 10x10-9 g/ml, preferencialmente menos de 5x10-9 g/ml.
[00150] Convenientemente, de acordo com uma realização, carboxialquil chitosan de acordo com a presente invenção exibe a imunocompatibilidade das formulações de carboximetil chitosan de origem fúngica utilizando o modelo de bolsa de ar de camundongo, 24 horas após a injeção, expressa por concentração de ligante 1 de motivo quemocina C-X-C (KC-CXCL 1) de menos de 50x10-9 g/ml, preferencialmente menos de 30x10-9 g/ml.
[00151] Convenientemente, de acordo com uma realização, carboxialquil chitosan de acordo com a presente invenção exibe imunocompatibilidade das formulações de carboximetil chitosan de origem fúngica utilizando o modelo de bolsa de ar de camundongo, 24 horas após a injeção, expressa por concentração de fator de necrose tumorosa alfa (TNF- alfa) de menos de 150x10-9 g/ml, preferencialmente menos de 125x10-9 g/ml.
[00152] Convenientemente, de acordo com uma realização, carboxialquil chitosan de acordo com a presente invenção exibe imunocompatibilidade das formulações de carboximetil chitosan de origem fúngica utilizando o modelo de bolsa de ar de camundongo, 24 horas após a injeção, expressa por concentração de KC-CXCL 1 de menos de 50x10-9 g/ml, preferencialmente menos de 30x10-9 g/ml.
[00153] Convenientemente, de acordo com uma realização, carboxialquil chitosan de acordo com a presente invenção exibe imunocompatibilidade das formulações de carboximetil chitosan de origem fúngica utilizando o modelo de bolsa de ar de camundongo, 24 horas após a injeção, que satisfaz simultaneamente os limites máximos expressos no presente em termos de número de glóbulos brancos e concentrações de IL1- beta, KC/CXCL1 e TNF-alfa.
[00154] As medições do número de glóbulos brancos do sangue e das concentrações de IL1-beta, KC/CXCL1 e TNF-alfa são conduzidas de acordo com os protocolos indicados nos exemplos.
[00155] Convenientemente, segundo uma realização, carboxialquil chitosan de acordo com a presente invenção possui meia vida na presença de mistura das enzimas lisozima e hialuronidase a 37 °C de mais de 500 minutos, de acordo com o protocolo de medição do Exemplo 6.
[00156] Convenientemente, de acordo com uma realização, particularmente uma aplicação intra-articular, carboxialquil chitosan de acordo com a presente invenção possui coeficiente de fricção (COF 0) de menos de 5, preferencialmente menor ou igual a 4 (de acordo com o protocolo do Exemplo 9).
[00157] A presente invenção refere-se particularmente a uma composição de acordo com a presente invenção para uso em tratamento nas áreas de reumatologia, oftalmologia, medicina estética, cirurgia plástica, cirurgia interna, tal como para a prevenção de aderências de tecidos pós- cirúrgicas, dermatologia ou cosmética.
[00158] Segundo uma variante, o tecido corporal é selecionado a partir de tecidos pertencentes às cordas vocais, músculos, ligamentos, tendões, cartilagens, órgãos sexuais, ossos, articulações, olhos, derme, epiderme, uma ou mais camadas da pele, mesoderma ou qualquer uma das suas combinações, mais especificamente pertencentes aos olhos, à derme e às articulações.
[00159] A presente invenção também se refere a uma composição de acordo com a presente invenção para uso no tratamento terapêutico de síndrome dos olhos secos, lesões ou danos à córnea ou inflamações das articulações.
[00160] A presente invenção refere-se adicionalmente à aplicação de uma composição de acordo com a presente invenção por meio de instilação sobre a superfície ocular, a fim de evitar ou combater danos ou lesões à córnea ou síndrome dos olhos secos, particularmente com vistas à lubrificação ou regeneração da superfície ocular.
[00161] A presente invenção também se refere, portanto, a uma composição de gotas oftálmicas que compreende um carboxialquil chitosan definido de acordo com a presente invenção.
[00162] Segundo uma variante, o paciente é afetado por patologia inflamatória (por exemplo, osteoartrose).
[00163] A presente invenção refere-se, mais especificamente, a uma composição de acordo com a presente invenção para o tratamento de artrose, artrite ou reparação de defeitos da cartilagem, por exemplo, por meio de injeção na cavidade sinovial ou implante no local do defeito da cartilagem.
[00164] A presente invenção refere-se, mais especificamente, a um dispositivo médico, tal como implante médico, caracterizado por compreender ou consistir de uma composição de acordo com a presente invenção.
[00165] Segundo uma variante preferida, a presente invenção refere-se, portanto, a um dispositivo médico que compreende uma câmara que contém carboxialquil chitosan em forma seca, particularmente em forma liofilizada e, opcionalmente, uma ou mais câmaras adicionais que contêm um ou mais produtos ativos, aditivos ou excipientes.
[00166] A composição de acordo com a presente invenção pode também compreender um ou mais aditivos ou excipientes que permitam modular as suas propriedades.
[00167] A presente invenção também se refere a uma composição de acordo com a presente invenção para uso em um método de tratamento terapêutico, por exemplo, que compreende a instilação ou injeção da mencionada composição, por via subcutânea, intradérmica, ocular, intraocular ou intra-articular, por exemplo, para o reparo ou enchimento de pelo menos um tecido do corpo que necessita de reparo ou enchimento.
[00168] A presente invenção também se refere a uma composição de acordo com a presente invenção para uso em um método de tratamento de artrose ou na reparação de defeito da cartilagem, por exemplo, por meio de injeção no fluido sinovial ou após mistura com sangue e implante na cartilagem.
[00169] A presente invenção também se refere a uma composição de acordo com a presente invenção para uso em um método de tratamento ou de cuidados estéticos por meio de enchimento da derme (“enchimento dérmico”). Isso envolve particularmente, por exemplo, injeção de composição de acordo com a presente invenção por via subcutânea ou intradérmica.
[00170] A presente invenção também se refere a uma composição de acordo com a presente invenção para uso em um método de tratamento superficial da pele por meio de múltiplas injeções por via intradérmica. Essas composições podem ser tipicamente utilizadas em dermatologia, como tratamentos destinados para propósitos estéticos. Esse método atende, por exemplo, ao propósito de fazer crescer a pele para fazer com que ela perca sua aparência enrugada (tratamento de rugas e/ou linhas finas). Esse tratamento pode ser fornecido a um paciente que desejar fornecer aspecto rejuvenescido à sua pele.
[00171] A presente invenção também se refere a uma composição de acordo com a presente invenção para uso em um método de tratamento no qual a composição é um agente de viscossuplementação. Neste caso, por exemplo, ele envolve a injeção da composição de acordo com a presente invenção no local intra-articular, particularmente para limitar a fricção das superfícies de cartilagem da articulação.
[00172] A presente invenção também se refere a uma composição de acordo com a presente invenção para uso como vetor celular, para um ou mais tipos celulares e/ou um ou mais agentes ativos. Estes podem ser agentes ativos do ponto de vista biológico ou farmacêutico. A composição de acordo com a presente invenção pode realmente ser compatível com a presença de células, preferencialmente células vivas. Dentre as células vivas de interesse, pode-se fazer menção, por exemplo, de: condrócitos
(carticulagem articular), fibrocondrócitos (menisco), fibroblastas de ligamentos (ligamento), fibroblastas da pele (pele), tenócitos (tendões), miofibroblastas (músculo), células tronco mesenquimais, glóbulos vermelhos (sangue) e queratinócitos (pele). A composição de acordo com a presente invenção pode ser também idealizada como vetor terapêutico para fornecimento dirigido e/ou liberação controlada de pelo menos um agente terapêutico.
[00173] Segundo uma variante, a adição de sangue, plasma, lisato de plaquetas, plasma rico em plaquetas ou qualquer fluido biológico com a composição de acordo com a presente invenção possibilita, por exemplo, aprimorar os aspectos de desempenho do produto.
[00174] Segundo uma variante, a composição de acordo com a presente invenção é formulada em forma sólida (por exemplo, filme ou espuma porosa), que é solubilizada após a implantação.
[00175] Segundo uma variante, a composição é formulada na forma de composição nebulizável (pulverização).
[00176] A presente invenção também se refere a uma composição de acordo com a presente invenção para uso em um método de tratamento ou de cuidados estéticos para um ou mais tecidos ou órgãos afetados pela temperatura excessiva, como no caso de queimaduras.
[00177] A presente invenção também se refere a uma composição de acordo com a presente invenção para uso em um método de tratamento de reparação de cartilagens (por exemplo, pela implantação de um defeito de cartilagem, a fim de promover sua regeneração).
[00178] A presente invenção também se refere a uma composição de acordo com a presente invenção para uso em um método de tratamento para prevenir aderências de tecidos após a cirurgia; o produto é aplicado sobre os tecidos ao final da cirurgia, tal como cirurgia ginecológica, abdominal etc.
[00179] A presente invenção também se refere a uma composição destinada a ser fluido sinovial artificial, que compreende carboxialquil chitosan de acordo com a presente invenção.
[00180] A composição de acordo com a presente invenção permite imitar um fluido sinovial saudável ou melhorar um fluido sinovial saudável ou defeituoso ao tentar, por exemplo, aumentar sua capacidade lubrificante para reduzir a fricção na articulação e/ou suas propriedades de absorção de choques (identificáveis pelo módulo de elasticidade G’), permanecendo facilmente injetável para encher uma seringa, por exemplo, ou para injeção no corpo humano ou animal. Para fins indicativos, o módulo elástico G’ de fluido sinovial saudável é de 40 a 100 Pa e seu módulo de perda G” é de 1 a 10 Pa.
[00181] Segundo uma variante, o carboxialquil chitosan ou a composição que o compreende é injetado na forma de solução.
Convenientemente, segundo esta variante, o carboxialquil chitosan ou a composição que o compreende é facilmente injetável através de uma agulha fina, tal como uma agulha com diâmetro gauge 21, à temperatura ambiente.
Compreende-se que injeção “fácil” indica que, preferencialmente, a força a ser exercida sobre essa seringa para causar fluxo de uma composição de acordo com a presente invenção através de uma agulha gauge 21 é de menos de 50 Newtons, preferencialmente força de menos de 20 Newtons.
[00182] A presente invenção também se refere a uma composição na forma de lágrimas artificiais, que compreende carboxialquil chitosan de acordo com a presente invenção.
[00183] Geralmente, as faixas de valores de osmolaridade e de pH procurados em aplicações biomédicas são próximas das faixas a seguir: • Osmolaridade: - iso-osmolar em plasma: 285 a 295 mosm/kg;
- iso-osmolar em fluido sinovial: 404 ± 57 mosml/kg, de acordo com Clin. Orthop. Relat. Res., 235, 289-95, 1988 e Biochem. Biophys.
Res. Comm., 422, 455-461, 2012; e - 280 a 350 mosm/kg.
• pH:
[00184] Geralmente, pH fisiológico é de mais de 6,8, particularmente acima de 7,0 e, particularmente, 7,4 (como para plasma ou fluido sinovial).
[00185] Geralmente, o pH de plasma é 7,4. Geralmente, o pH do fluido sinovial é de 7,768 +/- 0,044 de acordo com J. Bone Joint Surg.
Br., 41-B(2), 388-400, 1959; ou 7,3 de acordo com Acta Orthop. Scand. 634- 641, 1969, ou também de acordo com Clin. Rheumatol. 25, 886-888, 2006.
[00186] Geralmente, o pH sinovial no caso de osteoartrite ou artrite é considerado mais baixo que o de fluido sinovial saudável.
[00187] A presente invenção refere-se, portanto, a uma mistura de fluido sinovial com uma composição de acordo com a presente invenção, por exemplo, com base em razão em volume entre (i) o carboxialquil chitosan ou a composição que o compreende e (ii) o fluido sinovial que varia de 20/80 a 80/20 (v/v) e, por exemplo, 50/50 (v/v).
[00188] Convenientemente, a composição de acordo com a presente invenção é estéril. Muito convenientemente, a composição de acordo com a presente invenção é esterilizada por meio de elevação da temperatura, preferencialmente em autoclave.
[00189] Segundo uma variante, as composições de acordo com a presente invenção são transparentes ou translúcidas.
[00190] Compreende-se que o termo “translúcido” indica que um objeto pode ser diferenciado quando sua composição for colocada entre o olho do observador e o objeto. Compreende-se o termo “transparente” como indicando que é possível diferenciar caracteres alfanuméricos quando a composição for colocada entre o olho do observador e os caracteres observados. Geralmente, esta avaliação é conduzida com uma composição com espessura de cerca de 1 cm. É também possível seguir o método da monografia 2.9.20 da Farmacopeia Europeia, para inspeção visual. É também possível medir a densidade óptica da composição, por exemplo, por meio de espectrometria de UV visível a 500 nm e garantir que a densidade óptica seja de menos de 0,5, preferencialmente 0,2 em comparação com um solvente de referência.
[00191] Segundo uma variante, as composições de acordo com a presente invenção não são ou são pouco opalescentes.
[00192] Compreende-se que o termo “opalescente” indica que a solução resulta em difração de luz visível a olho nu, por exemplo, por meio de inspeção visual de acordo com um método tal como o da monografia
2.9.20 da Farmacopeia Europeia e por meio de comparação com soluções de referência com diferentes níveis de opalescência da Farmacopeia Europeia.
Segundo uma variante, a composição de acordo com a presente invenção é incolor, ou seja, particularmente, um observador a olho nu não atribui cor específica à composição. Segundo uma variante, a opalescência é menor que o máximo tolerável para a aplicação pretendida.
[00193] A presente invenção refere-se especificamente a artigos ou embalagens, preferencialmente estéreis, que compreendem um ou mais dispositivos de instilação ou injeção previamente preenchidos com uma composição de acordo com a presente invenção. Estes são tipicamente dispositivos que permitem a instilação do produto na forma de gotas ou em seringas previamente cheias.
[00194] A composição de acordo com a presente invenção pode ser convenientemente esterilizada. A presente invenção refere-se,
portanto, a carboxialquil chitosan esterilizado. O carboxialquil chitosan é, portanto, estéril, particularmente para aplicações que o exigem.
[00195] Segundo uma variante, a composição de acordo com a presente invenção é esterilizada a vapor, por exemplo, elevando-se a temperatura até mais de 100 °C, preferencialmente mais de 120 °C, por exemplo 121 °C a 138 °C, em um autoclave, por período de tempo suficiente para esterilização, por exemplo, geralmente de 15 a 20 minutos. Segundo outra variante, a composição pode ser esterilizada por meio de filtragem utilizando filtros adaptados com este propósito, tais como filtros com porosidade menor ou igual a 0,2 µm.
[00196] Convenientemente, segundo uma realização preferida, a perda de viscosidade intrínseca do carboxialquil chitosan durante o processo de esterilização a vapor é de menos de 40%.
[00197] A presente invenção também inclui uma composição de acordo com a presente invenção em forma seca, particularmente em forma liofilizada.
[00198] É particularmente possível (re)dispersar essa composição liofilizada antes do uso.
[00199] A presente invenção também se refere a um método de tratmento terapêutico que compreende a injeção de uma composição de acordo com a presente invenção.
[00200] A presente invenção também inclui o uso de uma composição de acordo com a presente invenção para preparação de composições farmacêuticas, particularmente para tratamento terapêutico, por exemplo, conforme definido mais especificamente pela presente invenção.
[00201] A presente invenção também se refere a um método de tratamento estético ou, em outras palavras, não terapêutico, que compreende a injeção de uma composição de acordo com a presente invenção. Isso envolve, por exemplo, o preenchimento de rugas ou o preenchimento em uma ou mais áreas de tecido visível danificado, por exemplo, após um acidente ou intervenção cirúrgica, para fins estéticos.
[00202] Tecido é um conjunto de células similares que possuem a mesma origem, agrupadas entre si como unidade funcional, ou seja, que contribuem para uma mesma função. Dentre os tecidos, pode-se fazer menção de tecido epitelial, tecido conjuntivo, tecido muscular e tecido nervoso.
[00203] Compreende-se a expressão “composição de acordo com a presente invenção” ou equivalentes como indicando uma composição de acordo com a presente invenção, que inclui, de acordo com qualquer uma das suas variantes, realizações específicas ou particulares, independentemente ou de acordo com qualquer uma das suas combinações, incluindo de acordo com as características preferidas.
[00204] Outros objetos, características e vantagens da presente invenção tornar-se-ão evidentes para os técnicos no assunto após a leitura do relatório descritivo que faz referência aos exemplos fornecidos unicamente a título de ilustração e que não podem, de nenhuma forma limitar o escopo da presente invenção.
[00205] Os exemplos fazem parte integral da presente invenção e qualquer característica que pareça ser inovadora em comparação com qualquer documento do estado da técnica com base na descrição considerada integralmente, incluindo os exemplos, faz parte integral da presente invenção com relação à sua função e generalidade.
[00206] Cada exemplo possui, portanto, escopo geral.
[00207] Por outro lado, nos exemplos, todos os percentuais são fornecidos em massa, a menos que indicado em contrário, a temperatura é expressa em graus Celsius, a menos que indicado em contrário, e a pressão é pressão atmosférica, a menos que indicado em contrário.
[00208] Os chitosans precursores dos chitosans substituídos de acordo com a presente invenção possuem massa molecular média em viscosidade (determinada por meio de viscosímetro capilar) e grau de acetilação (DA, proporção de unidade de N-acetil-D-glicosamina, determinada por meio de titulação potenciométrica) compreendido nas faixas da Tabela 1. A massa molecular de chitosan pode ser também definida pela viscosidade dinâmica de uma solução com concentração de 1% (m/m) de chitosan em ácido acético com concentração de 1% (v/v), conforme medido por meio de um viscosímetro de fuso giratório, tal como viscosímetro Brookfield, conforme descrito na Tabela 1.
TABELA 1
[00209] Características dos chitosans precursores: Faixa de Faixa de massa molecular média Faixa de DA Faixa viscosidade a 1% (viscosimetria capilar) (% molar) (mPa.s) “Ultrabaixa” cerca de 20.000 - 60.000 5 - 20 5 - 20% “Baixa” cerca de 60.000 - 120.000 20 - 50 15 - 25% “Média” cerca de 120.000 - 150.000 50 - 80 20 - 30% “Alta” cerca de 150.000 - 220.000 80 - 120 25 - 40% “Ultra-alta” cerca de 220.000 - 300.000 120 - 200 25 - 40% “400k” cerca de 300.000 - 500.000 200 - 600 35 - 50%
[00210] Os métodos a seguir são utilizados na presente invenção, a menos que indicado em contrário.
[00211] A formulação a ser analisada é diluída em tampão de fosfato para obter concentração de polímero final de 0,05% e levemente agitada em seguida até a homogeneização. A solução é então separada em frações diferentes e o pH de cada uma das frações é ajustado no valor desejado de pH 4 a 8, seja por meio da adição de 0,1N hidróxido de sódio ou da adição de 0,1 N ácido clorídrico. O potencial zeta de cada fração é medido utilizando-se um aparelho “Nano-Z” (faixa Zeta-Sizer, Malvern Instruments).
[00212] A faixa de solubilidade é estabelecida por meio da preparação de solução do polímero a ser testado em concentração de 1% e pH 9, dividindo-o em diversas frações cujo pH é ajustado em diferentes valores de pH ao longo de uma faixa de 9 a 1. Cada fração é verificada pa´ra determinar que o polímero é solúvel (ou seja, não forma turvação), de acordo com o método de inspeção visual da monografia 2.9.20 da Farmacopeia Europeia. A faixa de pH ao longo da qual o polímero é solúvel ou insolúvel é anotada.
[00213] Utilizou-se um modelo de bolsa de ar subcutânea de camundongo para avaliar a reação em corpos estranhos e a imunocompatibilidade de diferentes polímeros derivados de chitosan de origem fúngica. Neste modelo, é produzida uma cavidade de bolsa de ar por meio de injeções subcutâneas repetidas de ar estéril nas costas de camundongos. A bolsa gerada pela inflação do ar imita a cavidade sinovial, de forma a fornecer um ambiente localizado no qual é possível estudar o estímulo da reação inflamatória no fluido retirado da bolsa de ar e dos tecidos circunvizinhos, conforme descrito, por exemplo, pela Segwick et al (em J. Pathol. 141, 483, 1983) e Sin et al (em Ann. Rheum. Dis. 45, 873, 1986). A cavidade da bolsa de ar permite a injeção de até 1 ml de produto em um animal que pesa cerca de 30 g. Segundo o protocolo descrito por Dawson et al (em Int. J. Tiss. Reac. 8, 171, 1991), a bolsa de ar é estabelecida em camundongos albinos suíços CD-1 machos não consanguíneos (livres de patógenos, peso corporal mediante recepção de 25 a 35 g) em linha do tempo de Dia 0 e Dia 4 por meio de injeção repetida de 5 ml e, em seguida, 3 ml de ar estéril. No Dia 7, uma única injeção subcutânea de 1 ml de produto é administrada diretamente na cavidade de bolsa de ar. Injeções de 1 ml de solução salina e solução de 1% de carrageno servem de controles negativo e positivo, respectivamente. Os animais são monitorados regularmente nas horas após a injeção para detectar eventuais sinais clínicos de toxicidade local ou sistêmica e a tomada de peso corporal e temperatura é realizada no momento de injeção e sacrifício. Os animais sofrem eutanásia após um período de contato com o produto por 24 horas (3 animais por produto). As avaliações imunológicas do fluido de lavagem recuperado da bolsa incluem a análise citológica (contagem e distribuição de glóbulos brancos e vermelhos) e a quantificação dos principais mediadores inflamatórios (IL-1- beta, TNF-alfa e KC/CXCL1) por meio de kits “ELISA" (AbCam), conduzida de acordo com as instruções. São conduzidas análise macroscópica e histopatológica por meio de manchas de hematoxilina/eosina dos tecidos da pele circunvizinhos. Presta-se atenção específica à localização do produto sobre os tecidos circunvizinhos, bem como sua ressorção no fluido.
[00214] Segundo a literatura e as recomendações da Sociedade Internacional de Pesquisas sobre Osteoartrite (OARSI), carneiros são reconhecidos como modelos bem caracterizados para determinar os efeitos da injeção intra-articular de tratamentos inovadores (Little et al em: Osteoarthritis Cartilage 18, S80, 2010; Edouard et al em: Phys. Ther. Sport. 14, 116, 2013; McCoy et al em: Vet. Pathol. 52, 803, 2015). O modelo de carneiro permite injeção por via intra-articular de um volume da formulação que simula o uso clínico de viscossuplementação em seres humanos (Fraser et al em: Semin. Arthritis Rheum. 22, 9, 1993). As medições da capacidade de tolerância local compreendem sinais clínicos de inflamação sinovial (efusão, claudicação e conforto), utilizando balanças clínicas semiquantitativas validadas, descritas por Shafford et al (em Vet. Anaesth. Analg. 31, 20, 2004) e Kaler et al (em Vet.
J. 180, 189, 2009), bem como a avaliação citológica do fluido sinovial. Em alguns casos, essas análises podem ser suplementadas pela avaliação anatômica e histológica do membro injetado. Um volume de 2 ml de formulação é injetado na articulação (asfixia) de carneiros saudáveis (idade de 2 a 6 anos; peso de 60 a 80 kg). Após a injeção, os sinais clínicos dos animais são registrados diariamente ao longo de um período de 15 dias, com base em uma escala semiquantitativa de 0 a 4 para efusão (apalpando-se a asfixia) e claudicação. É registrada a quantidade de sinais encontrados para cada uma das avaliações ao longo de todo o período de observação. A fim de avaliar os efeitos de injeções repetidas da mesma formulação, segunda injeção é administrada após um mês na articulação dos mesmos animais e os animais são monitorados em seguida de acordo com o mesmo protocolo da primeira injeção. Além disso, é realizada punção do fluido sinovial no dia 15 e os parâmetros macroscópicos (cor e viscosidade) e citológicos (contagem e distribuição de glóbulos brancos e vermelhos), bem como a quantidade total de proteínas do soro, são determinados de acordo com métodos convencionais. O fluido sinovial é considerado normal se o seu aspecto for transparente, viscoso e levemente amarelado e a análise citológica indicar que a quantidade de glóbulos brancos é de menos de 1x105 células/ml e a concentração total de proteínas é de cerca de 25 mg/ml.
EXEMPLO 1 N-SUCCINIL CHITOSANS
[00215] Os N-succinil chitosans que possuem massa molecular e estrutura molecular diferentes (graus de acetilação (DA) e grau de substituição pelo grupo succinila (DS)) foram preparados e caracterizados de acordo com o método geral descrito no pedido de patente WO 2016/016463 ou WO 2016/016464 (patente EP 3016663). Primeira etapa de acetilação por meio da adição de anidrido acético foi conduzida para aumentar o grau de acetilação, exceto pelo polímero CSS-1 (Tabela 1a).
[00216] As formulações foram preparadas com esses N- succinil chitosans (CSS) sob concentração de 2% em osmolaridade e pH fisiológico e embaladas em seringas de vidro. As seringas são esterilizadas por meio de autoclave com ciclo padrão (15 minutos a 121 °C). As formulações são verificadas para determinar que elas não exibem material insolúvel ou turvação ao longo de ampla faixa de pH em volta do pH fisiológico (pH 6,5 a 7,5), por meio de inspeção visual de acordo com o método EP 2.9.20. Verifica-se que o nível de endotoxinas bacterianas nas formulações é de menos de 20 EU/ml de acordo o método de monografia 2.6.14 (D) da Farmacopeia Europeia e a carga microbiológica é de menos de 100 cfu/g de acordo com o método 2.6.12 da Farmacopeia Europeia, antes de conduzir-se avaliação da sua imunocompatibilidade in vivo.
TABELA 1A
[00217] Características de N-succinil chitosans: DA ** DS ** N° Faixa de massa molecular (mol%) (mol%) CSS-1 Média 12 62 CSS-6 Baixa 50 34 CSS-8 Baixa 49 32 CSS-10 Alta 61 37 * Massa molecular de chitosan precursor, de acordo com a Tabela 1; ** DA e DS medidos por meio de NMR de prótons de acordo com o método descrito na patente EP 3016663.
[00218] A imunocompatibilidade das formulações de CSS é avaliada por meio do modelo de bolsa de ar subcutânea de camundongo (Tabela 1b). A reação observada é comparada com a reação observada após a injeção de uma solução salina (controle negativo), controle positivo muito reativo (solução de carrageno a 1%) e um produto comercial com base em Hylan GF-20, ácido hialurônico parcialmente reticulado (Synvisc®, Sanofi).
TABELA 1B
[00219] Imunocompatibilidade de formulações de N-succinil chitosan utilizando o modelo de bolsa de ar subcutânea de camundongo 24 horas após a injeção*: Número de Conc. em IL1- Conc. de Conc. de N° glóbulos brancos do beta (10-9 KC/CXCL1 TNF-alfa sangue (106 células/ml) g/ml)** (10-9 g/ml) (10-9 g/ml) ** CSS-1 1,5 / / / CSS-6 0,7 <3 137 < 125 CSS-8 3,7 / / / CSS-10 2,1 <3 > 700 < 125 Controles Controle negativo 0,2 17 23 272 (solução salina) Controle positivo (carrageno a 33,2 28 700 767 1%) Synvisc® 0,7 4 46 < 125 (Hylan GF-20) * valor médio de 3 animais; ** limite de detecção: 3x10-9 g/ml para IL1-beta e 125x10-9 g/ml para TNF-alfa.
[00220] Aparentemente, de forma geral, essas formulações com base em CSS causam reação imunológica do tipo de reação de corpos estranhos, conforme evidenciado pelo número de glóbulos brancos no infiltrado celular, que é mais alto que para o controle negativo, mas não tão alto quanto o controle positivo (carrageno a 1%). A reação induzida pelas formulações é caracterizada pela ativação dos neutrófilos, conforme comprovado pela concentração mais alta do marcador KC/CXCL1 que as do controle negativo e do produto Synvisc®. Com relação aos marcadores IL1-beta e TNF-alfa, seus níveis são baixos.
[00221] A modificação de DA e/ou DS do CSS ou, de fato, a modificação da sua massa molecular não resulta em nenhuma diferença de reação imunológica. Embora as formulações de CSS não causem efeitos prejudiciais sobre os tecidos localmente, é necessário poder obter nível mais alto de imunocompatibilidade no caso de aplicações terapêuticas dirigidas a tecidos enfraquecidos pela patologia correspondente, tal como síndrome dos olhos secos, lesões da córnea ou inflamações relativas a patologias das articulações.
EXEMPLO 2
[00222] Foi possível obter dois carboximetil chitosans de origem animal, para uso médico ou farmacêutico, que podem ser implantados ou injetáveis (CC-1 e CC-2 na Tabela 2a).
[00223] Dois outros carboximetil chitosans foram testados: - um CC obtido por meio de carboximetilação de chitina de origem animal (CC-3); e - um CC obtido por meio de carboximetilação de chitosan de origem animal, em que o chitosan foi preparado por meio de desacetilação de chitina de origem animal (CC-4).
[00224] Os carboximetil chitosans (CC) foram caracterizados por meio de NMR carbono 13, a fim de confirmar sua identidade e determinar os valores de DA (grau de acetilação) e DS (grau de substituição pelo grupo carboximetila), com margem de erro estimada de cerca de ± 10% (Tabela 2a).
A alteração eletrostática do polímero é caracterizada pela medição do seu potencial zeta em concentração de 0,05% (m/m) ao longo de uma faixa de pH de 8 a 4 e é relatado o valor do potencial zeta sob pH 7,5 (Tabela 2a).
Observa-se que o valor do potencial zeta sob pH 7,5 é relativamente bem correlacionado ao valor de DS determinado por meio de NMR carbono 13. O polímero CC-3, por exemplo, é substituído em maior quantidade que o polímero CC-4 pelo grupo carboximetila aniônico (em forma de carboxilato sob pH 7,5) e possui DA similar, de forma que a sua carga negativa geral é maior (-28 mV x - 11 mV sob pH 7,5).
[00225] Observa-se que os polímeros CC-1 e CC-2 não são muito solúveis na faixa de pH fisiológico (pH 6,5 a 7,5). Não é possível determinar sua imunocompatibilidade utilizando o modelo de bolsa de ar subcutâneo de camundongo. Os polímeros CC-3 e CC-4 são, de fato, solúveis ao longo de toda a ampla faixa de pH, de 1 a 9.
TABELA 2A
[00226] Características de carboximetil chitosans de origem animal e suas formulações: Capacidade de DS * Faixa de Potencial zeta DA * esterilização da N° (concentração) (% solubilidade do sob pH 7,5 (% molar) formulação por molar) polímero (mV) autoclave CC-1 Insolúvel sob pH 8 124 / / (2%) 3,6 a 8,1 CC- 2 Insolúvel sob pH / / / / (2%) de menos de 6,6 CC-3 Solúvel em todos 71 149 Não -28 (2%) os valores de pH CC-4 Solúvel em todos 69 24 Sim - 11 (1.5%) os valores de pH * Os valores DA e DS dos polímeros de carboximetil chitosan são determinados por meio de ressonância magnética nuclear (NMR) de carbono 13 em estado sólido.
[00227] As formulações CC-3 (2%) e CC-4 (1,5%) foram preparadas em seguida de acordo com o mesmo método do Exemplo 1, embaladas em seringas de vidro e esterilizadas em seguida por meio de autoclave segundo um ciclo padrão de 15 minutos a 121 °C (Tabela 2a).
Considera-se que a formulação de 2% do polímero CC-3 não suporta esterilização final por meio de autoclave, conforme comprovado pela perda de cerca de 60% da sua viscosidade intrínseca, que reflete a hidrólise do polímero, bem como por uma perda de 98% do seu módulo de conservação G’.
Como alternativa à esterilização final por autoclave, a formulação de CC-3 é filtrada em seguida, antes de ser embalada em uma seringa, a fim de produzir uma formulação que pode ser avaliada fazendo uso do modelo de bolsa de ar de camundongo.
[00228] As formulações de CC-3 (2%, filtradas) e CC-4 (1,5%, esterilizada por autoclave) são verificadas de forma a determinar que o nível de endotoxinas e a carga microbiológica são de menos de 20 EU/ml e 100 cfu/g e, em seguida, sua imunocompatibilidade é avaliada fazendo uso do modelo de bolsa de ar subcutâneo de camundongo (Tabela 2b).
TABELA 2B
[00229] Imunocompatibilidade de formulações de carboximetil chitosan de origem animal utilizando o modelo de bolsa de ar subcutânea de camundongo 24 horas após a injeção*: Número de Conc. de IL1- Conc. de Conc. de glóbulos brancos do N° beta (x10-9 KC/CXCL1 TNF-alfa sangue (x106 g/ml) (x10-9 g/ml) (x10-9 g/ml) ** células/ml) CC-3 0,7 <3 49 < 125 4 1,0 5 115 184 Controles Controle negativo 0,2 17 23 272 (solução salina) Controle positivo 33,2 28 > 700 767 (carrageno a 1%) Synvisc® 0,7 4 46 < 125 (Hylan GF20) * Valor médio de três pacientes; ** limite de detecção: 3x10-9 g/ml para IL1-beta e 125x10-9 g/ml para TNF-alfa.
[00230] A formulação de CC-4 causa reação significativa, caracterizada por alta concentração dos dois marcadores KC/CXCL1 (ativação de neutrófilos) e TNF-alfa no infiltrado, simultaneamente. O marcador TNF-alfa não foi detectado após a injeção das formulações de CSS do Exemplo 2 ou Synvisc® (Hylan GF-20). Não é desejável, entretanto, induzir reação caracterizada pelo marcador TNF-alfa. Como é desejável ter boa imunocompatibilidade no caso de aplicações terapêuticas para as quais se espera que a formulação esteja em contato com tecidos enfraquecidos pela patologia, tal como, por exemplo, síndrome dos olhos secos, danos ou lesões da córnea ou inflamações articulares, e evitar a ativação de neutrófilos e TNF-alfa, o carboximetil chitosan de CC-4 de origem animal não é apropriado.
[00231] A formulação de CC-3 induz reação mais fraca, caracterizada por uma série de glóbulos brancos e concentração moderada do marcador KC/CXCL1, similar aos níveis do produto comparador Synvisc®, mas acima do controle negativo (solução salina). A formulação de CC-3 aparentemente, portanto, é menos imunorreativa que as formulações de CSS e a formulação de CC-4. A formulação de CC-3 apresenta, entretanto, a desvantagem de ter concentração do marcador KC/CXCL1 que poderá ser comprovadamente inadequada para um método de tratamento terapêutico, em que o paciente necessita de imunocompatibilidade muito boa e passar por forte hidrólise das cadeias macromoleculares sob o efeito de calor, o que torna impossível, portanto, sua esterilização por meio de autoclave durante uma última etapa ao final do processo de produção, ou seja, após o enchimento da seringa com a formulação.
EXEMPLO 3
[00232] A fim de obter os carboximetil chitosans das Tabelas 3a e 3b a partir de chitina ou chitosan de origem fúngica, são conduzidas as reações a seguir: - reacetilação seguida pela carboximetilação de chitosan fúngico com massa molecular “ultra-alta” (CC-5 da Tabela 3a);
- carboximetilação seguida pela reacetilação de chitosan fúngico com massa molecular “ultra-alta” (CC-5 a CC-9); - carboximetilação de chitosan fúngico com massa molecular “ultra-alta” (CC-11); e - carboximetilação de chitina fúngica (CC-10).
[00233] Como forma de exemplo, a preparação de CC-8 tem lugar conforme segue: 10 g de chitosan “ultra-alto” são dispersos em 220 ml de isopropanol e 68 ml de hidróxido de sódio a 40% (m/v). 45 g do agente alquilante ácido monocloroacético (MCA) são dissolvidos em 45 ml de isopropanol e adicionados à suspensão de chitosan. A reação é mantida em prosseguimento por um período de 16 horas a 25 °C. O polímero é recuperado por meio de precipitação em etanol e purificado em seguida por ciclos de solubilização/precipitação em etanol. O precipitado é seco em forno ventilado.
Massa de 15 g do precipitado é dispersa em água e 3,75 ml de anidrido acético são adicionados. Após 30 minutos de agitação à temperatura ambiente, o pH do meio é ajustado em 6 e são adicionados 3,75 ml de anidrido acético (AC). Após 30 minutos de agitação à temperatura ambiente, o meio é neutralizado e precipitado em etanol. O precipitado obtido desta forma é novamente dissolvido e precipitado novamente em seguida. O precipitado final de carboximetil chitosan (CC-8) é seco em um forno ventilado.
[00234] Os parâmetros de síntese aplicados para preparar os outros CCs são descritos nas Tabelas 3a e 3b.
TABELA 3A
[00235] Parâmetros de síntese de carboxialquil chitosan a partir de chitosan fúngico: Parâmetros CC-5 CC-6 CC-7 CC-8 CC-9 CC-11 Etapa de carboximetilação Agente alquilante
SCA MCA MCA MCA MCA MCA (MCA ou SCA)* NaOH/chitosan (m/m) 11 2,7 2,7 2,7 2,7 2,7
Parâmetros CC-5 CC-6 CC-7 CC-8 CC-9 CC-11 Ureia Sim Não Não Não Não Não Agente alquilante/chitosan 11,2 9 9 4,5 4,5 6,8 (m/m) Isopropanol/agente alquilante 0% 80% 80% 80% 80% 80% (%, m/m) Temperatura (°C) 15 °C 15 °C 25 ° C 25 °C 35 °C 60 °C Duração (horas) 22 h 16 h 16 h 16 h 4h 1h Etapa de reacetilação Antes ou depois da antes depois depois depois depois / carboximetilação AC/chitosan (v/m) -primeira adição 0,3 0,25 0,25 0,25 0,25 / -segunda adição 0,3 0,25 0,25 0,25 0,25 Duração e 0,5 hora a 0,5 hora a 0,5 hora a 0,5 hora a 0,5 hora a / temperatura da reação 25 °C 25 °C 25 °C 25 °C 25 °C * MCA: ácido monocloroacético; e SCA: sal de sódio de ácido monocloroacético.
TABELA 3B
[00236] Parâmetros de síntese de carboxialquil chitosan a partir de chitina fúngica: Parâmetros CC-10 Chitina/soda/água (m/m) 1/11,4/28,5 Duração e temperatura de contato com soda 16 horas a 4 °C Agente alquilante (MCA ou SCA) MCA Chitina/isopropanol/agente alquilante 1/28,5/4,5 (m/m/m) Duração e temperatura da reação 16 horas a 25 °C
[00237] Os carboximetil chitosans (CC) de origem fúngica obtidos são caracterizados por meio de NMR carbono 13, a fim de confirmar sua estrutura e determinar o valor de DA e DS (Tabela 3c). Considerando-se o desvio padrão inerente ao método de espectrometria NMR carbono 13 (cerca de ± 10%), observa-se que o valor do potencial zeta a pH 7,5 é correlacionado à estrutura molecular, particularmente DS.
TABELA 3C
[00238] Características de carboximetil chitosans de origem fúngica e suas formulações: DA* DS* Solubilidade do Esterilizável por Potencial Zeta N° (concentração) % % polímero autoclave** sob pH 7,5 (mV) Solúvel em CC-5 (1,5%) 67 18 Sim -12.5 qualquer pH Solúvel em CC-6 (2%) 71 42 Sim -15 qualquer pH Solúvel em CC-7 (2%) 57 70 Sim -18 qualquer pH Solúvel em CC-8 (2%) 50 80 Sim -26 qualquer pH Solúvel sob pH > CC-9 (2%) 41 101 Sim -22 3,1 Solúvel em CC-10 (2%) 46 167 Sim -24.5 qualquer pH Solúvel sob pH > CC -11 (2%) 23 130 Sim -26 3,5 * DA e DS conforme determinado por meio de NMR 13C; ** considerado esterilizável se a perda da viscosidade intrínseca antes/após a esterilização for de menos de 40%.
[00239] Todos os CCs obtidos são solúveis ao longo de ampla faixa de pH, particularmente ao longo da faixa de pH de 4,0 a 8,5, sem opalescência.
[00240] As formulações são preparadas em concentração em CC de 1,5 ou 2%, embaladas em seringas de vidro, esterilizadas em seguida por meio de autoclave de acordo com um ciclo padrão de 15 minutos a 121 °C. A fim de avaliar se as formulações são esterilizáveis por meio de autoclave, a viscosidade intrínseca dos polímeros é medida antes e depois do autoclave por meio de viscosimetria capilar, após diluição em fator de 25 com tampão de fosfato. A perda da viscosidade intrínseca de CC é de menos de 40%, o que indica resistência aceitável, ao contrário da formulação de CC-3 do Exemplo 2 (que sofreu perda de cerca de 60% da sua viscosidade intrínseca).
[00241] Inspeção visual das formulações esterilizadas da Tabela 3c indica que elas são transparentes e não opalescentes. Elas são então verificadas para determinar que o nível de endotoxinas e a carga microbiológica são de menos de 20 EU/ml e 100 cfu/g e, em seguida, sua imunocompatibilidade é avaliada fazendo uso do modelo de bolsa de ar subcutânea de camundongo.
TABELA 3D
[00242] Imunocompatibilidade das formulações de carboximetil chitosan de origem fúngica utilizando o modelo de bolsa de ar subcutânea de camundongo 24 horas após a injeção* Número de Conc. em Conc. em Conc. em N° glóbulos brancos IL1-beta KC / CXCL1 TNF-alfa (x106 células/ml) (x10-9g / ml) (x10-9g / ml) ** (x10-9g / ml) ** CC-5 1,9 6 28 391 CC-6 17 12 20 < 125 CC-7 9,0 12 20 < 125 CC-8 2,6 <3 20 < 125 CC-9 6,5 7 20 < 125 CC-10 2,4 <3 16 < 125 Controles Controle negativo 0,2 17 23 272 (solução salina) Controle positivo 33,2 28 > 700 767 (carrageno a 1%) Synvisc® 0,7 4 46 < 125 (Hylan GF20) * Valor médio de três pacientes; ** limite de detecção: 3x10-9 g/ml para IL1-beta e 125x10-9 g/ml para TNF-alfa.
[00243] Observa-se geralmente que existe boa imunocompatibilidade das formulações de CC de origem fúngica, com atenuação ou mesmo supressão da reação imunológica em comparação com as formulações de N-succinil chitosan do Exemplo 1 e às formulações de carboximetil chitosan de origem animal do Exemplo 2.
[00244] Observou-se que baixa concentração do marcador KC/CXCL1 é induzida pelas formulações de CC de origem fúngica, ao mesmo nível do controle negativo (solução salina) e inferior ao produto Synvisc®. Isso reflete ativação de neutrófilos desprezível ou mesmo ausente, ao contrário do nível que foi relatado após a injeção das formulações de CSS (Exemplo 1) e de CC de origem animal (Exemplo 2).
[00245] Além disso, observa-se que, para algumas das formulações de CC de origem fúngica (ou seja, CC-8 e CC-10), os quatro parâmetros da reação imunológica são atenuados ou suprimidos simultaneamente, ou seja, o número total de glóbulos brancos, o marcador IL-1 beta, o marcador KC-CXCL1 e o marcador TNF-alfa. Isso não acontece com as formulações de CSS, nem com as formulações de CC de origem animal.
[00246] Aparentemente, para os CCs de origem fúngica, as formulações que exibem esta atenuação simultânea dos quatro parâmetros são as que possuem carga negativa mais alta (por exemplo, -26 mV para CC-8 e - 24,5 mV para CC-10 sob pH 7,5).
[00247] Observa-se que as formulações de CC-4 de origem animal do Exemplo 2 e CC-5 de origem fúngica com fraca substituição pelo grupo carboxialquila causam certa ativação do marcador TNF-alfa e, por outro lado, somente a formulação de CC-4 de origem animal gera secreção significativa do marcador KC/CXCL1. Observa-se ainda que a formulação de CC-10 (de origem fúngica) não resultou em ativação dos neutrófilos, ao contrário da formulação de CC-3 de origem animal do Exemplo 2.
EXEMPLO 4 AVALIAÇÃO DA TOLERÂNCIA LOCAL INTRA-ARTICULAR DE FORMULAÇÕES DE
[00248] Formulações com 2% de dois carboximetil chitosans de origem fúngica (CC-8 e CC-10) descritos no Exemplo 3 são preparados a fim de determinar seu potencial de uso por meio de injeção intra-articular, utilizando um modelo ovino. É administrado ao carneiro um volume de 2 ml das duas formulações e a reação local induzida pela sua injeção intra-articular é avaliada ao longo de um período de duas semanas. Os efeitos de segunda injeção da formulação de CC-8 na mesma articulação, um mês após a data da primeira injeção, também foram avaliados. O produto Synvisc® é administrado da mesma forma, com volume de 1 ml ou 2 ml.
[00249] Os sinais clínicos são monitorados diariamente apalpando-se a articulação e observando-se a claudicação ao longo de um período de 15 dias, analisado com base em avaliação semiquantitativa de 0 (ausência de sinal) até avaliação máxima de 3 para efusão e 5 para claudicação. O resultado clínico geral ao longo do período de 15 dias é relatado em termos de incidência por avaliação (Tabela 4), bem como a caracterização do fluido sinovial produzido no dia 15.
TABELA 4
[00250] Avaliação da tolerância local de formulações de carboximetil chitosan de origem fúngica e Synvisc® utilizando um modelo em ovinos, por meio de injeção intra-articular: Caracterização do Formulação n° Incidência de efusão Incidência de fluido sinovial Volume ao longo de 15 dias claudicação ao longo puncionado no dia (N: n° de animais) (nota 0 a 3) de 15 dias (nota 0 a 5) 15 CC-8 Nota 0: 100% Nota 0: 100% Primeira injeção de 2 ml Normal Notas 1 a 3: 0% Notas 1 a 5: 0% (N = 4) CC-8 Nota 0: 100% Nota 0: 100% Segunda injeção de 2 ml Normal Notas 1 a 3: 0% Notas 1 a 5: 0% (N = 2) CC-10 Nota 0: 100% Nota 0: 100% Uma injeção de 2 ml Normal Notas 1 a 3: 0% Notas 1 a 5: 0% (N = 4) Synvisc® (Hylan GF-20) N = 8, dos quais: Nota 0: 62,5% Nota 0: 62,5% -uma injeção de 1 ml (N = Nota 1: 37,5% Nota 1: 37,5% Normal 4) Notas 2 a 3: 0% Notas 2 a 5: 0% - uma injeção de 2 ml (N = 4) EXEMPLO 5
[00251] Formulações de três carboximetil chitosans de origem fúngica com osmolaridade e pH fisiológico são preparadas com vistas à avaliação do seu potencial para administração intradérmica, utilizando um modelo de coelho (Tabela 5a). CC-12, CC-13, CC-14 e CC-15 de origem fúngica são preparados por meio de carboximetilação, seguida por reacetilação de acordo com o método geral descrito no Exemplo 3 para CC-8, modulando ao mesmo temo os parâmetros de síntese, de forma a causar variação de DA e DS (Tabela 5a). CC-13 e CC-14 apresentam baixo DS de 41% e 51%, respectivamente, e alto DA de 74% e 69%, respectivamente.
[00252] As formulações são embaladas em uma seringa de 1 ml e esterilizadas por autoclave em seguida de acordo com um ciclo padrão (15 minutos a 121 °C). As três formulações são resistentes à esterilização em autoclave, em que a perda de viscosidade intrínseca é de menos de 40%. Por fim, as formulações são verificadas de forma a determinar que o nível de endotoxinas bacterianas é de menos de 40 EU/ml e a carga microbiológica é de menos de 100 cfu/ml.
[00253] Volume de 200 µl de formulação é administrado a coelhos por meio de injeção intradérmica por uma agulha com diâmetro de gauge 27 (agulha com diâmetro muito pequeno), de acordo com um protocolo que atende à norma ISO 10993 (parte 10) para avaliação da irritação primária induzida por um implante intradérmico. Ao todo, seis coelhos recebem três injeções de cada formulação cada um. Um produto de carga dérmica comercial com base em ácido hialurônico reticulad, Juvéderm® Voluma (Allergan), também é injetado por meio de uma agulha com diâmetro de 27 gauge. Sinais macroscópicos de irritação da pele são relatados para todos os animais e locais injetados em 12, 24 e 48 horas com vistas a determinar a avaliação de irritação primária, determinando o possível surgimento de eritema, escaras,
edema e endurecimento em escala semiquantitativa, com base em avaliação de 0 (sem sinal) a 4 (sinal máximo). A avaliação de irritação primária de cada produto é determinada conforme segue: é adicionada a média das avaliações de eritema dos 18 locais injetados após 24, 48 e 72 horas. A soma das médias da avaliação de edema é calculada conforme segue. As duas somas (eritema e edema) são adicionadas e divididas por 54 em seguida para obter a avaliação de irritação primária média. A mesma forma de procedimento é seguida com o produto comparativo. As avaliações de irritação são relatadas na Tabela 5b.
Observa-se que as formulações de CC não produziram sinais de edema e produziram poucos sinais de eritema, com avaliação menor que a induzida por Juvéderm® Voluma em todos os casos. Conclui-se que as formulações não são irritantes e são menos irritantes que Juvéderm® Voluma.
TABELA 5A
[00254] Características de carboximetil chitosans de origem fúngica e suas formulações: Potencial zeta N° DA* DS* Solubilidade do Esterilizável sob pH 7,5 (concentração) (% molar) (% molar) polímero por autoclave** (mV) Insolúvel sob pH CC -12 (3%) 41 50 Sim -17 3,1 a 6,6 Solúvel em CC-13 (3%) 74 45 Sim -20 qualquer pH Solúvel acima de CC-14 (3%) 69 51 Sim -17 *** pH 3,6 Solúvel acima de CC-15 (2%) 55 100 Sim -27,5 pH 3,1 * conforme determinado por meio de NMR 13C; ** considerado esterilizável se a perda da viscosidade intrínseca antes/depois da esterilização por autoclave for menor ou igual a 40%; *** valor estimado a partir da regressão polinomial da curva de potencial zeta sob pH 7,5 em função de DS (± 20%). TABELA 5B
[00255] Avaliação da nota de irritação primária de formulações de carboximetil chitosan e Juvéderm® Voluma após injeção intradérmica em coelhos: N° Avaliação da irritação primária após 72 horas (concentração) Nota total (nota média) CC-12 (3%) 0,11 (0,002) CC-13 (3%) 0,22 (0,004) CC-13 (3%) 0,17 (0,003) CC-14 (2%) 0 (0) Juvéderm® Voluma 2,67 (0,049)
[00256] O período de observação é estendido em seguida para duas semanas após a injeção, com avaliação dos sinais clínicos nos dias 5, 7, 9, 11 e 14. A fim de conduzir possível análise histológica, dois animais foram sacrificados no Dia 3, Dia 7 e Dia 14 após a injeção.
[00257] As avaliações macroscópicas são relatadas na Tabela 5c. Observa-se que as quatro formulações exibem excelente tolerância local ao longo de um período de duas semanas após injeção intradérmica, com notas mais baixas que as observadas com o produto Juvéderm® Voluma para todos os sinais macroscópicos e nenhum sinal de escara ou edema. As formulações de CC-12 e CC-13 exibem alguns sinais de baixa nota de eritema (máximo 1) que desapareceram no Dia 11. A formulação de CC-13 exibe alguns sinais de eritema com avaliação máxima de 2, com incidência de 33% no Dia 9, que também desapareceu no Dia 11 e não resultou em efeito prejudicial sobre o tecido.
TABELA 5C
[00258] Avaliação da tolerância local de formulações de carboximetil chitosan após injeção intradérmica em coelhos (duas semanas) (expressa em termos de incidência das notas): Quadro de N° Dia 3 Dia 5 Dia 7 Dia 9 Dia 11 Dia 14 tempo (concentração) (18) (12) (12) (6) (6) (6) (n° de locais)* Nota de eritema Nota 0-1 100% 100% 100% 100% 100% 100% CC-12 (3%) Nota 2-4 0% 0% 0% 0% 0% 0%
Quadro de N° Dia 3 Dia 5 Dia 7 Dia 9 Dia 11 Dia 14 tempo (concentração) (18) (12) (12) (6) (6) (6) (n° de locais)* Nota 0-1 100% 100% 83% 67% 100% 100% CC-13 (3%) Nota 2-4 0% 0% 17% 33% 0% 0% Nota 0-1 100% 100% 100% 100% 100% 100% CC-14 (3%) Nota 2-4 0% 0% 0% 0% 0% 0% Nota 0-1 100% 100% 100% 100% 100% 100% CC-15 (2%) Nota 2-4 0% 0% 0% 0% 0% 0% Juvéderm® Nota 0-1 6% 17% 17% 17% 33% 33% Voluma Nota 2-4 94% 83% 83% 83% 67% 67% Notas de escaras e edema Nota 0-1 100% 100% 100% 100% 100% 100% CC-12 (3%) Nota 2-4 0% 0% 0% 0% 0% 0% Nota 0-1 100% 100% 83% 67% 100% 100% CC-13 (3%) Nota 2-4 0% 0% 17% 33% 0% 0% Nota 0-1 100% 100% 100% 100% 100% 100% CC-14 (3%) Nota 2-4 0% 0% 0% 0% 0% 0% Nota 0-1 100% 100% 100% 100% 100% 100% CC-15 (2%) Nota 2-4 0% 0% 0% 0% 0% 0% Juvéderm® Nota 0-1 100% 100% 100% 100% 100% 100% Voluma Nota 2-4 0% 0% 0% 0% 0% 0% * número de locais avaliados macroscopicamente em cada espaço de tempo após a injeção.
[00259] Além disso, as quatro composições (CC-12, CC-13, CC-14 e CC-15) podem ser facilmente injetadas através de uma agulha fina de Gauge 27, apropriada para administração intradérmica.
EXEMPLO 6
[00260] Neste exemplo, realiza-se comparação da velocidade de degradação da formulação na presença de uma mistura das duas enzimas lisozima e hialuronidase presentes em fluidos biológicos (por exemplo, fluido sinovial, lágrimas ou o fluido intersticial de tecidos conectivos).
A enzima lisozima é geralmente reconhecida pela sua capacidade de hidrolisar biomateriais com base em chitosan.
[00261] Carboximetil chitosan fúngico CC-16 é preparado da mesma forma que CC-8 do Exemplo 3, por meio de modulação dos parâmetros de síntese, a fim de ajustar DA e DS. As formulações de 2% de CC-16, CC-8
(Exemplo 3) e CC-10 (Exemplo 3) são preparadas em tampão de fosfato com 3,5% de sorbitol. Realiza-se também determinação de formulação de 2% de CC-3 de origem animal (Exemplo 2) e dois produtos de viscossuplementação comerciais com base em ácido hialurônico não reticulado (HA-1 e HA-2).
[00262] A formulação é diuída por fator de 25 em tampão de fosfato. A solução é agitada em seguida por um período de 12 horas e uma mistura das enzimas lisozima e hialuronidase é adicionada à solução diluída em doses de 184 unidades/ml e 2,6 unidades/ml, respectivamente. A medição da viscosidade intrínseca é conduzida em intervalos regulares, por meio de viscômetro capilar automático I-Visc (Lauda) equipado com capilar do tipo Ubbelohde (modelo 0a). A meia vida de cada formulação, ou seja, o tempo necessário para que a viscosidade intrínseca do polímero atinja a metade do seu valor inicial, é calculada em seguida (Tabela 6).
TABELA 6
[00263] Meia vida de formulações na presença de uma mistura das enzimas lisozima/hialuronidase a 37 °C: CC-8 CC-10 CC-16 CC-3 HA-1 HA-2 (2%) (2%) (2%) (2%) DA/DS (% molar)* 50 / 80 46 / 167 67 / 115 71 / 149 / / meia vida (minutos) 1200 min 958 min 612 min 88 min 73 min 11 min * determinados por ressonância magnética nuclear (NMR) de carbono 13 em estado sólido.
[00264] Compreende-se a partir dos resultados que as formulações de carboximetil chitosan são hidrolisadas pela mistura de lisozima/hialuronidase e a cinética de hidrólise pode ser modulada por meio da estrutura molecular de carboximetil chitosan. Isso possibilita ajustar a duração da permanência do produto de acordo com a aplicação terapêutica desejada.
Conclui-se também que os carboximetil chitosans de origem fúngica são degradados com menos rapidez que carboximetil chitosan de origem animal
(CC-3) e que os dois produtos comerciais com base em ácido hialurônico.
EXEMPLO 7
[00265] Neste exemplo, as seringas que contêm as formulações são colocadas em forno sob temperatura controlada a 60 °C pelo período de 11 dias, o que possibilita determinar sua resistência ao calor sob temperatura mais alta que a temperatura de armazenagem habitual. Em cada espaço de tempo, uma seringa é retirada e a viscosidade intrínseca do polímero é medida de acordo com o método descrito no Exemplo 6. A razão entre a viscosidade no dado espaço de tempo e a viscosidade inicial é relatada (em % da viscosidade inicial).
[00266] Dois carboximetil chitosans de origem fúngica, CC- 17 e CC-18, são preparados da mesma forma que CC-8 do Exemplo 3, por meio de modulação dos parâmetros de síntese, de forma a ajustar DA e DS, caracterizados por meio de NMR de carbono 13 (Tabela 7). Eles são formulados sob concentração de 2% na presença de açúcar redutor, sorbitol ou manitol, respectivamente. Realiza-se também determinação de formulação de 2% de CC-3 de origem animal indicado no Exemplo 2 (com 3,5% de sorbitol), bem como o produto de viscossuplementação baseado em ácido hialurônico não reticulado no Exemplo 6 (HA-2).
TABELA 7
[00267] Evolução da viscosidade intrínseca das formulações armazenadas a 60 °C (em % da viscosidade intrínseca inicial) N° (concentração, açúcar DA / DS Dia 3 Dia 7 Dia 11 de redução) (% molar)* CC-17 71 / 49 96% 95% 91% (2%, 3,5% sorbitol) CC-18 71 / 49 100% 92% 91% (2%, 3,5% manitol) CC-3 71 /149 84% 80% 70% (2%, 3,5% sorbitol)
N° (concentração, açúcar DA / DS Dia 3 Dia 7 Dia 11 de redução) (% molar)* HA-2 / 94% 92% 81% * determinados por meio de ressonância magnética nuclear (NMR) de carbono 13 em estado sólido.
[00268] Concluiu-se que as formulações de carboximetil chitosan de origem fúngica são resistentes ao calor e menos sensíveis que a formulação de origem animal (CC-3) e que um produto com base em ácido hialurônico comercial.
EXEMPLO 8
[00269] Carboximetil chitosan de origem fúngica, CC-19, é produzido de acordo com o método utilizado para preparar o CC-8 do Exemplo 3, a partir de chitosan “ultra-alto”. Suas características são as seguintes: DA 67% e DS 115% (medidos por meio de NMR de carbono 13), solúvel em qualquer pH, transparente e não opalescente. O potencial zeta sob pH 7,5 da formulação é estimado em -27 mV (a partir da regressão polinomial da curva de potencial zeta em função de DS). Uma formulação de CC-19 a 2% em tampão de fosfato com sorbitol a 3,5% é preparada conforme descrito no Exemplo 3.
Suas características são as seguintes: pH 7,3 e osmolaridade de 279 mOsm/kg. A fim de testar sua viabilidade e o impacto sobre as características finais da formulação, dois métodos conhecidos são efetivamente implementados, a fim de reduzir a carga microbiológica de formulações aquosas, a viscosidade intrínseca da formulação (diluída em fator de 25) é comparada utilizando-se um viscômetro capilar I-Visc (Lauda, 0a capilar) e seu índice de refração é medido utilizando-se um refratômetro HI88713 (Hanna) antes e depois do processo (Tabela 8). Os dois métodos são os seguintes: - autoclave: a formulação é colocada em uma seringa de vidro e, em seguida, a seringa é autoclavada de acordo com processo padrão
(15 minutos a 121 °C); e - filtragem: volume de 300 ml de formulação é filtrado utilizando-se filtro com porosidade de 0,2 µm (filtro de cápsula Preflow, Pall).
[00270] O processo de filtragem em um filtro de 0,2 µm tem lugar de forma apropriada, com pressão constante de 2 bar e velocidade de fluxo constante de cerca de 6 litros por hora.
TABELA 8
[00271] Impacto dos métodos de filtragem e autoclave sobre a formulação de CC-19 a 2%: Método de filtragem Método de autoclave Indicador (0,2 µm) (15 min, 121 °C) Diferença de viscosidade 14% de redução da 20% de redução da intrínseca (%) viscosidade inicial viscosidade intrínseca Diferença do índice de Sem diferença Sem diferença refração
[00272] Concluímos que os dois métodos possuem baixo impacto em termos de redução de material (índice de refração) e degradação do polímero (viscosidade intrínseca). Eles possuem, portanto, aplicação industrial, a fim de obter dispositivos médicos e produtos farmacêuticos com base nas formulações de carboximetil chitosan.
EXEMPLO 9
[00273] Este exemplo busca ilustrar a capacidade de lubrificação de formulações de dois carboximetil chitosans de origem fúngica, CC-8 do Exemplo 3 (2% e 1%) e CC-19 do Exemplo 8 (2%), com vistas ao seu possível uso como viscossuplemento intra-articular ou como gota oftálmica para a superfície ocular. A capacidade lubrificante é avaliada por meio do uso de modelo in vitro, que possibilita determinar a redução da fricção entre duas superfícies. A formulação de CC-3 (2%) de origem animal do Exemplo 2 e dos produtos comerciais com base em ácido hialurônico é também caracterizada: - viscossuplementos intra-articulares: Synvisc® (Sanofi) e dois viscossuplementos com base em ácido hialurônico não reticulado, HA-2 dos Exemplos 6 e 7 e HA-3; e - gotas oftálmicas: dois produtos com base em ácido hialurônico não reticulado (HA-4 e HA-5).
[00274] Além disso, fluido sinovial é retirado do joelho do paciente que sofre de osteoartrose, antes do procedimento cirúrgico para colocação de prótese do joelho. O fluido é armazenado a -20 °C e trazido em seguida para 25 °C antes da análise do coeficiente de fricção.
[00275] O coeficiente de fricção é medido de acordo com o método a seguir. Dois discos feitos de biomaterial do tipo poliacrilato utilizado para fabricação de lentes intraoculares hidrofóbicas (conforme descrito na patente EP 1830898), com diâmetro de 16,15 mm, são antecipadamente hidratados por meio de imersão em água a 60 °C por um período de cerca de duas horas e fixados em seguida às geometrias superior e inferior de um Reômetro DHR-2 (TA Instruments). Volume de cerca de 100 µl do fluido a ser testado é colocado sobre o disco inferior, a geometria superior é rebaixada em seguida até entrar em contato entre os dois discos, até força normal imposta de 5 Newtons. As medições de coeficiente de fricção são conduzidas a 25 °C por um período de 150 segundos, sob força normal constante (5 N), frequência de oscilação de 1256 rad/s e ângulo de deformação de cerca de 0,05 radianos, de acordo com um protocolo adaptado a partir do protocolo descrito por Waller et al (em: J. Rheumatol. 39, 7, 1473, 2012). A opção “atender ao ponto zero de início de movimento oscilatório" é ativada. Em cada ponto de medição, o valor de torque é registrado e, em seguida, o coeficiente de fricção (COF) é calculado de acordo com a fórmula: COF = torque / (1/3 x diâmetro do disco x força normal). Para cada formulação, a medição é reproduzida por cinco vezes.
O valor do coeficiente de fricção é relatado por meio de extrapolação da ordenada na origem de cada curva de COF em função de tempo (COF0, Tabela 7).
TABELA 9
[00276] Capacidade de lubrificação das formulações de carboximetil chitosan de origem fúngica: N° Coeficiente de fricção (COF0) (concentração) Medição 1 Medição 2 Medição 3 Fluido sinovial de paciente 20 40 12 com artrose CC-8 (2%) 1,2 1,7 1,3 CC-8 (1%) 2,4 3,7 3,9 CC-19 (2%) 4,0 3,2 3,0 CC-3 (2%) 6,2 6,1 6,0 Synvisc® 3,2 3,1 3,8 HA-2 6,7 6,3 6,6 HA-3 5,3 5,6 4,5 HA-4 6,8 6,7 6 ,0 HA-5 29,4 13,3 26,1
[00277] Na presença das formulações de 2% e 1% de carboximetil chitosan, o coeficiente de fricção é baixo, da mesma ordem de magnitude ou até menor que produtos disponíveis comercialmente para uso intra-articular e oftálmico e significativamente mais fraco que o de fluido sinovial de artrose, sob as condições de medição. Deduz-se que as formulações de carboximetil chitosan possuem potencial de agir como lubrificante por meio de redução da fricção entre duas superfícies, tais como as superfícies de cartilagem de uma articulação após injeção intra-articular ou a superfície ocular após instilação na forma de gotas. As formulações de CC de origem fúngica são mais eficazes na redução da fricção que a formulação de CC-3 de origem animal.
EXEMPLO 10
[00278] Este exemplo busca demonstrar que uma formulação de 2% de carboximetil chitosan com origem fúngica pode ser facilmente injetada na derme, particularmente utilizando agulhas muito finas projetadas para injeção nas camadas superficiais da derme. O teste consiste na medição da força necessária para ejetar o produto para fora da seringa equipada com uma agulha, em dada velocidade de ejeção, com o auxílio de uma bancada de teste de compressão. Considera-se empiricamente que a injeção do produto é fácil e confortável para o médico e o paciente quando a força de ejeção medida por este teste for de menos de 50 Newtons e a ejeção ocorrer de forma suave e regular. É conveniente poder administrar o produto utilizando agulhas com diâmetro de menos de 0,3 mm (30G), a fim de minimizar a dor e o sangramento na injeção, bem como o risco subsequente de hematomas e vermelhidão da pele.
[00279] Carboximetil chitosan de origem fúngica de referência CC-20 é produzido de acordo com o método geral de CC-8 indicado no Exemplo 3, a partir de chitosan do tipo “ultra-alto”, com as modificações a seguir: para 10 g de chitosan, utiliza-se 228 ml de isopropanol, 57 ml de hidróxido de sódio a 40% e 47 g de MCA. A reação é conduzida a 35 °C por um período de 23 horas. Para 15 g de intermediário carboximetil chitosan, utiliza-se 7,5 ml de anidrido acético em cada adição e três ciclos de purificação adicionais são aplicados antes da secagem e recuperação do carboximetil chitosan final. As características de CC-20 são as seguintes: DA 53% e DS 85% (determinado por meio de NMR de carbono 13), solúveis em água a qualquer pH (de acordo com o método descrito acima), formando uma solução transparente e não opalescente, com potencial zeta sob pH 7,5 estimado a -24 mV (a partir da regressão polinomial da curva de potencial zeta em função de DS).
[00280] Formulação de CC-20 a 2% (m/m) é preparada conforme descrito no Exemplo 3. A formulação é acondicionada em uma seringa de vidro de 1 ml (BD-Medical) sobre a qual a agulha é adaptada. Por meio de uma bancada de teste de compressão MultiTest 2.5-i (Mecmesin) equipada com uma célula de compressão de 100 N, a força necessária para ejetar o produto é medida por meio da aplicação de velocidade de ejeção constante de 80 mm/min. A força máxima tolerada pelo equipamento é de cerca de 70 Newtons. Foram testadas as agulhas a seguir: 30G, 32G, 33G e Agulha Invisível® (TSK Laboratory), cujas dimensões (diâmetro externo x comprimento) são relatadas na Tabela 10.
[00281] Para fins de comparação, os produtos comerciais com base em ácido hialurônico não reticulado (referências HA-6 e HA-7) e reticulado (HA-8), indicados para rejuvenesicmento da pele por via intradérmica, são avaliados de acordo com o mesmo método, na sua seringa original. Os resultados são relatados na Tabela 10.
EXEMPLO 11
[00282] Este exemplo busca demonstrar que uma solução de carboximetil chitosan com origem fúngica em baixa concentração pode ser aplicada para preparação de gotas oftálmicas destinadas a reduzir os sintomas de distúrbios da superfície ocular ou para protegê-la. Além das características fisiológicas, ou seja, preferencialmente pH de cerca de 7,2 e osmolaridade de cerca de 200 mOsm/kg, as gotas oftálmicas deverão possuir preferencialmente as propriedades físico-químicas a seguir: baixo índice de refração (cerca de 1,33) e capacidade de minimizar a fricção entre a superfície ocular e a conjuntiva e as pálpebras (capacidade de lubrificação). Por fim, o seu perfil reológico é tal que o produto não é fluido demais para poder ser depositado sobre o olho, mas é sim espalhado de forma homogênea e não é pegajoso. O seu perfil reológico deverá também ser tal que o piscar das pálpebras seja fácil, sem acúmulo, ou seja, baixa viscosidade sob alta taxa de cisalhamento.
Particularmente, Orobia et al consideram que a viscosidade durante o movimento ocular (excluindo o piscar das pálpebras) é convenientemente de mais de 10 mPa.s, tal como cerca de 20 mPa.s (em: Clinical Ophthalmology 12, 453, 2018). Dever-se-á observar neste ponto que o valor da viscosidade é propenso a variar de acordo com o método de medição e, particularmente, com o equipamento, o modo de medição e os parâmetros, a temperatura e a taxa de cisalhamento aplicada ao produto testado.
[00283] Carboximetil chitosan CC-21 de origem fúngica de referência é produzido de acordo com o mesmo método do CC-20 do Exemplo
10. É realizada comparação das estruturas moleculares de CC-20 e CC-21 em forma ácida, por meio de espectrometria de infravermelho por transformação Fourrier, utilizando um espectrômetro Nicolet iS5 equipado com ID7-ATR (Thermo Scientifics), de acordo com o método descrito por Chen et al (Carbohydrate Polymers 53, 355, 2003). Determina-se que suas estruturas moleculares são 99% idênticas na região de comprimento de onda de 1200 a 1800 cm-1 e, consequentemente, seus DA e DS são similares.
[00284] São preparadas duas formulações de carboximetil chitosan CC-21, com concentração de 0,7% e 0,4% (m/m) em tampão de fosfato com glicerol. O pH é ajustado em 7,2 ± 0,2 e a osmolaridade, em 200 ± 20 mOsm/kg; as formulações são filtradas em seguida e a sua capacidade de lubrificação e seu perfil de viscosidade são então caracterizados de acordo com os métodos descritos abaixo. Gotas oftálmicas com base em ácido hialurônico (HA) com composição variável disponíveis comercialmente são caracterizadas de acordo com os mesmos métodos (HA-5 a HA-9). Os resultados são relatados na Tabela 11b.
[00285] A capacidade de lubrificar, ou seja, reduzir a fricção entre duas superfícies que se encontram em contato, é avaliada por meio de medição do coeficiente de fricção entre dois discos feitos de material de poliacrilato idênticos aos do Exemplo 9. Os dois discos são fixados às geometrias superior e inferior de um reômetro DHR-2 (TA Instruments), um volume de cerca de 100 µl do produto a ser testado é colocado sobre o disco inferior e a geometria superior é então rebaixada até fazer contato entre os dois discos, até uma força normal imposta de 5 Newtons. A medição de coeficiente de fricção é conduzida a 25 °C por um período de 60 segundos, sob força normal constante (5 N), frequência de oscilação de 6 rad/s e ângulo de deformação de cerca de 1,71 radianos, de acordo com um protocolo adaptado a partir do protocolo adaptado de Waller et al (J. Rheumatol. 39, 7, 1473, 2012) e os parâmetros imitam as condições cinemáticas de piscar das pálpebras descritas por Kwon et al (J. Royal Society Interface 10, 2, 2013). A opção “atender ao ponto zero de início de movimento oscilatório" é ativada. Em cada ponto de medição, o valor de torque é registrado e, em seguida, o coeficiente de fricção (COF) é calculado de acordo com a fórmula: COF = torque / (1/3 x diâmetro do disco x força normal). O valor de COF médio é determinado entre 0 e 60 s. O coeficiente de fricção médio, bem como o desvio padrão de cinco medições consecutivas, são, portanto, calculados. O valor mínimo de COF é de 52 caso as duas superfícies não estejam em contato. O limite superior de COF corresponde ao caso em que os dois discos não se encontram mais em movimento entre si.
[00286] Considerando que o valor de COF é variável de uma série para outra, é necessário caracterizar os produtos a serem comparados em uma mesma série, utilizando os mesmos discos em ordem aleatória. Uma escala de avaliações relativas é utilizada para classificar os produtos testados na mesma série, do mais eficaz (nota 1) ao menos eficaz (nota 3), de acordo com os critérios da Tabela 11a. Os limites “COFA” e “COFB” são definidos pelo COF de duas gotas oftálmicas comerciais e tomadas como referência para cada série: gotas A (compostas de 0,15% de HA e 0,25% de carbômero) e gotas B (0,15% de HA). Segundo esta escala, é conveniente que a nota de redução da fricção seja de 1 ou 2, preferencialmente 1, para uso como gota lubrificante da superfície ocular. Para produtos com nota 3, a capacidade lubrificante não é satisfatória e a variação da medição é significativa.
TABELA 11A
[00287] Escala de notas de lubrificação (redução da fricção): Nota Limites de COF 1 ≤ 1,1 x COFA 2 > 1,1 x COFA e ≤ 1,1 x COFB 3 > 1,1 x COFB
[00288] Simmons et al determinaram que a taxa de cisalhamento durante movimentos dos olhos abertos é de cerca de 10 s -1 e a taxa de cisalhamento durante agitação das pálpebras é de cerca de 10000 s -1 (em: Clinical Ophthalmology 11, 1637, 2017). O método de medição reométrica é selecionado de acordo com a faixa de taxas de cisalhamento a ser estudada e considerando que os produtos são soluções fluidas com baixa viscosidade: - Faixa de cisalhamento correspondente ao movimento ocular. A viscosidade é medida em modo giratório com teste de varredura de fluxo por meio de um reômetro DHR-2 com tensão controlada (TA Instruments) equipado com placa de Peltier e geometria do tipo “cone” com diâmetro de 60 mm e ângulo de truncagem de 2°. O produto é equilibrado por um minuto a 37 °C, em que a temperatura é controlada pelo Peltier. A fim de evitar evaporação, o sistema é equipado com sifão de solvente e cobertura metálica. O teste de varredura de fluxo é iniciado em seguida e a viscosidade é medida em função da taxa de cisalhamento, de 0,001 s-1 a 100 s-1. È relatado o valor de viscosidade a 10 s-1; e - Faixa de cisalhamento correspondente à agitação das pálpebras. A viscosidade é medida em modo giratório com teste de varredura de fluxo por meio de um reômetro DHR-3 com tensão controlada (TA Instruments) equipado com geometria do tipo “manta com lacuna dupla (cilíndrica)” e cilindro concêntrico Peltier e equipado com um sifão de solvente e cobertura metálica. O produto é equilibrado por um minuto a 37 °C e é aplicada em seguida taxa de cisalhamento que varia de 0,001 s -1 a 10000 s-1. O valor de viscosidade a 10000 s-1 é então comparado com o valor a 10 s-1.
TABELA 11B
[00289] Características de formulações com baixa concentração de carboximetil chitosan de origem fúngica e gotas oftálmicas com base em ácido hialurônico: Viscosidade Nota de Índice de Referência a 10 s-1 a 10000 s-1 redução da refração (mPa.s) (mPa.s) fricção Tampão de fosfato Não 1,3348 N/A N/A com glicerol mensurável CC-21 0,7% 1,3358 27 Menor que a 1 viscosidade a 10 s- CC-21 0,4% 1,3353 10 1 1 HA-5 1,3343 6 2 HA-10 1,3386 3 Menor que a 2 HA-11 1,3350 6 viscosidade a 10 s- 2 1 HA-12 1,3346 50 2
[00290] Os resultados confirmam que as duas formulações de carboximetil chitosan fúngico CC-21 atendem às especificações técnicas para gotas oftálmicas: elas possuem baixo índice de refração, coeficiente de fricção satisfatório (nota 1, ou seja, tão eficaz quanto as gotas comerciais mais lubrificantes), viscosidade de 10 a 30 mPa.s sob condições de movimento ocular e viscosidade mais baixa em condições de piscar das pálpebras. Sem carboximetil chitosan, o tampão de fosfato suplementado com glicerol não permite atender às especificações técnicas para gotas oftálmicas.
Por fim,
observa-se que a viscosidade pode ser reduzida por meio de redução da concentração de carboximetil chitosan (por exemplo, 0,7 a 0,4%) sem prejudicar a capacidade de reduzir a fricção (nota 1).
Claims (20)
1. CARBOXIALQUIL CHITOSAN, caracterizado por conter unidades de glicosamina, unidades de N-acetilglicosamina e unidades de glicosamina substituídas com um grupo carboxialquila, em que o mencionado carboxialquil chitosan possui potencial zeta, medido sob pH 7,5, menor ou igual a -18 mV, em que o mencionado carboxialquil chitosan possui grau de acetilação de 40% a 80%, expresso em número de moles de unidades de N- acetilglicosamina com relação ao número de moles de unidades totais e o mencionado carboxialquil chitosan possui grau de substituição por grupo carboxialquila de mais de 20%, por exemplo mais de 50%, expresso como o número de moles do substituinte com relação ao número de moles de unidades totais.
2. CARBOXIALQUIL, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo mencionado carboxialquil chitosan possuir potencial zeta, medido sob pH 7,5, menor ou igual a -20 mV.
3. CARBOXIALQUIL, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 2, caracterizado pelo mencionado carboxialquil chitosan possuir grau de substituição por um grupo carboxialquila de mais de 70%, expresso como o número de moles do substituinte com relação ao número de moles de unidades totais.
4. CARBOXIALQUIL, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo chitosan ser derivado do micélio de fungo do tipo Ascomycetes, particularmente de Aspergillus niger, e/ou de um fungo Basidiomycetes, particularmente Lentinula edodes (shitake) e/ou Agaricus bisporus (cogumelo de Paris).
5. CARBOXIALQUIL, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo carboxialquil chitosan ser chitosan N- carboxilalquilado e O-carboxialquilado.
6. CARBOXIALQUIL, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo carboxialquil chitosan ser reacetilado.
7. CARBOXIALQUIL, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado por ser esterilizado.
8. COMPOSIÇÃO, caracterizada por compreender pelo menos um carboxialquil chitosan, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 7.
9. COMPOSIÇÃO, de acordo com a reivindicação 8, caracterizada pela composição também compreender ácido hialurônico ou hialuronato de sódio, reticulado ou não reticulado por ligações covalentes.
10. COMPOSIÇÃO INJETÁVEL, caracterizada por compreender pelo menos um carboxialquil chitosan, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 7.
11. COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, caracterizada por compreender pelo menos um carboxialquil chitosan, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 7.
12. COMPOSIÇÃO de acordo com qualquer das reivindicações 10 ou 11, caracterizada pela composição também compreender ácido hialurônico ou hialuronato de sódio, reticulado ou não por ligações covalentes.
13. COMPOSIÇÃO de acordo com qualquer das reivindicações 10 a 12, caracterizada pela composição ser uma composição farmacêutica injetável, composição farmacêutica implantável ou composição farmacêutica apropriada para instilação, ou um dispositivo médico injetável, dispositivo médico implantável ou dispositivo médico apropriado para instilação.
14. COMPOSIÇÃO, de acordo com a reivindicação 13, caracterizada por ser para uso em um método de tratamento terapêutico.
15. COMPOSIÇÃO, de acordo com a reivindicação 14, caracterizada pela composição ser instilada ou injetada por via subcutânea,
intradérmica, ocular, intraocular ou intra-articular, para reparação ou enchimento de pelo menos um tecido corporal que necessita de reparação ou enchimento.
16. COMPOSIÇÃO, de acordo com a reivindicação 15, caracterizada pelo tecido corporal ser selecionado a partir de tecidos pertencentes às cordas vocais, músculos, ligamentos, tendões, cartilagens, órgãos sexuais, ossos, articulações, olhos, derme ou qualquer das suas combinações, mais especificamente pertencentes às articulações.
17. COMPOSIÇÃO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 13 a 14, caracterizado por ser para uso em um método de tratamento de artrose ou reparação de defeitos da cartilagem, opcionalmente por injeção no fluido sinovial ou após mistura com sangue e implante na cartilagem.
18. COMPOSIÇÃO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 10 a 17, caracterizado por compreender um açúcar redutor.
19. DISPOSITIVO MÉDICO, caracterizado por compreender ou consistir de uma composição, conforme definida em qualquer uma das reivindicações 8 a 18.
20. MÉTODO DE PREPARAÇÃO DE COMPOSIÇÃO, que compreende carboxialquil chitosan, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 8 a 18, caracterizado pelo mencionado método incluir: - dissolução de carboxialquil chitosan, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 9 em solução aquosa, opcionalmente tamponada; - ajuste opcional do pH em pH desejado; - adição opcional de outros excipientes; e - ajuste opcional da osmolaridade da composição.
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