KR101460815B1 - 관절염 질환 치료의 지속성 효과를 갖는 제약 제제 - Google Patents

Abstract

본 발명은, 활성 성분으로서, 히알루론산의 관능기 중 일부가 히알루론산의 이당류 유닛 성분의 총 수에 대하여 0.6％ 내지 15％의 가교 비율로 가교기와 가교된 것인 가교된 히알루론산 유도체를 지속성 진통 효과를 갖는 양으로 제약상 허용된 담체와 함께 포함하는, 관절염 질환을 치료하기 위한 관절내 투여용 주사액, 및 상기 가교된 히알루론산 유도체 및 제약상 허용되는 담체를 포함하는, 관절염 질환에 의해 유발된 연골 퇴행 억제용 진통 조성물, 또는 연골 퇴행 또는 활막의 염증 억제용 조성물에 관한 것이다.

관절염 질환, 가교된 히알루론산 유도체, 장기 지속성

Description

관절염 질환 치료의 지속성 효과를 갖는 제약 제제{PHARMACEUTICAL AGENT HAVING LONG-LASTING EFFECT OF TREATING ARTHRITIC DISORDERS}

본 발명은 1회 주사에 의한 장기간 동안 지속성 진통 효과, 연골 보호 효과 및 항염증 효과를 갖는 제약 제제에 관한 것이다.

관절 동통, 및 관절 퇴행에 의해 유발되는 기능이상의 임상 증후군인 골관절염 (OA)은 어떤 다른 관절 질병에 비해 많은 사람들에게 발생한다. 골관절염은 미국 및 전세계에서 단연코 가장 흔한 관절 질환이며, 노인 신체 장애의 주된 원인 중 하나이다. 무릎 OA는 흔하지만, 1차 의료로 관리하기에는 종종 어려운 문제이다. 생활방식 변경, 물리 치료 및 약물 치료로 이루어지는 전통적인 비외과적 관리는 종종 효과가 없거나 잔류증상이 남는다. 증후성 무릎 OA를 앓는 대상자를 위한 옵션으로 히알루론산의 관절내 연속 주사를 행하는 치료(이하, IA-HA라 함)가 있다. 히알루론산나트륨은 세포외 매트릭스의 천연 성분이며, 이를 관절내 주사하면 윤활제 및 충격 흡수제로서 작용하여 OA의 동통을 경감시키고 무릎 기능을 개선시킨다. 현재, 미국에는 수파르츠(SUPARTZ^®), 신비스크(SYNVISC^®), 히알간(HYALGAN^®), 오르토비스크(ORTHOVISC^®) 및 유플렉사(EUFLEXXA)의 5개의 IA-HA 시 판 제제가 있다. SYNVISC^®는 미국에서 론칭된 최초 IA-HA 제제로, 유일한 히알루론산염의 가교된 유도체 수용액이며, 다른 제제들은 히알루론산나트륨 (이하, HA-Na이라고 함) 수용액이다. 현재 시판되고 있는 이들 IA-HA 제제는 효능면에서 명백하게 다르지 않다. 더욱이, 이들 제제는 3 내지 5회 연속 주사로 사용되며, 다시 말해 1회 주사로 장기간 반응을 얻지 못한다. 따라서, 더 적은 주사 횟수가 요구되는 신규 IA-HA 제제는 침습성 및 관절 감염의 잠재적 위험을 줄일 수 있고, 1회 주사로 장기간 반응을 얻을 수 있을 것으로 기대된다.

지금까지, SYNVISC^®과는 상이한 가교 방법으로 가교된 히알루론산염에 대한 다수의 보고, 예를 들면 가교기로서 다관능성 에폭시 화합물을 사용하여 제조된 가교된 히알루론산염 (특허 문헌 1 참조), 광 가교된 히알루론산염 (특허 문헌 2 내지 4 참조) 및 가교제없이 분자내 다리결합된 히알루론산염 (특허 문헌 5 참조)이 있다. 가교된 히알루론산염은, 전통적인 비-약물 치료 및/또는 단순 진통제, 예를 들면 아세타미노펜에 적당하게 반응하지 못하는 대상자에서의 무릎 골관절염에 관련된 동통을 위한 최소 침습 치료제로서 조사되고 있다. 예를 들면, 가교된 구조을 갖거나 갖지 않은 히알루론산염 겔 및 인지질을 포함하는 작용제를 이용함으로써 투여 횟수를 줄일 수 있다는 이점을 갖도록 개선된 관절 질환 치료용 주사제가 보고되어 있다 (특허 문헌 6 참조).

그러나, 광 가교된 히알루론산염 생성물에 대한 다수의 보고는 주로 상기 생성물의 합성법과 일반적인 특성에 주목하고 있으며, 상기 가교된 히알루론산염 생 성물에 대한 독특한 용법 및 특정 효과에 대해 가능한 및 제한적인 조건 및 특성에 대해서는 철저히 조사되어 있지 않다. SYNVISC^®와 광 가교된 히알루론산염 간의 항원성 및 자극성의 비교는 참고 문헌에 보고되어 있다 (비-특허 문헌 1 참조).

특허 문헌 1: JP-B2-5-74571

특허 문헌 2: USP5462976

특허 문헌 3: USP5763504

특허 문헌 4: USP6031017

특허 문헌 5: JP-A-2003-252905

특허 문헌 6: JP-A-2002-348243

비-특허 문헌 1: "Evaluation of in vivo biocompatibility and biodegradation of photocrosslinked hyaluronate hydrogels" J. Biomed Mater Res. A 70:550-559(2004)

<발명의 요약>

<발명의 개시>

본 발명은, 종전의 IA-HA 제제가 그 효과가 수주에 걸쳐서 지속되거나 계속되지 않는다는 문제점을 해결하기 위하여 본 발명은 개발되었다. 즉, 본 발명은 하기와 같다.

[1] 히알루론산의 관능기 중 일부가, 히알루론산의 구성 이당류 단위의 총 수에 대하여, 가교점이 1％ 내지 7.5％의 비율로 가교기에 의해 가교된 가교 히알루론산 유도체를, 활성 성분으로, 장기 지속성 진통 효과를 나타내는 양으로 포함하고, 약리적으로 허용된 담체로 이루어진, 관절 질환 치료용 관절내 투여용 주사용액에 있어서,
가교기가 신남산 또는 신남산 유도체의 잔기이고,
가교기의 도입률이 10% 내지 25%이며,
가교 히알루론산 유도체의 가교율이 10% 내지 30%인 것을 특징으로 하는, 주사용액.

[2] 가교기와 히알루론산 관능기 사이의 스페이서가 아미노알킬 알콜 잔기인 [1]에 기재된 주사용액.

[3] 가교 히알루론산 유도체 용액의 농도가 용액의 총 중량에 대하여 0.5 중량％ 내지 3.0 중량％인 [1] 또는 [2]에 기재된 주사용액.

[4] 가교 히알루론산 유도체 용액의 농도가 용액의 총 중량에 대하여 1 중량%인 [1] 또는 [2]에 기재된 주사용액.

[5] 18 게이지 내지 25 게이지인 니들을 통과할 수 있는 것을 특징으로 하는 [1] 또는 [2]에 기재된 주사용액

[6] 18 게이지 내지 25 게이지인 니들을 통과할 수 있는 것을 특징으로 하는 [3]에 기재된 주사용액.

[7] 18 게이지 내지 25 게이지인 니들을 통과할 수 있는 것을 특징으로 하는 [4]에 기재된 주사용액.

[8] 진통 효과가 투여 부위에 용액을 투여한 후 2주 이상 동안 지속되는 [1] 또는 [2]에 기재된 주사용액.

[9] 단위 투여량 제형인 가교 히알루론산 유도체로 이루어지고, 상기 단위 투여량이 1회의 투여에 있어서 1kg 당 가교 히알루론산 유도체 0.3 mg 내지 1.2 mg의 양인 [1] 또는 [2]에 기재된 주사용액.

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도 1은 토끼 전방 십자 인대 (ACL) 횡절단 연구: 육안 형태 평가를 나타내는 그래프이다.

도 2는 토끼에서의 ACL 횡절단 연구에 있어서 대퇴 관절융기의 조직학적 소견 (사프라닌 O/ 패스트 그린)이다.

도 2A는 인산염 완충 염수 (PBS) 군으로부터의 전형적인 검체이다.

도 2B는 1％ 히알루론산나트륨 용액 (1％ HA-Na) 군으로부터의 전형적인 검체이다.

도 2C는 1회 주사 가교된 히알루론산 겔 (HA-겔) 군으로부터의 전형적인 검체이다.

도 2D는 2회 주사 HA-겔 군으로부터의 전형적인 검체이다.

도 3은 래트에서의의 브라디키닌-유도된 관절염성 동통 모델에서의 HA-겔의 진통 효과를 나타내는 그래프이다.

도 3A는 브라디키닌 주사 1주 전 관절내 투여된 HA-겔의 진통 효과를 나타내는 그래프이다.

도 3B는 브라디키닌 주사 2주 전 관절내 투여된 HA-겔의 진통 효과를 나타내는 그래프이다.

도 3C는 브라디키닌 주사 4주 전 관절내 투여된 HA-겔의 진통 효과를 나타내는 그래프이다.

도 4는 질산은-유도된 관절염성 동통 모델: PBS, HA-겔 또는 1％ HA-Na 처리군의 중량 적재율을 나타내는 그래프이다.

도 5는 질산은-유도된 관절염성 동통 모델: PBS, HA-겔 또는 1％ HA-Na 처리군의 동통 점수를 나타내는 그래프이다.

도 6은 요산일나트륨-유도된 관절염성 관절 동통 모델: 이상 보행 점수의 변화를 나타내는 그래프이다.

도 7은 요산일나트륨-유도된 관절염성 관절 동통 모델: 이상 보행 점수의 변화를 나타내는 그래프이다.

도 8은 무릎 활액 중 HA-겔의 잔류율을 나타내는 그래프이다.

도 9는 무릎 활막 중 HA-겔의 잔류율을 나타내는 그래프이다.

도 10 및 11은 파파인-유도된 관절염 모델: 가교된 히알루론산 겔 및 PBS의 육안 형태 평가를 나타내는 그래프이다.

이후, 본 발명을 상세한 실시양태 및 방법으로 이하에 상세하게 설명한다. 이러한 상세한 설명은 본원에 개시되고 청구되는 본 발명을 예시하려는 것일 뿐이지, 특히 본원에 첨부되는 청구항에 명시되어 명백하게 청구한 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 이해해서는 안된다.

본 명세서에서, "골관절염", "히알루론산" 및 "히알루론산나트륨"은 각각 "OA", "HA" 및 "HA-Na"로 칭하며, 스페이서로서 사용될 수 있는 화합물은 "스페이서 화합물"로 칭한다.

본 발명에서 사용되는 가교된-히알루론산 유도체 또는 가교된 히알루론산 화합물 (이후, 가교된 HA 유도체로 칭함)은 HA에 공유 결합된 가교기를 통해 분자내 가교 또는 분자간 가교에 의해 형성된 가교된 구조를 갖는다. 가교된 구조는 가교된 HA 유도체를 3차원 망상 구조가 되게 하여 가교된 HA 유도체를 수성 매질에 용해시킨 용액이 점탄성 히드로겔 물성을 갖게 한다. 상기 용액은 동일한 농도 조건의 HA 용액보다 더 높은 점성을 갖는다.

가교된 HA 유도체는 염 또는 제약상 허용된 염을 형성하지 않은 유리 형태로 존재할 수 있다. 예를 들면, 가교된 HA 유도체의 제약상 허용된 염은 나트륨 염, 칼륨 염, 마그네슘 염, 칼슘 염 등을 포함한다.

본 발명에서 사용되는 히알루론산은, 기본 코어 구조로서 β1,3 결합을 통해 결합된 N-아세틸-D-글루코사민 및 D-글루쿠론산으로 이루어진 이당류 유닛으로 구성된 글리코사미노글리칸이며, 이당류 유닛의 β1,4 결합을 반복하여 구성되기만 하면, 즉 일반적으로 사용되는 히알루론산 (HA)이면, 특별히 제한되지는 않는다

사용되는 HA는 염 또는 제약상 허용되는 염을 형성하지 않은 유리 형태로 존재할 수 있다. HA의 제약상 허용된 염은, 나트륨 염, 칼륨 염과 같은 알칼리 금속 이온과의 염, 마그네슘 염 및 칼슘 염과 같은 알칼리 토금속 이온과의 염, 암모늄 염과 같은 무기 염기와의 염, 및 디에탄올아민, 시클로헥실아민 및 아미노산과 같은 유기 염기와의 염을 포함한다. 상기 HA 염은, 생체에 대한 그의 높은 친화성으로 인하여, 알칼리 금속 이온과의 염, 특히 나트륨 이온과의 염이 바람직하다.

사용되는 HA는 생체의 일부 물질 (예컨대, 볏, 탯줄, 연골, 피부 등)로부터 추출함으로써 천연물에서 유래할 수 있다. 또한, 이는 화학적으로 합성할 수 있거나, 효모와 같은 미생물에서 유전 공학에 의해 제조할 수 있다. 특히, 고순도이고, 약물에 있어서 허용되지 않는 불순물을 실질적으로 포함하지 않은 HA가 바람직하게 사용된다.

HA의 중량 평균 분자량은 특별히 제한되지는 않지만, 10,000 내지 5,000,000가 예시될 수 있다. 바람직하게는 200,000 내지 3,000,000 및 보다 바람직하게는 500,000 내지 2,500,000가 예시될 수 있다.

본 발명에서 사용되는 가교 형태는 우수한 결합 안정성 때문에 공유 결합을 이용하는 가교 형태가 바람직하다.

본 발명에서 사용되는 가교기로는, 바람직하게는 광선 (자외선)으로 조사하여 광이량체화 반응 또는 광중합 반응을 행할 수 있는 화합물의 임의의 잔기로부터 선택될 수 있는 광반응성 가교기 (즉, 광반응성 잔기를 갖는 가교기)가 예시된다. 예를 들면, 화합물의 상기 잔기로서는, 신남산, 치환된 신남산, 아크릴산, 말레산, 푸마르산, 소르브산, 쿠마린, 티민 등이 있다. 이러한 화합물 중에서, 광선 조사에 의해 시클로부탄환을 형성할 수 있는 비닐렌기를 갖는 화합물이 바람직하며, 신남산 또는 치환된 신남산이 광 반응성 및 생체에 대한 안전성의 관점에서 보다 바람직하다.

치환된 신남산으로는, 신남산 벤젠환의 임의의 위치에서 1개 또는 2개의 수소 원자가 탄소 원자수 1 내지 8의 저급 알킬기 (예를 들면, 메틸, 에틸, 프로필, 이소프로필, 부틸, tert-부틸 등), 탄소 원자수 1 내지 8의 저급 알콕실기 (예를 들면, 메톡시, 에톡시, 프로폭시, 이소프로폭시, 부톡시 등), 아미노기, 히드록실기 등으로 치환된 신남산 유도체가 예시될 수 있으며, 바람직하게는 아미노신남산 및 p-아미노신남산이 예시될 수 있다.

본 발명에서 사용되는 가교된 HA 유도체는, pH, 이온 강도, 온도 등과 같은 신체내 대사 환경에 적당한 내성을 갖는 것이 필요하며, 이는 투여 부위에서의 지속성 또는 계속성 효과를 돕는다. 아미드 결합이 산성 또는 알칼리성 조건하에서 가수분해에 대해 보다 우수한 내성을 갖기 때문에, 이는 아미드 결합인 것이 바람직하며, 이에 의해 가교기가 되는 화합물의 잔기가 HA의 카르복실기로 도입된다.

또한, 상기에 언급된 광반응성 가교기는, 스페이서로 불리는 아미노기를 갖는 화합물의 잔기를 통해 HA의 카르복실기로 도입될 수 있다. 또한, 스페이서를 이용하여, 가교기와 HA의 반응 및 광 가교 반응을 개선시킨다.

본 발명에서 스페이서로 사용되는 화합물은, 적어도 하나의 아미노기 및 광반응성 가교기에 결합할 수 있는 관능기를 갖는 화합물이면 특별히 제한되지는 않으며, 예를 들면 아미노알킬 알콜, 디아민, 아미노산, 펩티드 등을 바람직하게는 들 수 있다. 관절내 투여 동안 가교된 HA 유도체가 대사 분해에 대해 바람직한 내성을 가지고 그의 특성을 적당히 보존하는 것을 고려하면, 상기 화합물은 바람직하게는 탄소 원자수 2 내지 18의 아미노알킬 알콜, 보다 바람직하게는 탄소 원자수 2 내지 12의 아미노알킬 알콜이 예시된다. 가교 반응시, HA와 광반응성 가교기 사이에 적합한 거리를 주기 때문에, 특히 바람직하게는 아미노펜탄올, 아미노부탄올, 아미노프로판올 및 아미노에탄올이 예시될 수 있다.

달리 나타내지 않는 한, 본 명세서에서, 가교기는 스페이서 화합물의 잔기에 도입되는 가교기를 들 수 있으며, 따라서 광반응성 가교기도 스페이서 화합물의 잔기에 도입되는 광반응성 가교기를 들 수 있다. 가교된 구조를 형성하는 가교기는 때때로 가교된 기로 칭하며, 가교되지 않은 가교기는 때때로 가교가능 기로 칭한다.

본 발명의 가교된 HA 유도체의 합성 방법은, 아미드 결합을 통해 가교기가 될 수 있는 화합물에 HA를 화학적으로 결합시킬 수 있는 방법이면, 특별히 제한되지 않으며, 예를 들면 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드 히드로클로라이드 (EDCIㆍHCl), 1-시클로헥실-3-(2-모르폴리노에틸)카르보디이미드-메토-p-톨루엔술포네이트, 1-시클로헥실-3-(2-모르폴리노에틸)카르보디이미드 히드로클로라이드 등과 같은 수용성 카르보디이미드와 같은 수용성 축합제를 이용하는 방법; 상기 축합제 이외에, N-히드록시 숙신이미드 (HOSu) 및 N-히드록시 벤조트리아졸 (HOBt)와 같은 보조 축합제를 이용하는 방법; 4-(4,6-디메톡시-1,3,5-트리아진-2-일)-4-메틸모르폴리늄 클로라이드 (DMT-MM) 등과 같은 축합제를 이용하는 방법; 활성 에스테르화 방법; 산 무수물 방법 등을 들 수 있다. 또한, 스페이서가 도입된 가교기를 가교기로서 사용하는 경우, 먼저 스페이서 화합물을 HA에 도입하고, 이어서 가교기를 스페이서-연결된 HA에 도입하는 방법, 또는 먼저 스페이서를 가교기에 도입하고, 이어서 스페이서-연결된 가교기를 HA에 도입하는 방법일 수 있다.

이후, 설명을 간단하게 하기 위해서, 상기한 방법에 의해 제조된 가교기-연결된 HA 유도체가 아직 가교된 구조를 만들지 않은 경우, 상기 유도체는 때때로 비-가교된 생성물 또는 비-가교된 화합물로 칭한다.

비-가교된 생성물을 가교시키는 방법은 가교기 사이를 반응시킴으로써 가교된 구조를 형성시키는 방법이면 특별히 제한되지는 않는다.

예를 들면, 광 가교기를 이용한 비-가교된 생성물의 경우, 비-가교된 생성물을 균질하게 용해시킨 용액을 광선으로 조사하는 방법이 바람직하다.

HA 자체는 수성 매질에 대해 우수한 용해성을 가지지만, 그의 친수성에 기여하는 히알루론산에 있는 카르복실기에 스페이서 화합물이 도입된 히알루론산 유도체의 경우에는, 치환 정도가 증가될수록 친수성이 감소된다.

따라서, 상기한 비-가교된 생성물의 합성 방법으로, 바람직하게는 비-가교된 생성물의 수성 매질 중에서의 용해성을 개선하기 위해서 알칼리 처리를 수행하는 것을 포함하는 방법을 들 수 있다.

알칼리 처리 방법은 용액이 알칼리성이 되게 하는 처리이면, 특별히 제한되지는 않는다. 사용되는 알칼리제는 유기염 또는 무기염의 형태로 존재할 수 있다. 수성 용매 중에서의 처리를 고려하여, 무기 알칼리 염의 사용이 바람직하다. 이러한 무기 알칼리 염 중에서, 탄산수소나트륨 및 탄산나트륨과 같은 약 알칼리 염의 사용이 수산화나트륨과 같은 강 알칼리 염에 비해 보다 적합하며, 이는 상기 약 알칼리 염이 가교기-연결된 히알루론산 유도체의 저분자 화합물로의 전환 또는 가교기의 분해에 더 적은 영향을 미치기 때문이다. 여기서, 상기 알칼리 처리는 통상적으로 7.2 내지 11, 바람직하게는 7.5 내지 10의 pH 값에서 수행될 수 있다. 사용되는 알칼리 양 및 알칼리-처리 시간은 목표하는 친수성에 따라 적당히 조절할 수 있다. 예를 들면, 히알루론산 1 g을 기준으로 하여 탄산수소나트륨을 500 mg의 양으로 (즉, 히알루론산 몰의 10배 이상의 몰 양으로) 사용하는 경우, 알칼리 처리를 교반하면서 2 내지 3시간 동안 수행함으로써, 충분히 향상된 친수성을 갖는 비-가교된 화합물을 얻을 수 있다. 상기 방법에 의해 얻어지는 비-가교된 유도체 1.0 중량％ 용액을 5.0 Kg/cm²의 압력하에 24 ℃에서 2 mL/분 이상의 비율로, 공경 0.45 μm, 직경 25 mm의 다공성 필터에 통과시킬 수 있다.

비-가교된 생성물의 광선 조사 (광조사)는, 광반응성 가교기가 효율적으로 광이량체화 또는 광중합 반응을 일으키는 조건하에서 수행되는 것이 바람직하다.

사용되는 광선의 종류 및 파장은, 히알루론산의 글리코시드 결합을 분해시키지 않고, 광반응성 가교기를 광반응시킬 수 있는 파장의 광선으로부터 선택될 수 있는 것이면 특별히 제한되지는 않는다. 예를 들면, 사용되는 가교기가 신남산 또는 신남산 유도체인 경우, 파장이 200 내지 600 nm인 자외선이 바람직하다. 조사된 광선의 집적은 생성물의 원하는 특성, 원하는 치환 정도, 비-가교된 생성물 용액의 농도 등에 따라 적당하게 선택된다. 바람직한 광원으로서는, 자외선 램프, 고압 수은 램프 또는 메탈 할라이드 램프를 사용할 수 있다. 바람직하게는, 필요한 경우에, 원하지 않는 파장은 광선 공급원으로부터 예를 들면 차단 필터(cut filter)로 제거할 수 있다.

본 발명의 가교된 HA 유도체는 HA에 공유 결합된 가교기를 통해 분자내 가교 또는 분자간 가교에 의해 형성된 가교된 구조를 갖는다. 상기 가교된 구조가 가교된 HA 유도체를 3차원 망상 구조로 만듦으로써, 가교된 HA 유도체 용액은 점성 및 탄성으로 이루어진 점탄성 히드로겔의 물성을 갖는다. 상기 물성은 가교기의 치환 정도, 가교 정도, 가교 반응시 가교가능한 화합물의 농도 등과 같은 요인에 의해 영향을 받는다. 따라서, 상기 요인을 적당한 범위로 설정하는 것은 중요하다.

이러한 적합한 범위는 생성물의 원하는 특성에 따라 적당하게 결정할 수 있다. 예를 들면, 본 발명의 가교기의 치환 정도는, HA의 이당류 유닛 성분의 총 수에 대하여, 바람직하게는 3％ 내지 50％, 보다 바람직하게는 5％ 내지 30％ 및 보다 더욱 바람직하게는 10％ 내지 25％이다. 가교 반응시 반응 용액의 바람직한 농도는, 상기 용액의 총 중량에 대하여, 0.5％ 내지 10％, 보다 바람직하게는 0.7％ 내지 2％로 예시될 수 있다. 가교 정도는, 가교기 성분의 총 수에 대하여, 바람직하게는 5％ 내지 40％, 보다 바람직하게는 7％ 내지 35％ 및 보다 더욱 바람직하게는 10％ 내지 30％로 예시될 수 있다.

또한, 치환 정도 (DS)는 HA의 이당류 유닛 성분 당 가교기의 도입률(％)로 계산될 수 있으며, 예를 들면 이당류 유닛 성분 당 1개의 가교기 또는 200개의 단당류 유닛 성분 당 1개의 가교기를 갖는 비-가교된 화합물에 대한 DS는 각각 100％ 또는 1％이다.

가교 정도는 도입된 가교기에 대한 가교된 기의 비율로 계산될 수 있다. 예를 들면, 100개의 가교기를 갖는 HA 유도체에 있어서, 20개의 가교기 (단량체)가 10개의 이량체로 반응하는 경우, 가교 정도는 20％이다.

용질이 되는 가교된 히알루론산 유도체가 매질 (용매)에 비해 과도한 양으로 존재하고, 가교된 히알루론산 유도체에 있어서 과도한 다리 형성이 존재한다면, 유동성이 적당한 히드로겔 용액을 얻는 것이 어렵다는 것은 통상적으로 인정된다.

본 발명의 가교된 HA 유도체는 니들 팁(needle-tipped) 시린지에 의해 관절내 투여되기 때문에 적당한 유동성이 필요하다. 한편, 신체내 대사 환경에 대한 적당한 내성 및 투여 부위에서의 적합한 체류 능력 또한 필요하다. 따라서, DS 또는 가교 정도가 너무 낮은 것은 바람직하지 않다. 결론적으로 점성과 탄성의 균형이 중요하다.

상기 언급된 조건에 따라 설계된 가교된 HA 유도체의 용액은 18 게이지 내지 25 게이지인 니들을 통과할 수 있는 주사가능 용액일 수 있으며, 관절내 투여용 주사액으로 사용할 수 있다.

예를 들면, DS와 가교 정도의 곱이며, HA의 이당류 유닛 성분 당 가교기의 이량체 몰 비율 (％)로 나타내는 가교 비율의 관점에서, 본 발명의 가교된 HA 유도체는, HA의 이당류 유닛 성분의 총 수에 대하여, 0.6％ 내지 15％의 범위, 보다 바람직하게는 1.0％ 내지 7.5％의 범위의 가교 비율인 것이 바람직하다.

하기에 기재된 실시예에 나타나는 바와 같이, 본 발명의 가교된 HA 유도체는 1회 치료 기간 동안 3 내지 5회 연속 주사에 의해서가 아니라 1회 주사로 보다 현저한 진통 효과를 나타냈다. 이는 HA 단독 용액보다 장기간 진통 효과가 계속되는 것으로 나타났으며, 급성 동통 및 만성 동통 둘다에 대해 효과적이며 지속성 또는 계속성 진통 효과를 나타냈다. 더욱이, 이는 또한 1회 주사로 장기간 활막에 대한 항염증 효과 및 연골 보호 효과를 제공한다.

본 발명에 따르면, OA, 외상성 관절염, 염증성 관절염 질환, 퇴행성 관절염 질환 등을 비롯한 관절염 질환을 치료하기 위한 관절내 투여용 주사액 및 제약 조성물을 제공하는 것이 가능하다. 상기 주사액은 활성 성분으로서의 본 발명의 가교된 히알루론산 유도체 및 제약상 허용된 담체를 포함하며, 유사하게, 상기 제약 조성물은 활성 성분으로서의 본 발명의 가교된 히알루론산 유도체 및 제약상 허용된 담체를 포함한다.

제약상 허용된 담체는 본 발명의 가교된 HA 유도체 용액에 사용되는 수성 매질로 예시된다. 예를 들면, 주사용수, 생리 식염수 및 인산염 완충 염수가 있다. 또한, 본 발명의 주사액 및 제약 조성물이 원하는 치료 효과가 상실되지 않고 부작용이 생기지 않는다면, pH 조정제 및 등장화제와 같은 주사액에 통상적으로 사용되는 첨가제가 허용될 수 있다. 예를 들면, 인산이수소나트륨, 인산수소이나트륨 및 염화나트륨이 있다.

상기 주사액 및 제약 조성물은 시판되는 IA-HA 제제의 투여 횟수 (즉, 치료 기간 동안 3 내지 5회 연속 주사)보다 치료 기간 동안 투여 횟수가 더 적어도 충분히 효과적이다.

또한, 본 발명의 가교된 HA 유도체 용액으로 충전된 시린지를 포함하는 키트를 제공하는 것이 가능하며, 필요한 경우 상기 키트에는 플런저, 플런저 로드(plunger rod) 등을 구비할 수 있다.

상기 언급된 방법 및 조건에 따라 제조된 가교된 HA 유도체는 주사액 및 제약 조성물으로 사용할 수 있다. 상기 주사액 또는 제약 조성물으로 사용되는 바람직한 가교된 HA는 가교에 대해 하기 파라미터를 갖는다:

0.6％ 내지 15％의 가교 비율 및 3％ 내지 50％의 치환 정도

0.6％ 내지 15％의 가교 비율 및 5％ 내지 40％의 가교 정도

3％ 내지 50％의 치환 정도 및 5％ 내지 40％의 가교 정도

0.6％ 내지 15％의 가교 비율, 3％ 내지 50％의 치환 정도 및 5％ 내지 40％의 가교 정도, 또는

1％ 내지 7.5％의 가교 비율, 10％ 내지 25％의 치환 정도 및 10％ 내지 30％의 가교 정도.

본 발명의 제약 제제에 의해 치료되는 질병은 특별히 제한되지는 않으며, 관절염 질환에 의해 유발되는 관절 동통을 경감시키기 위한 치료제, 관절염 질환에 의해 유발되는 활막의 염증을 억제시키기 위한 치료제, 관절염 질환에 의해 유발되는 연골 퇴행을 억제시키기 위한 치료제, 및 관절의 움직임 범위를 개선시키기 위한 치료제로서 사용하는 것이 가능하다. 또한, 상기 질병의 치료 뿐만 아니라 예방을 위해서도 동일하게 사용하는 것이 가능하다.

상기 주사액 또는 제약 조성물의 투여량은, 치료되는 대상자의 특정 증상, 나이, 체중 등에 따라 개별적으로 결정되어야 하는 항목이기 때문에, 특별히 제한되지는 않는다.

바람직하게는 HA 유도체에 대하여 1회 투여시 성인 환자 (50 내지 70 kg) 당 15 mg 내지 60 mg의 통상적인 투여량 범위가 예시될 수 있으며, 더 많은 정보를 위해 0.3 mg/kg 내지 1.2 mg/kg의 범위가 예시될 수 있다. 또한, 바람직하게는 주사액의 농도는, 상기 용액의 총 중량에 대하여, 0.5％ 내지 3.0％, 구체적으로는 0.7％ 내지 2.0％ (가교기-연결된 HA 유도체의 경우)로 예시될 수 있다. 상기 주사액의 용법은 바람직하게는 1회 치료에 대해 1회 주사 또는 2회 주사가 예시될 수 있다. 제약 조성물의 주사가능한 형태도 동일하다.

본 발명의 주사액의 바람직한 실시양태 및 제약 조성물의 주사가능한 형태 중 하나는 하기로 예시될 수 있다.

가교된 HA 유도체의 특성은 하기와 같다:

HA의 중량 평균 분자량: 500,000 내지 2,500,000,

가교기 화합물: 신남산 또는 신남산 유도체,

스페이서 화합물: 아미노알킬 알콜, 보다 바람직하게는 아미노펜탄올, 아미노부탄올, 아미노프로판올 또는 아미노에탄올,

가교기의 DS: 10％ 내지 25％, 및

가교 정도: 10％ 내지 30％.

매질: 염수, 인산염 완충 염수 또는 주사용수

가교된 HA 유도체 용액의 농도: 0.7％ 내지 2.0％

용액의 특성: 상기와 동일한 농도 조건에서의 HA 용액보다 더 높은 점탄성 특성 및 더 높은 트레드-형성성(tread-formability)을 가지며, 24 ℃에서 0.2 ml/초의 비율로 주사 니들로부터 분출시키는 경우 18 내지 25 게이지의 니들을 통과할 수 있음.

더욱이, 가교 비율은 바람직하게는 1.0％ 내지 7.5％로 예시될 수 있다. 또한, 적당한 유동성을 가지며, 예를 들면 가교된 HA 유도체 겔 1 중량％ (가교기-연결된 HA의 경우)는 길이가 3 cm 이상인 연속 트레드를 형성하는 것이 가능하며, 이는 24 ℃에서 0.2 ml/초 비율로 수평 방향에서 45°하향으로 주사 니들로부터 분출될 때 23-게이지 주사 니들의 팁 오픈 말단에서 끊김없이 형성된다.

본 발명에서의 가교된 HA 유도체를 포함하는 히드로겔 상태 용액은, 예를 들면 미국 특허 제6,602,859호에서 개시되어 있으며, 상기 특허 문헌은 본원에 참고로 포함된다.

본 발명은 실시예를 기초로 하여 이하에 보다 구체적으로 기재된다. 그러 나, 이에 의해 본 발명의 기술적 범위가 제한되는 것은 아니다.

<합성예>

중량-평균 분자량이 900,000인 히알루론산나트륨 (세이가가쿠　고교　가부시키가이샤 제조) 400 mg을 교반하면서 물과 디옥산을 함유하는 혼합 용액과 혼합하였다. 생성된 용액에, N-히드록시 숙신이미드 (HOSu) 34 mg /물 1 ml (0.6 당량/HA 이당류 유닛 (mol/mol)); 1-에틸-3-(3-디메틸아미노-프로필)카르보디이미드 히드로클로라이드 (EDCI.HCl) 29 mg/물 1 ml (0.3 당량/HA 이당류 유닛 (mol/mol)); 4-(6-아미노헥산아미드)에틸 신나메이트 히드로클로라이드 51 mg/물 1 ml (0.3 당량/HA 이당류 유닛 (mol/mol))을 실온에서 순차적으로 혼합하였다. 생성된 혼합물을 3시간 동안 교반하였다. 얻어진 혼합물을 탄산수소나트륨 200 mg/물 3 ml과 2시간 동안 교반하면서 추가로 혼합하고, 이어서 염화나트륨 400 mg과 혼합하였다. 에탄올을 생성된 반응 용액에 충전시키자 고체가 침전되었다. 얻어진 고체를 연속하여 80％ (부피/부피) 에탄올 및 에탄올로 세척하고, 이어서 실온에서 밤새 건조시킴으로써 백색 고체 (4-(6-아미노헥산아미드)에틸 신나메이트-결합된 히알루론산 360 mg을 얻었으며: "4-(6-아미노헥산아미드)에틸 신나메이트-결합된 히알루론산"은 이후 단지 int-HAD 1로 칭한다.

추가로, N-히드록시 숙신이미드 (HOSu), EDCI.HCl 및 신나메이트 유도체의 당량을 이하에 기재되는 바와 같이 충전시킨다는 것을 제외하고는, 상기한 바와 같은 동일 절차를 수행함으로써, 서로 상이한 도입률 (치환 정도)을 갖는 int-HAD를 얻었다.

(int-HAD 2) HOSu, EDCI.HCl 및 3-아미노프로필 신나메이트 히드로클로라이드는 각각 0.2, 0.10 및 0.10 mol/mol HA 이당류 유닛이었다.

(int-HAD 3) HOSu, EDCI.HCl 및 4-아미노부틸 신나메이트 히드로클로라이드는 각각 1.0, 0.5 및 0.5 mol/mol HA 이당류 유닛이었다.

(int-HAD 4) HOSu, EDCI.HCl 및 5-아미노펜틸 신나메이트 히드로클로라이드는 각각 1.4, 0.7 및 0.7 mol/mol HA 이당류 유닛이었다.

(int-HAD 5) HOSu, EDCI.HCl 및 8-아미노옥틸 신나메이트 히드로클로라이드는 각각 0.6, 0.3 및 0.3 mol/mol HA 이당류 유닛이었다.

(int-HAD 6) HOSu, EDCI.HCl 및 3-아미노프로필 신나메이트 히드로클로라이드는 각각 0.2, 0.10 및 0.10 mol/mol HA 이당류 유닛이었다. int-HAD 6은, 3-아미노프로필 신나메이트 정도가 int-HAD 2의 정도보다 더 낮다는 점을 제외하고는, int-HAD 2 제조법과 동일한 방법으로 제조하였다.

이어서, 얻어진 용액의 농도가 히알루론산에 대해 1.0 중량％가 되도록 상기에서 얻어진 신남산 유도체-도입된 히알루론산 (int-HAD 1 내지 6)을 각각 5 mM 인산염-완충 생리 식염수 중에 용해시켰다.

또한, 상기 얻어진 용액을 각각 20 내지 40분 동안 자외선 조사하였다. 이들 용액이 자외선 조사에 의해 겔 형태 (히드로겔)로 변화되었다. 상기 얻어진 겔은 이후 가교된 히알루론산 겔로 칭한다.

하기 실험 연구에서 "가교된 히알루론산 겔" (본원에서 때때로 HA-겔로 칭함)은 상기 합성예에 의해 제조된 int-HAD 1.0％ 용액을 자외선 조사한 겔이었다. "1％ 히알루론산나트륨 용액 (1％ HA-Na)"은 하기 실험 연구에서 세이가가쿠　고교　가부시키가이샤에 의해 제조된 SUPARTZ^®로 사용되었다 (이후 때때로 HA-Na로 칭함).

가교된 히알루론산 겔 및 1％ 히알루론산나트륨 용액 (1％ HA-Na) 둘다는 닭/수탉 볏에서 유래된 히알루론산을 사용하였다.

실시예 1: 토끼에서의 전방 십자 인대 (ACL) 횡절단 유도된 관절염에 대한 가교된 히알루론산 겔 (HA-겔)의 관절내 주사 효과

목적

본 연구에서 사용된 토끼 ACL 횡절단 모델은 인간에서의 OA와 유사한 연골 퇴행을 일으키는 관절염 모델로서 인정되었다. 따라서, 상기 모델은 히알루로난 제제 (SUPARTZ^®, HYALGAN^®, HEALON^®, SYNVISC^®)의 평가에 자주 사용되었다.

상기 연구의 목적은 ACL 횡절단 모델에서의 HA-겔의 효능을 조사하는 것이다.

방법

48마리 수컷 토끼에서 일측성 ACL을 횡절단함으로써 실험 골관절염 (OA)을 유도하였다. ACL 횡절단 후 제4주째에 HA-겔을 0.05 mL/kg/관절의 투여량으로 좌측 후방 무릎의 관절강에 1회 또는 2회 (2주 간격으로) 투여하였다. 그의 효능을 5주 동안 주 1회 PBS 또는 1％ 히알루론산나트륨 용액 (1％ HA-Na)을 반복 투여한 것과 비교하였다. 모든 동물을 ACL 횡절단 후 제9주째에 희생시켰다. 이어서, 좌 측 무릎 관절을 분리하여, 연골 퇴행의 형태 평가, 활액의 용량 및 단백질 함량, 및 활막염의 지표로서 활액에서의 침윤 세포 개수 및 글리코사미노글리칸 함량, 및 연골 및 활막의 조직병리학적 검사로서 대퇴 관절융기의 사프라닌 O 염색을 평가하였다.

주사 용량은 모든 시험 물질에서 동일하게 설정하였다.

결과

형태 평가에서, 각 동물은 두 부위 (대퇴 관절융기 및 경골 고평부)에서의 변화에 대해 평가하고, 각 군의 총 24 부위를 하기 기준에 따라 등급을 매겼다.

등급 1: 무손상 표면 (인디안 잉크에 의해 염색되지 않음)

등급 2: 최소 피브릴화 (표면에 잉크가 긴 반점으로 묻음)

등급 3: 명백한 피브릴화

등급 4: 침식 (밑에 있는 뼈를 노출하는 연골의 손실)

4a: 0 mm < 침식 ≤ 2 mm (길이)

4b: 2 mm < 침식 ≤ 5 mm (길이)

4c: 5 mm < 침식 (길이)

4d: 5 mm x 2 mm < 침식 (mm (길이) x 너비)

형태 평가에서, 연골 퇴행은 HA-겔 군에서 1％ HA-Na에 비해 더 적었다 (도 1). 실제로, 1회- 및 2회-주사 HA-겔 군 모두에서, 관절 연골의 퇴행이 PBS를 5주간 주사 처리한 대조군에 비해 현저하게 적었다. 더욱이, 주사 횟수를 고려하면, HA-겔이 1％ HA-Na에 비해 관절 연골의 퇴행을 감소시킨다는 것을 명백하게 나타냈 다. 한편, 1％ HA-Na 투여는 PBS에 비해 연골 퇴행을 감소시켰지만, 효능은 현저하지 않았다. 시험 물질간의 중증도 비교는 하기 순서이었다: PBS > 1％ HA-Na > HA-겔 1회 주사 ≥ HA-겔 2회 주사. 연골 퇴행 억제에 대한 HA-겔 효능은 또한 활액에서 콘드로이틴 6-술페이트 (CS-6S)의 증가가 감소되는 것에 의해 입증되었다. 또한, HA-겔은 활액, 단백질 및 콘드로이틴 4-술페이트 (CS-4S) 함량의 증가가 감소되는 것으로 판단되는 바와 같이, 활막염의 증상을 개선시키는 것으로 나타났다.

또한, 활액에서의 CS-6S는 연골로부터 유래되고 활액에서의 CS-4S는 활막의 염증에 의해 혈관을 통해 방출된다는 것이 보고되어 있다. 다시 말하면, CS-6S 증가가 감소되는 것은 연골 퇴행을 예방한다는 것을 나타내며, CS-4S 증가가 감소되는 것은 활막 염증을 예방한다는 것을 나타냈다.

도 2에서, (A)는 PBS 군으로부터의 전형적인 검체이고, (B)는 1％ HA-Na 군으로부터의 전형적인 검체이고, (C)는 1회 주사 HA-겔 군으로부터의 전형적인 검체이고, (D)는 2회 주사 HA-겔 군으로부터의 전형적인 검체이다 (최초 배율 x 40).

사프라닌 O 염색은 연골에서의 글리코사미노글리칸 (GAG) 함량을 나타낸다 (GAG: 적색, 뼈 & 콜라겐 섬유: 녹색).

하기 관찰을 수행하여 점수를 매겼다: 사프라닌 O에 대해 염색되지 않거나/염색이 덜된 연골 매트릭스 영역, 연골 매트릭스에서의 열창 형성, 연골 매트릭스의 피브릴화, 연골 결손, 연골 세포의 개수의 증가, 연골 세포의 개수의 감소, 연골하 뼈의 리모델링 및 연골 매트릭스에서의 혈관 침습. 시험 물질간의 중증도 비교는 하기 순서이었다: PBS > 1％ HA-Na > HA-겔 1회 주사 > HA-겔 2회 주사.

종합적으로, 연골 퇴행은 활막염이 심하지 않을 때 완화되기 때문에, HA-겔에 의해 유도된 상기 변화는 이롭게 상호작용하여 병리학적 변화의 진행을 경감시킬 수 있다. 관절 연골의 조직병리학적 소견은 육안적 평가 (도 2)에 의해서도 지지된다. 활막의 조직병리학적 검사에서, 입방/중층 윤활 상피, 상피하 세포성 침윤, 상피하 섬유증/부종, 상피하 출혈 및 상피하 칼슘 침착이 모든 실험군에서 관찰되었다. 이러한 변화는 HA-겔 군에서 PBS 군에서보다 덜 심하였다.

결론

상기 데이타는, OA의 토끼 ACL 횡절단 모델에서 HA-겔 1회 또는 2회 투여 (2주 간격으로)가 활막염 및 연골 퇴행을 억제했다는 것을 나타낸다.

실시예 2: 래트에서의 브라디키닌-유도된 관절염성 동통에 대한 가교된 히알루론산 겔 (HA- Gel)의 관절내 주사 효과

목적

본 연구에서 사용된 관절염성 동통 모델은 브라디키닌 (내인성 과민통성 물질)을 PGE2 (동통 증강제)와 함께 래트의 관절강에 주사함으로써 발생된 국부 동통 모델이다. 이러한 모델은 "발 들기", "파행" 및 "세발로 워킹"과 같은 보행에서의 관절 동통의 행동 징후에 대한 히알루로난 제제의 진통 효과를 평가하는데 사용되었다. 상기 모델에 의해 평가된 진통 효과는 윤활 조직에서 히알루로난의 농도와 관련이 있다고 보고되어 있다.

본 연구의 목적은 래트에서 브라디키닌에 의해 유도된 관절염성 동통에 대한 HA-겔의 지속성 진통 효과를 1％ HA-Na 및 PBS와 비교하여 조사하는 것이다.

방법

시험 물질을 0.05 mL/관절의 투여량으로 암컷 래트의 좌후각의 무릎 관절강에 투여하였다. 투여 후 제1주, 제2주 및 제4주째에, 브라디키닌 용액과 PGE2의 혼합물을 동일한 관절에 주사하여 관절염성 동통을 유도하였다. 1％ HA-Na의 치료는 1주에 1회 재주사가 요구되기 때문에 제1주째에서만 평가하였다. 맹검 조건하에서, 동물의 워킹을 브리디키닌 용액 주사 후 약 2분 동안 관찰하고, 동통의 중증도를 5점-스케일로 점수를 매겼다 (표 1).

브라디키닌-유도된 관절염성 동통 모델: 동통 점수를 매기는 기준

점수	행동 징후
0	정상 또는 5초 이하 동안 파행
1	6 내지 30초 동안 파행
2	하기 2가지 징후 중 1가지가 나타남 31초 이상 동안 파행 5초 이하 동안 발 들기
3	하기 2가지 징후 중 1가지가 나타남 발 들기에 이어 파행 5초 이하 동안 세발로 워킹
4	6초 이상 동안 세발로 워킹

결과

HA-겔은 투여 후 시점 제1주, 제2주 및 제4주째에 브라디키닌-유도된 동통 반응을 대조군에 비해 현저하게 억제하였다 (도 3). HA-겔에 의한 진통 효과는 제1주째에 1％ HA-Na에 의한 것보다 훨신 현저하였다.

결론

관절강에 투여한 HA-겔은 양성 대조군으로서 시험된 PBS 및 1％ HA-Na보다 브라디키닌-유도된 관절염성 동통에 대해 더욱 효과적이다. 대조군과 비교하여, HA-겔은 적어도 4주 동안 계속된 지속 진통 효과를 제공하였다.

실시예 3: 래트에서의 질산은-유도된 관절염성 동통에 대한 가교된 히알루론산 겔 (HA-겔)의 관절내 주사 효과

목적

본 연구의 목적은 래트³에서의 질산은에 의해 유도된 관절염성 동통에 대한 HA-겔의 동통-경감 효과를 조사하는 것이다. 이러한 모델은 다양한 비-스테로이드성 항염증 약물 (NSAID)의 진통 효과의 평가에 통상적으로 사용되었다.

방법

1％ 질산은 수용액을 0.05 mL/관절의 투여량으로 42마리 수컷 래트의 좌후각의 무릎 관절강에 주사하였다. 주사 후 제24시간째에, 워킹 동안의 동통 점수 및 염증 발에서의 중량 적재(weight-loading)에 따라 동물을 군으로 분류하였다. 동통의 중증도는 하기 4-점 스케일로 점수를 매겼다: 0점 정상 또는 거의 정상, 점수 1 경증 파행, 점수 2 중증 파행, 점수 3 세발로 워킹. 중량 적재는 웨이팅 액티비티 진통계(weighting activity analgesia meter) (도껜 인크.(Tokken Inc.)사 제조)를 이용하여 측정하였다. HA-겔, 1％ HA-Na 또는 PBS를 0.05 mL/관절의 투여량으로 투여하였다. 투여 후 제1일, 제2일 및 제3일째에 염증 발에서의 중량 적재 및 동통 점수를 상기와 동일한 방식으로 평가하였다. 평가된 항목은 중량 적재율 (％) (=염증 발에서의 적재 (g)/체중 (g) x 100) 및 워킹 동안의 동통 점수였다.

결과

시험 물질 투여 후 제1일 내지 제3일째에 각 시점에서, 염증 발에서의 중량 적재율은 HA-겔을 투여한 동물에게서 PBS 또는 1％ HA-Na를 투여한 동물보다 현저하게 높았다 (도 4). 또한, HA-겔의 동통 점수는 측정된 각 시점에서 PBS 또는 1％ HA-Na보다 더 낮았다 (도 5).

결론

이러한 데이타는 관절강에 투여된 HA-겔이 PBS 및 1％ HA-Na보다 염증성 관절 동통에 대해 보다 효과적이었다는 것을 입증한다.

실시예 4: 개에서의 요산일나트륨-유도된 관절염성 관절 동통에 대한 가교된 히알루론산 겔 (HA-겔)의 진통 효과

목적

활액에서의 요산일나트륨 (MSU)의 미세결정의 침착은 인간의 급성 염증성 관절 동통을 진행시킨다. MSU 결정의 관절내 주사에 의해 유도된 실험 관절 동통 모델은 히알루론산나트륨 및 비-스테로이드성 항염증 약물의 진통 효능을 평가하는데 광범위하게 사용되었다.

본 연구의 목적은 개에서의 MSU에 의해 유도된 관절 동통에 대한 HA-겔의 진통 효과를 조사하는 것이다.

방법

HA-겔, 생리 식염수 또는 1％ HA-Na를 0.3 mL/kg/관절의 투여량으로 개의 좌후지의 무릎 관절강에 관절내 주사에 의해 암컷 비글 개에 투여하였다. 이어서, 염증 및 중증 동통을 유도하는 물질인 요산일나트륨 (MSU)을 시험 물질 처리 후 제0.5시간 또는 제72시간째에 동일한 관절에 주사하였다. MSU의 주사 후 제2시간, 제3시간, 제4시간, 제5시간, 제6시간 및 제8시간째에, 보행 상태를 점수로 매기고, 좌후지의 중량 지지율(weight-bearing rate)을 관절 동통 지표로서 계산하였다. 경과시간 곡선하 면적 (AUC)을 상기 지표 모두로부터 계산하였다.

보행을 관찰하고 하기 기준에 따라 보행 상태를 점수 (이상 보행 점수로 나타냄)로 매겼다: 0: 변화없음 (정상 보행), 1: 경증 (정상적으로 서 있지만 보행이 부자연스러움), 2: 중등도 (4지로 서 있지만 좌후지 (주사 부위)를 자주 듦), 3: 중증 (워킹시 좌후지 끝으로만 땅을 디딤) 및 4: 심한 중증 (좌후지에 체중을 실지 못하고; 3지로 워킹). 또한, 3개의 스케일이 중량-부하 측정에 사용하였다: 스케일 A는 디지털 플랫폼 스케일였음 (DP-6100GP; 야마또 스케일 캄파니 리미티드(Yamato Scale Co., Ltd)); 및 스케일 B 및 C는 로드-세포 디지털 플랫폼 스케일 (DP-6000; 야마또 스케일 캄파니 리미티드)이었음. 전지는 스케일 A, 우후지는 스케일 B, 및 좌후지는 스케일 C에 위치시켰다. 3개의 모든 스케일로부터의 값은 가장 가까운 0.1 kg으로 기록하였다. 중량-지지율은 하기 식을 이용하여 계산하였다.

중량-지지율 = 100 x 평균값 C/(평균값 A + 평균값 B + 평균값 C)

결과

시험 물질 처리 후 제0.5시간째에 MSU를 주사한 실험에서, 이상 보행 점수의 평균 AUC는 HA-겔, 생리 식염수 및 1％ HA-Na에서 각각 0.0, 28.0 및 13.5였다 (도 6, 표 2). HA-겔은 완전한 진통 효과를 나타내고, 모든 처리 동물에서 동통성 워킹이 전혀 관찰되지 않았다. 1％ HA-Na도 생리 식염수에 비하면 현저한 진통 효과를 나타냈지만, HA-겔의 효과보다는 현저히 낮았다. 시험 물질 처리 후 제72시간째에 MSU를 주사한 실험에서, 이상 보행 점수의 AUC는 HA-겔, 생리 식염수 및 1％ HA-Na에서 각각 1.5, 27.6 및 27.1이었다 (도 7, 표 3). HA-겔은 여전히 현저한 진통 효과를 나타냈으나, 무릎 관절 동통에 대한 1％ HA-Na의 효과는 거의 완전히 줄어들었다.

상기 실험 둘다에서, 좌후지의 중량-지지율의 변화는 이상 보행 점수의 변화와 일치하였다.

요산일나트륨-유도된 관절염성 관절 동통 모델: 이상 보행 점수의 AUC
생리 식염수, HA-겔 및 1％ HA-Na는 MSU 주사하기 0.5시간 전에 관절내 투여하였음
군	동물수	이상 보행 점수의 AUC
생리 식염수 (0.3 mL/kg)	12	28.0 ± 0.0
가교된 히알루론산 겔 (HA-겔) (0.3 mL/kg)	12	0.0** ± 0.0
1％ HA-Na (0.3 mL/kg)	12	13.5**, ## ± 3.2
** p<0.01: 생리 식염수와 유의적인 차이 (투키-크라머 다중 비교 검정)
## p<0.01: 가교된 히알루론산 겔과 유의적인 차이 (투키-크라머 다중 비교 검정)

요산일나트륨-유도된 관절염성 관절 동통 모델: 이상 보행 점수의 AUC
생리 식염수, HA-겔 및 1％ HA-Na는 MSU 주사하기 72시간 전에 관절내 투여하였음
군	동물수	이상 보행 점수의 AUC
생리 식염수 (0.3 mL/kg)	12	27.6 ± 1.1
가교된 히알루론산 겔 (HA-겔) (0.3 mL/kg)	12	1.5** ± 4.5
1％ HA-Na (0.3 mL/kg)	12	27.1## ± 2.1
** p<0.01: 생리 식염수와 유의적인 차이 (투키-크라머 다중 비교 검정)
## p<0.01: 가교된 히알루론산 겔과 유의적인 차이 (투키-크라머 다중 비교 검정)

결론

HA-겔의 1회 관절내 투여가 MSU-유도된 관절염성 무릎 관절 동통을 억제하였다는 것을 확인하였다. 1％ HA-Na에 비해, HA-겔의 진통 효과는 우수하였고 더 길었다.

실시예 5: 토끼에서의 무릎의 관절강 및 활막에서의 가교된 히알루론산 겔 (HA-겔)의 잔류율

목적

본 연구의 목적은 토끼에서 관절내 주사된 HA-겔의 국부 체류를 조사하는 것이다.

방법

HA-겔 및 그의 비-가교된 중간체 (int-HAD)를 0.05 mL/kg/관절의 투여량 (HA-겔 및 int-HAD의 농도: 1％)으로 수컷 토끼의 우측 및 좌측 무릎 관절강 둘다에 투여하였다. 동물을 투여 후 제1일, 제3일, 제5일, 제7일, 제14일 및 제28일째에 희생시키고, 활액 및 활막을 수집하였다. 가교된 히알루론산 겔의 잔류 가교제인 트랜스-신남산 (tCA)을 고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC)으로 정량하여 HA-겔 및 int-HAD의 잔류율을 계산하였다.

결과

잔류율을 HPLC로 측정한 값으로부터 계산하였다.

관절강에 외부 투여한 히알루론산염의 대사 분해에 대하여, 히알루론산염은 점차로 활액에서 활막으로 이동한다는 것이 통상적으로 알려져 있다.

대부분의 HA-겔이 활액에서는 7일 이내에 사라졌지만, 활막에서는 투여 후 제28일째까지도 남아있었다. HA-겔 및 int-HAD의 잔류율을 비교한 결과, 투여 후 제1일, 제3일 및 제5일째에 HA-겔의 현저히 높은 수준이 활액에서 검출되었다 (도 8). 도 8에 따르면, 활액에서는 HA-겔이 투여 후 제3일째 투여한 HA-겔의 약 15％가 남아있었다. 그러나, 활막에서는 가교된 히알루론산 겔의 비율이 제7일, 제14일, 제28일째에 현저히 높게 남아있었다 (도 9).

결론

비-가교된 히알루로난과 비교하여, 주사된 HA-겔은 긴 기간 동안 활액 및 활막에 남아있었다. 한편, 비-가교된 히알루로난은 활액으로부터 급속히 확산되었으며 활막에 저수준으로 남아있었다. 따라서, HA-겔이 활액에서 활막으로 보다 천천히 이동하고, int-HA에 비해 보다 점차로 대사분해되기 때문에, HA-겔은 관절 (즉, 투여 부위)에 장기간 존재하여 남을 수 있다. HA-겔의 증가된 체류는 우수한 연골 보호 효과 및 지속성 진통 효과에 기여할 수 있다.

실시예 6: 토끼에서의 파파인-유도된 관절염에 대한 가교된 히알루론산 겔 (HA-겔)의 관절내 주사 효과

본 연구에서 사용되는 토끼 파파인 유도된 관절염 모델은 토끼의 무릎 관절강에 파파인 (파파야에 존재하는 시스테인 프로테아제)을 주사함으로써 제조된 골관절염 (OA) 모델로 인정된다.

본 연구의 목적은 파파인-유도된 관절염 모델에서 HA-겔의 효능을 조사하는 것이다. 본 연구는 2회 수행하였다.

토끼 (21-주령 수컷)를 일반적인 마취제인 케타민 (1 mL/두부, 정맥내)하에서 양와위 자세로 고정시키고, 좌후각의 무릎 관절 주변의 넓은 영역을 전기 이발기로 면도하였다. 무릎 관절의 주사 부위를 70％ 에탄올 및 이소딘(Isodine^®) 용액으로 소독하였다.

이후에, 0.8％ 파파인 용액을 500 μL/관절의 투여량으로 좌측 후방 무릎의 관절강에 2회 (3일 간격으로) 투여하였다.

각 군이 5마리의 토끼로, 총 20마리의 토끼를 상기 연구에 사용하였다. 파파인 용액을 주사 직전에 1-시스테인으로 활성화시켰다.

파파인의 제2회 주사 후 제1주일째에 시험 물질 (HA-겔 또는 인산염 완충 염수 (PBS)) 150 μL를 3주 동안 주 1회 좌후각의 무릎 관절강에 투여하였다.

모든 동물을 시험 물질 최종 투여 후 제1주일째에 희생시켰다. 이어서, 좌측 무릎 관절을 분리하여, 활액 및 활막을 좌측 무릎 관절로부터 수집하였다.

좌측 무릎 관절을 활막 및 관절 연골의 형태 조사, 조직병리학적 검사, 활액의 부피 및 단백질 함량에 의해 평가하였다. 조직병리학적 검사를 위해, 파라핀 절편을 포르말린-고정된 활막으로부터 제조하여 헤마톡실린-에오신 (HE) 및 알루시안-블루로 염색하였다. EDTA 탈석회 작용 및 사프라닌 O 염색 후에, 대퇴 관절융기 및 경골 고평부의 연골 상태를 관찰하였다.

형태 평가에서, 퇴행 중증도는 실시예 1과 동일한 기준에 따라 점수를 매겼다 (도 10 및 11). 가교된 히알루론산 겔은 PBS에 비해 연골 퇴행을 완화시켰다. 그러나, 상기 효능은 현저하지 않았다. 이는 동물수가 충분하지 않았기 때문인 것으로 간주된다.

연골의 조직병리학적 검사에서, 연골 매트릭스의 퇴행, 연골 세포 감소 및 사프라닌 O에 대한 염색의 감소는 HA-겔에 의해 완화되었다.

상기 연구에서 사용된 HA-겔은 PBS에 비해 연골 퇴행을 억제하였다.

상기 연구에서 사용된 히알루론산 겔의 가교 비율은 각각 1.72％ (도 1O) 및 2.06％ (도 11)이고, 다른 실시예 연구에서 사용된 HA-겔보다 더 적었다. 특정 범위의 가교 비율은 관절염성 동통 및 연골 퇴행의 개선에 있어서 현저한 효능을 달성하는데 있어서 필수적인 것으로 고려된다.

이러한 상기 실시예에 따르면, HA-겔 1회 또는 2회 (2주 간격으로)의 관절내 주사는 무릎 OA 치료용 HA-Na의 5회 주사보다 동일하거나 훨씬 큰 효과를 갖는다는 것이 입증되었다. 또한, HA-겔은 NSAID 평가용 동물 모델에서 치료 효능을 제공한다는 것이 확인되었다.

HA-겔을 무릎 관절강에 주사하였을 때, 대부분의 HA-겔은 7일 이내에 활액에서 사라졌다. 그러나, 활막에서는 투여 후 제28일까지 남아있었다. 활막에서의 히알루로난 농도가 진통 효과와 서로 관련이 있는 것으로 간주되기 때문에, HA-겔의 증가된 체류는 지속성 진통 효과에 기여할 수 있다. 더욱이, HA-겔은 HA-Na 용액보다 점탄성이 더 크기 때문에 OA에서 동통을 경감시키고 무릎 기능을 개선시키는 우수한 충격 흡수제인 것으로 예상된다.

1회 주사에 의한 지속성 효과, 1회 치료 동안 투여 횟수의 감소, 및 관절내 투여에 있어서 감염 위험의 감소의 이점을 갖는 관절 질병용 치료제가 제시될 수 있다. 결과적으로, 관절 질환을 앓고 있는 환자의 스트레스를 낮출 수 있다.

Claims (21)

1. 히알루론산의 관능기 중 일부가, 히알루론산의 구성 이당류 단위의 총 수에 대하여, 가교점이 1％ 내지 7.5％의 비율로 가교기에 의해 가교된 가교 히알루론산 유도체를, 활성 성분으로, 장기 지속성 진통 효과를 나타내는 양으로 포함하고, 약리적으로 허용된 담체로 이루어진, 관절 질환 치료용 관절내 투여용 주사용액에 있어서,

   가교기가 신남산 또는 신남산 유도체의 잔기이고,

   가교기의 도입률이 10% 내지 25%이며,

   가교 히알루론산 유도체의 가교율이 10% 내지 30%인 것을 특징으로 하는, 주사용액.
2. 제1항에 있어서, 상기 가교기와 히알루론산 관능기 사이의 스페이서가 아미노알킬 알콜 잔기인 주사용액.
3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 가교 히알루론산 유도체의 용액의 농도가 용액의 총 중량에 대하여 0.5 중량％ 내지 3.0 중량％인 주사용액.
4. 제1항 또는 제2항에 있어서, 가교 히알루론산 유도체 용액의 농도가 용액의 총 중량에 대하여 1 중량%인 주사용액.
5. 제1항 또는 제2항에 있어서, 18 게이지 내지 25 게이지인 니들을 통과할 수 있는 것을 특징으로 하는 주사용액.
6. 제3항에 있어서, 18 게이지 내지 25 게이지인 니들을 통과할 수 있는 것을 특징으로 하는 주사용액.
7. 제4항에 있어서, 18 게이지 내지 25 게이지인 니들을 통과할 수 있는 것을 특징으로 하는 주사용액.
8. 제1항 또는 제2항에 있어서, 진통 효과가 투여 부위에 용액을 투여한 후 2주 이상 동안 지속되는 주사용액.
9. 제1항 또는 제2항에 있어서, 단위 투여량 제형인 가교 히알루론산 유도체로 이루어지고, 상기 단위 투여량이 1회의 투여에 있어서 1kg 당 가교 히알루론산 유도체 0.3 mg 내지 1.2 mg의 양인 주사용액.
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