KR20130028012A - 관절염 주사요법제 - Google Patents

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KR20130028012A
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조일환
황의진
서무석
박영수
김봉주
김형준
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신풍제약주식회사
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Abstract

본 발명은 히알루론산의 알킬렌디아민 가교물 하이드로겔을 포함하는, 관절염 질환의 치료 또는 증상 개선을 위한 관절내 투여용 주사액 조성물에 관한 것으로, 생체 적합성이 우수하고, 생체내에서 오래 지속될 수 있어 1회 주사에 의해 관절에서 장기간 지속되는 진통 효과, 연골보호효과 및 활막 염증 억제효과를 나타내어, 효과적으로 관절염 주사요법제로 사용될 수 있다.

Description

관절염 주사요법제{Therapeutic Injection Agent for Arthritis}
본 발명은 1회 주사에 의해 관절에서 장기간 지속되는 진통 효과, 연골보호효과 및 활막 염증 억제효과를 나타내는 관절염 주사요법제에 사용될 수 있는 주사액 조성물, 이를 포함하는 키트에 관한 것이다.
관절 동통 및 관절퇴행에 의해 유발되어 기능이상을 나타내는 골관절염(OA)은 고령의 연령층에서 흔히 볼 수 있는 질환으로 전 세계적인 고령화 추세에 따라 점차 증가하고 있다. 그 원인은 명확히 밝혀져 있지 않으나 초자연골과 활액막, 골조직에서 상호 파괴와 재생이 발생되는 이차적 염증반응의 결과로 동통, 부종, 관절운동 제한 등이 발생한다. 현재까지 골관절염 주사요법제의 치료 목적은 관절의 구조적 손상을 회복시켜주는 방향이라기보다, 증상 완화에 초점을 맞추어 통증을 줄이고, 질병의 진행을 지연시킴으로써 관절 기능과 삶의 질을 유지시키는 데 있다. 골관절염을 앓는 대상자들에 대한 치료 중 하나로, 히알루론산을 관절내 연속주사하는 히알루론산-주사요법제가 시행되고 있다.
히알루론산은 N-아세틸-D-글루코사민과 D-글루쿠론산으로 이루어진 반복 단위가 선형으로 연결되어 있는 생체고분자 물질로서, 안구의 유리액, 관절의 활액 등에 많이 존재하며, 관절 내 주사 시 윤활제 및 충격 흡수제로 작용하여 관절통증을 경감시키고, 관절 기능을 개선시킨다. 예컨대, 신비스크(Synvisc)?, 히알간(Hyalgan)? 등이 미국 내에서 시판되고 있다. 그러나, 이들 제제는 히알루론산 그 자체로 이루어져 있고, 히알루론산은 체내에 적용 뒤 수시간에 불과한 짧은 반감기를 갖기 때문에 일정 시간 동안 골관절염에 약효를 나타내기 위해서 3회 내지 5회의 다회에 걸친 연속주사가 불가피하였다. 하지만 다회 주사법의 경우 환자와 시술 의사 모두에게 번거롭고 비효율적인 방법이므로 동일한 효능을 지닌 단회 주사가 요구되는 실정이다. 이에 미국과 유럽을 중심으로 히알루론산을 가교 결합하여 반감기(체내 지속성)가 증대된 단회 주사제 개발 연구가 진행되어 왔다. 예컨대 디비닐술폰, 비스에폭사이드, 비스할라이드, 포름알데히드 등과 같이 작용기가 두 개인 화합물을 가교제로 사용하여 가교결합된 히알루론 유도체를 합성한 예가 여러 문헌에 보고되었으며, 이러한 제법을 기반으로 한 제품들이 퇴행성 관절염 주사요법제(Viscosupplement)로 시판되고 있다.
예컨대, 미국특허 제4,582,865호는 디비닐술폰(DVS)을 가교제로 사용하여 가교된 히알루론 유도체를 개시하고 있으며, 이의 하이드로겔 복합체 형태가 Synvisc-one?의 상품명으로 시판되고 있고, 미국특허 제5,827,937호는 다기능 에폭시화합물을 가교제로 사용하여 히알루론 유도체 가교물을 제조하는 방법이 개시되어 있으며, 이중 다기능에폭시화합물로서 1,4-부탄디올 디글리시딜에테르(BDDE)을 가교제로 사용하여 제조한 히알루론산 가교물의 하이드로겔 형태인 Durolane?은 유럽 CE 인증을 받아 여러 나라에서 시판되고 있다. 이들 제품들은 모두 히알루론산의 하이드록시기와 가교제가 결합하여 생성되는 것으로, 미가교 히알루론산에 비하면 그 생체 내 지속성이 증대되었다고는 하나, 여전히 6개월 이내에 분해되는 등 생체 지속성이 낮은 문제가 있었다. 이에, 본 출원인은 히알루론산 분해효소의 인식부위가 히알루론산의 카르복시기임을 착안하여 히알루론산의 카르복시기와 결합하는 아디프산 디하이드라자이드(ADH)를 가교제로 사용하여 생체 지속성이 높은 히알루론산-ADH 가교물을 제조하는 방법을 개발하고 이를 출원번호 제10-2008-0074260호로 출원한 바 있으나, 생체적합성이 낮은 문제가 있었다. 한편, 최근 미국 FDA의 PMA 승인된 제품인 GEL-ONE?은 위의 시판 제품들과 달리 카르복시기와 가교제가 결합하는 방식(미국특허 제6,031,017호)을 취하여 생체내 지속성이 우수할 것으로 기대된다.
한편 히알루론산 가교물은 체내에 이물로 인식될 수 있는 화학물질을 가교제로 사용되어 제조되고 있는바, 추후 생체에 투여되어 분해되는 경우 잔여 가교제로 인해 면역반응이 일어나는 등 생체적합성의 문제가 있으므로, 보다 우수한 생체적합성을 갖는 가교물이 요구된다.
이상과 같이 생체 내에서 오래 지속되고, 높은 생체적합성을 나타내어, 1회 주사에 의해 관절에서 장기간 지속되는 진통 효과, 연골보호효과 및 활막 염증 억제효과를 나타내는 관절염 주사요법제에 사용될 수 있는 주사액 조성물이 요망된다.
미국특허 제4,582,865호(1986년 4월 15일 공개) 미국특허 제5,827,937호(1998년 10월 27일 공개) 한국특허출원 제10-2008-0074260호(2009년 2월 5일 공개) 미국특허 제6,031,017호(2000년 2월 29일 공개)
본 발명은 상기한 바와 같은 종래 기술의 문제점을 해결하고자 한 것으로, 관절염 1회 주사요법제로 사용될 수 있도록, 생체내 지속성 및 생체 적합성이 우수한, 가교결합된 히알루론산 하이드로겔을 포함하는 주사액 조성물 및 그 제조방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 활성성분으로서 하기 식 1의 히알루론산의 알킬렌디아민 가교물 하이드로겔을 포함하는, 관절염 질환의 치료 또는 증상 개선을 위한 관절내 투여용 주사액 조성물을 제공한다;
[식 1]
[HA]m-C(O)-NH-R1-NH-C(O)-[HA]n
(상기 식에서, HA는 카르복실기 하나를 제외한 히알루론산 또는 그의 염을 나타내고, R1은 히드록시, C1-C6 알킬, 또는 C1-C6 알콕시로 치환되거나 비치환된 C3-C10 알킬렌기이며, m 및 n은 독립적으로 10,000 ~ 4,000,000의 정수이다).
바람직하게, 본 발명의 조성물에 사용되는 히알루론산은 분자량이 20,000 달톤 내지 4,000,000 달톤이다.
바람직하게, 본 발명의 조성물에서 알킬렌디아민이 헥사메틸렌디아민이다.
바람직하게, 본 발명의 조성물에서 가교물 하이드로겔의 가교율은 5 ~ 35%이다.
바람직하게, 본 발명의 조성물에서 가교물 하이드로겔은 주사액 총 중량에 대하여 0.4 ~ 3.0 (w/w)%로 포함된다.
바람직하게, 본 발명의 조성물은 1회 주사시 그 진통효과가 주사액 투여 후 2주 이상 장기간 지속된다.
바람직하게 본 발명의 조성물은 미변형 히알루론산을 더 포함한다.
본 발명의 조성물이 미변형 히알루론산을 더 포함하는 경우, 바람직하게는 히알루론산의 알킬렌디아민 가교물 하이드로겔 : 미변형 히알루론산 중량비가 5 : 5 내지 9.5 : 0.5이고, 더 바람직하게는 7 : 3 내지 9.5 : 0.5이다.
바람직하게 본 발명의 조성물은 관절염 질환에 의해 유발되는 관절 동통을 경감시키는 진통효과, 관절염 질환에 의해 유발되는 연골 퇴행 억제효과, 관절염 질환에 의해 유발되는 활막 염증 억제효과를 나타내어, 관절염 질환의 치료 또는 증상 개선용 주사요법제로 유용하게 사용된다.
바람직하게 본 발명의 조성물은 골관절염의 치료 또는 증상 개선을 위한 1회 주사요법제로 유용하게 사용된다.
조성물의 나머지 잔부는 물, 생리식염수 등의 약학적으로 적합한 담체로 구성된다.
또한, 본 명세서에서 용어 "히알루론산"은 히알루론산 자체는 물론 그의 염 및 유도체를 모두 포함하는 의미로 사용된다. 따라서, 이하에서 사용되는 용어 "히알루론산 수용액"은 히알루론산의 수용액, 히알루론산 염의 수용액, 및 이들의 혼합물 수용액을 모두 포함하는 개념이다.
본 발명에 따른 주사액 조성물에 사용되는 히알루론산의 알킬렌디아민 가교물 하이드로겔의 제법을 구체적으로 이하에서 설명한다.
본 발명에서 사용되는 히알루론산의 알킬렌디아민 가교물 하이드로겔은 카르복실기 활성화제와 펩티드 결합 촉진제의 존재하에 히알루론산을 알킬렌 디아민 화합물과 반응시켜 제조한다.
분자량이 10,000 달톤 내지 4,000,000 달톤, 더욱 바람직하게는 20,000 달톤 내지 4,000,000의 히알루론산(HA)이 사용된다. HA의 분자량 또는 농도를 조절하여 제조되는 가교물 하이드로겔의 생체 내 분해율을 조절할 수 있다. 통상 HA의 초기 농도가 높을수록 제조되는 가교물 하이드로겔의 가교율이 높으며, 이에 따라 낮은 생체내 분해율을 나타낸다. 바람직하게 HA는 1.0 내지 3.5 (w/w)%의 농도로 사용하며, 더욱 바람직하게는 3.0 (w/w)%를 사용한다. 1.0 (w/w)% 미만인 경우에는 원하는 정도의 생체분해율을 얻기 어렵고, 3.5 (w/w)%를 초과하는 경우에는 제조된 하이드로겔이 건조하여 부서지기 쉽다.
알킬렌디아민 화합물은 히드록시, C1-C6 알킬, 또는 C1-C6 알콕시로 치환되거나 비치환된 C3-C10 알킬렌디아민 화합물로서, 바람직하게는 C3-C7 알킬렌디아민, 보다 바람직하게는 C4-C6 알킬렌디아민, 가장 바람직하게는 C6 알킬렌디아민(헥사메틸렌디아민)을 사용하며, 히알루론산 반복 단위의 3.5 내지 80 몰%, 바람직하게는 10 내지 30 몰%, 가장 바람직하게는 10 내지 25 몰%로 사용한다.
카르복실기 활성화제로서는 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필) 카르보디이미드 (EDC, 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide)와 같은 1-알킬-3-(3-디메틸아미노프로필) 카르보디이미드들; 1-에틸-3-(3-(트리메틸암모니오)프로필) 카르보디이미드 (ETC, 1-ethyl-3-(3-(trimethylammonio)propyl) carbodiimide)와 같은 1-알킬-3-(3-(트리메틸암모니오)프로필) 카르보디이미드들; 1-사이클로헥실-3-(2-모르폴리노에틸) 카르보디이미드(CMC, 1-cyclohexyl-3-(2-morpholinoethyl) carbodiimide)와 같은 1-사이클로알킬-3-(2-모르폴리노에틸) 카르보디이미드 등의 수용성 카르보디이미드의 카르보디이미드를 사용하며, 보다 바람직하게는, 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필) 카르보디이미드(EDC)를 사용하고, 히알루론산 1몰당 몰비로 1 내지 5배로 사용하는 것이 바람직하다.
펩티드 결합 촉진제로서는 예를 들면, 1-히드록시벤조트리아졸(HOBt, 1-hydroxybenzotriazole), 3,4-디히드로-3-히드록시-4-옥소-1,2,3-벤조트리아진(HOOBt, 3,4-dihydro-3-hydroxy-4-oxo-1,2,3-benzotriazine), 1-히드록시-7-아자벤조트리아졸 (HOAt, 1-hydroxy-7-azabenzotriazole), 설포-N-히드록시설포숙신이미드 (Sulfo-NHS, Sulfo-N-hydroxysulfosuccinimide), O-(1H-벤조트리아졸-1-y)-N,N,N',N'-테트라메틸유로니움테트라플루오로보레이트(TBTU, O-(1H-benzotriazole-1-yl)-N,N,N',N'-tetramethyluronium tetrafluoroborate)를 사용하며, 바람직하게 1-히드록시벤조트리아졸(HOBt)를 사용하고, 히알루론산 1몰당 몰비로 1 내지 5배로 사용하는 것이 바람직하다.
바람직하게 알킬렌 디아민 화합물로서, 헥사메틸렌디아민(HMDA)을 사용하여 제조한 히알루론산-헥사메틸렌디아민 가교물을 도 1에 나타내었다. 도 1에서 알 수 있는 바와 같이, 카르복실기 활성화제와 펩티드 결합 촉진제의 존재하에, 히알루론산의 카르복실기와 알킬렌 디아민 화합물의 아민기가 아미드 결합을 통하여 가교가 일어남을 알 수 있다. 가교결합은 분자 간에 일어날 수도 있고, 분자 내에서 일어날 수도 있다. 히알루론산의 카르복실기는 히알루론산 분해효소인 히알루로니다제가 히알루론산을 인식하는 데에 관여하는 중요한 기로서, 본 발명의 히알루론산의 알킬렌디아민 가교물 하이드로겔은 히알루론산의 카르복실기가 가교에 사용됨으로써 생체 내에 투입시 분해효소에 의한 히알루론산 분해가 최소화되어 생체 지속성이 증대된다.
상기 가교 반응은 통상 물에서 수행된다. 히알루론산, 알킬렌디아민 화합물, 카르복실기 활성화제와 펩티드 결합 촉진제는 각각 물에 용해시켜 혼합하여도 좋고, 히알루론산 및 알킬렌디아민 화합물을 녹인 용액에 카르복실기 활성화제와 펩티드 결합 촉진제를 녹인 용액을 혼합하여도 좋다. 특히, 카르복실기 활성화제로 사용되는 EDC의 경우, 약한 산성에서 EDU(N-ethyl-N-(3-dimethylaminopropyl) urea)로 변형이 일어날 수 있어, EDC를 물에 녹이고 가교될 히알루론산 및 알킬렌 디아민 혼합물에 투입하는데 소요되는 시간이 길어짐에 따라 제조된 가교물 하이드로겔의 물성 특히 멸균후 조성물의 탄성계수가 낮아지는 등 물성이 열화될 수 있다. 바람직하게는 용해에서 투입시까지의 소요되는 시간은 10 내지 30분 이내, 가장 바람직하게는 10분 내지 20분 이내로 하는 것이 좋다. 또한, 반응 온도는 30 내지 50℃, 바람직하게는 43 내지 45℃로 유지한다. 상기 온도에서 효율적으로 하이드로겔화 반응이 진행되어, 통상 30분 내에 하이드로겔이 생성된다. 또한 상기 온도에서 최소한 9시간 동안 방치시켜 양호한 점탄성을 갖는 하이드로겔을 제조할 수 있다. 이때, 교반없이 방치하는 것이 바람직하다. 추가 반응 시간이 증가함에 따라 점탄성 등의 물성이 증가하며, 9시간 이상에서는 제조된 하이드로겔의 점탄성 등 물성의 변화가 거의 없다. 또한, 제조시 pH에 따라 제조된 가교 하이드로겔의 가교율이 달라지며, 물성이 변화될 수 있다. pH는 NaOH 수용액을 반응 용액에 첨가하여 조정할 수 있으며, 바람직하게 5.5 내지 6.5, 더욱 바람직하게 6.0 내지 6.3로 하는 것이 좋다. 특히, pH를 5.5 내지 6.5로 조정함으로써, 비교적 소량의 가교제 (예, 헥사메틸렌디아민) 및 반응보조제(예, EDC와 같은 카르복실기 활성화제와 HOBt와 같은 펩티드 결합 촉진제)를 사용하여도 우수한 점탄성 등의 물성을 가지며, 멸균 후에도 점탄성 등의 물리화학적 성질의 변화가 없는 히알루론산의 알킬렌디아민 가교물 하이드로겔을 제조할 수 있다. pH가 5.5 미만의 산성 환경에서 제조된 하이드로겔은 제조후 비교적 낮은 탄성 계수(G')를 나타내며, 멸균시 탄성이 더욱 저하될 수 있다. 제조된 하이드로겔은 체를 통과시키거나, 호모게나이저를 사용하여 균일한 입자형태로 만든다. 특히, 체를 사용하여 균질화하는 것이 바람직하며, 좁은 입자분포 및 낮은 돌출압력을 갖는 하이드로겔을 얻을 수 있다. 가교반응이 끝난후, 미반응 물질들은 PBS에 24시간 내지 3일 동안 투석막을 이용하여 투석하여 제거하거나, 에탄올 수용액 및/또는 버퍼를 이용하여 검출한계(2 ppm) 이하로 제거할 수 있다. 다만, HOBt와 같은 촉진제는 유기용매에 더 잘 녹는 경향이 있어, 투석막과 PBS를 이용하는 투석법에 의해서는 정제가 잘 되지 않으나, 에탄올 수용액 및/또는 버퍼를 이용하여 용이하게 검출한계 이하로 제거할 수 있다. 이때, 버퍼는 바람직하게 PBS용액이나 염화나트륨(NaCl) 용액을 사용하며, 더 바람직하게는 염화나트륨(NaCl) 용액을 사용한다. 사용되는 NaCl의 농도가 높을수록 정제가 용이하며, 바람직하게는 0.5 내지 1.5%, 가장 바람직하게는 1 내지 1.3%로 사용한다. 또한, 에탄올 수용액, 예컨대 80% 에탄올 수용액을 첨가하는 경우 하이드로겔 입자가 침전으로 생성되며, 이 과정에서 미반응 물질들이 용이하게 제거된다. 침전된 하이드로겔은 질소 가스로 건조하여 분말화할 수 있고, 분말로 된 하이드로겔은 생리학적으로 적합한 수용액으로 재수화시켜 사용할 수 있다. 이때, 생리학적으로 적합한 수용액으로는 PBS나 생리식염수가 바람직하며, 히알루론산-알킬렌디아민 가교물 하이드로겔 분말에 대해 20 내지 30(부피비)의 비율로 생리학적으로 적합한 수용액으로 재수화시켜 사용할 수 있다.
본 발명의 히알루론산-알킬렌디아민 가교물 하이드로겔은 5 내지 35 %의 가교율을 가지며, 바람직하게는 10 내지 20%의 가교율을 가진다. 가교율이 5% 미만인 경우에는 히알루론산내 가교결합에 관여하지 않은 미반응 COOH기의 비율이 높아짐으로써 분해효소인 히알루로니다제(hyaluronidase)에 의해 쉽게 분해되므로, 원하는 정도의 생체 지속성을 얻기 어렵다. 가교율이 35%를 초과하는 경우에는 하이드로겔의 팽윤성 및 관절 보호에 유용한 정도의 점탄성을 나타내기 어려우며, 생체내 분해후 잔여 가교제의 함량이 높아져 염증반응 등을 일으킬 가능성이 커지는 등 생체 적합성이 낮다. 또한, 하이드로겔의 가교율이 낮은 경우 멸균후 점탄성 등의 물성이 열화될 수 있다. 본 발명의 히알루론산-알킬렌디아민 가교물의 가교율은 전체 히알루론산 함량에 대한 가교에 참여한 히알루론산 함량의 백분율을 의미하는 것으로, 가교제로 사용하는 알킬렌디아민의 전체 히알루론산에 대한 사용비율을 조절하거나, 제조시 pH를 조절하는 등을 통해 가교율을 조절할 수 있다. 가교율의 측정은 당업계에서 공지된 분석법 예를 들면, NMR 분석 및 TNBS assay(Habeeb, A.F.S.A., Determination of free amino groups in proteins by trinitrobenzenesulfonic acid. Anal. Biochem., 1966. 14: pp. 328-33 참조)을 통해 용이하게 시행할 수 있다. 이상의 본 발명의 히알루론산-알킬렌디아민 가교물로 된 하이드로겔은 디비닐설폰(DVS)를 가교제로 사용한 HA-DVS 가교물 하이드로겔에 비하여 현저히 낮은 분해율을 나타내며, 아디프산 디하이드라자이드(ADH)를 가교제로 사용한 HA-ADH 가교물 하이드로겔에 비하여 양호한 팽윤성 등의 물성을 나타낸다.
본 발명의 조성물은 바람직하게 상기 히알루론산의 알킬렌디아민 가교물 하이드로겔을 조성물 총 중량에 대하여 0.4 내지 3.0 (w/w)%로 포함하며, 더 바람직하게는 1.0 내지 2.0 (w/w)%로 포함한다. 하이드로겔을 0.4 (w/w)% 미만으로 포함하는 경우, 제조되는 조성물이 원하는 정도의 생체내 지속성 및 돌출압력을 갖지 못하며, 3.0 (w/w)%를 초과하여 포함하는 경우, 조성물의 돌출압력이 지나치게 높아져 조직내 주입이 어려워질 수 있다.
한편, 본 발명의 조성물은 히알루론산-알킬렌디아민 가교물 하이드로겔 이외에 미변형(즉, 가교되지 않은) 히알루론산을 더 포함할 수 있다. 미변형 HA는 통상 히알루론산-알킬렌디아민 가교물 하이드로겔 제조시 사용한 동일한 히알루론산을 사용한다. 미변형 HA는 윤활제로 작용하여 조성물의 돌출압력을 낮춤으로써, 주사기에 충전하여 조직내 주입시 낮은 압력으로 조성물을 조직내 주입할 수 있다. 본 발명의 조성물이 미변형 히알루론산을 더 포함하는 경우, 바람직하게는 히알루론산의 알킬렌디아민 가교물 하이드로겔 : 미변형 히알루론산 중량비가 5 : 5 내지 9.5 : 0.5이고, 더 바람직하게는 7 : 3 내지 9.5 : 0.5이다. 또한, 바람직하게 상기 미변형 히알루론산은 조성물 총 중량에 대하여 0.1 내지 2.0(w/w)%로 포함되며, 더욱 바람직하게는 0.15 내지 1.0 (w/w)%로 포함된다. 0.1 (w/w)% 미만으로 포함시 원하는 정도로 돌출 압력이 저하되지 않으며, 2.0 (w/w)%를 초과하여 포함되는 경우, 멸균후 탄성계수가 지나치게 낮아지는 등, 물성이 열화되어 생체 내 지속성이 감소될 수 있다.
조성물의 나머지 잔부는 물, 생리식염수 등의 약학적으로 적합한 담체로 구성된다.
본 발명의 히알루론산의 알킬렌디아민 가교물 하이드로겔을 포함하는, 보다 바람직하게는 히알루론산의 알킬렌디아민 가교물 하이드로겔과 미변형 히알루론산을 5 : 5 내지 9.5 : 0.5의 중량비로 포함하는 관절내 투여용 주사액 조성물은 생체 적합성 및 관절 보호에 필요한 관절 내 윤활 작용, 관절 표면 보호 작용 및 충격 흡수 등에 필요한 물성이 우수하고 생체 내에서 오래 지속될 수 있어 우수한 관절 치료 또는 증상 개선용 단회 주사요법제로 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 본 발명의 HA-HMDA 가교물의 합성과정 및 합성된 가교물 구조에 대한 개략도이다.
도 2는 본 발명의 실시예 1 내지 4의 조성물 투여군의 랫드 관절 통증 경감 효과를 음성대조군에 비교하여 도시한 것이다.
도 3은 본 발명의 실시예 1 조성물 투여군과 기존 비교예 제제 투여군 및 음성 대조군의 랫드 관절 통증 경감 효과를 비교하여 도시한 것이다.
도 4는 본 발명의 실시예 1, 3 및 4 조성물 투여군과 음성대조군의 랫드 관절 경증 연골 손상 면적을 비교하여 도시한 것이다.
도 5는 본 발명의 실시예 1, 3 및 4 조성물 투여군과 음성대조군의 랫드 관절 중증 연골 손상 면적을 비교하여 도시한 것이다.
도 6은 본 발명의 실시예 1 조성물 투여군과 기존 비교예 제제 투여군 및 음성 대조군의 랫드 관절 중증 연골 손상도(%)를 비교하여 도시한 것이다.
도 7은 본 발명의 실시예 1 조성물 투여군과 기존 비교 제제 투여군 및 음성 대조군의 토끼 슬관절 대퇴골 손상도를 비교하여 도시한 것이다.
도 8은 본 발명의 실시예 1 조성물 투여군과 기존 대조제제 투여군 및 음성 대조군의 토끼 슬관절 경골 손상도를 비교하여 도시한 것이다.
도 9는 본 발명의 HA-HMDA 가교물 하이드로겔을 포함하는 조성물이 조직에 미치는 효과를 정상군과 비교하여 나타낸 것으로, 각 군 마우스의 등 부분의 조직 표본을 H&E를 사용하여 염색한 뒤 광학현미경으로 촬영한 결과이며, 표시된 막대는 10 ㎛를 나타낸다 ((A): 정상군 (B): 제조예 2의 HA-HMDA 하이드로겔 투여군, E: 표피, D: 진피, H: 피하).
도 10은 본 발명의 실시예 2 조성물과 대조품의 히알루로니다아제 효소에 의한 분해 효과를 탄성계수(G')와 연관지어 나타낸 것이다(○: 실시예 2, ●: 대조품).
도 11은 본 발명의 실시예 2 조성물과 대조제제의 대퇴골에서의 손상과 연골 두께, 연골세포 감소 여부를 관찰한 결과이며, 표시된 막대는 220 ㎛를 나타낸다((A): 정상 대조군 (B): 골관절염 대조군 (C): 비교예 대조제제군 (D): 실시예 2 투여군). 점선은 조직학적 검사 준비를 위한 부위를 표시하며, 화살표는 연골의 두께를 나타낸다.
도 12는 본 발명의 실시예 2 조성물과 대조제제의 대퇴골 및 경골 연골에서의 Total Mankin score를 비교하여 도시한 것이다.
제조예 1: 본 발명의 히알루론산-헥사메틸렌디아민( HA - HMDA ) 가교물 하이드 로겔의 제조
분자량 약 230 kDa의 히알루론산(HA, 제조사: Lifecore Co.)을 1 (w/w)%의 농도로 완전히 증류수에 녹인 후 카르복실기와의 반응으로 가교를 이루기 위해 헥사메틸렌디아민(HMDA)을 첨가하였다. HMDA은 HA의 반복단위의 72 몰%로 첨가하였다. 카르복실기의 활성제인 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필) 카르보디이미드(EDC)와 1-히드록시벤조트리아졸(HOBt)을 HA 반복단위의 1.4배의 양으로 증류수에 녹인 후 상기 HA와 HMDA의 혼합액에 첨가하였다. HA-HMDA 가교물의 완전한 가교반응을 위해 상기 혼합용액을 37℃에서 1시간 동안 반응을 시켰다. 용액의 pH는 5.0-5.5이었다. 그 후, 제조된 HA-HMDA 하이드로겔을 미리 세척해둔 투석막(7 kDa의 분자량 컷-오프)으로 밀봉하여 0.01 M PBS(phosphate buffered saline, pH 7.4)에 24시간 동안 투석하여 잔류 EDC, HOBt 및 HMDA를 제거하였다. 제조된 HA-HMDA 하이드로겔의 가교도는 8-9%이었다.
제조예 2: 본 발명의 히알루론산-헥사메틸렌디아민( HA - HMDA ) 가교물 하이드로겔의 제조
분자량 약 1,000 kDa의 히알루론산(HA, 제조사: Lifecore Co.)을 1 (w/w)%의 농도로 완전히 증류수에 녹인 후 카르복실기와의 반응으로 가교를 이루기 위해 헥사메틸렌디아민(HMDA)을 첨가하였다. HMDA은 HA의 반복단위의 72 몰%로 첨가하였다. 카르복실기의 활성제인 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필) 카르보디이미드(EDC)와 1-히드록시벤조트리아졸(HOBt)을 HA 반복단위의 1.4배의 양으로 증류수에 녹인 후 상기 HA와 HMDA의 혼합액에 첨가하였다. HA-HMDA 가교물의 완전한 가교반응을 위해 상기 혼합용액을 37℃에서 1시간 동안 반응을 시켰다. 용액의 pH는 5.5-5.9이었다. 그 후, 제조된 HA-HMDA 하이드로겔을 미리 세척해둔 투석막(7 kDa의 분자량 컷-오프)으로 밀봉하여 0.01 M PBS(phosphate buffered saline, pH 7.4)에 24시간 동안 투석하여 잔류 EDC, HOBt 및 HMDA를 제거하였다. 제조된 HA-HMDA 하이드로겔의 가교도는 11-13%이었다.
제조예 3: 본 발명의 히알루론산-헥사메틸렌디아민 ( HA - HMDA ) 가교물 하이드로겔의 제조
분자량 1,000 kDa의 히알루론산(HA, 제조사: Lifecore Co.)을 3 (w/w)%의 농도로 물에 완전히 녹인 후 카르복실기와의 반응으로 가교를 이루기 위해 헥사메틸렌디아민(HMDA)을 첨가하였다. HMDA은 HA의 반복단위(repeating unit)의 20 몰%로 첨가하였다. 0.25 N NaOH 수용액을 첨가하여 pH를 6.0-6.5로 조정하였다. 카르복실기의 활성제인 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필) 카르보디이미드(EDC)와 1-히드록시벤조트리아졸(HOBt)을 HA 반복단위의 1.0배의 양으로 증류수에 넣고 20분 동안 교반한 후, 상기 HA와 HMDA 수용액의 혼합액에 첨가하였다. 45℃에서 30분 동안 교반하였다. 상기 혼합용액을 교반없이 45℃에서 10시간 동안 방치시켜 HA-HMDA 가교물이 완전히 가교될 수 있도록 하였다. 제조된 HA-HMDA 하이드로겔을 일차적으로 분쇄한 후, 200 ㎛ pore size 체를 통과시켜 균질한 하이드로겔을 얻었다. 80% 에탄올을 가하여 하이드로겔 분말을 침전으로 수득하고, 1.3% NaCl 용액을 100배 부피로 가하여 1 시간 동안 교반하였다. 다시 80% 에탄올을 가하여 침전을 얻고, 수득된 하이드로겔 침전을 100% 에탄올에 10분간 넣은 후, 40℃, 12시간 감압건조 하여 잔류된 EDC, HOBt 및 HMDA를 제거하였다. LC 분석결과, 검출한계인 2 ppm 이하로 컨트롤되고 있음을 확인하였다. 제조된 HA-HMDA 하이드로겔의 가교도는 10-14%이었다.
실시예 1 내지 4: 본 발명의 히알루론산-헥사메틸렌디아민(HA-HMDA) 가교물 하이드로겔 함유 조성물
제조예 3의 방법에 의하여 제조 및 건조된 히알루론산-알킬렌디아민 하이드로겔, 미변형 히알루론산 및 생리식염수를 하기 표 1의 비율로 혼합한 뒤, 121℃에서 15분간 멸균하여 관절내 투여용 주사액을 제조하였다.
Figure pat00001
제조비교예 1: 아디프산 디하이드라자이드(ADH)를 가교제로 사용한 히알루론산- 아디프산 디하이드라자이드 ( HA - ADH ) 가교물 하이드로겔의 제조
Hahn 등(Hahn SK et al., Int. J. Biol. Macromol., 2007; 40; pp. 374-380)의 방법에 따라 분자량 약 234 kD의 히알루론산(HA, 제조사: Lifecore Co.) 100 mg을 물 20 ml에 녹여 5 mg/ml의 HA 수용액을 제조했다. 상기 HA 수용액에 HA 대비 몰비로 40배 과량의 아디프산 디하이드라자이드(ADH) 분말(1.736 g)을 혼합하고 10분간 완전히 녹였다. 얻어진 HA/ADH 혼합 수용액의 pH를 1 N 염산 수용액을 이용하여 4.8로 맞춘 후, 30분간 완전히 교반시켰다. 여기에 HA의 카르복실기를 활성화시키기 위해 교반을 잘 해주면서 몰비로 4배 과량의 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필) 카르보디이미드(EDC, 0.191 g) 분말을 첨가하였다. 상기의 수용액에 1 N HCl 수용액을 첨가하여 pH를 4.8로 유지하면서 두 시간 동안 반응시켰다. 두 시간 후에, 1 N 수산화나트륨 수용액을 첨가하여 pH를 7.0으로 끌어올려 반응을 정지시켰다. 수득된 생성물의 점성과 불순물(결합되지 않은 ADH)을 줄이기 위해 미리 씻어놓은 투석튜브(7 kDa의 분자량 컷-오프)에 넣어 100 mM NaCl 수용액에 60시간 투석시켰다. 이 후 25% 에탄올과 증류수에 각각 투석을 반복하였다. 투석이 완료된 수용액을 3일 동안 동결건조하여 HA-ADH 유도체를 얻었다. 상기의 방법으로 얻은 HA-ADH를 0.01 M PBS(pH 7.4)에 2시간 동안 녹였다. 하이드라자이드에 특이적 가교제인 비스[설포숙신이미딜]수베레이트(BS3)를 역시 PBS에 녹인 후 HA-ADH 용액에 첨가하였다. 이때 BS3의 첨가량은 HA-ADH의 하이드라자이드의 20 몰%에 해당하는 양이었다. 상기의 수용액을 완전히 섞어준 후 가교반응을 완전히 하기 위해 37℃에서 1시간 동안 반응시켜 HA-ADH 가교물 하이드로겔을 제조하였다.
제조비교예 2: 디비닐설폰(DVS)을 가교제로 사용한 히알루론산-디비닐설폰( HA - DVS ) 가교물 하이드로겔의 제조
Oh 등(Oh EJ et al., J. Biomed. Mater. Res A., 2008; 86; pp. 685-693)의 방법에 따라 분자량 약 230 kDa의 히알루론산(HA, 제조사: Lifecore Co.) 68 mg을 0.2 N의 수산화나트륨 (NaOH) 수용액 (=pH 13) 1.68 ml에 녹였다. 완전히 녹인 후, HA의 하이드록실기와의 반응으로 가교를 이루기 위해 디비닐설폰(DVS)을 첨가하였다. 이때, 히알루론산의 하이드록실기와 첨가된 DVS의 몰비율은 1:1로 하였다. 상기 용액을 37℃에서 한 시간 동안 반응시켜 HA-DVS 하이드로겔을 제조하였다. 이후 제조된 하이드로겔을 미리 세척해둔 투석막(7 kDa의 분자량 컷-오프)으로 밀봉하고 PBS에 24시간 동안 투석하여, 이온들(Na+과 OH-)을 투석막을 통해 확산 방출시키고 밀봉되어 있는 HA-DVS 가교물의 pH를 중성화시켰다.
비교예 :
본 발명의 주사용 조성물의 대조제제로서, 관절염 치료용 3회 주사요법제로 시판중인 "하이알-포르테 주"(신풍제약, 1% 히알루론산나트륨)을 사용하였다.
실험예 1: 히알루론산 가교물 하이드로겔의 생체외 분해 및 팽윤성 확인시험
본 발명에서 사용되는 히알루론산 가교물 하이드로겔의 생체내 지속성을 예측하기 위하여, 제조예 1과 제조비교예 1 및 2의 히알루론산 가교물 하이드로겔에 대해 히알루론산 분해효소에 의한 분해시험을 수행하였다.
제조예 1과 제조비교예 1 및 2의 히알루론산 가교물 하이드로겔들을 각 바이얼에 동일한 질량으로 담았다. 히알루론산 분해효소(hyaluronidase from Streptomyces hyalurolyticus, Sigma-Aldrich) 50 U을 포함한 0.2 M PBS(=pH 6.2)를 첨가하였다. 이 혼합물을 37℃에서 미리 정해 놓은 48시간 동안 반응시켰다. 그 후, 상등액을 완전히 제거하고 잔류하는 히알루론산 가교물들의 질량을 측정하였다. 가교물의 분해 정도는 잔류하는 가교물과 본래의 가교물의 질량비율 (%)로 산출하고, 시간 경과에 따른 분해율(degradation, %)을 하기 표에 나타내었다. 표 2에서 알 수 있는 바와 같이, 제조비교예 2의 HA-DVS 가교물은 약 25시간 내에 완전히 분해되는 반면, 본 발명에 따른 히알루론산-알킬렌디아민 가교물 하이드로겔은 40시간이 지나도 부분적인 분해만이 이루어졌다. 이로부터, 본 발명의 히알루론산-알킬렌디아민 가교물 하이드로겔은 시판 하이드로겔을 능가하는 우수한 생체 지속성을 가짐을 확인할 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 히알루론산-알킬렌디아민 가교물 하이드로겔은 비슷한 분해율을 나타내는 제조비교예 1의 HA-ADH 가교물에 비하여, 2배 이상의 높은 팽창율을 나타냄을 확인할 수 있다. 이로부터, 본 발명에 따른 히알루론산-알킬렌디아민 가교물 하이드로겔은 높은 생체 지속성 및 우수한 팽윤성 등의 물성을 나타냄을 확인할 수 있다.
Figure pat00002
실험예 2: 본 발명의 히알루론산 가교물 하이드로겔을 포함하는 조성물의 물성 확인
본 발명의 히알루론산 가교물 하이드로겔을 포함하는 조성물의 주사기 및 사용 주사바늘에 따른 돌출압력(injection force)을 예측하기 위하여, 본 실험을 수행하였다.
본 발명의 실시예 1-4의 조성물 및 비교예 1의 대조제제에 대해 Universal Tester(EZ-S-500N, SHIMADZU Corp, Japan)를 이용하여 돌출압력을 측정하였다. 시료를 3ml 용량의 유리주사기에 충진한 뒤 관절염 주사요법제 주사시 통상 사용되는 18, 20, 22 게이지 주사바늘을 장착하여 1 mm/min 속도로 돌출압력을 측정하였다. 그 결과를 하기 표 3 에 나타내었다.
Figure pat00003
상기의 결과에서 알 수 있듯이, 히알루론산-알킬디아민 가교물 하이드로겔 단일로 이루어진 주사용 조성물 실시예 1은 비교예 1에 비해 상당히 높은 돌출압력을 나타냄이 확인되었다. 이는 조성물내 사용된 하이드로겔의 점탄성이 높기 때문으로 사료된다. 한편, 미변형 히알루론산을 혼합한 실시예 2 내지 4는 실시예 1의 조성물에 비하여 돌출압력이 현저히 낮아졌으며, 특히 미변형 히알루론산의 비율이 높아질수록 돌출압력이 낮아졌으며, 이로써, 미변형 히알루론산의 혼합비율을 조절함으로써, 시술자의 시술편의성과 환자의 안전을 고려하여, 사용되는 주사기와 주사바늘에 적절한 돌출압력을 갖도록 조성물의 물성을 조정할 수 있음을 확인하였다.
실험예 3: 본 발명의 히알루론산 가교물 하이드로겔을 포함하는 조성물의 물성 확인
리올러지 특성(rheological property)은 가교된 하이드로겔의 물성을 나타내는 중요한 요소 중 하나이다. 실시예 1-4의 조성물의 탄성계수를 Ghosh et al (Biomacromolecules 2005;6: pp. 2857-2865)의 방법을 이용하여 AR 2000 controlled stress rheometer(T.A Instruments Ltd., USA) 장비와 4-cm, 2°-cone and plate 기하학을 이용하여 1% strain 및 oscillation mode로 0.1-20 Hz까지 측정했으며, 3 Hz에서 측정된 탄성계수(G')값을 하기 표 4에 나타내었다.
Figure pat00004
상기 결과로부터 알 수 있듯이, 미변형 히알루론산의 혼합비율이 높아질수록 탄성계수는 낮아지는 경향성을 보였다. 탄성계수가 낮아지면 관절 내 주입 시 돌출 저항이 낮아지고 윤활 효과가 증가되지만, 생체 내 지속성이 짧아지므로 복합적인 요소들을 고려하여 미변형 히알루론산의 혼합 비율이 결정되어야 함을 확인할 수 있다.
실험예 2 및 3의 결과에 따르면, 실시예 1의 경우 생체내 지속성과 관련된 탄성계수는 제일 높으나 미변형 히알루론산이 첨가되지 않아 실제 돌출압력이 상당히 높게 나타났고, 실시예 3 및 4의 경우 돌출압력은 낮지만 탄성계수가 낮아 생체 내 지속성이 낮아질 수 있으며, 실시예 2의 경우 적절한 탄성계수와 적절한 돌출압력을 나타내었다.
실험예 4: 본 발명의 조성물의 관절 통증 경감효과의 확인
관절염 모델로서 통상 사용되는 랫드(rat) MIA 관절염 유발 모델을 이용하여 실시예 1 내지 4 조성물의 관절염 통증 경감 효능을 확인하였다. 랫드의 오른발 무릎 주변을 깨끗이 제모한 후 골관절염 유발물질인 MIA(monosodium iodoacetate)를 헤밀턴 주사기를 사용하여 오른발 무릎 관절강 내에 25 ㎕씩 투여하여 골관절염을 유발하였다(Bove S.E et al., Osteoarthritis and cartilage. 11: 821-830; Combe R et al., Neurosci. Lett. 370 (2-3): 236-240). MIA 주입 7일 후, 실시예 1 내지 4의 조성물을 무릎 관절강 내에 35 ㎕를 주입하였다.
관절 통증 감소 효과는 골관절염 유발 후 1, 7, 14, 21째 되는 날에 인커패시턴스 테스터(Incapacitance tester, Linton instrument Co., UK, Model No. 600R)를 이용하여 왼쪽과 오른쪽 각각의 발 무게(g)를 측정하여, 왼발에 실리는 무게 변화율(Change in Hind Paw Weight Distribution; HPWD, %)을 산출하여 평가한다.
왼발에 실리는 무게 변화율(%)=[왼발에 실리는 무게/(왼발에 실리는 무게 + 오른발에 실리는 무게)] x 100
측정치는 양쪽 발의 무게에 대한 왼발의 무게 비율을 계산하여 평균(%) ± 표준오차로 표시한다.
왼발에 실리는 무게 변화율은 오른쪽 다리에 관절염이 유발됨으로써 오른쪽 무릎의 통증으로 인해 왼쪽 뒷발에 하중이 더 실리는 수치를 백분율로 계산하여 나타낸 값으로 50% 측정치가 관절염이 없는 정상상태라 할 수 있다.
실험 결과 왼쪽 발에 실리는 무게 변화율은 대조군의 경우 14일부터 21일까지 75% 이상으로 유지되는 반면, 본 발명의 실시예 1, 2, 3 및 4 조성물 투여군은 14일째에서 왼쪽 발에 실리는 무게 변화율이 음성 대조군에 비해 각각 14.0%, 13.8%, 10.8%, 10.8% 감소하여 모든 시험군에서 유의성 있는 약물 효과가 관찰되었다. 또한, 투여 21일째에서는 실시예 1, 2 및 4 조성물 투여군의 왼쪽 발에 실리는 무게 비율이 대조군에 비해 각각 17.0%, 15.7%, 11.5%로 감소하여, 유의적인 약물 효과가 확인되었다 (표 5 및 도 2 참조).
Figure pat00005
(각 값은 평균± S.D로 표시되었다 (N=5). *P<0.05 : 음성 대조군에 대하여, **P<0.01 : 음성 대조군에 대하여)
실험예 5: 본 발명의 조성물의 관절 통증 경감효과의 확인
본 발명의 실시예 1 조성물과, 비교예의 대조제제의 골관절염 통증 경감 효능을 랫드 MIA 관절염 유발 모델을 이용하여 비교하였다. 모든 시험방법은 상기 실험예 4과 동일하게 진행하되, 본 발명의 실시예 1 조성물은 관절염 유발 7일 후 1회만 투여하고, 비교예 제제는 관절염 유발 후 7일, 17일 및 27일에 걸쳐 3차례 투여한 후, 투여후, 1주 내지 7주에 걸쳐, 왼쪽 발에 실리는 무게 변화율을 산출하여 하기 표 6 에 나타내었다.
Figure pat00006
골관절염 유발 전 왼발에 실리는 무게 변화율은 모든 그룹에서 49~50%로서, 양쪽 발에 수평을 이루었으나, MIA에 의한 골관절염 유발 7일 뒤 모든 그룹에서 왼발에 실리는 무게 변화율이 증가하였다. 본 발명의 실시예 1 조성물은 투여 후 7일 후부터 21일까지 지속적으로 음성대조군에 비해 낮은 왼발에 실리는 무게 변화율을 나타내어, 유의성 있는 약물효과를 나타냄이 확인되었다. 투여 후 35일 뒤에는 실시예 2과 비교예 1 투여군 모두에서 유의성(P<0.01)있게 약물 효과가 나타났다. 투여 후 49일 뒤에도 실시예 1 조성물 및 비교예 투여군 모두에서 유의성(P<0.05)있는 약물 효과가 확인되었다 (표 6, 도 3). 상기 결과로부터 확인되는 바와 같이, 본 발명의 조성물은 단지 1회의 투여만으로도 7주의 장기간 동안 통증을 경감시키는 효과를 나타내었으며, 동일 기간 내 3회 투여된 비교 제제보다 훨씬 양호한 통증 경감효과를 나타내었다.
실험예 6: 본 발명의 조성물의 관절 내 연골 보호 효과 확인
관절염 모델로서 통상 사용되는 랫드 MIA 관절염 유발 모델을 이용하여 실시예 1, 3 및 4 조성물의 관절염 통증 경감 효능을 확인하였다. 상기 실험예 3에 개시한 방법으로, 랫드에서 관절염을 유발하였다. 관절염 유발 후 21일째 복대동맥을 통해 전혈을 회수한 다음, 오른쪽 무릎을 절개하여 대퇴골과 경골을 분리해 내고, 분리된 경골의 연골 손상 면적을 현미경(VHX-600, 20배율)에서 사진 촬영하고, 이미지 분석기로 측정하였다. 전체 연골 면적(whole area, WA)은 경골에 연골이 분포한 무릎 관절 전체 면적이고, 경증 연골 면적(white rough area, WRA)은 연골이 손상되어 윤기를 잃고 거칠어진 경증도 연골 손상 면적, 중증 연골 면적(hollow area, HA)는 연골이 손상되어 연골 기저부의 해면골이 드러나기 시작한 중증도 연골 손상 면적이다.
1) 연골 손상 면적 측정결과
본 발명의 실시예 1 조성물 투여군에서 경증 연골 손상 면적과 중증 연골 손상 면적이 대조군에 비해 각각 38.5%, 67.7%의 유의적인 감소(P<0.05)가 관찰되었다(표 7, 도 4). 한편, 실시예 3 및 4 조성물 투여군에서는 중증 연골 손상 면적의 감소가 관찰되었다.
2) 경증 연골 손상도
경증 연골 손상도는 전체 연골 면적(WA) 대비 경증 연골 면적(WRA) 비율을 나타낸다. 즉, 경증 연골 손상도(%) = WRA/WA × 100으로 나타내었다. 본 발명의 실시예 1, 3 및 4 투여군에서 경증 연골 손상도는 음성대조군보다 40.3%, 15.8%, 12.0%로 감소되었다(표 8, 도 4).
3) 중증 연골 손상도
중증 연골 손상도는 전체 연골 면적(Whole area, WA) 대비 중증 연골 면적(HA) 비율을 나타낸다. 즉, 중증 연골 손상도(%) = HA/WA × 100으로 나타내었다. 본 발명의 실시예 1, 3 및 4 투여군에서 중증 연골 손상도는 음성대조군보다 각각 39.1%, 26.5%, 35.2% 감소되었다(표 9, 도 5).
Figure pat00007
(각 값은 평균± S.D로 표시되었다 (N=5). *P<0.05 : 음성 대조군에 대하여)
Figure pat00008
Figure pat00009
실험예 7: 본 발명의 조성물의 랫드 관절 내 연골 보호 효과 확인
본 발명의 실시예 1 조성물과, 비교예의 대조제제의 연골 보호 효과를 랫드 MIA 관절염 유발 모델을 이용하여 비교하였다. 모든 시험방법은 상기 실험예 5와 동일하게 진행하되, 본 발명의 실시예 1 조성물은 관절염 유발 7일 후 1회만 투여하고, 비교예의 대조제제는 관절염 유발 후 7일, 17일 및 27일에 걸쳐 3차례 투여하고, 중증 연골 손상도를 산출하여 도 6에 나타내었다.
도 6에서 확인되는 바와 같이, 본 발명의 실시예 1 조성물 투여군 및 비교 제제 투여군 모두에서 중증 연골 손상 면적 감소 효과가 나타났다. 한편, 1회 요법제인 본 발명의 실시예 1 조성물 투여군은 3회 요법제인 비교 제제 투여군에 비해, 음성대조군 대비 각각 24%, 19%의 유의성 있는 중증 연골 손상 면적 감소 효과를 나타내었으며, 본 발명 실시예 1 조성물 투여군은 1회 주사로, 비교예 1 투여군에 비해 더욱 양호한 연골 보호효과를 나타내었다.
실험예 8: 본 발명 조성물의 토끼 관절 내 연골 보호 효과 확인
토끼 반월상 연골판 절제술을 통한 골관절염 유발 모델을 이용하여, 본 발명의 실시예 1 조성물과 비교예의 대조제제의 골관절염 연골보호효과를 비교하여 확인하였다.
토끼의 한쪽 다리를 무균 처리 후 절개한 뒤, 내측 연골판을 전방에서 중간부위까지 약 1/2가량을 절제한 후, 무통주사를 일정량 투여하고 트레드밀에서 자발적으로 운동시켜 관절염을 유발하였다. 수술 5주 후 본 발명의 실시예 1 조성물과 비교예 제제를 무릎 관절강 내에 0.3 ㎖씩 투여하고, 수술 7주 및 9주에 비교예 제제의 2차 및 3차 투여가 이루어졌다. 최종적으로 유발 7주차에 부검하여, 대퇴골, 경골에서의 연골 손상 면적을 측정하여 각각 하기 표 10과 도 7 및 표 11 및 도 8에 나타내었다.
Figure pat00010
Figure pat00011
(각 값은 평균±S.D로 표시되었다 (N=5). *P<0.05 : 음성 대조군에 대하여)
상기 표의 결과에서 알 수 있는 바와 같이, 본 발명의 실시예 1 조성물 투여군과 비교예 제제 투여군에서 무릎관절에서의 연골 손상 면적이 감소하는 효과가 나타났다. 즉, 1회 요법제인 본 발명의 실시예 1 조성물 및 3회 요법제인 비교예 제제 투여군 모두에서, 대퇴골부위의 연골 손상 면적이 음성 대조군에 비해 감소되었다. 경골부위에서도 본 발명의 실시예 1 투여군 및 비교예 투여군 모두 연골손상면적이 감소되었으며, 특히 본 발명의 실시예 1 투여군은 경골에서 비교예 1 투여군에 비해 현저히 우수한 연골보호 효과를 나타내었다.
실험예 9: 본 발명 조성물의 생체적합성 확인
본 발명에서 사용된 실시예 1의 히알루산 가교물 하이드로겔 조성물의 생체적합성을 평가하였다.
Fujimura 등(Fujimura T et al., J. Dermatol. Sci., 2000; 24; pp. 105-111)의 방법에 따라 6주령의 암컷 무모 마우스(hairless mouse type SKH; Jung-Ang Lab Animal Inc., Korea) 등에 사각형(1.5 × 1.5 cm2)의 문신을 하고, 본 발명의 실시예 1의 히알루론산 가교물 하이드로겔을 사각형 문신 내에 피하 투여하였다. 본 발명의 히알루론산 가교물 하이드로겔 0.4 ㎖를 각각 마우스의 등쪽 피하층의 문신된 사각형 안에 27 게이지 주사기 바늘을 통해 주입하였다. 히알루론산 가교물 하이드로겔 투여 12주 후에 헤마토자일린-이오신(H&E) 염색 사용하여 조직학적 검사를 시행하였다. 각 마우스로부터 피부 샘플을 취한 후 10 부피% 완충 포름알데히드에 고정시키고, 에탄올로 탈수한 후, 파라핀에 보관하여 표본을 만들고, 이들을 4 ㎛ 부분으로 얇게 자르고 H&E로 염색하였다. 염색된 시료를 광학현미경을 이용하여 촬영한 결과를 도 9에 나타내었다. 도 9에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 실시예 하이드로겔을 투여한 마우스는 대조군 마우스들과 동일하게 아무런 염증반응을 나타내지 않았다 (H&E의 경우, 헤마토자일린은 염증 반응시 파란색으로 염색이 되며, 이오신은 헤마토자일린과는 대조 염색으로서 붉게 염색이 된다). 즉, 본 발명의 HA-HMDA 가교물 하이드로겔(도 9B)을 처치한 경우, 표피는 정상군 마우스의 표피와 유사하게 변화되었고 진피 또한 정상군 마우스와 같이 어떠한 용혈이나 염증 반응이 관찰되지 않았다.
이상의 결과로부터 본 발명의 히알루론산-알킬렌 디아민 가교물 하이드로겔을 함유하는 조성물은 매우 뛰어난 생체적합성을 나타내며, 생체내에서 오래 지속되어, 관절내 1회 주사함으로써, 효과적으로 관절염으로 인한 통증을 2주 이상 장기간 경감시키고, 관절의 연골을 보호하므로, 효과적으로 관절염 질환을 치료하기 위한 관절내 투여용 주사액으로 사용될 수 있음을 알 수 있다.
실험예 10: 본 발명 조성물 내 히알루론산 가교물 하이드로겔의 생체외 분해 정도와 물성( G' )에 따른 지속 효과 확인
본 발명의 히알루산 가교물 하이드로겔 함유 멸균 조성물의 히알루론산 분해효소에 대한 민감성의 측정은 공지의 방법(W.E.Hennink, Rheological monitoring of long-term degrading polymer hydrogels. J. Rheol., 1999. 43(4): pp. 933-950)을 변형하여 시행하였다. 분해효소에 대한 민감성의 측정은 G'값과 연관지어, Q-Med AB사에서 시판중인 BDDE(1,4-butanediol diglycidyl ether)를 사용하여 히알루론산의 하이드록시기를 가교한 제품(20 ㎎/㎖)을 대조품으로 하여 비교 평가하였다. 본 발명 실시예 2의 멸균 조성물 및 대조품을 각각 1.5 ㎖ 시험관에 800 ㎕씩 분주하였다. 히알루론산 분해효소(Hase, Bovine Testes, Sigma-Aldrich)를 2 ㎎/㎖로 PBS(pH 7.4)에 용해한 후(2,000 U), 15 ㎕씩을 각 시험관에 분주하여 37℃에서 시간대 별로 반응시킨 다음, 3 Hz에서 탄성계수(G')를 측정하여 그 변화를 도 10에 나타내었다. 대조품은 3 Hz에서 620 Pa의 초기 탄성계수를 나타내었으며, 실시예 2의 멸균 조성물은 3 Hz에서 330 Pa의 초기 탄성계수를 나타내었다. 25 시간에 걸쳐 탄성계수의 변화를 확인하였다. 도 10에 보이는 바와 같이 대조품의 경우는 초기 탄성계수(G')는 높지만 3시간 까지 매우 급격하게 히알루론산 분해효소에 의해 분해되어 매우 낮은 탄성계수을 나타내었던 반면, 본 발명 실시예 2의 멸균 조성물은 25 시간 까지도 분해에 대한 안정성을 보였다. 또한, 가교된 히알루론산(HA)의 분해는 초기 탄성계수 G'와 무관함이 확인되었다.
실험예 11: 본 발명 조성물의 대퇴골 연골 보호 효과 및 조직학적 변화 관찰
골관절염 유발 토끼 모델을 이용하여, 본 발명의 실시예 2 조성물과 비교예의 대조제제의 골관절염 연골보호 효과를 확인하였으며, 연골의 두께 및 연골 세포 감소 정도를 확인한 조직 병리학적 검사로 구체적인 손상 정도를 확인하였다.
실험동물을 25 mg/kg의 Zoletile mixture(Zoletile 50; Vibac Lab., France) 복강 주사로 마취를 유도한 다음, 70% N2O와 28.5% O2 가스에 1.5% isoflurane(Hana Pharm.Co., Hwasung, Korea)을 혼합한 마취가스로 전신마취를 유지하면서, 이전의 방법들(Hanashi et al., 2002; Jiang et al., 2010)에 준하여, 왼쪽 슬관절낭을 노출하고 전방 십자인대(anterior cruciate ligament) 절제 및 내측반월판 부분 절제술(partial medial menisectomy)을 실시하여 골관절염을 유발하였다. 정상 대조군에서는 관절낭을 절제하여 전방 십자인대 및 내측반월판 연골(medial meniscus)을 확인한 다음 절제하지 않고 관절낭을 폐쇄하였다. 관절염 유발 5주 후 본 발명의 실시예 2 조성물과 비교예의 대조제제를 무릎관절강 내에 0.3 ㎖씩 투여하고, 수술 7주 및 9주에 비교예의 대조제제의 2차 및 3차 투여가 이루어졌다. 정상 대조군에서는 0.3 ㎖ 용량의 멸균 생리식염수만 관절염 유발 5 주후 단회 관절낭내 투여하였다.
조직병리학적 관찰을 위해, 무릎 관절을 취하여 10% 중성 포르말린 버퍼 상에 고정시켰다. 24시간 고정 후, 석회질 제거 용액 [24.4% formic acid, and 0.5N sodium hydroxide] 으로 5일간 석회질 제거과정을 진행하였다. 그 뒤, 표면 연골을 분리하여 세로로 잘라내어 파라핀 고정시킨 후 3~4 ㎛ 두께의 절편으로 썰어내고, 이 시료를 Safranin O로 염색 후 관찰하였다. 조직형태계측법은 앞서 염색시킨 시료 절편을 컴퓨터 이미지 분석 프로그램인 iSolution FL ver 9.1 (IMT i-solution Inc., Vancouver, Canada)을 이용하여 분석하였다. 연골세포의 수는 관절의 동일 면적 내에서 이미지 분석프로그램을 이용하여 측정하였다. 결과를 도 11에 나타내었다. 도 11에 나타낸 바와 같이, 골관절염 컨트롤에서 대퇴골 전체의 손상(흑색으로 염색된 표면)과, 연골 두께와 연골 세포의 감소가 관찰되었다. 그렇지만, 비교예의 대조제제와 본 발명의 실시예 2 조성물 처리군에서는 확연한 개선 효과를 나타내었다.
실험예 12: 본 발명 조성물의 Mankin score 및 조직형태계측을 이용한 평가
본 발명의 실시예 2 조성물과, 비교예의 대조제제의 토끼관절 손상 정도를 Mankin score를 이용하여 평가하였다 Mankin score는 골관절염을 평가하는 가장 기본적인 조직병리학적 관찰로, 골관절염시 유발되는 관절연골의 표면 손상, 염색성, 연골세포의 수적 변화 및 클론(clone)의 형성 유무를 기준으로 판단하며, score가 높을수록 골관절염의 유발 정도가 높은 것으로 알려져 있다(Armstrong et al. [1994] and Lovasz et al [2001] using Safranin O stain). 또한 대퇴부 및 경골 관절 표면 연골의 조직형태계측을 관찰하였다. 대퇴골 및 경골 관절 표면 연골의 조직형태계측 결과와 Mankin score 결과를 각각 하기 표 12와 표 13에 나타내었다.
Figure pat00012
(각 값은 평균±S.D로 표시된다. a d P<0.01 b e P<0.05 : 정상 대조군에 대하여, c f P<0.01 g P<0.05: 골관절염 대조군에 대하여)
Figure pat00013
(각 값은 평균±S.D로 표시된다. a d P<0.01 b e P<0.05 : 정상 대조군에 대하여, c f P<0.01 g P<0.05: 골관절염 대조군에 대하여)
상기 표의 결과에서 알 수 있는 바와 같이, 본 발명의 실시예 2 조성물 투여군과 비교예 대조제제 투여군에서 연골 두께 및 연골세포가 증가하는 효과가 나타났다. 골관절염 대조군의 경우, 대퇴골 및 경골의 관절연골에서 표면 손상, 연골세포의 수적 감소, 클론(clone) 형성 및 염색성의 감소가 인정되어, 정상 대조군에 비해 유의성 있는 (p<0.01) Mankin score의 증가가 대퇴골 및 경골 관절연골에서 각각 인정되었으나, 비교예의 대조제제 및 실시예 2 조성물 투여군에서는 골관절염 대조군에 비해 유의성 있는 (p<0.01) 대퇴골 및 경골 관절연골의 Mankin score 감소가 각각 인정되었다. 즉, 본 발명의 실시예 2 조성물 및 3회 요법제인 비교예 제제 투여군 모두에서, 대퇴골 및 경골 부위에서의 연골 보호 효과가 있었다. 또한 Mankin score의 전체적인 감소가 관찰되었다. 골관절염 대조군의 경우, 정상 대조군에 비해 유의성 있는(p<0.01) 대퇴골 및 경골 관절 연골의 두께 및 단위 면적당 연골세포 수의 감소가 각각 인정되었으나, 비교예의 대조제제 및 본 발명의 실시예 2 조성물 투여군에서는 골관절염 대조군에 비해 유의성 있는(p<0.01) 대퇴골 및 경골 관절 연골 두께 및 단위 면적당 연골세포 수의 증가가 각각 인정되었다. 대퇴골 관절연골의 Mankin score는 골관절염 대조군에서 정상 대조군에 비해 550.00%의 변화를 나타내었으며, 비교예의 대조제제 및 본 발명의 실시예 2 조성물 투여군에서는 각각 골관절염 대조군에 비해 -42.31 및 -57.69%의 변화를 나타내었다. 경골 Mankin score는 골관절염 대조군에서 정상 대조군에 비해 507.69%의 변화를 나타내었으며, 비교예의 대조제제 및 실시예 2 투여군에서는 각각 골관절염 대조군에 비해 -50.63% 및 -65.82%의 변화를 나타내었다. 대퇴골 관절 연골의 두께는 골관절염 대조군에서 정상 대조군에 비해 63.19 및 111.34%의 변화를 나타내었다. 경골 관절 연골의 두께는 골관절염 대조군에서 정상 대조군에 비해 -63.06%의 변화를 나타내었으며, 비교예 대조제제 및 본 발명의 실시예 2 투여군에서는 각각 골관절염 대조군에 비해 80.82 및 135.40%의 변화를 나타내었다. 대퇴골 관절 연골에서 단위면적당 연골세포의 수는 골관절염 대조군에서 정상 대조군에 비해 -73.61%의 변화를 나타내었으며, 비교예의 대조제제 및 실시예 2의 조성물 투여군에서는 각각 골관절염 대조군에 비해 166.67 및 209.06%의 변화를 나타내었다. 경골 관절 연골에서 단위면적당 연골세포의 수는 골관절염 대조군에서 정상 대조군에 비해 -70.97%의 변화를 나타내었으며, 비교예의 대조제제 및 실시예 2의 조성물 투여군에서는 각각 골관절염 대조군에 비해 84.40% 및 127.27%의 변화를 나타내었다.
또한 Mankin score의 합계(Totals)를 도 12에 나타내었다. 대퇴골과 경골에서의 유의성은 정상 대조군에 대하여 a p<0.01 및 b p<0.05, 골관절염 대조군에 대하여 c p<0.01을 나타낸다.

Claims (15)

  1. 활성성분으로서 하기 식 1의 히알루론산의 알킬렌디아민 가교물 하이드로겔을 포함하는, 관절염 질환의 치료 또는 증상 개선을 위한 관절내 투여용 주사액 조성물:
    [식 1]
    [HA]m-C(O)-NH-R1-NH-C(O)-[HA]n
    (상기 식에서, HA는 카르복실기 하나를 제외한 히알루론산 또는 그의 염을 나타내고, R1은 히드록시, C1-C6 알킬, 또는 C1-C6 알콕시로 치환되거나 비치환된 C3-C10 알킬렌기이며, m 및 n은 독립적으로 10,000 ~ 4,000,000의 정수이다).
  2. 제1항에 있어서, 상기 히알루론산의 분자량이 20,000 달톤 내지 4,000,000 달톤인 조성물.
  3. 제1항에 있어서, 상기 알킬렌디아민이 헥사메틸렌디아민인 조성물.
  4. 제1항에 있어서, 상기 가교물 하이드로겔의 가교율이 5 ~ 35%인 조성물.
  5. 제1항에 있어서, 상기 가교물 하이드로겔이 주사액 총 중량에 대하여 0.4 ~ 3.0 (w/w)%로 포함되는 조성물.
  6. 제1항에 있어서, 진통효과가 주사액 투여후 2주 이상 지속되는 조성물.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 미변형 히알루론산을 더 포함하는 조성물.
  8. 제7항에 있어서, 상기 히알루론산의 알킬렌디아민 가교물 하이드로겔 : 미변형 히알루론산 중량비가 5 : 5 내지 9.5 : 0.5인 조성물.
  9. 제8항에 있어서, 상기 히알루론산의 알킬렌디아민 가교물 하이드로겔 : 미변형 히알루론산 중량비가 7 : 3 내지 9.5 : 0.5인 조성물.
  10. 활성성분으로서 제1항의 히알루론산의 알킬렌디아민 가교물 하이드로겔을 포함하는, 관절염 질환에 의해 유발되는 관절 동통 경감용 진통 조성물.
  11. 활성성분으로서 제1항의 히알루론산의 알킬렌디아민 가교물 하이드로겔을 포함하는, 관절염 질환에 의해 유발되는 연골 퇴행 억제용 조성물.
  12. 활성성분으로서 제1항의 히알루론산의 알킬렌디아민 가교물 하이드로겔을 포함하는, 관절염 질환에 의해 유발되는 활막 염증 억제용 조성물.
  13. 제1항 및 제10항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 관절염 질환이 골관절염인 조성물.
  14. 제1항에 따른 조성물로 충전된 주사기를 포함하는 키트.
  15. 제7항에 따른 조성물로 충전된 주사기를 포함하는 키트.
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