JP2008531148A - 骨関節症におけるヒアルロン酸のアミド誘導体 - Google Patents

Abstract

本発明は、ヒアルロン酸(HA)のアミド誘導体、並びに骨関節症(OA)に冒された関節に加え、軟骨及び/又は滑膜に損傷を引き起こす(疼痛を伴う)関節の炎症及び/又は外傷の症例を治療するために、滑液の部分的/全体的代用品として、関節内経路により投与される、ヒアルロン酸(HA)のアミド誘導体、特にHAのヘキサデシルアミドから製造された医用材料に関する。最後に本発明者らは、全体の構造が、生理的加齢に起因した摩耗の徴候を示している関節の治療におけるそれらの使用を説明しかつ請求する。
【図面】図１

Description

本発明は、骨関節症(OA)に加え、軟骨及び/又は滑膜(synovia)へ損傷を引き起こす関節の炎症及び/又は外傷の症例(疼痛を伴う)により影響を受けた関節を治療するために、滑液(synovial liquid)の部分的/全体的代用品として関節内経路により投与される、ヒアルロン酸(HA)のアミド誘導体、特にHAのヘキサデシルアミドで製造された医用材料に関する。最後に、本発明者らは、全体の構造が生理的加齢に起因した摩耗の徴候を示す関節の治療におけるそれらの使用を説明しかつ特許請求している。

骨関節症(osteoarthosis)/変形性関節症(osteoarthritis)(OA)は、関節マトリックスの分解及び主要細胞成分である軟骨細胞の喪失に起因した関節軟骨の進行性侵食により特徴付けられる、重篤な能力欠損の状態である。
この状態の正確な病因は、依然不明である。しかし、最近の研究は、関節全体に影響を及ぼす力学的不均衡により引き起こされることを示している。力学的関節の不安定性は、様々な要因(例えば、関節包全体(in toto)に関連する外傷及び/又は力学的ストレス、関節システムの炎症)により引き起こされ、並びに主に軟骨細胞及び滑膜細胞により合成される細胞外マトリックスの合成及び分解の間の微妙な均衡を狂わせることがある。

この完全であるが脆弱であるホメオスタシスが狂った場合、このマトリックスの分解は、軟骨細胞が喪失されたために、その合成により補償されず、次第に悪化する。
実際、関節の過剰及び/又は不適切な負荷は、軟骨の分解に寄与する正にその(the very)酵素であるメタロプロテアーゼ(MMP)と称されるプロテアーゼ酵素の合成としてそれ自身現れる軟骨細胞反応を引き起こし得る。これらは特に炎症病変の発生時に、関節腔内で生成及び放出される、IL-1及びTNF-αなどの炎症性サイトカインにより刺激された場合に、軟骨細胞により合成される。IL-1は、高レベルの一酸化窒素(アポトーシスによる軟骨細胞死に寄与する)の合成を刺激することに加え、軟骨細胞それら自身によるプロテオグリカン(マトリックス成分)合成も阻害する(Dozin B.ら, Matrix Biology, 2002, 21:449-459)。

細胞外マトリックスは、生存のために、軟骨細胞に一体化されなければならないことはわかっている。科学文献のデータは、このマトリックスからの分子の分解は、同様に軟骨細胞アポトーシスの誘導が可能である他の分子(これは同様にマトリックスの分解に由来する)の放出につながり得ることを明らかにしている(Cao L.ら, Exp Cell Res, 1999, 246:527-537)。
これが理由で、骨関節症患者の軟骨は、細胞充実性の低下、及び対応する関節マトリックス内の空の「小腔」の形成の増加を示す。
高レベルのIL-1は、関節リウマチ(RA)及び乾癬性関節炎に罹患した患者の滑液中に認められる(Arend W.P.ら, Arthritis Rheum,1995, 38:151-160)。
関節表面の生理的加齢過程も、OAに特有の酵素機構に関連しているように見える。その結果、この病理を治療するために通常使用される療法は、同じく「通常の」関節加齢により部分的又は全体的に損傷された軟骨を伴う関節に適用される。

軟骨マトリックスは、コラーゲン分子及び凝集したプロテオグリカン複合体により形成された三次元構造により構成される。これらは次に、ヒアルロン酸(HA)に会合されたポリペプチド配列へ非共有的に結合され、グリコサミノグリカン分子(GAG)と相互作用するヒアルロン酸をベースにした支持構造により構成され、従って力学的特性及び粘弾性特性の両方を軟骨にもたらす。
実際、HAは、特別な粘弾性特性を伴う分子であり、主に滑膜細胞により関節腔内においても合成及び分泌され(Asari A.ら, Arch Histol Cytol, 1995, 58(1):65-76)、従ってこれは、滑液の主要成分のひとつである。関節がゆっくり動く時、HAは、粘性の潤滑油として作用する一方で、関節が活発に動く時は、HAの弾性特性は、その関節が曝され得るあらゆる外傷又は微小損傷に対抗する衝撃吸収材として、HAが作用することを可能にする。

滑液の機能的特徴は、HAの濃度及び重合度の両方に左右されること、並びにこれらの何らかの変化は、関節へのOA-型組織学的損傷につながることがあることはわかっている。
健常な滑液中のHAの(及び一般にグリコサミノグリカンの)代謝回転は、通常迅速(ヒツジにおいて1日)であるが、OAの過程では、その濃度(GAGの減少に関連した)及びその平均分子量(MW)の低下に加え、更にはその代謝回転の顕著な減少が認められる(Balazs EA.ら, J Rheumatol Suppl, 1993, 12:75-82；Belcher C.ら, Annals of the Rheumathic Disease, 1997, 56:299-307)。

プロテオグリカン合成の割合として測定されるHAは、単に生体力学的粘度補充(biomechanical viscosupplementation)特性を有するのみではなく、軟骨細胞をIL-1の作用から保護する能力も有するという、更なる知見が示されている(Brun P.ら, OsteoArthritis and Cartilage, 2003, 11:208-216)、(Stove J.ら, Journal of Orthopaedic Research, 2002, 20:551-555)。
これらの知見を基に、最初にBalazsが、骨関節症の進行は、外来性HAの投与、特に高-分子量HAの関節腔への直接的投与により変更されることを示唆した。
現在OAにおけるHAの関節内投与のために、様々な薬物が市販されており、例えば以下が挙げられる：Hyalgan(登録商標)、オンドリの鶏冠から精製された、MWが5〜7.5x10⁵DaであるHA (欧州特許第0138572 B1号)；Synvisc(登録商標)(Hylan G-F 20)、ホルムアルデヒド及びジビニルスルホンと架橋された、MWが6〜7x10⁶DaであるHA(米国特許第4,713,448号)、Artz(登録商標)、MWが6.2〜12x10⁵DaであるHA。

更に欧州特許第1144459 B1号は、OA関節病変の治療のための、新規HA誘導体を開示及び請求している。これは、HAのカルボキシ基とアミド結合を形成するためにポリアミンと架橋された、ヒアルロン酸誘導体である。これは一般に、最終架橋度50％を伴う、水に不溶性のヒドロゲルの形で調製され、及び引き続き試験された(Barbucci R.ら, Biomaterials, 2002, 23:4503-4513)。

HAの関節内注射は、粘度補充を提供し、かつOA病理に冒された四肢の機能を改善し、結果として関節痛を低下することはわかっている。しかし、HAの関節包内の滞留時間は、Hyalgan(登録商標)の塗布後約40時間に限定される(Fraser JR.ら, Seminars in Arthritis and Rheumatism, 1993, 22:9-17)が、Synvisc(登録商標)の場合、これは数日間持続することができる(Fiorentini R., Proceedings of the US FDA Advisory Panel on Orthopaedic and Rehabilitation Devices, 11/21/96 Fairfax (VA): CASET Associates, 1996；Berkowitz D., Proceedings of the US FDA Advisory Panel on Orthopaedic and Rehabilitation Devices, 11/20/96 Fairfax (VA):CASET Associates, 1996)。
この制限は、週1回の投与サイクルで、合計少なくとも5回の関節内注射が通常求められることを意味する。

更に、Synvisc(登録商標)のような化学的に修飾されたHAを基にしたこれらの薬物の一部は、時には重篤な有害事象の報告に関連しており(Hammesfahr JF.ら, The American Journal of Orthopaedics, 2003, 32:277-283)、これには恐らく特に好酸球動員に連関された炎症過程の発生が続くであろう(Schiavinato A.ら, Clinical and Experimental Rheumatology, 2002, 20:445-454)。
前述のことを考慮し、関節腔内の滞留時間並びにHAの化学修飾において使用される溶媒及び/又は特定の化学物質に起因した毒性のリスクに連関された問題点を克服することが可能であると同時に、未修飾の多糖の特徴及び固有の特性の全てが維持されているHAの新規化学誘導体が研究されている。

本出願人は驚くべきことに、HAのカルボキシ基によりアミンへ化学的に結合されたHYADD(登録商標)と称されるHA(欧州特許第1095064 B1号)は、先に説明されたHAの固有の特性を全て有することを発見し、更にはこれはOAヒト軟骨細胞へ驚くべき増殖刺激を提供し、OA滑膜に対する保護作用を誘起し、その分解過程を遅延し、OA軟骨表面の形態学的変化及び骨棘形成(骨関節症に典型的な骨性形成物)を低下し、従ってOAの新規治癒的療法を表していること、最後に、これは損傷を受けた又は外科的に治療された関節における滑液の部分的及び/又は完全な一体化/代用を可能にする粘弾性特性を有し、膝の適切な無痛の負荷を可能にすることを明らかにした。
欧州特許第1095064 B1号は、HAのカルボキシ基と、脂肪族、芳香族、アリール脂肪族、脂環式、ヘテロ脂肪族シリーズに属するアミンのアミン基の間のアミド結合の形成を起源とする、HAのアミド誘導体を開示かつ請求している。それらから誘導される化合物(HYADD(商標)と称される)は、0.1〜5％の範囲の異なるアミド化度を示すことができ(実施例1)、その結果最終製品は、水、リン酸緩衝液又は生理食塩水に可溶性である。

前記誘導体は、多種多様な方法で製剤された医薬組成物の調製に関し、手術用製品の調製のために異なる形に製造された医用材料の調製において、並びに最後に、カテーテル及びステントのような生物医学的製品のコーティングに適した形で説明されている。
更にそれらの使用は、整形外科を含む、臨床診療の広範な範囲において請求されている。しかしそれらの使用は、軟骨及び/又は滑膜の損傷を引き起こす炎症及び/又は関節外傷の全ての症例(疼痛を伴う)における、OAの、又はRA及び乾癬性関節炎の、治癒的療法として、並びに最後に関節の加齢に関連した病理の療法として、特に関節内レベルで使用される医用材料として、説明も、特許請求も、仮定さえもされていない。

特に、骨関節症/変形性関節症の治療のための医薬品の調製に関するヒアルロン酸のアミド誘導体の使用は、本発明の主題である。
骨関節症、外傷、炎症及び/又は関節構造の加齢に起因した摩耗により影響を受けた関節の治療における、滑液の部分的及び/又は全体的代用品としてのヒアルロン酸のアミド誘導体も、本発明の主題である。
ヒアルロン酸のアミド誘導体により構成された医用材料も、本発明の主題である。

以下に説明される実験により、本出願人は、以下の点を明らかにしている。
・HYADD(商標)誘導体は、HA固有の特性を有し、関節内での滞留時間は、天然のHAの滞留時間よりも、断然長い、
・これらは、OA軟骨細胞に対する強力な増殖刺激を発揮し、その結果損傷を受けた軟骨の治癒のための有効な新規療法として有望である、
・これらは、OA滑膜及び軟骨に対する予想外の保護的作用を発揮し、分解過程を遅延する、
・これらは、損傷を受け/炎症を起こし/加齢した関節又は手術を受けた関節中の滑液の部分的及び/又は完全な一体化/代用を可能にする粘弾性特性を有する、
・これらは、in vitro及びin vivoにおいて処置される軟骨細胞又は滑膜細胞に対し毒性作用を有さない、
・最後に、先の理由の全てに関して、HYADD(商標)誘導体は、OA-関連した疼痛の軽減において活性があり、その結果関節の適切な負荷が可能であることが証明されている。

前述のことを基に、本出願人は、HYADD(商標)誘導体を、関節、特にOAにより影響を受けた関節、更には外傷及び/もしくは炎症の影響を受けた関節、又は生理的加齢過程により損傷を受けたもしくは手術により処置された関節の治療における滑液を部分的/全体的に代用するために使用される医用材料として請求する。

本発明において説明されるHYADD(商標)として公知のHA誘導体は、欧州特許第1095064 B1号に従い合成され、これは、例えば、オンドリの鶏冠からの抽出によるか(欧州特許第0138572 B1号)、又は、発酵によるか、又は技術的手段により得られるいずれかの給源からのHA誘導体で出発し、並びに、400〜3x10⁶Da、特に1x10⁵Da〜1x10⁶Da、更には特に500,000〜750,000Daの範囲である分子量を有する。

In vitro及びin vivoの両方で実行される全ての実験で使用されるHYADD(商標)は、平均アミド化度が2〜3％であり、好ましい活性化物質としてのカルボニルジイミダゾールと共にヘキサデシルアミンを用いて合成された(実施例2)。
得られた生成物は、水溶性であり、及び当業者に公知の方法により滅菌することができる。しかしオートクレーブによる滅菌が好ましい。

特に本発明のヒアルロン酸のアミド誘導体において、アミドは、ヒアルロン酸のカルボキシ基と、脂肪族、芳香族、アリール脂肪族、脂環式又はヘテロ脂肪族シリーズに属するアミンのアミン基の間のアミド結合により形成される。このアミンは、好ましくはヘキサデシルアミンである。アミド化度は、0.1〜5％である。より好ましくは、平均アミド化度は、2％又は5％である。
本発明のヒアルロン酸のアミド誘導体は、ゲル、ヒドロゲル、粉末、ミクロスフェア、ナノスフェアの形で製造される。

以下に説明される実験の目的は、HYADD(商標)誘導体の粘度特性及び化学/生物学特性の両方を分析することであった。
・関節内治療後のOAヒツジにおける滑膜(滑膜層(synovial membrane))の組織学的分析のためのin vivo実験(以下詳述)、
・関節内治療後のOA軟骨表面の形態の分析及び骨棘の存在の評価のためのin vivo実験(以下詳述)、
・関節内治療前後のOAヒツジの滑液中に存在するグリコサミノグリカン濃度を測定するためのin vivo実験(以下詳述)、
・関節内治療前後のOAヒツジ関節の滑液の固有の粘度を決定するためのin vivo実験(以下詳述)、
・関節腔中の滞留時間及び関節軟骨中の位置を評価するためのin vivo実験、
・合成に関するHAの能力を評価するための、関節内治療を受けたヒツジのOA関節から採取した滑膜細胞の培養物を使用するin vitro実験(以下詳述)、
・それらの増殖作用及び毒性を証明するための、ヒトOA軟骨細胞の培養物を使用するin vitro実験。

材料、方法、及びIn vivo実験から得られた結果：ヒツジ関節のOAモデル
Ghosh P.らの論文(Proceeding Hyaluronan 2003 Congress, Ed. Matrix Biology Institute 2004 e、Little C.ら, J Rheumatol, 1997, 24:2199-2209)に説明されたように、18頭のメリノ種ヒツジで、年齢7〜8歳のものに、最初に、両方の前肢の半月板の外側部分を除去するため、膝関節半月板切除術を行い；手術の16週後、OAが明らかになった。

処置
その後18頭の動物を、3群に分け、各々、術後16週目に開始し、及び20週目に終了する、異なる処置を与えた。
・OA＋プラセボ：動物は、滅菌生理食塩水2mlの毎週1回の関節内注射により、合計5回注射を処置した。
・OA＋HA：動物は、HA(MW 500,000〜730,000 D)2mlの毎週1回の関節内注射により、合計5回注射を処置した。
・OA＋HYADD(商標)：これらの動物は、リン酸緩衝液(PBS)中に最終濃度5mg/mlで希釈されたHYADD(商標)(PMのMW 500,000〜730,000 D及び平均アミド化度2％であるヒアルロン酸のヘキサデシルアミド)2mlの2週間に1回の関節内注射により、合計3回注射を処置した。
これらの動物は、26週目に屠殺した。
滑液を、処置の開始直前及び屠殺前1週間(従って、処置終了の5週間後)に、ヒツジから採取する一方で、滑膜及び軟骨を、屠殺時に採取した。

In vivoにおいて行った分析：
滑膜の組織学
膝関節半月板切除術を受け及び先に説明されたように処置された関節から得た滑膜試料を、最初に緩衝したホルマリン溶液(PBS中10％)中に24〜48時間含浸した。アルコール及びキシロールで脱水後、これらをパラフィンに包埋し、当業者に公知のように処理し、厚さ4μmの切片を得、引き続きヘマトキシリン及びエオシンで染色した。先に説明したように処理した試料の3群に、「非-OA対照」と記される非-手術動物の第4群を加えた。

滑膜層(synovial membrane)は、関節腔の内側の非-軟骨表面の全体を覆い、及び結合組織により構成されている。これは構造的に、内膜(intima)、内膜下組織(subintima)及び下滑膜(subsynovial)として公知の3層で構成されている。内膜内には、規則的に配列された細網線維及びコラーゲン線維が認められ、これは内膜下組織及び下滑膜において数が増大している。該切片は、拡大鏡40Xにより分析される各区域の250μmの視野を投影した光学顕微鏡下で、グリッド1cm²を使用し、分析した。1切片につき5個の無作為に選択された区域を分析した。考慮されたパラメータ(それらはOAを特徴付けるので選択された)は、以下であった：内膜の過形成、内膜中の血漿浸潤の存在、及び滑膜層の線維化(fibrosis)(滑膜中のコラーゲン線維の「乱れた」配列により明らかにされる)。
滑膜の線維化は、最大値250μmまで、内膜下組織の深さを測定することにより評価した。最初の2種のパラメータのスコア化は、下記表を基にしている：

結果
膝関節半月板切除術は、分析した組織学的パラメータの全てにおいて、非-手術対照(これは、OA-フリーの状況を示す)と比べ、著しい増加を引き起こし、その結果使用したOA誘導のモデルの正当性を明らかにしている。全ての場合において、HYADD(商標)による処置(図1、2及び3)は、考慮されたパラメータの顕著かつ有意な改善を決定し、プラセボ及びHAの両方による処置に関して(図3)並びにひとつの場合(図3)、HYADD(商標)は、非-OA対照と同じ結果を生じた。

関節軟骨分析
滑膜層の組織学的分析と並行して、OA動物の関節軟骨について、顕微鏡による形態学的分析を行い、非-処置のもの(プラセボ)及び対照(この場合も、「非-OA対照」と表される非-手術動物の第4群が、前記3群に加えられる)と比べた。これらの関節を切開し、脛骨と大腿骨を接続している内側関節面を分析した。評価は、Cakeらの「肉眼的形態スコアシステム(Gross Morphology Score System)」を基にし(Osteoarthritis and Cartilage, 2000, 8:404-411)、軟骨損傷及び処置の作用の両方を評価するために使用した。
このスコアシステムは、下記のスコアを適用することにより、軟骨の完全性及び骨棘(骨関節症に典型的な骨性形成物)の出現の両方を推定した：

結果：
プラセボで処置された動物は、骨棘出現の最高スコアを有した(図4-5)。HYADD(登録商標)による処置は、そのような変化の出現を有意に低下し、特に大腿骨顆部の内側コンパートメントにおいて明白であった(図5)。
同様に、脛骨板(tibial plate)及び大腿骨顆部の両方を検討し、軟骨損傷に関する最高スコアは、プラセボで処置した動物において認められたのに対し、HYADD(登録商標)で処置した群の軟骨は、最も変化が少なかった(図6-7)。

グリコサミノグリカン濃度
この分析の目的は、処置された動物、対、プラセボの滑液中に存在する及び/又は新たに合成された硫酸グリコサミノグリカン(GAG)の濃度を評価しかつ比較することであった。この分析は、Farndale RW.らの論文(Connective Tissue Res., 1982, 9:247-248)に説明され、及びAppleyard RC.らの論文(Osteoarthritis Cartilage, 2003, 11:65-77)において完成された技術を用いて行った。

これらの結果は、図8のグラフに示し、GAG濃度は、処置の最後に決定し、及び処置開始時に測定した濃度に対する割合(％)で表した。図8は、HYADD(商標)単独による処置は、本実験終了時に、滑液中のGAG濃度(これは、先に考察したように、逆に、処置出発時よりも実質的に低い値を生じる)は、プラセボよりも大きい増加であることを決定し、滑膜組織の滑膜細胞によりより多く合成されたことに由来するGAGは、問題のHAアミドにより刺激され及び保護されることを示している。

動的粘度
滑液の動的粘度(すなわち、その固有粘度)は、各処置の開始時及び終了の5週間後に、マイクロフーリエレオメーター(Micro Fourier Rheometer)により測定した。全ての結果は計算し、及び0.5Hzの周波数で互いに比較した(Ghosh P.ら, Proceedings Hyaluronan 2003 Congress, Ed. Matrix Biology Institute 2004)。
結果は、図9に示した：HYADD(商標)処置は、プラセボと比べ、処置した動物における固有粘度の有意な上昇を決定した。

滞留時間
HYADD(商標)の関節腔内の滞留時間は、非-OAウサギ関節において評価した：各5匹のウサギの5群は、初期濃度5mg/mlのHYADD(商標)0.25mlの単回関節内注射を受け取り(従って各関節はHYADD(商標)1.25mgを受け取る)、投与後15、25、35、45及び55日目に分析した。
関節内の滞留時間は、動物の麻酔後、設定した時間に、処置した関節から採取した滑液中に存在する (HYADD(商標)誘導体の)アミン残基のHPLC分析により決定した。

滑液試料は、NaOHで処理し、その後70℃で加水分解し、その結果問題の分子からのヘキサデシルアミンの完全な放出を可能にする。その後アミンは、ジエチルエーテルにより溶液から抽出し、メタノール中に溶解し、蛍光光度計(励起波長330nm、放出波長440nm)を備えたHPLC技術によるクロマトグラフィー分析用に調製した。
試料中のヘキサデシルアミンを定量することにより、滑液中のHYADD(商標)の濃度を確立することが可能である。
得られた滞留時間は、15日間であり、その理由は図10に示されたように、最初の誘導体の27％は、この時点以降、依然関節腔に存在するが、この値は注射後25日目には5％に下落するからである。

HYADD(商標)誘導体に好ましい位置の決定
この種の実験のために、本発明者らは、同位体¹⁴Cで標識されたHYADD(商標)誘導体を使用した：(¹⁴C)-HYADD(商標)は、初期比活性3.01μCI.mg^-1を有し、これはABC Laboratoriesから調製及び供給された。誘導体(¹⁴C)-HYADD(商標)は、初期濃度8mg.ml^-1でリン酸緩衝液中に調製し；得られた溶液0.4mlを、5＋5匹のウサギの関節腔に注射し、これらは後に処置後2及び14日目に屠殺し、この時、軟骨表面に存在する放射活性を分析した。採取した軟骨試料を、最初に2M NaOHによる、70℃で30分間の、塩基性加水分解に曝した。その後各試料を、緩衝液で洗浄し、洗浄緩衝液を、先のNaOH溶液と一緒にプールした。その後これらの試料を、最終の放射活性の読み取りのために、Quickszint 1シンチレーション液と混合し(比1:10)、その後放射活性を、Packard TR 2100シンチレーション分析装置を用いて決定した。

得られた結果は、最初に注射された放射活性に対する割合(％)として表した。関節内注射の2日後、軟骨の塩基性加水分解後に回収された放射活性の％は、最初に注射されたものの2％であったのに対し、この値は、処置後14日目は1％に下落した。
この結果は、HYADD(商標)誘導体は、関節内へ注射された後に、滑液に閉じ込められ続けることはないが、2日後と早期に関節軟骨の表面に認めることができることを明らかに示しており、従って、本発明の対象のアミド誘導体は、OA処置に対する新規療法を示すことが確認された。

In vitro分析：
培養物中のOAヒツジ滑膜細胞
材料、方法及び実験から得られた結果
細胞：
下記実験に使用した滑膜層は、in vivo実験に関して先に説明されたように、HYADD(商標)及びHAで処置した動物並びに各々の対照から採取した。
これらは最初に、ペトリ皿において細断し、洗浄し、リン酸緩衝液(PBS)と共に、2000rpm、20℃で10分間遠心し、その後トリプシン(0.2％)及びEDTA(0.1％)を含有するPBS中に再懸濁した。消化された材料は、培養培地(DMEM)により洗浄及び遠心し、その後、ウシ胎仔血清FCS(10％)を含有するDMEM中で再懸濁した。こうして得られた細胞は、2000rpmで10分間再遠心し、ペレットを、2mg/mlコラゲナーゼを含有する培養培地(DMEM/FCS)により収集した。37℃で3時間インキュベーションした後、細胞を遠心し、10％FCSを含有するDMEMと共にペトリ皿に播種した。こうして得られた細胞を、第二継代に増殖した。培地は、2/3日毎に交換し、細胞が集密度90％に到達した時点で、滑膜細胞を³H-酢酸塩のアリコートセット(Amersham Pharmacia Boitech)と共にインキュベーションすることによりHA合成を決定するために使用した。その後細胞を、滑膜細胞によりin vitroにおいて合成されたHA分子中に取り込まれた³H-酢酸塩の最終決定のために、Ghosh P.らの論文(Proceedings Hyaluronan 2003 Congress, Ed. Matrix Biology Institute 2004)に説明されたように処理した。

結果：
得られた結果は、OA関節のHYADD(商標)による処理は、滑膜細胞を、通常OA関節に存在するプロ炎症性サイトカインの細胞毒性作用から保護することを示し、これは、HYADD(商標)、対、プラセボで処置されたOAヒツジから採取された滑膜細胞で得られた図11の実験データに示されるように、それらの高いHA合成能により明らかにされる、未変化のそれらの細胞代謝に好ましく/これを維持する。

ヒトOA軟骨細胞培養
材料：
HYADD(商標)(分子量500,000〜730,000D及び平均アミド化度2％を伴う、ヒアルロン酸のヘキサデシルアミド)を、リン酸緩衝液中に、最終濃度3mg/mlで希釈した。

細胞：
ヒト軟骨細胞：これらの細胞は、関節置換術を受けた患者の関節軟骨の生検から得た。簡単に述べると、これらの試料は、細断し、トリプシン(0.25％)、精巣ヒアルロニダーゼ及びI型コラゲナーゼで処理した。次に消化した材料を、ウシ胎仔血清(10％)、4mMグルタミン及び100Uペニシリン/ストレプトマイシンを含有する培養培地(Ham's F12)中に再懸濁した。
こうして得られた細胞を、毎日培地を交換し、第二継代まで増殖した。細胞生存度は、トリパンブルーによる染色により試験した。

細胞増殖の時間経過
HYADD(商標)が、軟骨細胞増殖速度に対し有し得るあらゆる毒性及び/又はあらゆる可能性のある影響をチェックするために、これらの細胞を、異なる濃度のHYADD(商標)(培養培地の0.5及び1.5mg/ml)の存在下で3〜9日間播種した。これらの実験は、3つ組で実行した。細胞生存度を、MTT法により決定した(Dezinot F.ら, J Immunol Methods, 1986, 22(89):271-277)。

結果
得られた結果(図12)は、濃度1.5mg/mlのHYADD(商標)による処置は、処置の3日目と早期に、全ての試験調製物においてヒト軟骨細胞の生存度を有意に増大したことを示している。更に処置の9日後、濃度1.5mg/ml及びより低い濃度0.5mg/mlの両方で、このアミド誘導体の有意な増殖作用が認められた。
従ってHYADD(商標)による試験の結果は、該ヒアルロン酸誘導体は、OA患者由来のヒト軟骨細胞の培養物に対し顕著な増殖作用を有することを確認している。

In vivo及びin vitroの両方で得られた結果を検討し、以下の点を述べることができる：
・HYADD(商標)と称されるHAアミド誘導体(特にHAのヘキサデシルアミド)は、先に詳述したように、OAにおいて軟骨細胞死滅に関連した連続分解過程を受ける、細胞外マトリックスの合成に寄与する細胞である軟骨細胞の増殖を刺激する；
・本発明の対象であるアミド誘導体は、滑膜細胞によるHAの合成を刺激することができ、従って先に説明されたように、そうでない場合はOA関節において重度に損なわれる、滑液中のHAの代謝回転(及び他のグリコサミノグリカンの代謝回転)の正常化に寄与することも証明されている；
・in vivoにおいて試験した場合、本発明の対象であるアミド誘導体は、滑膜及び関節軟骨をOAに典型的変化から保護することができ、非-OA対照のものと等しくなくとも類似したパラメータで滑膜を安定化することが証明されている；
・処置された滑液試料の最終粘度は、OAにおいて認められるものよりも大きく、並びに関節腔内のアミド誘導体の滞留時間は、他の誘導体及び/又は非-修飾のHAのものよりも顕著に長い。

本発明の対象である誘導体の毒性の絶対的欠如、軟骨にもたらされるOA分解からの保護、関節腔内中のそのかなりの滞留時間に関連した滑膜の保護及び滑液の粘度の正常化は、この誘導体を絶対的に新規であり、かつ以下の使用に適したものとしている：
・骨関節症/変形性関節症の新規治療として、
・骨関節症により影響を受けた関節の治療における、並びに軟骨及び/又は滑膜損傷を生じる炎症及び/又は外傷の症例(疼痛を伴う)における、滑液の部分的/全体的代用品として。

最後に本発明者らは、関節構造の生理的加齢に起因した摩耗により影響を受けた関節の治療におけるその使用を請求する。
本発明の対象である医用材料は、薬理学的及び/又は生物学的活性材料、例えばステロイド、サイトカイン、インターフェロン、ペプチド及び核酸、増殖因子(例えば、PDGF、IGF、TGF-β、FGF、GDF5、GDF6)及び/又は分化増殖因子(例えば、BMP2及びBMP7)などと会合し、様々な形(例えば、ゲル、ヒドロゲル、粉末、ミクロスフェア、 ナノスフェア)に製造するか、又は分化された細胞(例えば、軟骨細胞、線維芽細胞、滑膜細胞、骨芽細胞/骨細胞)、又は非-分化細胞、例えば間葉細胞のためのビヒクルとして使用することができる。

本発明の対象であるアミドHA誘導体は、最良の可能性のある医薬製剤を得るために、安定剤、賦形剤、保存剤及び/又は当業者が有用であると考え得る任意の他の分子と会合して、当業者に公知の全ての方法で製剤することができる。
単に説明を目的とし、これらにより限定されるものではなく、本発明者らは、本発明の対象であるアミドHA誘導体(HYADD(商標))の調製のいくつかの実施例を報告する：

実施例1
アミド化度5％のヒアルロン酸ヘキサデシルアミドの調製
HAのテトラブチルアンモニウム塩(HA/TBA)2g(3.2mM)を、DMSO 100ml中に可溶化した。この溶液に、HCl蒸気を吹き入れ、メタンスルホン酸60μmlで、それがpH値4.5〜5に達するまで処理した。引き続き、この溶液にカルボニルジイミダゾール52g(0.32mM)を添加し、これを室温で1時間振盪し、その後ヘキサデシルアミン780mg(3.2mM)を添加した。これを、16〜18時間反応させ、その後飽和NaCl溶液5mlを添加し、得られた生成物を、アセトン200mlにより沈殿させ、濾過し、真空乾燥した。最終のアミド化度は、こうして得られた生成物の少量を塩基性加水分解した後、HPLCで調べた。

実施例2
アミド化度2％のヒアルロン酸ヘキサデシルアミドの調製
手順は、添加されるカルボニルジイミダゾールの量を、この場合30mgに変更したこと以外、実施例1と同じである。
こうして説明された本発明は、これらの方法が、様々な様式で変更することができることを明らかにしている。このような変更は、本発明の精神及び目的からの逸脱とは見なされず、当業者に明らかであるあらゆる変更は、「特許請求の範囲」内である。

処置したOA試料、対非-OA対照、及び対プラセボにおける、滑膜の内膜及び内膜下組織の線維化の深さを示す図。 処置したOA滑膜試料、対非-OA対照、及び対プラセボの血漿浸潤を示す図。 処置したOA試料、対非-OA対照、及び対プラセボの滑膜内膜の過形成を示す図。 処置したOA試料、対非-OA対照、及び対プラセボにおける骨棘：脛骨板を示す図。 処置したOA試料、対非-OA対照、及び対プラセボにおける骨棘：大腿骨顆部を示す図。 処置したOA軟骨、対非-OA対照、及び対プラセボの試料の評価：大腿骨顆部を示す図。 処置したOA軟骨、対非-OA対照、及び対プラセボの試料の評価：脛骨板を示す図。 処置したOA試料、対、プラセボの滑液中のグリコサミノグリカン濃度を示す図。 処置されたOA試料、対、プラセボの滑液粘度を示す図。 関節腔内のHYADD滞留時間を示す図。 処置したOA滑膜細胞、対、プラセボにより合成された³H-標識HAの濃度を示す図。 HYADD 0.5-1.5mg/mlで処置された関節ヒト軟骨細胞の増殖を示す図。

Claims (26)

1. 骨関節症/変形性関節症の新規治療としてのヒアルロン酸のアミド誘導体。
2. 骨関節症、外傷、炎症及び/又は関節構造の加齢に起因した摩耗により影響を受けた関節の治療における、滑液の部分的及び/又は全体的代用品としての、ヒアルロン酸のアミド誘導体。
3. 前記アミドが、ヒアルロン酸のカルボキシ基と、脂肪族、芳香族、アリール脂肪族、脂環式又はヘテロ脂肪族シリーズに属するアミンのアミン基の間のアミド結合により形成される、請求項1又は2に記載のヒアルロン酸のアミド誘導体。
4. 前記アミンが、ヘキサデシルアミンである、請求項3に記載のヒアルロン酸のアミド誘導体。
5. 前記アミド化度が、0.1〜5％の範囲である、請求項3に記載のヒアルロン酸のアミド誘導体。
6. 前記平均アミド化度が、2％である、請求項5に記載のヒアルロン酸のアミド誘導体。
7. 前記平均アミド化度が、5％である、請求項5に記載のヒアルロン酸のアミド誘導体。
8. 前記アミド誘導体が、水溶性である、請求項5〜7のいずれかに記載のヒアルロン酸のアミド誘導体。
9. 前記ヒアルロン酸の分子量が、400〜3x10⁶Da、特に1x10⁵Da〜1x 10⁶Da、更により特定すると500,000〜750,000Daの範囲である、請求項8に記載のヒアルロン酸のアミド誘導体。
10. ゲル、ヒドロゲル、粉末、ミクロスフェア、ナノスフェアの形で作製される、請求項1〜9のいずれかに記載のヒアルロン酸のアミド誘導体。
11. 請求項3に記載のヒアルロン酸のアミド誘導体により構成された医用材料。
12. 前記アミンが、ヘキサデシルアミンである、請求項11に記載のヒアルロン酸のアミド誘導体により構成された医用材料。
13. 前記平均アミド化度が、0.1〜5％の範囲である、請求項12に記載のヒアルロン酸のアミド誘導体により構成された医用材料。
14. 前記平均アミド化度が、2％である、請求項13に記載のヒアルロン酸のアミド誘導体により構成された医用材料。
15. 水溶性である、請求項11〜14のいずれかに記載のヒアルロン酸のアミド誘導体により構成された医用材料。
16. 前記ヒアルロン酸の分子量が、400〜3x10⁶Da、特に1x10⁵Da〜1x10⁶Da、更により特定すると500,000〜750,000Daの範囲である、請求項16に記載のヒアルロン酸のアミド誘導体により構成された医用材料。
17. ゲル、ヒドロゲル、粉末、ミクロスフェア、ナノスフェアの形で作製される、請求項11〜16のいずれかに記載のヒアルロン酸のアミド誘導体により構成された医用材料。
18. 薬理学的及び/又は生物学的活性物質と会合されている、請求項17に記載のヒアルロン酸のアミド誘導体により構成された医用材料。
19. BMP2及び/又はBMP7(分化増殖因子)と会合されている、請求項18記載のヒアルロン酸のアミド誘導体により構成された医用材料。
20. 分化細胞及び/又は未分化細胞のビヒクルとしての、請求項17に記載のヒアルロン酸のアミド誘導体により構成された医用材料。
21. 軟骨細胞及び/又は間葉細胞のビヒクルとしての、請求項20に記載のヒアルロン酸のアミド誘導体により構成された医用材料。
22. 骨関節症、外傷、炎症及び/又は関節構造の加齢に起因した摩耗により影響を受けた関節の治療のための新規医薬組成物の調製における、請求項1〜9のいずれかに記載のヒアルロン酸のアミド誘導体の使用。
23. ゲル、ヒドロゲル、粉末、ミクロスフェア、ナノスフェアの形の新規医薬組成物の調製における、請求項22に記載のヒアルロン酸のアミド誘導体の使用。
24. 薬理学的及び/又は生物学的活性材料との会合における、請求項22に記載のヒアルロン酸のアミド誘導体の使用。
25. 分化細胞及び/又は未分化細胞のビヒクルとしての、請求項22に記載のヒアルロン酸のアミド誘導体の使用。
26. 軟骨細胞及び/又は間葉細胞のビヒクルとしての、請求項25に記載のヒアルロン酸のアミド誘導体の使用。

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