PT1853279E

PT1853279E - Derivados de amida de ácido hialurónico para osteoartrose

Info

Publication number: PT1853279E
Application number: PT67072033T
Authority: PT
Inventors: Antonella Schiavinato; Davide Bellini
Original assignee: Fidia Farmaceutici
Priority date: 2005-03-02
Filing date: 2006-02-20
Publication date: 2013-07-18
Also published as: WO2006092233A1; HK1106161A1; AU2006220034B2; ITPD20050056A1; DK1853279T3; CA2598331A1; EP1853279A1; JP2008531148A; CY1115215T1; SI1853279T1; US20080069884A1; ES2421915T3; JP5047814B2; EP2457574A1; CA2598331C; US7863256B2; AU2006220034A1; EP1853279B1; IL185248A0; PL1853279T3

Description

ΕΡ1853279Β1

DESCRIÇÃO

DERIVADOS DE AMIDA DE ÁCIDO HIALURÓNICO PARA OSTEOARTROSE

OBJETO DA INVENÇÃO A presente invenção refere-se a um biomaterial produzido a partir de hexadecilamidas de ácido hialurónico (HA), particularmente a hexadecilamida de HA, administrada pela via intra-articular como um substituto parcial/total para o fluido sinovial para tratar articulações afetadas pela osteoartrose (OA) assim como nos casos de inflamação da articulação e/ou trauma que provoca lesões na cartilagem e/ou no sinóvia (associado à dor) . Por último, é descrito e reivindicada a sua utilização no tratamento de articulações em que a estrutura inteira apresenta sinais de desgaste devido ao envelhecimento fisiológico.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO A osteoartrose/osteoartrite (OA) é um estado de incapacitação grave caracterizado por uma erosão progressiva da cartilagem da articulação devida à degradação da matriz da articulação e perda dos principais componentes celulares: condrócitos. A etiologia exata do estado ainda não é clara. Contudo, estudos recentes demonstraram que pode ser desencadeada por um desequilíbrio mecânico que afeta a articulação inteira. A instabilidade da articulação mecânica pode ser provocada através de vários fatores (e.g. trauma e/ou stress mecânico envolvendo a cápsula da articulação no total, inflamação do 1 ΕΡ1853279Β1 sistema de articulação) e pode perturbar o equilíbrio delicado entre a síntese e degradação da matriz extracelular, que é principalmente sintetizado por condrócitos e sinoviócitos.

Quando esta homeostasia perfeita, mas frágil, é perturbada, a degradação da matriz é descompensada pela sua síntese devido à perda de condrócitos, e gradualmente agravada.

Na verdade, a carga excessiva e/ou incorreta da articulação pode provocar uma resposta de condrócito que manifesta ela própria na síntese das mesmas enzimas responsáveis pela degradação da cartilagem, enzimas de protease denominadas metalo-proteinases (MMP). Estas são sintetizadas pelos condrócitos quando estimuladas por citoquinas inflamatórias, tais como IL-1 e TNF-cx, que são produzidas e libertadas na cavidade de articulação, particularmente no início de uma patologia inflamatória. A IL-1 também estimula a síntese de níveis elevados de óxido nítrico (responsável pela morte do condrócito pela apoptose) assim como inibindo a síntese de proteoglicano (componentes de matriz) pelos próprios condrócitos (Dozin B. et al., Matrix Biology, 2002, 21: 449-459). É bem conhecido que a matriz extracelular deve ser integral para os condrócitos sobreviverem. Resultados na literatura científica demonstraram que a degradação das moléculas da matriz pode conduzir à libertação de outras moléculas (que de igual modo derivam da degradação da matriz) de um modo semelhante capaz de induzir a apoptose do condrócito (Cao L. et al., Exp Cell Res, 1999, 246:527-537). 2 ΕΡ1853279Β1

Por esta razão, a cartilagem de doentes osteoartróticos apresenta uma diminuição da celularidade e correspondente aumento na formação de "lacunae" vazias na matriz da articulação.

Foram encontrados níveis elevados de IL-1 no fluido sinovial de doentes que sofrem de artrite reumatóide (RA) e artrite psoriática (Arend W.P. et al.r Arthritis Rheum, 1995, 38:151-160). O processo de envelhecimento fisiológico das superfícies da articulação também parece envolver os mecanismos enzimáticos peculiares para OA. Consequentemente, as terapias normalmente utilizadas para tratar esta patologia também são aplicadas a articulações com cartilagem parcialmente ou totalmente danificada pelo "normal" envelhecimento da articulação. A matriz da cartilagem é constituída por uma estrutura tridimensional formada por moléculas de colagénio e complexos de proteoglicano agregados. Estes, por sua vez, são constituídos por uma estrutura de suporte baseada em ácido hialurónico que interage com moléculas de glucosaminoglicano (GAG), ligadas não covalentemente a sequências de polipéptido associadas com ácido hialurónico (HA), conferindo assim à cartilagem propriedades tanto mecânicas como viscoelásticas.

Na verdade, HA é uma molécula com propriedades viscoelásticas especiais, sintetizada e segregada também na cavidade de articulação principalmente pelos sinoviócitos (Asari A. et al., Arch Histol Cytol, 1995, 58(1):65-76) e é 3 ΕΡ1853279Β1 por isso um dos principais componentes de fluido sinovial. Quando a articulação é movida lentamente, o HA atua como um lubrificante viscoso, embora quando é movido bruscamente as propriedades elásticas dos HA' s permitem que atue como um amortecedor de choque que neutraliza qualquer trauma ou microtrauma ao qual a articulação pode ser expostas. É sabido que as caraterísticas funcionais do fluido sinovial dependem da concentração e do grau de polimerização de HA, e que quaisquer alterações nestas pode conduzir a lesão histológica de tipo AO para a lesão. A rotatividade de HA (e de glicosaminoglicanos em geral) no fluido sinovial saudável é normalmente rápida (1 dia em ovinos) , mas no decurso de OA, foi observada uma queda na sua concentração (associada à diminuição em GAG) e no seu peso molecular médio (MW), assim como uma diminuição acentuada na sua rotatividade (Balazs EA. et al., J Rheumatol Suppl, 1993, 12:75-82/ Belcher C. et al., Annals of the Rheumathic Disease, 1997, 56:299-307).

Descobertas posteriores demonstraram que o HA não possui apenas propriedades de viscossuplementação biomecânica, mas também a capacidade para proteger os condrócitos da ação de IL-1, medida como a percentagem de síntese de proteoglicano (Brun P. et al., OsteoArthritis and Cartilage, 2003, 11:208-216), (Stove J. et al., Journal of Orthopaedic Research, 2002, 20: 551-555).

Com base nestas observações, foi Balazs quem primeiro sugeriu que a evolução da osteoartrose pode ser modificada através da administração de HA exógeno, especialmente HA de 4 ΕΡ1853279Β1 elevado peso molecular, diretamente na cavidade de articulação.

Existem atualmente no mercado vários fármacos para a administração intra-articular de HA em OA, tal como: Hyalgan®, HA purificado a partir de cristãs de galo com um MW de: 5-7,5 X 105 Da (Patente Europeia N°. 0138572 Bl); Synvisc®, (Hylan G-F 20) HA ligado reticuladamente com formaldeido e divinil sulfona com um MW de: 6-7 X 106 Da (Patente US 4 713 448), Artz®, HA com MW: 6,2-12 X 105 Da. W02004/011503 revela géis de derivados do ácido hialurónico nos quais um composto de sacárido contendo um grupo amina está ligado a um ácido hialurónico por amidação. O referido composto de sacárido contendo o grupo amina é derivado de quitosano ou ácido hialurónico desacetilado e seus derivados. W02002/30990 revela derivados de amida ligados reticuladamente de ácido hialurónico obtido por ligação reticulada de polimero ou oligómero possuindo dois ou mais grupos amina, com ácido hialurónico ou seus sais de hialuronato através de reação de amidação. O referido polimero ou oligómero pode ser quitosano ou seus derivados, ácido hialurónico desacetilado ou seus derivados, polietilenoglicol ou proteina ou péptido possuindo dois ou mais grupos amina com capacidade de reação que podem aceitar protões. Além disso, a Patente Europeia N°. 1144459 Bl descreve e reivindica um novo derivado de HA para o tratamento de patologias na articulação de OA. É um derivado de ácido hialurónico de ligação reticulada com poliaminas para formar ligações de amida com os grupos carboxilo de HA. Está na forma de um hidrogel normalmente insolúvel em água, preparado e subsequentemente testado com um grau final de 5 ΕΡ1853279Β1 ligação reticulada de 50% (Barbucci R. et al., Biomaterials, 2002, 23:4503-4513).

Injeções intra-articulares de HA são conhecidos por proporcionar viscossuplementação e melhorar a função nos membros afetados pela patologia de OA, com uma redução consequente na dor da articulação. Contudo, o tempo de residência de HA's na cápsula da articulação está limitado a cerca de 40 horas após a aplicação de Hyalgan® (Fraser JR. et al., Seminars in Arthritis and Rheumatism, 1993, 22:9-17) enquanto no caso de Synvisc® pode durar durante alguns dias (Fiorentini R., Proceedings of the US FDA Advisory Panei on Orthopaedlc and Rehabllltatlon Devices, 11/21/96 Fairfax (VA):CASET Associates, 1996; Berkowitz D., Proceedings of the US FDA Advisory Panei on Orthopaedic and Rehabilitation Devices, 11/20/96 Fairfax (VA):CASET Associates, 1996).

Esta limitação significa que são normalmente necessários ciclos de administração semanal, com um total de pelo menos 5 injeções intra-articulares.

Além disso, alguns destes fármacos baseados no HA modificado quimicamente, tais como Synvisc®, foram envolvidos em relatórios de eventos adversos por vezes sérios (Hammesfahr JF. et al., The American Journal of Orthopaedics, 2003, 32: 277-283), provavelmente seguido pelo inicio de processos inflamatórios, especialmente ligados ao recrutamento de eosinófilos (Schiavinato A. et al., Clinicai and Experimental Rheumatology, 2002, 20:445-454).

Considerando o acima referido, estão a ser estudados novos derivados quimicos de HA que permitem que os problemas 6 ΕΡ1853279Β1 ligados ao tempo de residência na cavidade de articulação e ao risco de toxicidade devido a solventes e/ou agentes químicos particulares utilizados na modificação química de HA sejam ultrapassados, embora mantendo todas as caraterísticas e propriedades intrínsecas do polissacárido não alterado. 0 Requerente descobriu surpreendentemente que HA, ligado quimicamente a uma amina pelo seu grupo carboxilo e denominado HYADD™ (Patente Europeia N°. 1095064 Bl), possui todas as propriedades intrínsecas de HA descrito acima, demonstrando, para além disso, que proporciona um estímulo proliferativo surpreendente na direção dos condrócitos humanos de OA, induz uma ação protetora na sinóvia de OA, retardando o processo degenerativo, reduzindo as alterações na morfologia da superfície da cartilagem de OA e a formação dos osteofitos (as formações ósseas típicas da osteoartrose) , representando desse modo uma nova terapia curativa para OA e, por último, que possui caraterísticas viscoelásticas que permitem a integração/substituição parcial e/ou completa do fluido sinovial numa articulação que foi lesada ou tratada por cirurgia, permitindo uma carga do joelho correta, sem dor.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO A Patente Europeia N°. 1095064 Bl descreve e reivindica derivados de amida de HA com origem a partir da formação de uma ligação amida entre o grupo carboxilo de HA e o grupo amina de uma amina que pertence à série alifática, aromática, arilalifática, cicloalifática, heteroalifática. Os compostos que derivam destas (denominados HYADD™) podem apresentar diferentes graus de amidação, variando desde 0,1 até 5%, 7 ΕΡ1853279Β1 (Exemplo 1) de modo a que o produto final seja solúvel em água, tampão fosfato ou solução salina.

Os referidos derivados foram descritos em relação à preparação de composições farmacêuticas formuladas de vários modos diferentes, na preparação de biomateriais fabricados em diferentes formas para a preparação de artigos de cirurgia e, por último, em formas adequadas para o revestimento de objetos biomédicos, tais como cateteres e "stents". A sua utilização também foi reivindicada numa vasta gama de práticas clinicas, incluindo ortopedia. Contudo, a sua utilização nunca foi descrita, reivindicada, ou mesmo formulada como hipótese, como um biomaterial para ser utilizado especificamente a um nivel intra-articular como uma terapia curativa para OA, ou para RA e artrite psoriática, em todos os casos de inflamação e/ou trauma da articulação que provoca lesão à cartilagem e/ou sinóvia (associada com dor) e por último, como uma terapia para patologias associadas ao envelhecimento da articulação.

Em particular, é o objeto da presente invenção a utilização de hexadecilamidas de ácido hialurónico para a preparação de um medicamento para o tratamento de osteoartrose/osteoartrite.

Hexadecilamidas de ácido hialurónico como substitutos parciais e/ou totais para o fluido sinovial no tratamento de articulações afetadas por osteoartrose, trauma, inflamação e/ou desgaste devido ao envelhecimento da estrutura da articulação são também objeto da presente invenção. Os 8 ΕΡ1853279Β1 biomateriais constituídos pelas hexadecilamidas de ácido hialurónico são também um objeto da presente invenção.

Pelas experiências aqui descritas abaixo, o Requerente demonstrou que: • Os derivados de HYADD™ possuem as propriedades intrínsecas de HA, com um tempo de residência decididamente mais longo na articulação do que a do HA nativo; • exercem um estímulo proliferativo forte nos condrócitos de OA e por isso prometem ser um novo alvo eficaz para a cura de cartilagem danificada; • exercem uma ação protetora inesperada sobre a sinóvia de OA e a cartilagem, retardando o processo degenerativo; • possuem propriedades viscoelásticas que permitem a integração/substituição parcial e/ou completa do fluido sinovial numa articulação que está danificada/inflamada/envelhecida ou que sofreu uma cirurgia; • não possuem efeito tóxico nos condrócitos ou sinoviócitos tratados in vitro e in vivo; • por último, por todas as razões acima, os derivados de HYADD™ demonstraram ser ativos na redução da dor associada a OA, permitindo desse modo a carga correta da articulação. 9 ΕΡ1853279Β1

Com base no acima referido, o Requerente reivindica derivados de HYADD™ como biomateriais a serem utilizados para substituir parcialmente/totalmente o fluido sinovial no tratamento de articulações, especialmente aqueles afetados por OA e, para além disso, para articulações afetadas por trauma e/ou inflamação, ou que foram danificados pelo processo de envelhecimento fisiológico ou tratado por cirurgia.

Os derivados de HA conhecidos como HYADD™ descritos na presente invenção são sintetizados de acordo com a Patente Europeia N°. 1095064 Bl, começando com um derivado de HA de qualquer fonte, por exemplo, obtidos por extração a partir de cristãs de galo (Patente Europeia N°. 0138572 Bl), ou por fermentação ou por meios tecnológicos, e possuem um peso molecular que varia entre 400 e 3xl06 Da, em particular entre lx 105 Da e lx 106 Da, e ainda mais particularmente entre 500 000 e 750 000 Da. O derivado de HYADD™ utilizado em todas as experiências realizadas, tanto in vitro como in vivo, possui um grau médio de amidação de 2-3%, e foi sintetizado utilizando hexadecilamina com diimidazole de carbonilo como o agente de ativação preferido (Exemplo 2). O produto obtido é solúvel em água e pode ser esterilizado pelos métodos conhecidos dos peritos no campo. Contudo, é preferível a esterilização por autoclave.

Em particular, nas hexadecilamidas de ácido hialurónico de acordo com a presente invenção a amida é formada por ligações amida entre o grupo carboxilo do ácido hialurónico 10 ΕΡ1853279Β1 e o grupo amina da hexadecilamina. 0 grau de amidação varia entre 0,1 e 5%. Mais preferencialmente o grau médio de amidação é 2% ou 5%. As hexadecilamidas do ácido hialurónico de acordo com a presente invenção são produzidas na forma de géis, hidrogéis, pós, microesferas, nanoesferas. O objetivo das experiências aqui descritas adiante foi o de analisar a viscosidade e as propriedades quimicas/biológicas do derivado de HYADD™: • in vivo para análise histológica da sinóvia (membrana sinovial) em ovinos com OA após tratamento intra-articular (aqui descrito em detalhe adiante). • in vivo para analisar a morfologia da superfície da cartilagem de OA e avaliar a presença de osteófitos após tratamento intra-articular (aqui descrito em detalhe adiante); • in vivo para medir a concentração dos glicosaminoglicanos presentes no fluido sinovial de ovinos com OA antes e após tratamento intra-articular (aqui descrito em detalhe adiante); • in vivo para determinar a viscosidade intrínseca do fluido sinovial de articulações de ovino com OA antes e após tratamento intra-articular (aqui descrito em detalhe adiante); 11 ΕΡ1853279Β1 • in vivo para avaliar o tempo de residência na cavidade de articulação e localização na cartilagem da articulação; • in vitro utilizando culturas de sinoviócitos tirados de articulações de ovinos com OA que receberam tratamento intra-articular (aqui descrito em detalhe adiante) para avaliar a capacidade dos HA's para síntese; • in vitro utilizando culturas de condrócitos humanos com OA para verificar o seu efeito proliferativo e toxicidade.

Materiais, métodos, e os resultados obtidos a partir de uma experiência in vivo: Modelo de OA em articulações de ovinos 18 ovinos da raça Merino como idades de 7-8 anos foram primeiro submetidos a meniscectomia para remoção da parte lateral do menisco em ambos os membros da frente; 16 semanas após cirurgia, a OA era evidente, como descrito em Ghosh P. et al., Proceeding Hyaluronan 2003 Congress, Ed. Matrix Biology Institute 2004 e em Little C. et al., J Rheumatol, 1997, 24:2199-2209.

Tratamento

Os 18 animais foram então divididos em 3 grupos, a cada um foi dado um tratamento diferente começando na 16a semana após cirurgia e terminando na 20a semana: 12 ΕΡ1853279Β1 • OA + Placebo: os animais foram tratados semanalmente com 1 injeção intra-articular de 2 mL de solução salina estéril, para um total de 5 inj eções; • OA + HA: os animais foram tratados semanalmente com 1 injeção intra-articular de 2 mL de HA (MW 500 000-730 000 D), para um total de 5 injeções; • OA + HYADD™: estes animais foram tratados a cada duas semanas com 1 injeção intra-articular de 2 mL de HYADD™ (Hexadecilamida de ácido hialurónico com um MW de PM 500 000-730 000 D e um grau médio de amidação de 2%) diluído em solução de tampão fosfato (PBS) a uma concentração final de 5 mg/mL, para um total de 3 injeções.

Os animais foram sacrificados na 26a semana. O fluido sinovial foi retirado do ovino imediatamente antes do início do tratamento e 1 semana antes do sacrifício (por isso, 5 semanas após o final do tratamento) , enquanto a sinóvia e a cartilagem foram removidas na altura do sacrifício.

Análises realizadas in vivo:

Histologia da sinóvia

As amostras de sinóvia das articulações sujeitas a meniscectomia e tratadas como descrito acima, foram primeiro imersas em solução de formalina tamponada (10% em PBS) 13 ΕΡ1853279Β1 durante 24-48 horas. Após desidratação com álcool e xilol, elas foram incorporadas em parafina e processadas como é conhecido de um perito na área para obter secções de 4 mm de espessura, subsequentemente coradas com hematoxilina e eosina. Aos 3 grupos de amostras tratadas como descrito, foi adicionado um 4o grupo de animais não operados, representando "controlos não OA". A membrana sinovial cobre a superfície não cartilagem interior inteira da cavidade de articulação e é constituída por tecido conjuntivo. Estruturalmente, é composta por três camadas, conhecidas como a intima, subintima e subsinovial. Na intima, podem ser observadas fibras reticulares e de colagénio dispostas regularmente, que aumentam em número na subintima e subsinovial. As referidas secções foram analisadas num microscópio ótico utilizando uma grelha de 1 cm2 que, com uma lente com amplificação de 40 X, projetada um campo visual de 250 mm de cada área analisada. Foram analisadas cinco áreas selecionadas aleatoriamente por secção. Os parâmetros considerados (escolhidos porque caracterizam OA) , foram os seguintes: hiperplasia da intima, presença de infiltrações de plasma na intima e fibrose da membrana sinovial (manifestada por um arranjo "desarrumado" das fibras de colagénio na sinóvia). A fibrose da sinóvia foi avaliada medindo a profundidade da subintima até um valor máximo de 250 mm. A classificação nos primeiros dois parâmetros foi baseada na tabela abaixo: 14 ΕΡ1853279Β1

Parâmetros Classificação Observações Hiperplasia 0 Presença de 1-2 camadas de da intima células; 1 Entre 3 e 4 camadas; 2 5 o camadas ou mais; 3 5 camadas ou mais ao longo da intima. Infiltrações 0 Nenhum; do Plasma 1 1 foco de infiltração; 2 entre 2 e 5 foci; 3 Presença de 5 ou mais foci disseminados.

Resultados : A meniscectomia provocou um aumento significativo em todos os parâmetros histológicos analisados, em comparação com os controlos não operados (que representam uma situação livre de OA) , demonstrando desse modo a validade do modelo de indução de OA que foi utilizado. Em todos os casos, o tratamento com HYADD™ (Fig. 1, 2 e 3) determinou um melhoramento acentuado e significativo nos parâmetros considerados, em relação ao tratamento com Placebo e HA (Fig. 3) e, num caso (Fig. 3), HYADD™ ainda deram o mesmo resultado que o controlo não OA.

Análise da cartilagem da articulação

Em paralelo com a análise histológica da membrana sinovial, a análise morfológica macroscópica foi realizada na cartilagem da articulação dos animais com OA em 15 ΕΡ1853279Β1 comparação com os não tratados (placebo) e os controlos (neste caso também, um quarto grupo de animais não operados representando "controlos não OA" foi adicionado aos três grupos). As articulações foram abertas para analisar a superfície das articulações medianas ligando a tibia e o fémur. As avaliações foram baseadas no Sistema de

Classificação de Morfologia de Gross de Cake et al., Osteoarthritis and Cartilage, 2000, 8:404-411, utilizada para avaliar a lesão da cartilagem e os efeitos do tratamento. O Sistema de Classificação estima a integridade da cartilagem e o desenvolvimento de osteófitos (formações ósseas tipicas de osteoartrose) aplicado as seguintes classificações:

Parâmetros Classificação Observações Integridade de 0 Normal Cartilagem 1 Rugosidade 2 Fibrilhação e fissuras 3 Pequenas erosões (< 5 mm) 4 Erosões maiores (> 5 mm) 5 Desenvolvimento 0 Normal; de osteófito 1 Abranda desenvolvimento de (os.) os. ; 2 Modera o desenvolvimento de os. 3 Grande Desenvolvimento de os. 16 ΕΡ1853279Β1

Resultados :

Os animais tratados com placebo tinham as maiores classificações para o desenvolvimento de osteófitos (Fig. 4-5) . O tratamento com HYADD® reduziu significativamente o desenvolvimento dessas alterações, particularmente evidentes no compartimento médio do côndilo femoral (Fig. 5).

De modo semelhante, as maiores classificações relativas a lesão na cartilagem foram observadas nos animais tratados com placebo, enquanto a cartilagem do grupo tratado com HYADD® foi o menos alterado, considerando a placa tibial e o côndilo femoral (Fig. 6-7).

Concentração de Glicosaminoglicanos O propósito desta análise foi avaliar e comparar a concentração de glicosaminoglicanos sulfatados (GAGs) presentes e/ou sintetizados de novo no fluido sinovial dos animais tratados vs placebo. A análise foi realizada utilizando a técnica descrita por Farndale RW. et ai., Connective Tissue Res., 1982, 9:247-248, e aperfeiçoada pro

Appleyard RC. et al.r Osteoarthritis Cartilage, 2003, 11:65- 77.

Os resultados são apresentados como um gráfico na Fig. 8 como a concentração de GAGs determinada no final do tratamento e expressa como uma percentagem da concentração medida no inicio do tratamento. A Figura 8 mostra que o tratamento com HYADD™ isolado determina um maior aumento do que o placebo na concentração de GAGs no fluido sinovial no final da experiência (que, inversamente, produz valores 17 ΕΡ1853279Β1 substancialmente mais baixos do que no inicio do tratamento, como discutido previamente), os GAGs que podem derivar de uma maior síntese pelos sinoviócitos do tecido sinovial estimularam e protegeram pela amida de HÁ em questão.

Viscosidade Dinâmica A viscosidade dinâmica do fluido sinovial (i. e. a sua viscosidade intrínseca) foi medida no início e 5 semanas após o fim de cada tratamento com um reómetro Micro Fourier. Todas as observações foram calculadas e comparadas umas com as outras a uma frequência de 0,5 Hz (Ghosh P. et al., Proceedings Hyaluronan 2003 Congress, Ed. Matrix Biology Institute 2004) .

Os resultados são apresentados na Fig. 9: tratamento com HYADD™ determina um aumento significativo na viscosidade intrínseca nos animais tratados, em comparação com placebo.

Tempo de Residência O tempo de residência de HYADD™ na cavidade da articulação foi avaliado em articulações de coelho não-OA: a 5 grupos de 5 coelhos cada foi dada uma injeção única intra-articular de 0,25 mL de HYADD™ a uma concentração inicial de 5 mg/mL (recebendo deste modo cada articulação 1,25 mg de HYADD™), e analisou-se 15, 25, 35, 45 e 55 dias após administração. O tempo de residência na articulação foi determinado por análise de HPLC do resíduo amina (do derivado HYADD™) presente no fluido sinovial retirado das articulações 18 ΕΡ1853279Β1 tratadas, em tempos estabelecidos, após eutanásia dos animais.

As amostras de fluido sinovial foram tratadas com NaOH antes da hidrólise a 70°C, permitindo deste modo a completa libertação da hexadecilamina a partir da molécula em questão. A amina foi então extraida a partir da solução com dietiléter, dissolvida em metanol e preparada para análise cromatográfica pela técnica de HPLC com fluorimetro (comprimento de onda de excitação de 330 nm, comprimento de onda de emissão de 440 nm).

Quantificando a hexadecilamina nas amostras, é possivel estabelecer a concentração de HYADD™ no fluido sinovial. O tempo de residência resultante foi de 15 dias, porque 27% do derivado inicial estava ainda presente na cavidade da articulação após este tempo, mas este valor caiu para 5% 25 dias após injeção, como apresentado na Fig. 10.

Determinação da localização da preferência do derivado HYADD"1

Para este tipo de experiência, utilizou-se o derivado HYADD™ marcado com o isótopo 14C: (14C) -HYADD™ com atividade especifica inicial de 3,01 yCI.mg"1, preparado e fornecido por ABC Laboratories. O derivado (14C)-HYADD™ foi preparado em tampão fosfato numa concentração inicial de 8 mg.ml-1/ 0,4 mL da solução resultante foi injetada nas cavidades da articulação de 5+5 coelhos que foram depois sacrificados nos 2° e 14° dias após tratamento quando a radioatividade presente na superfície da cartilagem foi analisada. As amostras de cartilagem retiradas foram primeiro expostas a 19 ΕΡ1853279Β1 hidrólise básica com NaOH a 2 M durante 30 minutos a 70°C. Cada amostra foi então lavada com tampão e o tampão de lavagem misturado com as soluções anteriores de NaOH. As amostras foram então misturadas com fluido de cintilação Quickszint 1 (numa proporção de 1:10) para a leitura final de radioatividade, depois a radioatividade foi determinada utilizando um analisador de cintilação Packard TR 2100.

Os resultados obtidos foram expressos como a percentagem de radioatividade inicial injetada. Dois dias depois das injeções intra-articulares, a % de radioatividade recuperada após hidrólise básica da cartilagem foi de 2% da inicialmente injetada, enquanto o valor caiu para 1% 14 dias após o tratamento.

Este resultado indica claramente que o derivado HYADD™ não permanece confinado ao fluido sinovial depois de ter sido injetado intra-articularmente, mas pode ser encontrado na superfície da cartilagem da articulação tão precocemente quanto dois dias depois, confirmando deste modo que o derivado de amida, objetivo da presente invenção, representa uma nova terapia para o tratamento de OA.

Análises In vitro:

Sinoviócitos OA de ovelha em cultura

Materiais, métodos e resultados obtidos a partir da experiência 20 ΕΡ1853279Β1 Células :

As membranas sinoviais utilizadas na experiência que se segue foram retiradas de animais tratados com HYADD™ e HA e dos respetivos controlos, como previamente descrito para experiência in vivo.

Estas foram primeiro fatiadas numa placa de Petri, lavadas e centrifugadas com solução de tampão fosfato (PBS) a 2 000 rpm a 20°C durante 10 minutos, ressuspensas depois em PBS contendo tripsina (0,2%) e EDTA (0,1%). O material digerido foi lavado e centrifugado com meio de cultura (DMEM) e depois ressuspenso em DMEM contendo soro de vitela fetal FCS (10%). As células assim obtidas foram recentrifugadas a 2 000 rpm durante 10 minutos e o sedimento foi recolhido com meio de cultura (DMEM/FCS) contendo 2 mg/mL de colagenase. Após 3 horas em incubação a 37°C, as células foram centrifugadas e semeadas em placas de Petri com DMEM contendo 10% de FCS. As células assim obtidas foram expandidas para a segunda passagem. O meio foi renovado em cada 2/3 dias e, quando as células atingem 90% de confluência, utilizadas para determinar a síntese de HA, incubando os sinoviócitos com alíquotas determinadas de 3H-acetato (Amersham Pharmacia Biotech). As células foram então tratadas como descrito por Ghosh P. et al., Proceedings Hyaluronan 2003 Congress, Ed. Matrix Biology Institute 2004 para a determinação final do 3H-acetato incorporado nas moléculas de HA sintetizadas in vitro pelos sinoviócitos. 21 ΕΡ1853279Β1

Resultados :

Os resultados obtidos mostram que o tratamento de articulações OA com HYADD™ protege os sinoviócitos da ação citotóxica das citoquinas pró-inflamatórias normalmente presentes nas articulações OA, favorecendo/mantendo inalterado o seu metabolismo celular, demonstrado pela sua elevada capacidade para a síntese de HA, como mostrado pelos dados experimentais na Figura 11, obtidos com sinoviócitos retirados de ovelhas OA tratados HYADD™ vs placebo.

Culturas de condrócitos Humanos OA

Materiais: 0 HYADD™ (hexadecilamida de ácido hialurónico com um PM de 500 000-730 000 D e um grau de amidação médio de 2%) diluído em tampão fosfato para uma concentração final de 3 mg/mL. Células:

Condrócitos humanos: as células foram obtidas por biópsia da cartilagem da articulação de doentes que sofreram cirurgia para substituições da articulação. Em resumo, as amostras foram picadas e tratadas com tripsina (0,25%), hialuronidase testicular e colagenase de tipo I. O material digerido foi então ressuspenso em meio de cultura (Ham's F12) contendo soro de vitela fetal (10%), glutamina, 4 mM, e penicilina/estreptomicina, 100 U. 22 ΕΡ1853279Β1

As células assim obtidas foram expandidas para a segunda passagem com alterações diárias do meio. A viabilidade celular foi testada por coloração com Azul Tripano.

Duração em tempo da proliferação celular

Para verificar qualquer toxicidade e/ou qualquer possível influência que HYADD™ possa ter na taxa de proliferação de condrócito, as células foram semeadas na presença de duas concentrações diferentes de HYADD™ (0,5 e 1,5 mg/mL de meio de cultura) durante um período de 3 a 9 dias. As experiências foram realizadas em triplicado. A viabilidade celular foi determinada pelo método MTT (Dezinot F. et al., J Immunol Methods, 1986, 22(89):271-277).

Resultados

Os resultados obtidos (Fig. 12) indicam que o tratamento com HYADD™ numa concentração de 1,5 mg/mL aumentou significativamente a viabilidade de condrócitos humanos em todas as preparações de teste tão precocemente como o 3o dia de tratamento. Além disso, após 9 dias de tratamento, pode ser visto um efeito proliferativo significativo do derivado de amida, para a concentração de 1,5 mg/mL e para o mais baixo de 0,5 mg/mL.

Os resultados do estudo com HYADD™ confirmam deste modo que o referido derivado de ácido hialurónico possui um marcado efeito proliferativo em culturas de condrócitos humanos de doentes com OA. 23 ΕΡ1853279Β1

Considerando os resultados obtidos in vivo e in vitro, pode dizer-se que: • Os derivados de amida de HA denominados HYADD™ (especialmente a hexadecilamida de HA) estimulam a proliferação de condrócitos, as células responsáveis pela síntese da matriz extracelular que, na OA, sofre um processo degenerativo contínuo associado com a morte de condrócitos, como previamente descrito em detalhe; • 0 derivado amida, objetivo da presente invenção, também provou ser capaz de estimular a síntese de HA pelos sinoviócitos, contribuindo deste modo para a normalização do processamento de HA (e o dos outros glicosaminoglicanos) no fluido sinovial, que é de outra forma gravemente dificultado nas articulações OA, como descrito antes; • quando testado in vivo, o derivado de amida que é objetivo da presente invenção provou ser capaz de proteger a membrana sinovial e a cartilagem da articulação das alterações típicas de OA, estabilizando o sinovia em parâmetros semelhantes, se não iguais, aos do controlo não OA; • a viscosidade final das amostras de fluido sinovial tratado foi superior à observada na OA, e o tempo de residência do derivado de amida na cavidade da articulação foi notoriamente mais longa do que a dos outros derivados e/ou HA não modificado. 24 ΕΡ1853279Β1 A absoluta ausência de toxicidade do derivado que é o objetivo da presente invenção, a proteção da degeneração de OA confere à cartilagem, proteção da membrana sinovial e normalização da viscosidade do fluido sinovial, associado com o seu considerável tempo de residência na cavidade da articulação, torna este derivado absolutamente novo e adequado para utilização: • como um novo tratamento para osteoartrose/osteoartrite, • como um substituto parcial/total para o fluido sinovial, no tratamento de articulações afetadas por osteoartrose e em casos de inflamação e/ou trauma com lesão da cartilagem e/ou sinovial resultante (associada com dor).

Por último, reivindica-se a sua utilização no tratamento de articulações afetadas por desgaste devido ao envelhecimento fisiológico da estrutura da articulação. 0 biomaterial que é o objeto da presente invenção pode ser preparado em várias formas (tais como géis, hidrogéis, pós, microesferas, nanoesferas), associado com substâncias farmacologicamente e/ou biologicamente ativas tais como esteróides, citoquinas, interferão, péptidos e ácidos nucleicos, factores de crescimento (tais como PDGF, IGF, TGF-β, FGF, GDF5, GDF6) e/ou factores de crescimento de diferenciação (e.g. BMP2 e BMP7), ou utilizado como um veiculo para células diferenciadas (e.g. condrócitos, 25 ΕΡ1853279Β1 fibroblastos, sinóvios, osteoblastos/osteócitos) , ou células não diferenciadas tais como as células do mesênquima.

Os derivados de amina de HA que são o objectivo da presente invenção podem ser formulados de todas as maneiras conhecidas de um perito no campo, em associação com estabilizadores, excipientes, conservantes e/ou qualquer outra molécula que um especialista possa pensar ser útil, para obter a melhor formulação farmacêutica possivel.

Reportam-se alguns exemplos para a preparação dos derivados de amina de HA (HYADD™) que são o objectivo da presente invenção:

Exemplo 1

Preparação da hexadecilamida de ácido hialurónico com um grau de amidação de 5%

Solubilizaram-se dois gramas (3,2 mM) de sal de tetrabutilamónio de HA (HA/TBA) em 100 mL de DMSO. A solução é insuflada com vapores de HC1 ou tratada com 60 mL de ácido metanossulfónico até atingir um valor de pH entre 4,5 e 5. Subsequentemente, 52 gramas (0,32 mM) de carbonildiimidazole foi adicionado à solução, que é agitada à temperatura ambiente durante 1 hora, depois são adicionados 780 mg (3,2 mM) de hexadecilamina. É deixado reagir durante 16-18 horas, após o qual são adicionados 5 mL de uma solução saturada de NaCl e o produto obtido é precipitado com 200 mL de acetona, filtrado e seco em vácuo. O grau de amidação final é determinado em HPLC após hidrólise básica de uma pequena quantidade do produto assim obtido. 26 ΕΡ1853279Β1

Exemplo 2 ico com um modificando adicionado,

Preparação da hexadecilamida de ácido hialurói grau de amidação de 2% O procedimento é o mesmo do Exemplo 1, apenas a quantidade de carbonildiimidazole a ser neste caso 30 mg.

Lisboa,11 de Julho de 2013 27

Claims

ΕΡ1853279Β1 REIVINDICAÇÕES 1. Hexadecilamidas de ácido hialurónico, caracterizadas por a hexadecilamida de ácido hialurónico ter um grau de amidação entre 0,1 e 5% para utilização no tratamento de articulações afetadas por osteoartrose, trauma, inflamação e/ou desgaste devido a envelhecimento da estrutura da articulação.
2. Hexadecilamidas de ácido hialurónico para utilização de acordo com a reivindicação 1, em que as referidas hexadecilamidas são substitutos parciais e/ou totais do fluido sinovial.
3. Hexadecilamidas de ácido hialurónico para utilização de acordo com qualquer das reivindicações anteriores em que nas referidas hexadecilamidas o grau médio de amidação é 2%.
4. Hexadecilamidas de ácido hialurónico para utilização de acordo com qualquer das reivindicações anteriores em que nas referidas hexadecilamidas o grau médio de amidação é de 5%.
5. Hexadecilamidas de ácido hialurónico para utilização de acordo com qualquer das reivindicações anteriores em que as referidas hexadecilamidas são solúveis em água.
6. Hexadecilamidas de ácido hialurónico para utilização de acordo com a reivindicação 5 em que nas referidas hexadecilamidas o peso molecular do ácido hialurónico varia entre 400 e 3xl06Da, em particular entre lx 105Da e lx 106 Da, e mais particularmente ainda entre 500 000 e 750 000 Da.
7. Hexadecilamidas de ácido hialurónico para utilização de acordo com qualquer das reivindicações anteriores em que as 1 ΕΡ1853279Β1 referidas hexadecilamidas são preparadas na forma de géis, hidrogéis, pós, microesferas, nanoesferas.
8. Biomateriais constituídos por hexadecilamidas de ácido hialurónico de acordo com a reivindicação 1 para utilização no tratamento de articulações afetadas por osteoartrose, trauma, inflamação e/ou desgaste devido a envelhecimento da estrutura da articulação.
9. Biomateriais constituídos por hexadecilamidas de ácido hialurónico para utilização de acordo com a reivindicação 8 em que nas referidas hexadecilamidas o grau médio de amidação é de 2%.
10. Biomateriais constituídos por hexadecilamidas de ácido hialurónico para utilização de acordo com as reivindicações 8-9 em que as referidas hexadecilamidas são solúveis em água.
11. Biomateriais constituídos por hexadecilamidas de ácido hialurónico para utilização de acordo com a reivindicação 10 em que nas referidas hexadecilamidas o peso molecular do ácido hialurónico varia entre 400 e 3xl06Da, em particular entre lx 105Da e lx 105Da, e mais particularmente ainda entre 500 000 e 750 000 Da.
12. Biomateriais constituídos por hexadecilamida de ácido hialurónico para utilização de acordo com as reivindicações 8-11 em que as referidas hexadecilamidas são preparadas na forma de géis, hidrogéis, pós, microesferas, nanoesferas.
13. Biomateriais constituídos por hexadecilamidas de ácido hialurónico para utilização de acordo com a reivindicação 12 em 2 ΕΡ1853279Β1 associação com substâncias farmacologicamente e/ou biologicamente ativo.
14. Biomateriais constituídos por hexadecilamidas de ácido hialurónico para utilização de acordo com a reivindicação 13 em associação com BMP2 e/ou BMP7.
15. Biomateriais constituídos por hexadecilamidas de ácido hialurónico para utilização de acordo com a reivindicação 12 em que os referidos derivados de hexadecilamida são um veiculo para células diferenciadas e/ou indiferenciadas.
16. Biomateriais constituídos por hexadecilamidas de ácido hialurónico para utilização de acordo com a reivindicação 15 em que as referidas hexadecilamidas são um veículo para condrócitos e/ou células do mesênquima.
17. Hexadecilamidas de ácido hialurónico para utilização de acordo com a reivindicação 1, em que as referidas hexadecilamidas estão em associação com substâncias farmacologicamente e/ou biologicamente ativas.
18. Hexadecilamidas de ácido hialurónico para utilização de acordo com a reivindicação 1, em que as referidas hexadecilamidas são um veículo para as células diferenciadas e/ou indiferenciadas
19. Hexadecilamidas de ácido hialurónico para utilização de acordo com a reivindicação 18 em que as referidas células diferenciadas e/ou indiferenciadas são condrócitos e/ou células do mesênquima. Lisboa,11 de Julho de 2013 3