KR20240046347A

KR20240046347A - Dna 분획물 및 콜라겐을 포함하는 복합 하이드로겔 및 이의 제조방법

Info

Publication number: KR20240046347A
Application number: KR1020220125001A
Authority: KR
Inventors: 박기수; 박하은; 박상철; 강준구; 양은경
Original assignee: 주식회사 현대바이오랜드
Priority date: 2022-09-30
Filing date: 2022-09-30
Publication date: 2024-04-09

Abstract

본 발명은 DNA 분획물과 콜라겐을 포함하는 조성물 및 이의 용도에 관한 것이다. 상기 조성물은 바람직하게는 DNA 분획물과 콜라겐의 혼합물로서 점탄성력, 복원능, 관절 통증/염증 억제능, 관절강내 세포 보호 기능 등을 가져 관절 윤활용 조성물, 관절염 개선용 조성물, 피부 주입용 조성물, 상처 치유용 조성물, 조직 보충용 조성물, 점성 보충용 조성물 등의 다양한 용도로 이용 가능하다.

Description

DNA 분획물 및 콜라겐을 포함하는 복합 하이드로겔 및 이의 제조방법{Composite hydrogel for comprising DNA fraction and collagen and manufacturing method thereof}

본 발명은 DNA 분획물과 콜라겐을 포함하는 복합 하이드로겔 조성물 및 이의 용도에 관한 것이다.

상기 조성물은 바람직하게는 DNA 분획물과 콜라겐의 혼합물로서, 점탄성력 및 복원능을 갖는 것을 특징으로 하며, 관절 윤활용 조성물, 관절염 개선용 조성물, 피부 주입용 조성물, 상처 치유용 조성물, 조직 보충용 조성물, 점성 보충용 조성물 등의 다양한 용도로 이용 가능하다.

콜라겐은 결합조직의 주성분이며, 뼈와 피부에 주로 있지만, 관절, 각 장기의 막, 머리카락 등 인체 모든 곳에 분포되어 있는 성분이다. 인체에서의 콜라겐의 비율을 약 25~30%로 높은 비중을 차지하고 있기 때문에 의료, 미용, 건강기능식품으로 사용되고 있다. 의료목적으로 사용되는 콜라겐은 생분해성을 가지며, 스폰지, 필름, membrane, gel의 다양한 제형의 형태로 인체 내 콜라겐의 결손부위에 보충목적, 조직의 재생목적, 약물 전달 지지체로 사용되고 있다.

일반적으로 DNA 분획물의 경우 인산, 4종류의 염기, 데옥시리보오스와 같은 생체 고분자들로 이루어져 있으며, 이들 성분이 혼합된 물질은 세포의 필수 구성성분들로서 이 분획물질을 상처부위 등에 주입함으로써 상처 부위의 치료 및 개선 등을 목적으로 하는 의약품이나 세포활성과 관련된 주름 개선 등을 목적으로 하는 화장품 등 여러 용도로 사용되고 있다. 그러나 의료, 미용 목적으로 많이 사용되고 있는 제품 중, 콜라겐과 DNA 분획물의 혼합 제형을 가지는 제품은 없는 것으로 알려져 있다.

관절 (articulation)은 뼈와 뼈가 연결되는 부위로, 관절을 구성하는 두 뼈가 마주하는 면에는 관절 연골이라고 불리는 유리 연골의 얇은 층이 있다. 관절 주위는 골막의 연속인 결합조직성 막으로 둘러 싸여져 있고 이것을 관절낭이라고 하며, 그 내강을 관절강 (articular cavity)이라고 한다. 관절낭의 내면에는 활막이라는 얇은 막이 있으며 끊임없이 소량의 활액을 관절강 내에 분비하여 관절 운동을 부드럽게 한다. 이러한 관절에 문제가 생기면 관절 질환이 나타나는데, 이 중 가장 유병률이 높은 질환이 골관절염이다. 골관절염이 주로 침범되는 부위는 손가락, 무릎, 고관절 및 요추이며 침범 관절에 따라 조금씩 다르지만 통증과 운동 제한이 공통적인 증상이다. 골관절염의 치료 목표는 통증을 완화시키며, 관절의 운동성을 유지하고 개선함으로써 장애를 최소화하는 것이다. 골관절염은 만성질환으로, 기대수명의 증가와 함께 장기간의 치료를 필요로 한다. 치료의 선택은 크게 비약물적 보존적 치료, 약물요법 및 수술적 치료로 크게 나눌 수 있고, 치료 계획은 증상의 정도 및 기간, 방사선학적 소견, 환자의 나이 및 동반질환, 생활양식 및 사회경제적 수준, 발병 전 활동도 등에 따라 개별적으로 수립되어야 한다. 골관절염은 다른 관절 질환들과는 다르게 관절강 내 약물 투여가 가능한 질환이며, 골관절염 치료를 위해 히알루론산 (hyaluronic acid, HA)의 관절강 내 투여가 여러 나라에서 승인되어 사용되고 있다. 그러나 히알루론산 자체는 관절 연골의 재생 등까지 영향을 주는 것까지는 확인되지 않아, 진통 효과와 함께 골관절 내의 연골 등의 재생 기능까지 있는 다양한 물질의 개발이 필요하다.

이에 본 발명자들은 DNA 분획물과 콜라겐이 갖는 다양한 생리활성을 연구하던 중, 상기 다양한 콜라겐 제형방법 중 관절강 주사로 보충을 통해 골관절염의 진행을 지연하고, 여기에 DNA 분획물이 갖는 항염 및 윤활효과를 부가함으로써 이상적인 관절염 주사제를 개발하게 되었다.

대한민국 등록특허 제10-1916193호 (발명의 명칭 : 핵산 및 키토산을 포함하는 관절강 주사용 조성물, 출원인 : 주식회사 파마리서치프로덕트, 등록일 : 2018년11월01일) 대한민국 공개특허 제10-2018-0065113호 (발명의 명칭 : 핵산 추출물을 이용한 식품 조성물, 출원인 : 주식회사아이지바이오, 공개일 : 2018년06월18일)

본 발명의 목적은 점탄성력, 복원능을 가져 관절염 개선용 조성물, 피부 주입용 필러, 상처 치유용 조성물, 조직 보충용 조성물, 점성 보충용 조성물 등의 다양한 용도로 이용 가능한 DNA 분획물과 콜라겐의 혼합물을 포함하는 조성물을 제공하는 데에 있다.

본 발명은 DNA 분획물과 콜라겐을 포함하는 조성물의 제조방법에 관한 것이다.

상기 제조방법은, (제1단계) 포유동물의 피부 분쇄물을 에탄올 수용액에 침지한 후, 피부 분쇄물을 정제수로 옮겨 펩신을 첨가한 뒤 교반하고, NaCl 수용액을 가하여 콜라겐을 응집하고, 응집된 콜라겐을 정제수에 용해하여 콜라겐 추출 액상을 얻는 단계;

(제2단계) 상기 콜라겐 추출 액상을 동결건조하여 스펀지화하고, 스펀지화된 콜라겐에 산성 용액을 첨가하여 콜라겐 용액을 제조하고,

여분의 콜라겐 추출 액상에 Na₂HPO₄ 수용액을 첨가하여 콜라겐을 슬러리 상태로 섬유화하고, 원심분리 후 농축하고 정제수에 희석하여 콜라겐 섬유화 용액을 얻고,

상기 콜라겐 용액과 콜라겐 섬유화 용액을 혼합하여 콜라겐 복합 용액을 제조하는 단계;

(제3단계) DNA 분획물 수용액에 제2단계의 콜라겐 복합 용액을 혼합하는 단계;

를 포함할 수 있다.

상기 제1단계에서 보다 바람직하게는 세척된 포유동물의 피부 분쇄물을 50~90 %(v/v) 에탄올 수용액에 12~48 시간 동안 침지한 후, 피부 분쇄물을 정제수로 옮겨 펩신을 첨가하고 72~96 시간 동안 교반한 뒤, 1~3 N NaCl 수용액을 가하여 콜라겐을 응집한 후 응집된 콜라겐을 정제수에 용해하여 콜라겐을 추출된 액상을 얻는 과정을 거칠 수 있다.

제1단계에서 상기 포유동물은 바람직하게는 돼지 또는 소를 사용하는 것이 좋다. 상기 피부는 털과 지방층이 제거된 상태인 것을 사용할 수 있다.

상기 제1단계에서 펩신의 농도는 0.05~0.2 wt%인 것이 적절하며, 정제수와 동일 중량 내지 2배 이하의 중량으로 혼합하는 것이 바람직하다.

상기 제2단계의 산성 용액은 pH 2.8 ~ 2.9이며, 염산 수용액일 수 있다. 상기 산성 용액은 제균 여과된 정제수에 희석된 것을 사용할 수 있다.

상기 제2단계에서 콜라겐 용액의 농도는 0.5~5.2 wt%인 것이 바람직하다.

상기 제2단계에서 Na₂HPO₄ 수용액의 농도는 10~1000 mM일 수 있다.

상기 제2단계에서 콜라겐 추출 액상에 Na₂HPO₄ 수용액을 첨가하여 콜라겐을 슬러리 상태로 섬유화할 때, 30~37 ℃에서 4~30 시간 반응시킬 수 있다.

상기 제2단계에서 콜라겐 섬유화 용액의 농도는 1.3~6.5 wt%일 수 있다. 콜라겐 섬유화 용액의 희석용 정제수는 제균 여과된 것을 사용하는 것이 바람직하다.

상기 제3단계에서 DNA 분획물의 최종 농도가 0.5~3.0 wt% 일 수 있다.

상기 제3단계에서 콜라겐 복합 용액의 최종 농도가 0.5~3.0 wt%가 되도록 첨가할 수 있다.

상기 DNA 분획물과 콜라겐 복합 용액의 각각의 농도는 이들이 혼합될 때 안정적인 제형을 유지하는데 필요한 최적의 농도이며, DNA 분획물이나 콜라겐 복합 용액의 농도가 0.5wt% 미만이거나 3.0 wt%를 초과할 경우 일정 시간 이후 층분리가 일어나거나 혼합 자체가 되지 않아 관절용 조성물로 사용하기에 적합하지 않다.

또한 이 때, 콜라겐 용액과 콜라겐 섬유화 용액을 혼합할 때도 콜라겐 용액의 농도는 0.5~5.2 wt%, 콜라겐 섬유화 용액의 농도는 1.3~6.5 wt%의 범위를 벗어날 경우, 콜라겐 복합 용액 0.5~3.0 wt%를 제조하기에 적합하지 않다.

상기 DNA 분획물은 폴리뉴클레오티드 (Polynucleotide, PN) 및 폴리데옥시리보뉴클레오티드 (Polydeoxyrbonucleotide, PDRN)로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. DNA 분획물은 분자량 1,600 kDa 내지 2,500 kDa인 것을 사용할 수 있다. 이 때, 분자량 1,600 kDa 미만인 것을 사용할 경우, 콜라겐 복합 용액과의 혼합 시 점성이 낮아 목적하는 완충, 윤활, 통증 완화 등의 용도로 사용하기에 적합하지 않으며, 분자량 2,500 kDa을 초과하는 것의 경우, 점성이 너무 높아서 자체적으로 응집되거나 콜라겐 복합 용액과의 혼합 시 잘 혼합되지 않을 수 있어 역시 바람직하지 않을 수 있다.

상기 조성물은 관절 윤활 및 항염용 조성물일 수 있다.

또한 본 발명은 관절의 통증 및 염증 완화에 도움을 줄 수 있는 조성물에 관한 것일 수 있다. 바람직하게는 상기 조성물은 관절강 내 주사용 조성물 일 수 있다.

상기 조성물은 상처치료, 조직의 결손부위 보충, 재생목적으로 이용하며, 더 나아가 피부미용 분야에서도 이용 가능하다. 또한 관절 윤활용 조성물, 관절염 개선용 조성물, 피부 주입용 조성물, 상처 치유용 조성물, 조직 보충용 조성물, 점성 보충용 조성물로도 적용 가능하다.

이하, 본 발명을 상세하게 설명한다.

상기 조성물은 수용성 고분자를 추가성분으로 함유할 수 있다. 수용성 고분자는 히알루론산 (hyaluronic acid), 콘드로이틴황산 (chondroitin sulfate), 글리코겐 (glycogen), 덱스트린 (dextrin), 덱스트란 (dextran), 덱스트란 황산 (dextran sulfate), 히드록시프로필메틸셀룰로스 (hydroxy-propyl methylcellulose), 알긴산 (alginic acid), 키틴 (chitin), 풀루란 (pullulan), 키토산 (chitosan), 젤라틴 (gelatin) 및 이들의 가수분해물, 폴리비닐알코올 (polyvinyl alcohol), 폴리비닐피롤리돈 (polyvinyl pyrrolidone), 폴리아크릴산 (polyacrylic acid) 및 카르복시비닐 중합체 (carboxylvinylpolymer)로 이루어진 군 중에서 선택되는 1종 이상일 수 있다.

상기 조성물은 용액, 크림, 겔, 스펀지, 파우더 형태의 제형일 수 있다.

본 발명에서 사용하는 콜라겐은 생체 유래 콜라겐으로 소, 돼지, 생선 등에서 유래되는 것일 수 있다.

상기 약학 조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 상기 약학 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈 (lactose), 덱스트로즈 (dextrose), 수크로스 (sucrose), 솔비톨 (sorbitol), 만니톨 (mannitol), 자일리톨 (xylitol), 에리스리톨 (erythritol), 말티톨 (maltitol), 전분 (starch), 아카시아 고무 (acacia gum), 알지네이트 (alginate), 젤라틴 (gelatin), 칼슘 포스페이트 (calcium phosphate), 칼슘 실리케이트 (calcium silicate), 셀룰로즈 (cellulose), 메틸 셀룰로즈 (methyl cellulose), 미정질 셀룰로스 (microcrystalline cellulose), 폴리비닐 피롤리돈 (polyvinyl pyrrolidone), 물 (water), 메틸히드록시벤조에이트 (methylhydroxybenzoate), 프로필히드록시벤조에이트 (propylhydroxybenzoate), 탈크 (talc), 마그네슘 스테아레이트 (magnesium stearate) 및 광물유 (mineral oil)를 들 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 본 발명의 조성물에 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면, 전분 (starch), 탄산칼슘 (calcium carbonate), 수크로스 (sucrose) 또는 락토오스 (lactose), 젤라틴 (gelatin) 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트 (magnesium stearate), 탈크 (talc) 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물 (water), 리퀴드 파라핀 (liquid paraffin) 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜 (propylene glycol), 폴리에틸렌글리콜 (polyethylene glycol), 올리브 오일 (olive oil)과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔 (witepsol), 마크로골 (macrogol), 트윈 (tween) 61, 카카오지 (cacao butter), 라우린지 (laurin fat), 글리세로제라틴 (glycerogelatin) 등이 사용될 수 있다.

본 발명의 약학 조성물의 투여량은 치료받을 대상의 연령, 성별, 체중과, 치료할 특정 질환 또는 병리 상태, 질환 또는 병리 상태의 심각도, 투여경로 및 처방자의 판단에 따라 달라질 것이다. 이러한 인자에 기초한 투여량 결정은 당업자의 수준 내에 있으며, 일반적으로 투여량은 0.01 ㎎/㎏/일 내지 대략 2000 ㎎/㎏/일의 범위이다. 더 바람직한 투여량은 1 ㎎/㎏/일 내지 500 ㎎/㎏/일이다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수도 있다. 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

본 발명의 약학 조성물은 쥐, 가축, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁내 경막 또는 뇌혈관 내 주사에 의해 투여될 수 있다.

본 발명은 DNA 분획물과 콜라겐을 포함하는 조성물 및 이의 용도에 관한 것이다. 상기 조성물은 바람직하게는 DNA 분획물(1,600 kDa 내지 2,500 kDa)과 콜라겐 용액의 혼합물로서 세포독성이 미미하고 점탄성력, 복원능, 관절 통증/염증 억제능, 관절강내 세포 보호 기능 등을 가져 관절 윤활용 조성물, 관절염 개선용 조성물, 피부 주입용 조성물, 상처 치유용 조성물, 조직 보충용 조성물, 점성 보충용 조성물 등의 다양한 용도로 이용 가능하다.

도 1은 본 발명의 제조예 3의 혼합용액의 상태를 설명하는 그림이다.
도 2는 본 발명의 비교예 1, 비교예 2, 비교예 3, 제조예 3의 시료 동결건조물에 대한 FT-IR 분석결과 그래프를 나타내며, 각 그래프 피크는 다음을 나타낸다: (A) Amide A and OH, (B) Amide B, (C) Amide Ⅰ, (D) Amide Ⅱ, (E) Amide Ⅲ, (F) Carbohydrater
도 3은 본 발명의 제조예 3, 비교예 1, 비교예 3의 성상을 나타낸 그림이다.

이하 본 발명의 바람직한 실시예를 상세히 설명하기로 한다. 그러나, 본 발명은 여기서 설명되는 실시예에 한정되지 않고 다른 형태로 구체화될 수도 있다. 오히려, 여기서 소개되는 내용이 철저하고 완전해지도록, 당업자에게 본 발명의 사상을 충분히 전달하기 위해 제공하는 것이다.

<제조예 1: 콜라겐 혼합 용액의 제조>

제조예 1-1: 콜라겐 용액 제조

털과 지방층이 제거된 돼지 피부를 70 %(v/v) 에탄올 수용액에 24시간 침지한 후 정제수를 이용하여 세척한다. 세척된 돼지피부를 0.1 wt% 펩신수용액으로 처리하고 여과하여 콜라겐을 얻는다. 상기 콜라겐 추출 시 바이러스도 불활화된다. 염석 공정 (2 M NaCl 수용액을 동일 부피로 첨가함)을 이용하여 콜라겐을 응집하고 정제수에 용해하고 0.5 wt% 콜라겐 용액 (pepsin soluble collagen 용액; PSC 용액)을 제조하고 0.2 μm 필터로 여과 (filter)하였다. 이 때, 필터 과정은 고농도의 콜라겐 용액을 제조 후 먼저 수행하고, 이를 0.5 wt%로 희석할 수도 있다.

제조예 1-2: 섬유화 콜라겐 용액

정제수에 Na₂HPO₄ 66 mM (9.369 g/L)를 녹여 pH를 7.3~7.45로 적정한 용액을 제조하고, 이를 0.2 μm 필터를 통해 제균 여과하였다. 이 용액을 제조예 1-1 용액과 1:1 (w/w) 중량비로 혼합하여 37 ℃에서 30 시간 반응시켜 섬유화 콜라겐 (collagen slurry)을 제조하였다.

섬유화된 콜라겐을 원심 분리 및 회수하여 0.2 μm 필터로 제균 여과된 정제수로 희석한다. 희석된 섬유화 콜라겐 용액을 드라이오븐을 이용하여 건조하여 용질 (콜라겐)의 무게를 확인한다. 이 용액을 최종 농도가 5.5 wt%가 되도록 제균 여과된 희석액 (20 mM dibasic phosphate buffer, pH 7.3 ~ pH 7.4)으로 희석하여 섬유화 콜라겐 용액을 제조하였다.

제조예 1-3: 비섬유화 콜라겐 용액

제조예 1-1 의 0.5 wt% 콜라겐 용액을 동결 건조를 이용하여 스펀지로 제조한 후 콜라겐 스펀지를 제균여과된 정제수로 제조한 pH 2.85~2.9의 염산 수용액에 녹인다. 제조된 용액을 드라이오븐을 이용하여 건조하여 용질 (콜라겐)의 무게를 확인하고, 이 용액을 최종 농도 1.57 w%의 농도가 되도록 pH 2.85~2.9의 염산 수용액에 희석하여 희석하여 비섬유화 콜라겐 용액을 제조하였다.

제조예 1-4: 콜라겐 복합 용액 (섬유화/비섬유화 용액 혼합)

제조예 1-2의 5.5 wt% 섬유화 콜라겐 용액 3,000 g과 제조예 1-3의 1.57 wt% 비섬유화 콜라겐 용액 1,853 g을 섞어 호모게나이저로 균질화하여 pH 6.0~7.0 사이의 총 농도가 3 wt%인 콜라겐 복합 용액을 제조하였다.

<제조예 2: PN 용액 제조>

연어에서 추출된 DNA 분획물인 Polynucleotide (PN) (HTL 社, France, 분자량 1,600 ~ 2,500 kDa, Medical device grade)을 이용하였다.

희석액 (40 mM Dibasic phosphate buffer, pH 7.3~7.4)을 제조하여 0.2 μm 필터로 제균 여과하였다. 희석액에 멸균된 PN powder를 40 ℃에서 12시간 이상 녹인 후, 이 용액을 UV detector 를 260 nm 파장에서 PN 함량을 측정 후 최종 농도가 2 wt%의 농도가 되도록 희석액을 첨가하였다.

<제조예 3: 최종 혼합 용액 제조>

제조예 1-4의 콜라겐 복합 혼합용액과 제조예 2의 PN용액을 1:1 (w/w) 혼합비로 섞어 호모게나이저로 균질화하고, 25 ℃에서 72시간 동안 교반하여 최종혼합용액을 제조하였다.

<비교예 1: 콜라겐 용액 (3%)>

정제수에 Na₂HPO₄ 66 mM (9.369 g/L)를 녹여 pH를 7.3~7.45로 적정한 용액을 제조하고, 이를 0.2 μm 필터를 통해 제균 여과하였다. 이 용액을 상기 0.5 wt% 콜라겐 용액과 1:1 (w/w) 중량비로 혼합하여 37 ℃에서 30 시간 반응시켜 섬유화 콜라겐 (collagen slurry)을 제조하였다.

섬유화된 콜라겐을 원심 분리 및 회수하여 0.2 μm 필터로 제균 여과된 정제수로 희석한다. 희석된 섬유화 콜라겐 용액을 드라이오븐을 이용하여 건조하여 용질 (콜라겐)의 무게를 확인한다. 이 용액을 최종 농도가 3.0 wt%가 되도록 제균 여과된 희석액 (20 mM dibasic phosphate buffer, pH 7.3 ~ pH 7.4)으로 희석하여 섬유화 콜라겐 용액을 제조하였다.

즉, 제조예 1-2와 같이 섬유화 콜라겐 용액을 제조하되, 최종 농도만 3.0 wt%가 되게 하는 것을 비교예 1이라 하였다.

<비교예 2: 가교 콜라겐 파우더와 PN의 혼합용액>

제조예 1-2의 섬유화 콜라겐 용액을 동결 건조를 이용하여 스펀지로 제조하여 진공오븐을 이용하여 105 ℃에서 48 시간 동안 진공 가열하여 가교하는 DHT (dehydrothermal) 과정을 수행한 후 후 동결 분쇄기를 이용하여 콜라겐 파우더 (CP; Cross-linked collagen powder)를 회수한다. 가교 콜라겐 파우더 (CP) 1.5 g을 제조예 2 PN 용액 100 g과 섞어 호모게나이저로 용액 내에 고르게 분산시킨다.

<비교예 3: PN 용액 (2 wt%)>

연어에서 추출된 DNA 분획물인 Polynucleotide (PN) (HTL 社, France, 분자량 2,280 kDa, Medical device grade)을 이용하였다. (이 외 추가적으로 수행한 실험에서 분자량 1,990 / 2,080 / 1,880 kDa인 PN을 각각 사용하여 약 1,600~2,500 kDa 내 범위에서 안정적임을 확인함).

희석액 (20 mM Dibasic phosphate buffer, pH 7.3 ~ 7.4)을 제조하여 0.2 μm 필터로 제균 여과하였다. 희석액에 멸균된 PN powder를 40 ℃에서 12 시간 이상 녹인 후, 이용액을 UV detector를 260 nm 파장에서 PN 함량을 측정 후 최종 농도가 2 wt%의 농도가 되도록 희석액을 첨가하였다.

즉, 제조예 2와 PN 농도는 2 wt%로 같으나 체내에 적용되는 조성을 고려하여 buffer 농도를 2배 희석되게 하는 것을 비교예 3이라 하였다 (제조예 2에 40 mM의 buffer 농도는 제조예 3의 제조 과정을 통해 20 mM로 희석된다).

<실험예 1: 제형 적합성 확인>

콜라겐과 PN의 균일한 혼합을 위하여 콜라겐의 상태에 따라 각각의 제조예 2 PN 용액과 혼합한 최종 제형을 만들어 비교한 결과를 표 1에 나타내었다. 제형 1 내지 3은 콜라겐용액과 PN용액을 1:1의 중량비로 혼합하였다.

구성	혼합 조건	콜라겐과 PN의 혼합 후 상태	제형화 여부
제형예 1	제조예 2 (PN) + 제조예 1-2 (섬유화 콜라겐 용액)	층분리 발생	x
제형예 2	제조예 2 (PN) + 제조예 1-3 (비섬유화 콜라겐 용액)	불균일한 혼합	x
제형예 3 (제조예 3)	제조예 2 (PN) + 제조예 1-4 (콜라겐 혼합 (섬유화/비섬유화) 용액)	균일한 혼합	o

제형예 1에서, PN을 섬유화 콜라겐과 혼합 시 층분리가 발생하였고, 제형예 2에서는 비섬유화 콜라겐 용액과 혼합하여 섬유화 진행 시 콜라겐의 섬유화가 진행되지 않고 균일한 혼합이 이루어지지 않았다.

반면, 제형예 3 (제조예 3과 동일)에서는 섬유화 콜라겐과 비섬유화 콜라겐이 혼합된 용액 사용 시 PN 용액과의 균일한 혼합이 가능했다. 즉, 제형예 1에서처럼 섬유화 콜라겐 만으로는 PN 혼합시 층분리가 일어나는 반면, 제형예 3 (제조예 3과 동일)에서 섬유화 콜라겐에 비섬유화 콜라겐을 넣고 섬유화함으로써 PN 분자가 콜라겐 섬유 다발 사이에 트랩되면서 층분리가 일어나지 않고 균일한 혼합이 가능해짐을 보여준다.

콜라겐과 PN의 혼합 상태 (제조예 3)는 도 1의 모식도에 나타난 바와 같다.

한편, 상기 제조예 3의 상태는 실험예 3 내지 4를 통해 확인할 수 있는데, 이 결과에서 콜라겐과 PN이 화학적 결합이나 이온결합 상태가 아님을 설명할 수 있다.

이는 화학적 결합이나 이온결합이 아니기 때문에 콜라겐과 PN의 결합에 의한 부산물이 없어 이러한 특정 결합으로 위험 요소가 없음을 나타내고 인체에 부작용을 일으킬 수 있는 부산물이 생성되지 않았음을 입증한다.

<실험예 2: 농도별 성상확인>

제조예 3의 농도별 제형을 확인하기 위해 농도 별로 혼합 후 상태를 육안 관찰을 통해 비교하였다.

표 2의 각 농도는 PN과 콜라겐 복합 용액이 혼합된 상태에서의 결과를 나타낸다. 콜라겐 복합 용액은 섬유화 콜라겐 용액 1.3~6.5%, 비섬유화 콜라겐 용액 0.5~5.2%을 이용하여 제조하였다.

콜라겐 (섬유화/비섬유화) (wt%)	PN (wt%)	혼합 상태
0.25	0.25	불균일
	0.5
	1
	2
	3
	4
0.5	0.25	불균일
	0.5	균일
	1
	2
	3
	4	불균일
1	0.25	불균일
	0.5	균일
	1
	2
	3
	4	불균일
1.5	0.25	불균일
	0.5	균일
	1
	2
	3
	4	불균일
2	0.25	불균일
	0.5	균일
	1
	2
	3
	4	불균일
3	0.25	불균일
	0.5	균일
	1
	2
	3	불균일
	4	불균일
4	0.25	불균일
	0.5
	1
	2
	3
	4

표 2의 결과와 같이, 콜라겐과 PN을 혼합하였을 때 제형 상태를 확인한 바, 총 혼합액 기준으로 콜라겐 약 0.5 ~ 3.0 wt%이면서 PN 약 0.5 ~ 3.0 wt% 일 경우 가장 균일한 혼합 상태를 나타내었다.

<실험예 3: FT-IR 분석>

제조예 3의 제형에서, 콜라겐과 PN의 화학적 결합 형태가 존재하는지를 확인하기 위해 비교예 1, 비교예 2, 비교예 3을 대조군으로 하여 FT-IR 분석을 진행하였다.

FT-IR (Fourier transform IR spectroscopy)의 분석조건

(1) 모델명: Thermo Scientific (Nicolet iS10)

(2) 측정영역: 7,800 - 350 cm^-1(KBr), 11,000 - 375 cm^-1(XT-KBr)

(3) Resolution: 0.5 cm^-1

(4) S/N Ratio = 35,000:1 (Peak to Peak)

(5) Ordinate Linearity (ASTM E1421): Less than 0.1 %T

각 시료는 동결 건조하여 sheet 형태로 제조하여 분석을 진행하였으며, FT-IR 분석결과는 도 2에 나타내었다.

도 2와 같이 주요 peak (amide A, B, Ⅰ, Ⅱ, Ⅲ)는 유사하게 형태를 나타냈다. 또한, 새로운 peak는 생성되지 않았으며, 투과도의 차이만 있으므로 콜라겐과 PN의 화학적 결합은 없는 것으로 확인하였다.

<실험예 4: 제타포텐셜 측정평가>

상기 제조된 제조예 3의 콜라겐과 PN의 이온결합 형태가 존재하는지를 확인하기 위해 제조예 1-2의 섬유화 콜라겐 용액과 제조예 1-4의 콜라겐 혼합용액, 비교예 3의 PN 용액, 제조예 2의 PN 용액의 buffer 유무에 따라 각각 샘플을 준비하여 제타포텐셜 장비를 이용하여 분석을 진행하였다.

제타포텐셜의 분석장비

(1) 시험장비: HORIBA (SZ100)

(2) 측정범위: -200 - +200 mV

(3) 전압 세기: 2.8 - 3.5 V

위의 분석 장비로 분석한 결과를 표 3에 나타내었다.

	Buffer 유무	결과	상대적 Charge⁺⁾
제조예 3	X (정제수 사용)	-76.2	(-)(-)
제조예 3	O	-32.0	(-)
제조예 1-4 (콜라겐 복합 용액)	X	6	(+)
제조예 1-2 (섬유화 콜라겐 용액)	X	5	(+)
제조예 2 (PN 용액)	X (정제수 사용)	-88.9	(-)(-)
제조예 2 (PN 용액)	O	-18.7	(-)
비교예 3	O	-29.5	(-)
+) Buffer 유무로 비교 시 charge 값의 상대적인 수치 값, (-)(-) : - 70mV 이상 (-) : - 42 mV 이하

표 3 에 제시된 결과와 같이 제조예 3과 제조예 2의 PN 용액은 buffer의 포함 여부에 따라 값의 차이가 있으며, buffer 농도 (비교에 3은 제조예 2의 1/2배의 buffer 농도)에 따라서도 PN 용액의 표면 charge 값이 차이가 발생하였다. 이는 buffer의 Na⁺ 이온이 PN 분자와 이온 결합하여 표면 charge (-)를 상쇄시킨 것으로 판단되며, 제조예 3의 표면 charge 감소효과는 콜라겐과 PN의 이온결합이 아닌 buffer에 의한 것으로 판단된다.

<실험예 5: 점탄성 (Rheometer) 측정평가>

제조예 3 및 비교예 1, 비교예 2, 비교예 3의 유동학적 특성 규명을 위하여 레오미터 (rheometer)를 사용하여 분석하였다.

회전형 레오미터(Rotational Rheometer)의 분석조건

(1) 시험장비: Anton-Paar (MCR 302)

(2) Frequency: 1.0 Hz

(3) Temperature: 22 ℃

(4) Strain: 0.1 %

위의 분석 조건으로 분석한 결과인 저장 탄성율 (storage modulus), 점도 (viscosity)을 표 4에 나타내었다.

	저장탄성율 (storage modulus)	점도 (viscosity)
비교예 1	59 Pa	62 Pa·s
비교예 2	104 Pa	103 Pa·s
비교예 3	128 Pa	123 Pa·s
제조예 3	117 Pa	115 Pa·s

표 4에 나타난 바와 같이 제조예 3과 비교예 3, 비교예 2는 유사한 저장 탄성율과 점도를 갖는 것으로 확인되며, 비교예 1은 비교적 낮은 수치를 나타내었다.

즉, PN-콜라겐 혼합제형인 제조예 3과 비교예 1인 콜라겐을 비교할 때, 본 발명에서 제조한 PN-콜라겐 혼합제형이 콜라겐보다는 점탄성이 현저하게 우위에 있는 물질임을 파악할 수 있다.

<실험예 6: 세포독성 평가>

제조예 3 및 비교예 1, 비교예 2, 비교예 3 의 안전성 평가를 위해 세포독성 평가를 진행하였다.

(1) 시료용출 조건

각 시료를 4 g/ 20 ml (10 % FBS, 1 % antibiotics MEM 배지)의 조건으로 37 ℃ 24 시간 용출

(2) 세포배양

6 well plate에 2 x 10⁵ Cells/well 비율로, 37 ℃ 24 시간 배양

(3) 시험물질 처리

24 시간 배양한 시험물질을 원심분리 (3,000 rpm, 15 min) 후 plate의 배지를 용출배지로 치환 후 37 ℃ 48 시간 배양 후 육안관찰

(4) 정량분석 (Cell counting)

트립신 용액을 처리하여 3분간 37 ℃에서 incubation한 후 배지를 처리하여 파이펫팅 해준다. 파이펫팅한 용액을 혈구계산기 (hematocyometer)에 loading하여 cell 수를 counting 해준다. 각 시험군의 세포생존율 (viability)는 아래의 식을 통해 계산한다.

(세포수_시험군/세포수_{음성대조군)}x 100 = 세포생존율(%)

각 시료의 세포생존율은 표 5에 나타내었다.

	세포생존율 (%)
음성대조군	100.0
제조예 3	96.6
비교예 1	93.0
비교예 2	98.9
비교예 3	65.0

표 5에 나타난 바와 같이, 제조예 3과 비교예 1, 비교예 2는 음성대조군과 유사한 수치를 보였지만, 비교예 3은 70 % 미만 (ISO 10993-5 세포독성 안전성 기준 → Cell viability 70 % 이상)의 수치를 보였다. 이는 PN만 고농도로 단독으로 사용되었을 때는 세포 독성을 나타내어 체내 주사제로 사용하기에 바람직하지 않은 것으로 보여지나, 콜라겐이 혼합됨으로 인해 독성이 현저하게 줄어듦으로써 생물학적 안전성 측면에서 유리함을 보여준다.

<실험예 7: 삼투압 분석 시험>

제조예 3 및 비교예 1, 비교예 3의 체내 (활액 내) 주입 시 삼투압을 확인 하기 위해 삼투압 분석 시험을 진행하였다.

삼투압 분석조건

(1) 분석장비: 증기 압력식 삼투압측정기 (Vapor 5600)

2) 표준용액 100, 280, 1,000 mmol/kg 이용 (calibration curve)

3) 시료 당 3번 측정

위의 분석 조건으로 분석한 결과인 삼투압 수치는 표 6에 나타내었다.

	측정 결과 (mmol/kg)
제조예 3	393.0 ± 5.0
비교예 3	315.3 ± 5.8
비교예 1	347.0 ± 7.9

표 6에서 나타난 바와 같이, 제조예 3, 비교예 3, 비교예 1의 삼투압 수치는 모두 300 ~ 400 mmol/kg 내의 수치 값을 가지며, 이는 인체의 활액 내 삼투압 수치인 285 ~ 422 mmol/kg 내에 해당됨으로 활액 내 사용이 용이함을 확인하였다.

<실험예 8: 압출강도 측정 시험>

제조예 3의 주사능을 확인 하기 위하여 비교예 1, 비교예 3을 대조군으로 압출강도 측정 시험을 진행하였다.

압출강도 측정 조건

1) 22G 니들을 통끝에 체결 후, 외통을 시험 지그에 고정

2) 밀대에 100 mm/min의 속도로 3 cm까지 압축 하중을 가하여 시험액을 유출

3) 최대 하중 (Maximum force, N) 측정

측정 결과는 표 7에 나타내었다.

	측정 값 (N)
제조예 3	7.5
비교예 3	5.5
비교예 1	9.0

표 7에서 나타난 바와 같이, 제조예 3의 경우 PN 단독 제형인 비교예 3과 섬유화콜라겐 용액(콜라겐 단독 제형)의 결과 값의 중간 정도의 수치를 나타내나 격차가 크지 않아 PN 및 콜라겐 단독 제형과 유사한 주사능을 가지고 있다는 것을 확인하였다.

<실험예 9: 성상 비교>

PN-콜라겐 혼합 제형인 제조예 3의 성상을 확인하기 위하여 PN 단독 제형인 비교예 3과 콜라겐 단독 제형인 비교예 1을 대조군으로 설정하여 시료의 성상을 육안 관찰하였다. 각 시료의 성상을 도 3에 나타내었다.

도 3에서 보여지는 것과 같이 비교예 1에 비해서 비교예 3과 제조예 3의 응집력 및 탄성이 우수한 것을 확인 하였다. 따라서 본 발명에서 제조한 조성물은 콜라겐 단독 제형 대비 복원능이 우수한 것을 확인하였다.

<실험예 10: 동물실험 (관절 통증 경감 효과 확인)>

제조예 3, 비교예 2, 비교예 3의 관절 주입용 조성물으로서의 효능을 평가하기 위해 동물실험을 진행하였다.

시험군은 정상군, 음성대조군(손상처치군), 손상처치 후 제조예 3, 손상처치 후 비교예 2, 손상처치후 비교예 3을 투입한 군 포함하여 총 4군으로 군당 6 마리씩 구성되었다.

골관절염을 유발하기 위하여 MIA (Monosodium iodoacetate)는 3 mg/head의 용량으로 정상군을 제외한 모든 군에 오른쪽 다리 관절강에 투여하였고 정상군은 부형제인 생리식염주사액을 동량 투여하였다.

제조예 3, 비교예 2, 비교예 3은 각각 50 μL/head (건조 중량으로 각각 제조예 3: 30 mg/mL, 비교예 2: 35 mg/mL, 비교예 3: 20 mg/mL) 의 용량으로 MIA 투여 3일 후에 관절강에 단회 투여하였고, 정상군 및 음성대조군은 부형제인 phosphate buffer를 같은 용량으로 투여하였다. 그리고 MIA 투여 전 (0일), 투여 후 3, 7, 14 및 21일에 WBI (weight bearing index)를 측정하였다.

※ 오른발(투여)에 실리는 무게 변화율 (WBI, %) =

[오른발(투여)에 실리는 무게/(오른발(투여)에 실리는 무게 + 왼발(비투여)에 실리는 무게)] x 100

WBI 결과는 표8에 나타내었다.

Group	투여 후 WBI (%)
Group		0일	3일	7일	14일	21일
정상군	Mean	49.9	47.9	49.1	50.6	51.2
정상군	S.D.	1.2	4.6	1.8	0.9	1.9
음성대조군	Mean	50.1	28.2	32.0	33.1	32.5
음성대조군	S.D.	1.2	5.2	2.8	5.1	3.0
제조예 3	Mean	49.6	27.4	36.6	40.0	46.0
제조예 3	S.D.	1.6	4.0	4.3	3.5	5.8
비교예 2	Mean	49.3	27.4	31.9	34.4	37.0
비교예 2	S.D.	1.5	3.8	3.8	3.9	4.9
비교예 3	Mean	49.9	28.5	33.3	34.2	37.3
비교예 3	S.D.	1.7	6.8	5.1	3.9	4.6
* 오른발 (투여)에 실리는 무게변화율 → 양발 균형이 맞을 경우 50%

표 8에서 나타난 바와 같이, 제조예 3이 음성대조군과 비교하여 시험물질투여 7일차부터 통계적으로 유의한 차이를 보이며 21일차까지 통증이 회복되는 것을 확인하였다. 또한 비교예 2, 비교예 3 보다 우월한 통증경감효과를 가지는 것을 확인하였다.

이 결과를 통해 본 발명에서 제조한 조성물이 기존 PN이나 콜라겐의 다른 혼합 제형보다도 우월한 통증경감 효과를 가져오면서도 세포독성을 낮추는 매우 우수한 효능을 나타냄을 확인할 수 있다.

Claims

(제1단계) 포유동물의 피부 분쇄물을 에탄올 수용액에 침지한 후, 피부 분쇄물을 정제수로 옮겨 펩신을 첨가한 뒤 교반하고, NaCl 수용액을 가하여 콜라겐을 응집하고, 응집된 콜라겐을 정제수에 용해하여 콜라겐 추출 액상을 얻는 단계;
(제2단계) 상기 콜라겐 추출 액상을 동결건조하여 스펀지화하고, 스펀지화된 콜라겐에 산성 용액을 첨가하여 콜라겐 용액을 제조하고,
여분의 콜라겐 추출 액상에 Na₂HPO₄ 수용액을 첨가하여 콜라겐을 슬러리 상태로 섬유화하고, 원심분리 후 농축하고 정제수에 희석하여 콜라겐 섬유화 용액을 얻고,
상기 콜라겐 용액과 콜라겐 섬유화 용액을 혼합하여 콜라겐 복합 용액을 제조하는 단계;
(제3단계) DNA 분획물 수용액에 제2단계의 콜라겐 복합 용액을 혼합하는 단계;
를 포함하는 것을 특징으로 하는 DNA 분획물 및 콜라겐을 함유하는 조성물의 제조방법.
제1항에 있어서,
상기 DNA 분획물은 폴리뉴클레오티드 (Polynucleotide, PN) 및 폴리데옥시리보뉴클레오티드 (Polydeoxyrbonucleotide, PDRN)로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 DNA 분획물 및 콜라겐을 함유하는 조성물의 제조방법.
제1항의 방법으로 제조된 것을 특징으로 하는 DNA 분획물 및 콜라겐을 함유하는 조성물.
제3항의 조성물을 함유하는 것을 특징으로 하는 관절강용 주사제 조성물.
제3항에 있어서,
상기 조성물은 관절 통증 완화 또는 관절 염증 완화 효능을 갖는 것을 특징으로 하는 관절강용 주사제 조성물.
제3항의 조성물을 함유하는 것을 특징으로 하는 관절 윤활용 조성물.
제3항의 조성물을 함유하는 것을 특징으로 하는 관절염 개선용 조성물.
제3항의 조성물을 함유하는 것을 특징으로 하는 점성 보충용 조성물.
제3항의 조성물을 함유하는 것을 특징으로 하는 피부 주입용 조성물.
제3항의 조성물을 함유하는 것을 특징으로 하는 상처 치유용 조성물.
제3항의 조성물을 함유하는 것을 특징으로 하는 조직 보충용 조성물.