KR20190116636A

KR20190116636A - Dna 단편 혼합물 및 히알루론산을 포함하는 연골 재생용 조성물

Info

Publication number: KR20190116636A
Application number: KR1020180039522A
Authority: KR
Inventors: 김석순
Original assignee: 김석순
Priority date: 2018-04-05
Filing date: 2018-04-05
Publication date: 2019-10-15
Also published as: KR102285724B1

Abstract

본 발명은 연골 재생의 효과를 가진 조성물에 관한 것으로, 어류 정소로부터 분리된 DNA 단편 혼합물과 히알루론산을 포함하는 것을 특징으로 하여 관절 내 주입이 가능하도록 적절한 점성을 갖추며, 윤활기능과 동시에 세포 증식 효과에 따른 연골 재생을 극대화하여 골관절염을 치료할 수 있는 효과를 갖는다.

Description

DNA 단편 혼합물 및 히알루론산을 포함하는 연골 재생용 조성물{Composition for regenerating cartilage comprising polydeoxyribonucleotide and hyaluronic acid}

본 발명은 연골 재생의 효과를 가진 조성물에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 연골 재생 및 윤활기능에 따른 항통증 효과를 통한 골관절 치유 조성물에 관한 것이다.

퇴행성 관절염이라 불리는 골관절염(osteoarthritis)은 관절과 뼈의 구조적 변화와 더불어 관절 연골이 손상되어 심한 통증과 관절운동장애 등의 증상이나 증후를 나타내는 질환이다. 골관절염은 방사선 검사를 통해 연골 손실과 뼈의 변화 정도를 포함한 관절의 생리적 상태를 평가하는 질환이기에 명확한 정의를 내리기는 어렵지만, 일반적으로 “연골손실을 특징으로 활액낭, 관절, 관절 주위 뼈의 구조적 변화가 확인되는 상태”로 정의되고 있다.

실제 퇴행성 관절염 환자의 무릎 관절을 평가한 결과 관절을 보호하고 있는 연골의 손상 또는 관절을 이루는 뼈와 인대 등에 손상이 일어나 비가역적으로 연골조직이 파괴되어 있음을 확인할 수 있다.

현행 골관절염의 기본적인 치료 방법으로는, 초기에 있어 통증만 있는 경우에는 단순 진통제를 복용하여 통증을 없애는데 초점이 맞춰 있으나, 좀 더 진행된 후 통증이 계속된 경우에는 항염 효과가 강한 소염 진통제를 사용하게 된다. 그러나 이와 같은 소염 진통제는 코르티코스테로이드(corticosteroid) 유형의 소염 물질을 사용하게 되는데, 이러한 진통제의 일종인 하이드로코르티존(hydrocortisone) 및 베타메타손(betamethasone) 등을 장기간 사용하는 경우 위, 간, 신장의 기능을 저하 시키고, 연골 세포의 재생 능력을 저해시키는 등의 부작용이 있어 지속적인 관찰과 함께 경구투여가 아닌 히알루론산나트륨의 관절강 내 주사와 같은 요법 등이 사용되고 있다.

히알루론산은 관절 활액 중에 기 존재하는 완전히 생체 적합한 성분으로써, 이상 반응의 발현 빈도가 매우 낮은 장점에도 불구하고, 진통 효과 발현이 매우 느리고, 관절강 내 주입시 국소 부위의 통증으로 인해 환자의 치료 만족도가 낮으며, 연골 재생 효과가 낮은 단점이 있어왔다.

1. 대한민국 등록 특허 10-1739409

따라서 본 발명이 해결하고자 하는 과제는 상기한 한계점을 극복하기 위한 것으로, 관절의 세포 증식 효능에 따른 연골 재생 효과 및 윤활기능에 따른 골관절 치유의 효과가 뛰어난 DNA 단편 혼합물 및 히알루론산을 포함하는 골관절염 치료 조성물을 제공하는 것이다.

상기 기술적 과제를 달성하기 위하여,

어류 정소로부터 분리된 DNA 단편 혼합물과 히알루론산을 포함하는 것을 특징으로 하는 연골 재생용 조성물을 제공한다.

상술한 바와 같은 본 발명에 따른 연골 재생용 조성물에 있어서, 상기 DNA 단편 혼합물의 분자량은 300~3,000kDa이고, 상기 히알루론산의 분자량은 100~3,000kDa인 것이 바람직하다.

상술한 바와 같은 본 발명에 따른 연골 재생용 조성물에 있어서, 상기 DNA 단편 혼합물의 농도는 0.2~6%이고, 상기 히알루론산의 농도는 0.1~3%인 것이 바람직하다.

상술한 바와 같은 본 발명에 따른 연골 재생용 조성물에 있어서, 상기 DNA 단편 혼합물과 히알루론산의 중량비는 2:1인 것이 바람직하다.

상술한 바와 같은 본 발명에 따른 연골 재생용 조성물에 있어서, 상기 어류는 연어과 어류인 것이 바람직하다.

본 발명에 따른 DNA 단편 혼합물(PDRN)과 히알루론산(HA) 혼합 조성물은 관절 내 주입이 가능하도록 적절한 점성을 갖추며, 윤활기능과 동시에 세포 증식 효과에 따른 연골 재생을 극대화하여 골관절염을 치료할 수 있는 효과를 갖는다.

이하, 본 발명에 대하여 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있도록 상세히 설명한다.

본 발명에서의 히알루론산은 히알루론산 또는 그의 약학적으로 허용되는 염 또는 그의 수화물 또는 이의 혼합물로써, 히알루론산의 약학적으로 허용되는 염은, 예를 들어, 히알루론산 나트륨, 히알루론산 마그네슘, 히알루론산 아연, 히알루론산 코발트 등과 같은 무기염과, 히알루론산 테트라부틸암모늄 등과 같은 유기염일 수 있으며, 이들 염이 한개 이상이 조합되어 사용될 수 있다. 본 발명의 히알루론산의 분자량은 100~3,000kDa인 것이 바람직하다.

본 발명에서, 히알루론산 또는 그의 약학적으로 허용되는 염 또는 그의 수화물은, 본 발명의 조성물의 총 중량에 대하여 히알루론산 또는 그의 약학적으로 허용되는 염으로서 0.1~3중량%로 포함되는 것이 바람직하다. 히알루론산 또는 그의 염의 농도가 0.1중량% 미만인 경우에는 골관절염 치료 효과가 미미할 수 있고, 3중량% 초과인 경우에는 조성물의 급격한 점성 증가로 인하여 프리필드 시린지 또는 앰플 용기 충전에 어려움이 있고, 또한 환자의 환부 투여 시 어려움을 야기할 수 있다.

또한, 본 발명에 따른 DNA 단편 혼합물(Polydeoxyribonucleotide, PDRN)의 분자량은 300~3,000kDa이며, 0.2~6중량%로 포함되는 것이 바람직하다. 0.2중량% 미만에서는 효과가 미미하며, 6중량% 초과의 농도로 제조할 경우에는 점성 증가로 인하여 골관절염 치료의 효능이 떨어지게 된다.

또한, 본 발명에서 DNA 단편 혼합물과 히알루론산의 중량비는 2:1인 것이 바람직하다. 이 비율을 벗어나는 경우 골관절염의 치료 효과가 상대적으로 낮아진다.

본 발명에 따른 조성물은 액상으로서 주사제형으로 제제화하는 것이 바람직하며, 골관절염 치료를 위하여 관절강 내 주사로 투여되는 것이 바람직하다.

본 발명에 따른 주사제형의 조제예는 히알루론산 0.5g, 폴리데옥시리보뉴클레오티드 1g, 염화나트륨 0.9g, 인산수소나트륨 0.2g, 인산수소이나트륨 2.5g을 주사용수 100ml에 완전히 용해시킨 다음 제균 여과 하여 제제화 할 수 있다.

본 발명의 조성물의 pH는 NaH₂PO₄, Na₂HPO₄를 사용하여 6.0 내지 8.0로 조절하는 것이 바람직하다. 6.0 미만 또는 8.0을 초과하는 pH에서는 히알루론산이 불안정하고, 관절 내 상기 액상 조성물 투여 시 국소자극을 통한 통증, 부종, 염증 등의 부작용이 나타날 수 있다.

또한, 본 발명의 약학적 조성물에는, 항류머티즘제, 비-스테로이드성 항염증성 약물(NSAID), 진통제, 마취제, 국소 마취제, 면역 억제제, 성장 호르몬, 호르몬 대체 약물, 방사성 약제 등의 약물을 더 포함할 수 있다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

< 준비예 1. 송어 정소로부터 DNA 단편 혼합물의 제조>

1)분쇄

무지개송어(바다에서 양식된 송어로 바다송어라칭함)의 정소 10㎏을 정제수 150L와 NaCl 37.4 ㎏을 넣어 분쇄기로 분쇄하였다.

2)분자저감

분쇄된 정소에 증류수 150L을 추가로 가하고, 소디움도데실설페이트(이하 SDS라 칭함) 1.2㎏을 투입한 다음 100~105℃에서 4~5시간 동안 반응하여 분자저감하였다.

3)정제과정

분자저감 후 실온까지 냉각하여 15,000rpm에서 원심분리하여 정소 찌꺼기를 제거하고 여과하였다. 에탄올에 여과액을 서서히 첨가하여 흰색 고체를 수득하였다.

4)탈수, 건조과정

흰색고체를 70%(v/v)에탄올로 세척한 다음 무수에탄올로 탈수 후 여과, 건조 후 800g의 DNA 단편 혼합물(PDRN, 순도 99.5%)을 얻었다. 평균 분자량은 겔 이미지 분석 시스템으로 측정한 결과, 저분자량인 300~3,000kDa에 주로 분포하였다.

상기 과정을 통해 얻어진 DNA 단편 혼합물(PDRN)을 0.9%의 염화나트륨 용액 첨가하여 혼합한 뒤 120℃에서 15분간 습윤멸균한 다음 냉각시켜 하기의 실험예에 사용되었다.

<실시예 1 내지 5 및 비교예 1 내지 6. DNA 단편 혼합물 및 히알루론산 조성물의 제조>

상기 준비예 1에서 제조된 DNA 단편 혼합물(PDRN)과 100~3,000kDa 분자량의히알루론산(HA, 시그마알드리치에서 구입)을 하기 표 1과 같은 농도 및 중량비가 되도록 0.9% 염화나트륨이 첨가된 용액에 혼합한 뒤 실린지 필터로 멸균하여 액상의 조성물을 제조하였다.

구분	DNA 단편 혼합물 (PDRN, 중량%)	히알루론산 (HA, 중량%)	PDRN : HA
실시예 1	1	1	1 : 1
실시예 2	0.5	1	1 : 2
실시예 3	2	1	2 : 1
실시예 4	3	1	3 : 1
실시예 5	4	1	4 : 1
비교예 1	-	1	-
비교예 2	0.5	-	-
비교예 3	1	-	-
비교예 4	2	-	-
비교예 5	3	-	-
비교예 6	4	-	-

<실험예 1. DNA 단편 혼합물과 히알루론산 혼합물의 연골세포 성장 효과>

1-1. 세포 수 측정

사람 연골 세포(CHON-001, ATCC CRL-2846)를 10% FBS(fetal bovine serum)와 1% 페니실린/스트렙토마이신이 포함된 DMEM(Dulbeco’s Modified Eagle’s Medium)에서 배양하였고, 배양된 세포에 트립신/EDTA를 처리하여 바닥으로부터 세포를 떼어낸 후 헤마사이토미터(hemacytometer)를 이용하여 세포 수를 측정하였다. 상기 세포를 3×10³ cells/200ul로 96-well plate에 접종하고 24시간 안정화시켰다. 이후 각 well의 배지를 제거하고 실시예 1 내지 5 및 비교예 1 내지 6의 조성물이 포함된 DMEM 배지를 세포에 넣어주었다. 그 후 5% CO₂가 포함된 37℃ 인큐베이터에서 72시간 동안 배양하였다. 이때, 음성 대조군으로는 PDRN과 히알루론산이 모두 첨가되지 않은 0.9% 염화나트륨이 첨가된 DMEM 배지를 사용하였다. 이후, 세포수 측정을 위해서 상기 세포에 트립신/EDTA를 처리하여 바닥으로부터 세포를 떼어낸 후 헤마사이토미터(hemacytometer)를 이용하여 세포 수를 측정하였다(표 2).

구분	음성 대조군(cells)	세포수(cells)
실시예 1	(5.2±1)×10⁴	(6.5±2)×10⁴
실시예 2		(9.6±1)×10⁴
실시예 3		(15.5±2)×10⁴
실시예 4		(9.5±1)×10⁴
실시예 5		(7.6±1)×10⁴
비교예 1		(5.3±3)×10⁴
비교예 2		(5.8±1)×10⁴
비교예 3		(6.0±1)×10⁴
비교예 4		(6.3±0.5)×10⁴
비교예 5		(6.3±2)×10⁴
비교예 6		(6.2±2)×10⁴

그 결과, 비교예 1 내지 6에서 확인할 수 있듯이, 히알루론산(HA)을 단독 처리 했을 때 보다 DNA 단편 혼합물(PDRN)을 단독 처리 했을 때 세포 성장률이 더 높았다.

또한, 실시예와 비교예에서 확인할 수 있듯이, DNA 단편 혼합물(PDRN)과 히알루론산(HA) 혼합 조성물에서는 단독 처리하였을 때의 세포 성장률보다 우수한 세포증식 효능을 보였으며 특히, DNA 단편 혼합물(PDRN)과 히알루론산(HA)의 중량비가 2:1이 될때 가장 우수한 세포증식 효능을 보였다.

1-2. CCK-8 assay

실험예 1-1에서 실시한 동일한 방법으로 사람 연골세포를 배양한 다음, 실시예 1 내지 5 및 비교예 1 내지 6의 조성물을 세포에 처리하였다. 그 후, 5% CO₂가 포함된 37℃ 인큐베이터에서 72시간 동안 배양하였다.

세포 증식률은 CCK-8 (Dojindo Molecular Technologies, Japan) 분석법을 이용하였다. 72시간 배양 세포에 CCK-8 시약을 첨가하여 2시간 동안 37℃, 5% CO₂ 배양기에서 배양하였다. ELISA reader (SPECTRAmax® M2 Microplate Spectrophotometer; Molecular Devices, USA)를 사용하여 450nm에서 흡광도를 측정하였으며, 음성 대조군의 흡광도를 기준으로 세포 증식률을 산출하였다.

구분	음성 대조군(%)	세포 증식률(%)
실시예 1	100±1.1	1,205±2
실시예 2		1,564±1.5
실시예 3		2,502±2
실시예 4		1,509±1
실시예 5		1,350±2.2
비교예 1		886±1.1
비교예 2		925±1
비교예 3		968±0.5
비교예 4		1,163±1.5
비교예 5		1,160±2
비교예 6		1,160±1

표 3의 결과에서도, DNA 단편 혼합물(PDRN)과 히알루론산(HA) 혼합 조성물에서는 단독 처리하였을 때의 세포 성장률보다 우수한 세포 증식 효능을 보였다.

또한, DNA 단편 혼합물(PDRN)과 히알루론산의 중량비가 2:1이 될때 가장 우수한 세포증식 효능을 보였다.

< 실시예 6 내지 9. 분자량에 따른 DNA 단편 혼합물 및 히알루론산 조성물의 제조>

상기와 같이 세포증식 효능이 가장 우수한 DNA 단편 혼합물(PDRN)과 히알루론산(HA)의 중량비가 2:1이 될 때(실시예 3), 각 분자량에 따른 세포증식 효능을 알아보고자 실시예 6 내지 9의 조성물을 제조하였다.

구분	DNA 단편혼합물(PDRN) 분자량(kDa)	히알루론산(HA) 분자량(kDa)	PDRN : HA
실시예 3	300~3,000	100~3,000	2 : 1
실시예 6	5,000~10,000	100~3,000	2 : 1
실시예 7	50~250	100~3,000	2 : 1
실시예 8	300~3,000	5,000~10,000	2 : 1
실시예 9	300~3,000	10~90	2 : 1

2-1. 실시예 6 내지 9의 세포 수 측정

상기 1-1의 세포수 측정에 따라 실시예 6 내지 9의 세포 증식 효능을 측정한 결과, 하기 표 5에서와 같이 실시예 3과 비교하여 DNA 단편혼합물(PDRN)과 히알루론산(HA)의 분자량이 커지거나 작아지면 세포 증식 효능이 떨어짐을 알 수 있었다.

이것으로 실시예 3과 같이 DNA 단편혼합물(PDRN)의 분자량이 300~3,000kDa, 히알루론산(HA)의 분자량이 100~3,000kDa이며 중량비가 2:1일 때가 세포 증식 효능이 가장 우수한 최적의 분자량 즉, 최적의 점도임을 확인하였다.

구분	음성 대조군(cells)	세포수(cells)
실시예 3	(5.2±1)×10⁴	(15.5±2)×10⁴
실시예 6		(8.6±1)×10⁴
실시예 7		(10±1)×10⁴
실시예 8		(9.5±2)×10⁴
실시예 9		(9.7±1)×10⁴

< 실험예 2. 모노-요오드아세테이트(Mono- iodoacetate ) 유발 골관염 모델에 서의 항통증 효력평가>

약 8주령의 Male SD rat 각 조성물 당 5마리씩 75마리를 구입한 후, 온도 23±2℃, 상대습도 40-60%이 유지되는 청정구역에서 1주일 동안 안정화하였다. 각 Male SD rat의 오른쪽 다리에 Mono-idoacetate(MIA)를 50μL(60 mg/mL)를 투여하여 골관절염을 유발하였다. MIA 투여 3일 후 오른쪽 다리의 통증정도를 체중 밸런스를 측정함으로서 평가하였다. 측정 후 실시예 1 내지 7 및 비교예 1 내지 8의 조성물 당 5마리씩 총 75마리에 50uL를 실린지로 관절강 내에 1회 투여하였다. 투여 1, 3, 7 일 후 관절의 통증정도를 평가하고, 표 6에 나타내었다.

통증의 정도를 평가하는 방법은 가장 일반적으로 사용되는 weight distribution(%)을 이용하여 오른쪽 다리 체중부하율(%)을 측정하였으며, 이를 바탕으로 체중 부하 회복율(%)을 계산하였다. 체중부하율은 Incapacitance meter tester를 이용하여 각 뒷다리에 가해진 세기를 10초에 걸쳐 평균을 산출하였다. 체중부하율 및 체중 부하 회복율은 각각 하기 수학식 1 및 2와 같다.

[수학식 1]

체중부하율 (%) ={오른쪽 다리 체중부하율 / (오른쪽 다리 체중부하율 + 왼쪽 다리 체중부하율)}×100

[수학식 2]

체중 부하 회복율 (%) = {(약물투여 후 오른쪽 다리 체중부하율 - MIA 투여 3일 후 오른쪽 다리 체중부하율) / MIA 투여 3일 후 오른쪽 다리 체중부하율}×100

	오른쪽 다리 체중 부하 회복율(%)
구분	약물 투여 1일차	약물 투여 3일차	약물 투여 7일차
실시예 1	40	58	80
실시예 2	45	62	85
실시예 3	48	72	93
실시예 4	40	65	83
실시예 5	42	62	80
실시예 6	41	55	79
실시예 7	43	60	81
실시예 8	40	56	79
실시예 9	40	57	80
비교예 1	25	40	65
비교예 2	28	48	70
비교예 3	33	50	74
비교예 4	33	50	76
비교예 5	30	49	75
비교예 6	28	45	73

상기 실험 결과의 비교예 1 내지 6에서 알 수 있는 바와 같이, 히알루론산(HA)을 단독 처리 했을 때 보다 DNA 단편 혼합물(PDRN)을 단독 처리 했을 때 체중 부하 회복율이 더 높았다.

또한, 실시예 1 내지 5과 비교예 1 내지 6에서 확인할 수 있듯이, DNA 단편 혼합물(PDRN)과 히알루론산(HA) 혼합 조성물에서는 단독 처리하였을 때 보다 우수한 체중 부하 회복 효능을 보였으며 특히, DNA 단편 혼합물(PDRN)과 히알루론산(HA)의 중량비가 2:1이 될 때 가장 우수한 체중 부하 회복 효능을 보였다.

게다가 실시예 6 내지 9에서와 같이 실시예3 보다 분자량이 크거나 낮아질 때, 즉 점도가 높아지거나 낮아지면 체중 부하 회복 효능이 떨어짐을 보여, 실시예 3과 같이 DNA 단편혼합물(PDRN)의 분자량이 300~3,000kDa, 히알루론산(HA)의 분자량이 100~3,000kDa이며 중량비가 2:1일때가 항통증 효능이 가장 우수한 최적의 분자량 즉, 최적의 점도임을 확인하였다.

따라서 본 발명은 세포증식 효능의 극대화에 따른 연골 재생과 윤활기능으로 골관절염 치료에 효과가 있는 최적의 중량비와 분자량을 갖춘 DNA 단편 혼합물(PDRN)과 히알루론산(HA) 혼합 조성물을 제공한다.

Claims

어류 정소로부터 분리된 DNA 단편 혼합물과 히알루론산을 포함하는 것을 특징으로 하는 연골재생용 조성물.
제1항에 있어서, 상기 DNA 단편 혼합물의 분자량은 300~3,000kDa이고, 상기 히알루론산의 분자량은 100~3,000kDa인 것을 특징으로 하는 연골재생용 조성물.
제 1항에 있어서, 상기 DNA 단편 혼합물의 농도는 0.2~6%이고, 상기 히알루론산의 농도는 0.1~3%인 것을 특징으로 하는 연골재생용 조성물.
제 1항 또는 제 3항에 있어서, 상기 DNA 단편 혼합물과 히알루론산의 중량비는 2:1인 것을 특징으로 하는 연골재생용 조성물.
제 1항에 있어서, 상기 어류는 연어과 어류인 것을 특징으로 하는 연골재생용 조성물.