KR102008232B1 - 헤스페리딘이 함유된 젤란검 하이드로겔 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 생체 적합한 천연재료인 젤란검 하이드로겔을 베이스로 하고 여기에 헤스페리딘이 배합된 주입식 하이드로겔 조성물을 이용하여 연골 손상 치료용 조성물로 사용하는 것을 특징으로 한다. 본 발명의 연골 손상 치료용 조성물을 체내에 주입하면 콜라겐 생성 효과와 항염 작용으로 인해 염증 완화를 시켜주는 헤스페리딘의 효과와 더불어 젤란검 특유의 높은 탄성과 내구성으로 인하여 연골치료용 주사제로써 적합하다. 또한, 세포 독성이 없고, 염증 반응이나 독성 물질에 의해 녹지 않는 장점이 있다. 또한, 연골 재생 효과를 증진시키기 위해, 자가 무릎 연골을 채취하여, 기존 자가 연골세포 이식술에서 생기는 단점을 최소화할 수 있다.

Description

헤스페리딘이 함유된 젤란검 하이드로겔 조성물 {Gellan-gum hydrogels composition containing hesperidin}

본 발명은 헤스페리딘이 함유된 젤란검 하이드로겔 조성물에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 손상된 연골복구와 골관절염 치료를 위한 생체 적합하고 주입 가능한 헤스페리딘이 첨가된 젤란검을 지지체로 이용하여 하이드로겔 형태로 구성되는 조성물과 이를 연골재생 및 골염증 완화 효과를 갖는 연골재생용 조성물에 적용하여 주입하는 발명에 관한 것이다.

퇴행성 관절 질병인 골관절염은 연골 퇴보와 뼈 과성장의 특성을 나타낸다. 골관절염은 임상실습에서 보이는 가장 흔한 퇴행성 골절과 노인 장애의 주된 요인이다. 연골은 연골세포와 연골조직으로 구성된 조직으로 충격을 흡수하여 관절을 보호하는 완충작용을 하고 관절면을 뒤덮는 초자 연골의 관절 연골인 윤활액이 들어있는 관절 주머니를 가지는 윤활 관절은 뼈 사이의 마찰력을 줄여 움직임을 부드럽게 한다.

이러한 관절을 보호하는 역할을 하고 있는 연골이 노화와 비만, 무리한 관절사용으로 마모되거나 퇴행성 변화로 인해 파열되면 골관절염 질병의 원인이 된다. 골관절염은 관절 염증, 통증, 부기, 부종, 변형 등의 증상들이 나타나는데 이러한 골관절염 증상들은 환자 삶의 질을 저하시킨다. 하지만, 관절 연골의 낮은 자가치료 능력 때문에 골관절염은 현재로써는 정확한 치료방법이 없어, 도전적인 질병 분야이다. [Bone Res (Wei Zhang, Hongwei Ouyang, Crispin R Dass, and Jiake Xu) 2016; 4; 15040.]

궁극적으로 골관절염의 치료는 환자의 통증을 줄이고 관절의 기능을 개선시키는데 목적이 있다. 하지만, 기존의 비스테로이드성 소염제인 진통해열제와 합성 진통 마취제들은 통증과 부종을 완화 시키는 데는 효율적이지만 근본적인 문제인 연골의 손상을 막을 수 없고 장기적인 복용이 힘들며, 대부분 심각한 부작용을 동반한다.

따라서 연골 재생을 증진시키고 손상된 연골 복구의 치료법으로 최근 조직 재생과 치료의 효율성이 증대함에 따라 연골 재생에 대한 조직공학적 방법의 필요성이 제기되어 왔다.

젤란검(Gellan Gum)은 생분해성 물질로 생체 주입에 적합하고 내열성, 내산성, 내효소성의 우수한 물성뿐만 아니라 친수콜로이드(hydrocolloid)로써 신체에 주입시 겔을 형성하여 손상된 부위를 촉촉하게 유지하고, 괴사조직의 자연분해를 도와 생체조직공학에서의 응용이 광범위하다. 젤란검은 O-글리코시드(O-glycosidically)가 결합된 에스터(ester)로써 아실기(Acyl group)를 함유하고 있으며, 아실기의 함유량에 따라 하이아실젤란검(high acyl gellan gum), 로우아실젤란검(low acyl gellan gum)으로 나누어진다. 특히, 젤란검의 구성성분인 글루코산은 실제 연골의 글리코사민글리칸과 유사한 환경조성을 하는 것으로 알려져 연골 복구재생 연구에 적합하다.(Balakrishnan B1, Joshi N1, Jayakrishnan A2, Banerjee R3, Self-crosslinked oxidized alginate/gelatin hydrogel as injectable, adhesive biomimetic scaffolds for cartilage regeneration, Acta Biomater, 2014 Aug;10(8):3650-63.)

또한, 헤스페리딘(Hesperidin)은 비타민 P의 일종으로 콜라겐 생성을 돕고 항염증 작용, 노화에 관련된 질병에 효과가 있으며, 관절 및 연골에 영향을 준다고 알려져 있다 (일본등록특허 제4838772호, 일본공개특허 제2005-255527호).

상기 언급한 조직공학적 생체재료를 이용한 주입형 하이드로겔은 그 필요성에도 불구하고, 연구가 전무한 실정이다.

일본등록특허 제4838772호 일본공개특허 제2005-255527호

1. Balakrishnan B1, Joshi N1, Jayakrishnan A2, Banerjee R3, Self-crosslinked oxidized alginate/gelatin hydrogel as injectable, adhesive biomimetic scaffolds for cartilage regeneration, Acta Biomater, 2014 Aug;10(8):3650-63.

상기와 같은 종래기술의 문제점을 개선하기 위하여, 헤스페린과 젤란검을 활용하여 연골 손상을 효율적으로 개선하고 골관절염을 치료할 수 있도록 하기 위한 방안의 개발을 해결과제로 한다.

그러므로 본 발명자들은 수술부위를 최소화할 수 있는 비외과적(Non-surgical)인 조직공학적 방법을 통해, 연골 재생 및 골 관절염 치료를 위한 방법을 개발하고자 하였다. 그 결과, 연골치료를 위한 헤스페리딘이 배합된 젤란검 하이드로겔 주입식 관절염 치료제를 개발하여, 연골 복구를 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

따라서 본 발명의 목적은 수술부위를 최소화할 수 있는 비외과적인 조직공학적 방법을 통해, 연골 재생 및 골관절염 치료를 위한 하이드로겔 조성물을 제공하는 데 있다.

또한, 본 발명의 다른 목적은 연골치료를 위한 헤스페리딘이 배합된 젤란검 하이드로겔로서 주입식으로 사용하여 관절염 치료와 연골 복구가 가능한 연골 재생 및 손상 치료용 조성물을 제공하는 데 있다.

또한, 본 발명의 또 다른 목적은 연골 결함과 관절염 치료를 위해 항염증, 항산화, 연골 재생효과가 있는 헤스페리딘과 젤란검을 함유한 연골 치료용 주사제 조성물을 제공하는 데 있다.

위와 같은 본 발명의 과제 해결을 위하여, 본 발명은 연골 재생 및 골염증을 완화 유효성분으로 헤스페리딘이 젤란검에 배합되어 하이드로겔 형태로 이루어진 것을 특징으로 하는 헤스페리딘이 함유된 젤란검 하이드로겔 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 헤스페리딘이 함유된 젤란검 하이드로겔 조성물을 연골재생 유효성분으로 포함하는 연골 손상 치료용 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 헤스페리딘과 젤란검을 함유한 상기 연골 손상 치료용 조성물을 포함하는 주입식 관절염 치료제를 제공한다.

본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다.

(i) 본 발명은 생체 재료를 이용하여 연골 복구 및 골 관절염 치료제로서 헤스페리딘(Hesperidin)과 젤란검(Gellan-gum)을 포함하는 연골 재생 및 관절염 치료용 조성물을 제공함으로써 생체공학적 관절염 치료에 매우 유용하다.

(ii) 본 발명에 따른 연골재생용 조성물은 헤스페리딘이 배합된 연골 손상 치료용 젤란검 하이드로겔 형태의 연골 재생용 조성물을 이용하여 통해 연골 손상의 치료 효과를 크게 개선할 수 있으며, 간편하게 주입식으로 손상 부위에 직접 적용할 수 있는 효과가 있다.

(iii) 본 발명은 연골재생용 조성물을 조직공학적 주입형 하이드로겔 형태로 제작함으로써, 비외과적인 치료로 인해 수술에 따른 부작용 및 수술 시간을 크게 단축할 수 있는 효과가 있다.

도 1은 젤란검 하이드로겔에 헤스페리딘이 함량별 (0 mg, 1 mg, 2 mg, 4 mg) 로 첨가된 본 발명의 헤스페리딘과 젤란검을 함유한 연골재생용 조성물을 지지체 형태로 제작한 것을 보여주는 사진이다.
도 2는 본 발명에 따라 제조된 헤스페리딘/젤란검 하이드로겔 지지체에 파종된 토끼 연골세포의 증식률을 확인한 그래프이다.
도 3은 본 발명에 따라 제조된 헤스페리딘/젤란검 하이드로겔 지지체를 동결건조 시킨 다음 지지체 표면과 그 위에 파종된 토끼 연골세포를 파종 후 2주 뒤에 BIo-LV SEM을 통해 확인한 사진이다.
도 4는 본 발명에 따라 제조된 헤스페리딘/젤란검 하이드로겔 지지체의 압축강도를 측정한 그래프이다.
도 5a. 5b, 5c는 본 발명에 따른 헤스페리딘/젤란검 하이드로겔 지지체에서 헤스페리딘 함량을 달리한 헤스파리딘 함량별 젤란검 하이드로겔 지지체에 파종된 토끼연골세포의 연골 관련 마커 유전자 발현도를 항존유전자(Housekeeping gene) Beta-actin을 사용하여 RT-PCR로 측정한 그래프이다.

이하, 본 발명을 하나의 구현예로서 더욱 상세하게 설명하면 다음과 같다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 관절염 등 연골 손상의 치료를 위하여, 생체 적합한 고분자인 헤스페리딘이 배합된 젤란검 하이드로겔 조성물을 제공한다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면 기존의 연골치료 수술법과는 달리, 추가적 수술과 부작용을 최소화하는 방법의 치료를 위한 새로운 조성물로서, 연골 세포의 증식과 기능유지에 효과적인 조직공학적 생체 적합 재료를 이용하여, 연골 손상부분을 효과적으로 재생시킬 수 있는 새로운 구성의 주입식 적용이 가능한 젤란검 하이드로겔을 조성물을 제조하였다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명에서 사용되는 헤스페리딘 (Hesperidin)은 생체이용에 적합하고 콜라겐 생성을 돕고 항염증 작용을 하여 노화에 관련된 질병에 효과가 있으며 관절 연골에 긍정적인 영향을 준다고 알려져 있다.

본 발명에서 사용되는 젤란검 하이드로겔은 생체에 적합한 천연 재료로서, 높은 탄성률과 제조시 조절 가능한 강성을 가지고 있다. 젤란검 하이드로겔은 온도가 특정온도 이하로 내려가면 2차 코일 헬릭스 구조를 이루어 겔화 된다. 특히, 젤란검은 낮은 독성을 가질 뿐만 아니라 다루기가 쉽기 때문에, 헤스페리딘과 혼합하여 하이드로겔을 제조하면, 외과적 수술을 하지 않고 주입식 치료제로 사용할 수 있다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 젤란검 하이드로겔의 농도는 0.5~ 1중량%, 더욱 좋기로는 0.7-1중량%인 것이 바람직하다. 즉, 본 발명에서 사용하는 젤란검 하이드로겔은 순수 젤란검에 헤스페리딘을 혼합하고 배합한 하이드로겔로 구성된 것으로서, 예컨대 헤스페리딘를 첨가한 후 가교하여 바이옵시 펀치를 사용하게 되면 원통형 형태의 하이드로겔 조성물로 구성될 수 있다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 헤스페리딘의 농도는 젤란검에 대해 5 ~ 20중량% 인 것이 바람직하다. 만일, 그 함량이 너무 낮으면 첨가 효과가 없고, 너무 높으면 세포 과성장에 따른 비대 및 세포사멸이 이루어져 바람직하지 않은 문제가 발생할 수 있다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 하이드로겔 조성물은 예컨대 무릎 연골 손상부위에 적용하는 경우 주사제를 이용하여 곧바로 주입 가능한 제형일 수 있다. 그러므로 본 발명의 하이드겔 형태의 연골 손상 치료용 조성물은 그 사용이 기존에 비해 현저하게 편리한 효과가 있다.

그러므로 본 발명은 상기와 같은 헤스페리딘이 함유된 젤란검 하이드로겔 조성물을 유효성분으로 포함하는 연골 손상 치료용 조성물을 제공한다.

본 발명의 연골 손상 치료용 조성물을 체내에 주입하면 콜라겐 생성을 돕고 항염 작용으로 염증 완화에 도움을 주는 헤스페리딘의 효과와 더불어 젤란검 특유의 높은 탄성과 내구성으로 인하여 연골치료용 주사제로써 적합하다.

또한, 본 발명에 따른 조성물은 세포 독성이 없고, 염증 반응이나 독성 물질에 의해 녹지 않는 장점이 있다.

본 발명에 따르면, 본 발명의 연골 손상 치료용 조성물을 사용하는 경우 기존에 연골 재생 효과를 증진시키기 위해, 예컨대 자가 무릎연골을 채취하여, 자가 연골세포 이식술에서 생기는 방법으로 치료하던 방법에서 나타나는 여러 가지 단점을 최소화할 수 있는 것이다.

또한, 본 발명에 따르면 상기와 같은 연골 손상 치료용 조성물에는 추가적으로 히알루론산 (hyaluronic acid), TGF-β1 중에서 선택된 하나 이상이 통상의 방법으로 혼합 사용될 수 있다.

또한, 본 발명은 상기와 같은 연골 손상 치료용 조성물은 주사에 적당한 기계적 강도를 가짐으로써 주입 가능한 주사용 관절염 치료제로 제공될 수 있다. 즉, 본 발명에 따른 하이드로겔 조성물은 연골 손상 부위에 주사하는 경우 예컨대, 1mg 헤스페리딘/ 1% 젤란검 농도의 주사제로 적용 가능하며, 이 경우 대체로 14일 내지 21일 경과 후에는 연골 재생 효과가 나타나 연골 손상부위에 대한 치료효과가 이루어지기 때문에 손상된 용이하게 연골을 치료할 수 있게 되는 것이다.

본 발명은 상기와 같은 연골 손상 치료용 조성물을 포함하는 주사용 관절염 치료제를 포함한다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 연골 손상 치료용 조성물은 주사형태로 주입하는 경우 연골손상 부위에 따라 3-5ml 의 범위 내에서 그 투여량을 조절할 수 있다. 바람직하게는 체중 60Kg 중량의 성인 기준으로 무릎 관절염 환자에 대해 1회 3-5ml의 범위 내에서 투여하는 것이 바람직하다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 연골 손상 투여용 조성물은 연골 손상 정도 및 재생 정도에 따라 주 또는 월 단위로, 반복 투여가 가능하다.

본 발명의 연골 손상 치료용 조성물을 체내에 주입하면 관절 조직 보호와, 항산화 효과 및 세균감염을 억제하고 높은 탄성과 내구성으로 인하여 주입식으로 사용하여 연골 손상 치료제로 유용하게 적용될 수 있다.

특히, 연골 재생 효과를 증진시키기 위해, 자가 무릎 연골을 채취하여, 기존 자가 연골세포 이식술에서 생기는 단점을 최소화할 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 자세히 설명한다. 하기에 나오는 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것이며, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

비교예 및 실시예 1 - 3 : 헤스페리딘/젤란검 하이드로겔 조성물의 제조

지용성 물질인 헤스페리딘의 용해는 EtOH를 이용한다. 중탕시킨 90℃의 3차 증류수(100 ml)에 젤란검(0.7g)(Sigma)을 용해시켜, 0.7 % 젤란검 수용액을 20분간 교반시키며 가열한다. 젤란검 파우더가 완전히 녹으면 0.03 % 염화칼슘(0.03g)을 넣고 10분간 용해시킨다.

60℃ 까지 온도가 낮아진 젤란검 수용액에 각각 0(비교예), 1mg(실시예 1), 2mg(실시예 2) 및 4mg(실시예 3) 함량의 헤스페리딘 수용액을 넣는다. 젤란검 수용액과 헤스페리딘 수용액을 섞은 후 페트리 디쉬에 붓고 상온에서 굳혀서 하이드로겔 조성물을 얻었다.

이렇게 얻은 하이드로겔은 굳은 겔 형태이므로 이를 바이옥시 펀지를 이용해 직경 6 mm, 높이 5 mm 로 잘라서 그 제품 사진을 도 1에 제시하였다.

도 1은 젤란검 하이드로겔에 헤스페리딘이 함량별 (0 mg, 1 mg, 2 mg, 4 mg) 로 첨가된 본 발명의 헤스페리딘과 젤란검을 함유한 연골재생용 조성물을 지지체 형태로 제작한 것을 보여주는 사진이다.

실험예 :

(1) 무릎 연골세포의 채취 및 배양

연골 세포를 얻기 위해 생후 2주된 암컷 뉴질랜드 화이트 토끼(Hanil laboratory animal center, Wanju, Korea)를 사용하였다. 토끼의 무릎 관절 사이에서 연골부위를 절개한 후 PBS(pH 7.4, Gibco, NY, USA)로 여러 번 세척 한 다음 연골세포를 긁어내었다. 긁어낸 연골세포는 코니컬 튜브에 넣고 1200 rpm, 4℃에서 3분 동안 2번 원심분리 하였다.

원심분리가 끝난 연골세포에 Dulbecco’s modified eagle medium(DMEM/F-12, Gibco), 10% 우태아 혈청(FBS, Gibco), 그리고 1% 항생제(100 units/mL 페니실린과 100μg/mL 스트렙토마이신)를 혼합한 배양액 10 mL와 0.2 wt% 콜라게네이즈 A형(Roche, Indianapolis, USA) 200μL를 첨가하여 36℃, 5% CO₂조건하의 인큐베이터 안에서 1일 동안 콜라겐을 분해하였다. 1일 후 1200 rpm, 4℃에서 3분 동안 원심분리 후 피펫팅하여 세포 배양접시(Cell culture dish)에 배양액과 함께 분주하였으며, 3일에 한번 씩 배양액을 교체해주었다. 파종에 사용된 세포는 Passage 2의 세포를 지지체당 1×10⁵cell/scaffold로 하였다.

(2) 물성 및 효능 분석

(2-1) 세포의 증식률 평가

하이드로겔 지지체에서 세포의 증식률을 알아보고자 MTT (디메틸치아졸-2-일-2,5-디페닐테트라졸리움 브로마이드) 분석법을 시행한 결과, 시간이 증가할수록 세포증식률이 모든 군에서 증가하는 것을 확인하였다. 또한, 모든 타임 포인트에서 1 mg H/G에서 가장 우수한 세포증식률을 보였다.

그 결과는 도 2에 나타내었는바. 여기서 헤스페리딘/젤란검 하이드로겔 지지체에 파종된 토끼 연골세포의 증식률을 확인할 수 있다.

(2-2) 세포의 모폴로지 확인

제작된 하이드로겔 지지체를 동결건조 시킨 후 SEM을 이용해 지지체 표면 다공을 관찰하였다. 토끼 무릎 연골세포를 채취한 후 지지체에서 2주간 배양하고 2.5 % 글루타 알데하이드를 이용해 고정한 후, 연골세포의 모폴로지를 확인하였다.

도 3은 상기 제조된 헤스페리딘/젤란검 하이드로겔 지지체 위에 파종된 토끼 연골세포를 파종 후 2주 뒤에 BIo-LV SEM을 통해 확인한 사진이다. 여기서는 1 mg 헤스페리딘이 함유된 젤란검 하이드로겔에서 세포의 증식이 가장 많이 일어난 것을 확인할 수 있었으며, 세포외 기질 또한 형성이 많이 되었다.

(2-3) 지지체의 압축강도 분석

헤스페리딘/젤란검 지지체의 압축강도를 측정하기 위해 실험실용 프레스(TMS-Pro, Food Technology Corporation, Sterling, USA)를 사용하였다. 이때 측정 속도는 1mm/sec, 측정 힘은 0.5N으로 설정하여, 압축강도를 측정하였다. 지지체 균열파괴시의 하중을 지지체의 단면적으로 나누었다.

도 4는 헤스페리딘/젤란검 하이드로겔 지지체의 압축강도를 측정한 그래프이다. 측정 결과, 0mg 헤스페리딘이 함유된 젤란검 하이드로겔에서 5N 이상의 압축강도가 관찰되었으며, 1, 2 및 4mg 헤스페리딘이 함유된 젤란검 하이드로겔에서는 헤스페리딘 함량이 증가할수록 압축강도가 점차 감소하는 경향성을 나타냈다.

(2-4) 유전자 발현 분석

젤란검 하이드로겔과 헤스페리딘이 배합된 하이드로겔의 유전자 표현형이 비교되었을 때, 헤스페리딘이 함유된 젤란검 하이드로겔에서 발현이 더 잘된 것을 확인하였다.

도 5a, 도 5b, 도 5c는 상기 결과로서 헤스페리딘/젤란검 하이드로겔 지지체에서 헤스페리딘 함량을 달리한 헤스파리딘 함량별 젤란검 하이드로겔 지지체에 파종된 토끼 연골세포의 연골 관련 마커 유전자 발현도를 항존 유전자(Housekeeping gene) Beta-actin을 사용하여 RT-PCR로 측정한 그래프이다.

여기서 어그리칸과 제 I, II형 콜라겐과 같은 ECM-연관 유전자 발현결과에 따르면, 헤스페리딘이 배합된 젤란검 하이드로겔은 바람직한 ECM의 합성을 향상시키는 더 적합한 미세 환경을 제공할 수 있을 것으로 사료된다.

(2-5) 실험결과

상기와 같은 실험결과로부터, 본 발명에 따른 헤스페리딘/젤란검 하이드로겔은 기존의 제조 방법보다 간단하고, 겔 형태를 유지할 수 있고, 보관이 용이하다. 또한, 세포의 성장이 완결된 후에는 자연적으로 생분해되어 몸에 흡수되기 때문에 다른 재료보다 생체 적합한 장점이 있는 것으로 확인되었다.

또한, 실시예의 경우 헤스페리딘을 사용하지 않은 비교예에 비해 현저하게 각종 물성 및 세포의 성장 효과가 우수하여 연골 손상 치료에 효과가 있는 것으로 확인되었다.

Claims (8)

1. 연골 재생 및 골염증을 완화하는 유효성분으로 헤스페리딘이 젤란검에 배합되어 하이드로겔 형태로 이루어진 것으로서, 젤란검 하이드로겔의 농도는 0.5 ~ 1 중량%이고, 헤스페리딘의 농도는 젤란검에 대하여 5 ~ 20중량%로 함유하며, 주사제 형태로 구성된 것을 특징으로 하는 헤스페리딘이 함유된 연골 손상 치료용 젤란검 하이드로겔 조성물.
   
2. 삭제
3. 삭제
4. 삭제
5. 삭제
6. 청구항 1에 따른 헤스페리딘이 함유된 연골 손상 치료용 젤란검 하이드로겔 조성물을 포함하는 주사용 관절염 치료제.
   
7. 청구항 6에 있어서, 연골손상 부위에 따라 3-5ml 범위로 투여량을 조절할 수 있는 것을 특징으로 하는 주사용 관절염 치료제.
   
8. 청구항 7에 있어서, 연골 손상 정도 및 재생 정도에 따라 주 또는 월 단위로, 반복 투여하는 것을 특징으로 하는 주사용 관절염 치료제.

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