KR101950115B1

KR101950115B1 - 재조합 인간 뼈 형성 단백질-2 및 비스포스포네이트로 이루어진 복합체, 이를 포함하는 조성물

Info

Publication number: KR101950115B1
Application number: KR1020170141397A
Authority: KR
Inventors: 이상길; 전상옥; 오동호; 서조은
Original assignee: 계명대학교 산학협력단
Priority date: 2016-10-27
Filing date: 2017-10-27
Publication date: 2019-02-19
Also published as: KR20180046386A

Abstract

본 발명은 재조합 인간 골 형성 단백질 2(rhBMP2)의 양전하를 띠는 아민기와, 비스포스포네이트(bisphosphonate)의 음전하를 띠는 인산기가 이온결합하여 생성된 것을 특징으로 하는 복합체, 이를 유효성분으로 포함하는 골 생성 증진용 조성물, 골 형성 단백질 2(BMP2) 전달용 조성물, 뼈 질환 예방, 개선 또는 치료용 조성물 및 의료기기에 관한 것으로, 상기 복합체는 rhBMP2와 비스포스포네이트와의 상승 작용으로 인해 rhBMP2의 서방출성 및 체내 전달률이 향상되어 효과적으로 골 생성 및 재생을 유도할 수 있는 바, 골 재생 내지는 뼈 질환과 관련된 다양한 분야에서 유용하게 활용될 수 있다.

Description

재조합 인간 뼈 형성 단백질-2 및 비스포스포네이트로 이루어진 복합체, 이를 포함하는 조성물{Complex Consist of Recombinant Human Bone Morphogenetic Protein and Composition Comprising the Same}

본 발명은 재조합 인간 골 형성 단백질 2(rhBMP2)의 양전하를 띠는 아민기와, 비스포스포네이트(bisphosphonate)의 음전하를 띠는 인산기가 이온결합하여 생성된 것을 특징으로 하는 복합체, 이를 포함하는 골 생성 증진용 조성물, 골 형성 단백질 2 전달용 조성물, 뼈 질환 예방 또는 치료용 조성물 및 의료기기에 관한 것이다.

산업이 고도화됨에 따라 노령인구가 증가하면서 노령인구의 삶의 질에 대한 관심이 증가하고 있고, 인공 뼈 시장도 연평균 20% 이상으로, 전 세계 인공 뼈 시장은 5조원 규모로, 국내 시장은 1,500억원 규모로 성장하였다. 2002. 12 데이터모니터(Datamonitor)에 의하면 글로벌 뼈 이식 시장은 2001년에만 해도 7억 3200만 달러(약 1조 시장 규모)로 예측되었으나, 미국의 뼈 이식 및 대체 골 이식 시장 수익(bone graft substitutes market revenue)은 2006년도에 13억 달러, 2013년에는 33억 달러, 2006년에서 2013년까지 13.8%의 연평균 성장률로 성장하고 있다.

한편, 인간 BMP(Bone Morphogenetic Protein)은 TGF-β-슈퍼패밀리에 속하는 단백질로서, 뼈 형성과정에서 성장요인(growth factor)으로 작용할 수 있다. 현재는 미국 및 유럽의 경우, 뼈 질환의 치료를 위해 재조합 BMP 단백질이 다국적 제약회사(화이자 등)에 의해 의약품으로 발명되어 판매되고 있다. 국내의 경우, 동물세포를 이용한 재조합 BMP 단백질 생산을 시도하여 발명한 예가 있고, 또는 박테리아 시스템(bacterial system)에서 생산된 BMP 단백질을 의료기기로 식약청에서 허가받아 치과 재료로 사용 및 판매하고 있다.

특히, 그중 BMP-2(뼈 헝성 단백질-2, bone morphogenetic protein-2)는 114개의 아미노산으로 구성된 폴리펩티드 이량체로, 섬유아세포 성장인자와 상호작용하여 연골세포와 골모세포 전구체의 형성뿐만 아니라, 표피조직의 발생을 유도하며, 신경세포의 분화 또한 유도할 수 있는 것으로 알려져있다.

이러한 BMP-2는 다양한 포유동물에서 장골의 결손을 치료할 수 있고, BMP-2 유전자가 이식된 골수의 중간엽 줄기세포와 생물학적으로 재흡수 가능한 고분자를 이용하여 뼈 결손을 치료할 수 있다는 연구결과에 따라, BMP-2의 골다공증을 비롯한 다양한 뼈 결손의 치료효과에 대해 주목하게 되었다.

그러나 생체 내에서 필요로 하는 BMP-2의 양은 지금까지 개발된 제품들에 담지된 약물 양에 비해 매우 소량만이 필요함에도 불구하고, 방출 특성 조절이 어려워 과량 사용되어 다른 부위에서의 골 형성 부작용, 즉 낮은 조직 선택성이나 면역원성, 항원성 및 암 발생 가능성에 대한 문제점이 제기되고 있어 완벽한 약물의 제어방출 기술을 확보하는 것이 매우 필요한 실정이다. 구체적으로, BMP-2는 생체 내 반감기가 7-16분인 매우 불안정한 약물이기 때문에 약물전달시스템 개발 시 안정성 확보가 매우 중요하며 약물의 방출 특성도 최소 2주 이상 유지할 수 있는 기술의 확보가 필요하다.

한국공개특허 제10-2016-0032230호(2016.03.23 공개)

본 발명의 목적은 조골세포 분화 촉진 활성이 있는 신규한 복합체를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 조골세포 분화 촉진 활성이 우수한 골 생성 증진용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 보다 효과적으로 골 형성 단백질 2를 전달할 수 있는 골 형성 단백질 2 전달용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 보다 효과적으로 뼈 질환을 예방 또는 치료할 수 있는 약학 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 보다 효과적으로 뼈 질환을 예방 또는 개선할 수 있는 건강기능식품 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 보다 효과적으로 골 생성을 촉진하는 의료기기를 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 재조합 인간 골 형성 단백질 2(rhBMP2)의 양전하를 띠는 아민기와, 비스포스포네이트(bisphosphonate)의 음전하를 띠는 인산기가 이온결합하여 생성된 복합체를 제공한다.

상기 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 상기 복합체를 유효성분으로 포함하는 골 생성 증진용 조성물을 제공한다.

상기 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 상기 복합체를 유효성분으로 포함하는 골 형성 단백질 2(BMP2) 전달용 조성물을 제공한다.

상기 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 상기 복합체를 유효성분으로 포함하는 뼈 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.

상기 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 상기 복합체를 유효성분으로 포함하는 뼈 질환 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물을 제공한다.

상기 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 상기 조성물을 함유한 이식재를 포함하는 의료기기를 제공한다.

본 발명에 따른 rhBMP2-비스포스네이트 복합체는 제조 시 유기용매를 사용하지 않아 안전하고, 비공유결합 방식, 즉, 이온 결합 방식의 매우 간단한 원리를 적용하여 대량생산이 가능하며, 수율과 회수율이 높고, 더욱이 rhBMP2와 비스포스네이트와의 상승 작용으로 인해 rhBMP2의 서방출성 및 체내 전달률이 향상되어 효과적으로 골생성 및 재생을 유도할 수 있는 바, 골 생성 촉진용 조성물, 골 생성 단백질 2 전달용 조성물, 뼈 질환 예방, 개선 또는 치료용 조성물 및 의료기기로 유용하게 활용될 수 있다.

도 1은 rhBMP2-리세드로네이트 복합체의 반응 역학에 대한 온도의 영향을 나타낸 것이다(검은 동그라미: 상온에서 6시간 동안 반응한 경우, 하얀 동그라미: 4℃에서 5시간 동안 반응한 경우).
도 2는 rhBMP2-리세드로네이트 복합체의 형태를 전자현미경을 이용하여 관찰한 것이다((A) 내지 (C): 5000X 배율의 TEM 이미지, (D) 내지 (F): 25000X 배율의 SEM 이미지).
도 3은 rhBMP2-리세드로네이트 복합체의 형태를 초분광 현미경을 이용하여 관찰한 것이다((A): BMP2(파란색), (B): 리세드로네이트(빨간색), (C): 복합체 내의 BMP2 및 리세드로네이트의 매핑 이미지).
도 4 및 도 5는 rhBMP2-리세드로네이트 복합체의 FT-IR 분석을 수행한 결과를 나타낸 것이다(도 4에서, (A): BMP2(파란색), (B): 리세드로네이트(초록색), (C): BMP2-리세드로네이트 복합체(빨간색); 도 5에서, (A): 2차 구조 결정을 위한 곡선맞춤된 아마이드 I 지역, (B): 2차 유도체).
도 6은 rhBMP2-리세드로네이트 복합체의 CD 값을 측정한 결과를 나타낸 것이다(동결건조 반응 후 재용해된 BMP2(실선) 및 1 mM HCl에 녹인 BMP2(짧은 점선)).
도 7 은 rhBMP2-리세드로네이트 복합체로부터 rhBMP2의 in vitro 방출 속도 및 방출률을 나타낸 것이다(검은 동그라미: PBS(pH 7.4)에서 장출된 BMP2의 %, 하얀 동그라미: PBS(pH 4.8)에서 방출된 BMP2의 %, 검은 삼각형: SBF(pH 7.4)에서 방출된 BMP2).
도 8은 rhBMP2-리세드로네이트 복합체의 SDS-PAGE 수행 결과를 나타낸 것이다(Lane 1, Lane 5: 기준 마커, Lane 2, Lane 6: 비환원 네이티브 rhBMP2, Lane 3, LAne 7: 동결건조 비처리-복합체에서 해리된 rhBMP2, Lane 4, 8: 동결건조 처리-복합체에서 해리된 rhBMP2).
도 9 및 도 10은 4종의 rhBMP2-비스포스포네이트 복합체의 세포 독성을 확인한 결과이다.
도 11은 4종의 rhBMP2-비스포스포네이트 복합체 투여 후 ALP의 활성을 확인한 결과이다.
도 12는 BMP2 및 BMP2와 비스포스포네이트들의 혼합물을 처리한 후의 ALP의 활성을 확인한 결과이다.
도 13은 BMP2, 리세드로네이트(Ris), BMP2 및 리세드로네이트 혼합물(B-Ris), 복합체(Com), 복합체에서 재용해된 BMP2(dis-Com)의 처리 후 ALP 활성을 확인한 결과이다(상기 복합체는 300 ng/ml에 해당하는 BMP2를 포함함).
도 14는 다양한 처리 후 조골세포 분화마커와 관련된 mRNA의 발현을 확인하기 위해, 정량적 PCR을 수행한 결과이다((A): ALP, (B): 타입 I 콜라겐, NC; 음성 대조군, B; rhBMP2, Ris: 리세드로네이트, B-Ris: rhBMP2 및 리세드로네이트의 혼합물, Com: 복합체, dis-Com: 복합체에서 재용해된 rhBMP2).
도 15 및 도 16은 rhBMP2-리세드로네이트 복합체 투여 후 in vivo에서 CT 촬영을 수행한 결과를 나타낸 것이다(도 15에서, (A): 횡단면, (B): 관상면(frontal plan), 왼쪽의 화살표는 히알루론산 하이드로겔 처리 군에서 생성된 신생골, 오른쪽 화살표는 폴록사머 407 하이드로겔 처리군에서 생성된 신생골임; 도 16에서, (A): 하이드로겔이 로딩된 BMP2 처리군, (B): 새로 생성된 뼈들을 다른 색으로 표시한 것으로, 노란색은 히알루론산 하이드로겔, 보라색은 폴록사머 하이드로겔임).
도 17 및 도 18은 각각 1.5% 히알루론산 하이드로겔 처리군 및 19% 폴록사머 407 하이드로겔 처리군에서 마이크로-CT 분석을 통해 얻어진 골 부피(mm³) 결과이다.
도 19는 BMP2-리세드로네이트 복합체 투여 후 신생골을 헤마톡실린&에오신 염색을 통해 조직학적으로 평가한 결과를 나타낸 것이다((A): 음성 대조군, (B): BMP2 용액 처리군, (C): 복합체 처리군; TB: 성숙 소주골, BC: 조혈 골수, M: 골격근).

이하, 본 발명을 보다 상세히 설명한다.

본 발명은 재조합 인간 골 형성 단백질 2(rhBMP2)의 양전하를 띠는 아민기와, 비스포스포네이트(bisphosphonate)의 음전하를 띠는 인산기가 이온결합하여 생성된 것을 특징으로 하는 복합체를 제공한다.

이때, 상기 비스포스포네이트는 리세드로네이트(risedronate), 모노소듐 알렌드로네이트, 디소듐 파미드로네이트, 모노소듐 올파드로네이트, 아미노-알렌드로네이트, 아미노-디메틸-알렌드로네이트, 아미노-파미드로네이트, 아미노-올파드로네이트, 아미노-에티드로네이트(amino-etidronate), 네리드로네이트(neridronate), 에티드로네이트(etidronate), 클로드로네이트(clodronate), 이반드로네이트(ibandronate), 인카드로네이트(incadronate), 졸렌드로네이트(zolendronate), 알렌드로네이트(alendronate), 틸루드로네이트(tiludronate) 및 이들의 혼합물로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나일 수 있고, 보다 바람직하게는 리세드로네이트일 수 있으나 이에 제한되지는 않는다.

본 발명의 일 실시예에서, 상기 복합체는 rhBMP2의 등전점(pI)±1의 pH를 나타내는 rhBMP2 용액에 비스포스포네이트 용액을 적가하여 반응시킴으로써 제조될 수 있는 바, 이러한 조건으로 반응시켜 복합체를 제조하는 경우, 단순히 rhBMP2와 비스포스포네이트가 혼합된 경우보다 훨씬 더 우수한 골 형성 증진 효과를 나타낼 수 있으므로 바람직하다.

본 발명의 일 실시예에서, 상기 복합체는 조골세포의 분화를 촉진함으로써 골 형성을 증진시킬 수 있으며, 보다 상세하게는 상기 복합체는 알칼라인 포스파타아제(ALP) 및 타입 I 콜라겐의 발현을 향상시킴으로써 조골세포의 분화를 촉진시킬 수 있다.

따라서, 본 발명은 상기 복합체를 유효성분으로 포함하는 골 생성 증진용 조성물을 제공한다.

이때, 상기 조성물은 복합체를 구성하는 비스포스포네이트 외에 자유 비스포스포네이트를 더 포함할 수 있는 바, 자유 비스포스포네이트를 추가적으로 더 포함하는 경우, 골 생성 증진 효과가 극대화되므로 바람직하다.

더욱이, 본 발명은 상기 복합체를 유효성분으로 포함하는 골 형성 단백질 2(BMP2) 전달용 조성물을 제공한다.

이때, 상기 복합체는 rhBMP2을 서방출하는 특성을 나타낼 수 있는 바, 따라서 골 형성 단백질 2의 전달률을 극대화할 수 있다.

더불어, 본 발명은 상기 복합체를 유효성분으로 포함하는 뼈 질환 예방 또는 치료용 약학 조성을 제공한다.

이때, 상기 뼈 질환은 골다공증, 골수염, 골연화증, 암세포의 골전이에 의한 골 손상, 추간판 탈출증, 섬유성 골이형성증, 클리펠-파일 증후군 및 낭성 섬유뼈염으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나일 수 있으나, 조골세포가 관여하는 질환이면 이에 제한되지는 않는다.

상기 조성물은 상기 복합체를 총 중량에 대하여 0.0001 중량% 내지 90 중량% 포함할 수 있고, 바람직하게는 0.001 내지 50 중량% 포함할 수 있는 바, 상기 복합체만 주입하여도 우수한 효과를 나타낼 수 있으므로 바람직하지만, 이에 제한되지는 않는다.

본 발명의 한 구체예에서, 상기 복합체를 유효성분으로 포함하는 조성물은 통상적인 방법에 따라 주사제, 과립제, 산제, 정제, 환제, 캡슐제, 좌제, 겔, 현탁제, 유제, 점적제 또는 액제로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 제형을 사용할 수 있다.

본 발명의 다른 구체예에서, 상기 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제, 붕해제, 감미제, 피복제, 팽창제, 윤활제, 활택제, 향미제, 항산화제, 완충액, 정균제, 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 첨가제를 추가로 포함할 수 있다.

구체적으로 담체, 부형제 및 희석제는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 사용할 수 있으며, 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 조성물에 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트, 수크로스 또는 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 조제할 수 있다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용할 수 있다. 경구를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 있으며 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제 등이 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기재로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 따르면 상기 조성물은 정맥내, 동맥내, 복강내, 근육내, 동맥내, 복강내, 흉골내, 경피, 비측내, 흡입, 국소, 직장, 경구, 안구내 또는 피내 경로를 통해 통상적인 방식으로 대상체로 투여할 수 있다.

상기 복합체의 바람직한 투여량은 대상체의 상태 및 체중, 질환의 종류 및 정도, 약물 형태, 투여경로 및 기간에 따라 달라질 수 있으며 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 그러나 바람직한 효과를 위해서, 본 발명의 복합체는 1일 0.0001 내지 100 mg/kg으로, 바람직하게는 0.001 내지 100 mg/kg으로 투여하는 것이 좋다. 투여는 하루에 한 번 투여할 수도 있고 수회로 나누어 투여할 수도 있으며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것은 아니다.

본 발명에 있어서, 본 발명의 조성물은 쥐, 생쥐, 가축, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁내 경막 또는 뇌혈 관내(intracerebroventricular) 주사에 의해 투여될 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 복합체를 유효성분으로 포함하는 뼈 질환 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물을 제공한다.

상기 건강기능식품 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그밖에 천연 과일 주스, 합성 과일 주스 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 또한, 건강기능식품 조성물은 육류, 소세지, 빵, 초콜릿, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 껌류, 아이스크림류, 스프, 음료수, 차, 기능수, 드링크제, 알코올 및 비타민 복합제 중 어느 하나의 형태일 수 있다.

또한, 상기 건강기능식품 조성물은 식품첨가물을 추가로 포함할 수 있으며, "식품첨가물"로서의 적합 여부는 다른 규정이 없는 한 식품의약품안전청에 승인된 식품첨가물공전의 총칙 및 일반 시험법 등에 따라 해당 품목에 관한 규격 및 기준에 의하여 판정한다.

상기 "식품첨가물공전"에 수재된 품목으로 예를 들어, 케톤류, 글리신, 구연산칼륨, 니코틴산, 계피산 등의 화학적 합성품, 감색소, 감초추출물, 결정셀룰로오스, 고랭색소, 구아검 등의 천연첨가물, L-글루타민산나트륨 제제, 면류 첨가 알칼리제, 보존료제제, 타르색소 제제 등의 혼합 제제류 등을 들 수 있다.

이때, 건강기능식품 조성물을 제조하는 과정에서 식품에 첨가되는 상기 복합체는 필요에 따라 그 함량을 적절히 가감할 수 있으며, 바람직하게는 1 중량% 내지 90 중량% 포함되도록 첨가될 수 있다.

더불어, 본 발명은 상기 골 생성 증진용 조성물 또는 골 형성 단백질 2(BMP2) 전달용 조성물이 함유된 이식재를 포함하는 의료기기를 제공한다.

본 발명에서, 상기 “의료기기”는 인체의 뼈와 같은 조직이 상실되었을 때 이를 회복시켜 주는 대체물을 포함하는 것으로서, 의학적 이상을 예방 또는 치료하기 위하여 일시적 또는 영구적으로 포유동물에 도입되는 의료용 장치 또는 기구들을 포함한다. 상기 의료기기에는 피하, 경피 또는 외과적으로 도입되어 동맥, 정맥, 심실 및 심방과 같은 장기, 장기의 조직 또는 내강 내에 남겨지는 임의의 것들도 모두 포함될 수 있다.

상기 조성물에 포함된 복합체는 조골세포의 분화를 촉진함으로써 골 형성을 증진시킬 수 있으며, 보다 상세하게는 상기 복합체는 알칼라인 포스파타아제(ALP) 및 타입 I 콜라겐의 발현을 향상시킴으로써 조골세포의 분화를 촉진시킬 수 있는 바, 이러한 원리를 이용하여 상기 조성물을 처리한 이식물을 포함하는 의료기기는 효과적으로 골 대체 내지 이식 분야에서 활용될 수 있다.

본 발명의 일 실시예에서, 상기 조성물은 복합체를 구성하는 비스포스포네이트 외에 자유 비스포스포네이트를 더 포함할 수 있는 바, 자유 비스포스포네이트를 추가적으로 더 포함하는 경우, 골 생성 증진 효과가 극대화되므로 바람직하다.

본 발명의 일 실시예에서, 상기 이식재는 치주 또는 외과수술용일 수 있는 바, 치과에서 사용하는 임플란트 또는 정형외과에서 사용되는 골 이식재로 사용될 수 있다.

또한, 상기 이식재는 골 조직 수복용, 골 조직 재생용 또는 골 조직 증강용일 수 있으며, 상기 이식재에 조성물이 포함되어 있으므로, rhBMP2 전달을 통해 골 생성을 보다 효과적으로 촉진시킬 수 있다.

본 발명의 일 실시예에서, 상기 이식재는 방출 조절 매트릭스로서 히알루로닉산, 콜라겐, 덱스트란설페이트, 콘드로이친설페이트, 폴록사며, 카보머, 셀룰로오스계 고분자, 메타크릴레이트계 고분자, 폴리락틱산(poly lactic acid; PLA), 폴리글리콜산(poly glycolic acid; PGA), 폴리카플로락톤(poly caprolactone) 및 폴리메틸메타아크릴레이트(poly methyl metha acrylate)로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 고분자를 포함할 수 있는 바, 상기 고분자들을 더 포함함으로써 방출 속도를 조절할 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.

또한, 상기 이식재는 하이드록시 아파타이트(Hydroxyapatite, HA), 인산칼슘(calcium phosphate), 삼칼슘인산(Tri-calcium phosphate, TCP), 사칼슘인산(Tetra-calcium phosphate), 황산칼슘(calcium phosphate), 탈회골기질(Demineralized Bone matrix, DBM), 골형성 단백질(Bone Morphogenic Protein, BMP), 혈소판 풍부 혈장(Platelet-rich plasma, PRP), 골세포 내 성장 인자 및 이들의 조합으로 구성되는 군에서 선택되는 어느 하나 이상을 더 포함하여, 골 생성을 촉진하는 효과를 극대화할 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.

본 발명의 일 실시예에서, 상기 이식재는 하이드로겔(Hydrogel) 상 또는 페이스트(Paste) 상으로 주입 가능하도록 제공될 수 있는 바, 하이드로겔 내지는 페이스트 상으로 주입된 후, 주입된 뼈, 근육, 치아 등 조직 부위에서 딱딱해지고, rhBMP2의 방출이 일어나 골 형성을 증진시킬 수 있다. 이때, 상기 이식재가 고형 상이 아니므로 주입이 훨씬 용이하다는 장점이 있다.

또한, 상기 의료기기는 기재로서 티타늄, 티타늄 합금, 코발트 합금, 스테인리스 스틸, 니티놀, 플래티늄, 이리듐, 나오븀, 탄탈륨, 금, 은, UHMWPE(Ultra High Molecular Weight Polyethylene), PEEK(poly ether ether ketone), 폴리우레탄, 실리콘 엘라스토머, 생체흡수형 폴리머, 산화알루미늄, 지르코늄, 생리적 활성 유리섬유, 실리콘 질소화합물, 칼슘 인산염 및 카본으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나를 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

이때, 상기 생체흡수형 폴리머는 고분자 분열에 의해 생리학적 환경에서 분해되는 생체 적합성이 우수한 폴리머로서, 이의 구체적인 예로는 폴리락틱산(poly lactic acid; PLA), 폴리글리콜산(poly glycolic acid; PGA) 및 폴리카플로락톤(poly capro lactone), 폴리메틸메타아크릴레이트(poly methyl metha acrylate) 등을 예로 들 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다. 다만 하기의 실시예는 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이며 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐이므로 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1> rhBMP2-비스포스포네이트 복합체의 제조

먼저, 비스포스포네이트의 대표적인 예로서 리세드로네이트를 사용하여 rhBMP2(1 mg/ml)-리세드로네이트(1.25 mg/ml) 이온 복합체를 제조하기 위하여, rhMBP2 및 리세드로네이트를 칭량한 후 증류수를 첨가하여 용해시켰다. 이후, 수용성의 두 약물(rhBMP2, 리세드로네이트)이 반대의 전하를 띌 수 있도록 1N 소듐 하이드록사이드로 두 용액의 pH를 5.7-5.8로 조정하였고, 주사기(syringe)에 리세드로네이트 용액을 주입하고 연동 주사기 펌프(peristaltic syringe pump; KDS 100, Kd Scientific, USA)에 장착하였다. 이후, 교반 상태의 rhBMP2 용액에 리세드로네이트 용액을 0.17 ml/mi 속도로 점적 주사하여 rhBMP2-리세드로네이트 이온성 복합체가 생성되도록 하였다. 이때 탁한 용액이 형성되며 실온에서 교반하여 3시간 반응시킨 후, 반응 용액을 미반응 약물과 분리하기 위해 10분간 원심분리(12,000 rpm; Smart R17, Hanil Science, Seoul, Korea)하였다. 또한, 제조 조건의 온도를 4℃로 변화시켰을 때 반응종결시점을 확인하기 위해, 도 1에 나타난 바와 같이, 400nm에서 흡광도 변화를 확인하였다. 미반응 rhBMP2 및 리세드로네이트가 포함된 상층액 분리 후에는 가라앉은 복합체를 동결 건조하여 -20℃에서 보관하였다.

<실시예 2> rhBMP2-리세드로네이트 복합체의 물리화학적 특성 평가 연구

1. 실험 방법

(1) 복합체 형성률(complexation efficiency)의 평가

복합체 형성 후 미반응 rhBMP2 및 리세드로네이트를 정량함으로써 두 약물 간의 반응비를 확인하고 이 결과를 바탕으로 제조조건을 최적화하였다.

구체적으로, 복합체 제조 직후 원심분리를 통해 반응에 참여하지 않은 rhBMP2와 리세드로네이트를 분리하였고, 미반응 rhBMP2를 ELISA(Enzyme-Linked Immunosorbent Assay; RHF913CKX, Antigenix America Inc., New York, NY, USA) kit으로 제조자의 추천 프로토콜에 따라 정량하였고, 이온성 복합체에서 해리된 BMP2의 양을 HPLC 시스템(YL9100, Young Lin Instrument Co. Ltd., Anyang, Korea)을 이용하여 측정하였다. 이때, 분리는 C₄ 컬럼(Vydac 218TP, 4.6 × 250 mm, 5 μm)을 이용하여 수행되었고, 유속은 0.2 ml/min, 주입 부피는 20 μl 였으며, 용출액은 214 nm에서 모니터링되었다. 이동상은 70:30 비율(v/v)의 증류수에 함유된 0.1% 트리플루오로아세트산(TFA) 및 아세토니트릴에 함유된 0.1% TFA(JT Baker, Phillipsburg, NH)로 구성되었으며, 샘플들은 농도 구배에 따라 용출되었고, 이동상은 실험 후 8분 내지 20분에서 20:80(v/v)의 비율로 조절되었다가 20분 후에는 70:30(v/v)으로 회복시켰다.

또한, 미반응 리세드로네이트는 HPLC를 이용하여 정량하였는데, 이때 분리는 C18 역상 컬럼(ZORBAX Eclipse XDB-C18, 4.6 × 250 mm, 5 μm)이 장착된 이온-페어 크로마토그래피를 이용하여 수행되었다. 유속은 1.0 ml/min이었고, 주입 부피는 20 μl이었으며, 용출액은 262 nm에서 모니터링되었다. 역상은 아세토니트릴과 수성 용액(22:78 비율(v/v)의 5 mM 테트라뷰틸암모늄 브로마이드, 5 mM 소듐 파이로포스페이트, pH 7.0)으로 구성되었다.

이렇게 정량한 rhBMP2 및 리세드로네이트를 대상으로, 하기 식을 이용하여 복합체 형성률을 산출하였다.

Complexation efficiency (%) =

× 100

(A는 처음 첨가된 BMP2의 양, B는 상층액에서의 BMP2의 양임)

(2) 복합체로부터 rhBMP2의 in vitro 방출 특성 평가

pH가 각각 4.8, 7.4인 인산 완충 식염수(Phosphate buffer saline; PBS) 및 0.05% 소혈청알부민(BSA)과 0.02%의 소듐 아자이드를 포함하는 인공체액(simulated body fluid, SBF, pH 7.4)과 같은 다양한 in vitro 매질(media) 환경에서의 rhBMP2-리세드로네이트 복합체로부터 rhBMP2의 방출양상을 확인하였다. 즉, 본 실험을 통해 rhBMP2-약물 복합체로부터 rhBMP2 지속 방출 가능 여부를 확인하고 향후 in vivo 효력실험에 사용할 겔 시스템 선정에 근거자료로 활용하고자 하였다.

구체적으로, 125 μg의 BMP2를 함유하는 이온성 복합체를 7 ml씩 36.5℃의 상기 매질에서 각각 인큐베이팅시켰고, 특정 시간 간격마다, 샘플들을 12,000 rpm에서 10분간 원심분리하였으며, 상층액에서 샘플 5 ml를 취하였다. 이후 상층액을 제거한 후, 같은 부피의 신선한 버퍼로 교체하였고, 상층액 분취량에 포함된 BMP2의 양을 인간 BMP2 ELISA kit로 정량하였다.

(3) 입자도(Particle size) 및 다분산지수(PI; Polydispersity index) 측정

먼저, 동적 빛 산란(DLS; Dynamic Light Scattering) 원리를 이용하여 입자크기를 측정하였고, 다분산지수(Polydispersity index; PI) 값을 확인하여 입자크기의 균일성(uniformity)을 확인하였다. 보다 구체적으로, 상기 실시예 1에서 제조한 복합체 현탁액을 0.1% Tween 80 용액에 20배 희석하여 사용하였고, 큐벳에 일정량 담아 입자 크기 분석기(particle size analyzer; ZetaPALS, Brookhaven Instrument, Holtsville, NY, USA)를 이용하여 입자 크기 및 PI 값을 측정하였다.

(4) 전자현미경(Electron Microscope)을 이용한 입자 형태 관찰

전자현미경은 고진공하에서 고전압을 필라멘트에 가하여 전자빔을 생성시킨 다음 시료와 반응시켜 시료의 미세구조에 대한 정보를 얻는데 사용된다. 이에, 본 발명에서는 rhBMP2-리세드로네이트 복합체의 형태(morphology)를 확인하기 위해 전자투과현미경 및 투과전자현미경을 이용하였다.

구체적으로, 투과전자현미경을 이용하여 형태를 관찰하기 위해, 상기 실시예 1에서 제조된 복합체를 증류수에 분산시킨 다음, 탄소-코팅된 구리 그리드(carbon-coated copper grid)에 떨어뜨린 후 필터 페이퍼를 이용하여 10분간 건조시켰다. 건조 후 80kV 가속 전압 하에서 50,000 내지 200,000X의 확대율을 갖는 투과전자현미경(TEM, H-7500, HITACHI Ltd., Japan)으로 관찰하였다. 또한, 주사전자현미경을 통한 형태 관찰을 위해, 금-팔라듐(gold-palladium)을 이용하여 복합체 표면을 코팅한 다음 주사전자현미경(SEM, S-4200, HITACHI Ltd., Japan)을 이용하여 입자표면을 관찰하였다.

(5) Cytoviva ^TM 어댑터가 장착된 초분광 현미경을 이용하여 복합체 관찰

Cytoviva^TM 어댑터가 장착된 초분광 현미경은 고해상도 일루미네이터(High Resolution Illuminator)와 듀얼 모드 형광(Dual Mode Fluorescence)을 접목시킨 광학장비로 별도의 염색 없이도 살아있는 세포 및 나노 크기의 입자를 관찰할 수 있는 장비이다. 본 실험에서는 나노 입자의 rhBMP2-리세드로네이트 복합체에 매핑(mapping) 기법을 적용한 다음 초분광현미경(Aetos Technologies Inc., Auburn, AL, USA)을 이용해 관찰함으로써 두 약물의 반응 여부를 육안으로 확인하였다.

구체적으로, BMP2 및 리세드로네이트의 분취 용액을 슬라이드 글라스에 떨어뜨린 후, 400 내지 1000 nm 파장범위에서 스캐닝 과정을 통해 두 약물의 스펙트럼 프로필(spectral profile)을 얻고, 각각의 약물이 흡수하는 특정 흡수(specific absorption) 파장을 선별한 다음 rhBMP2 및 리세드로네이트를 파란색 및 빨간색으로 설정하여 레퍼런스를 설정하였다. 그 다음 위와 동일한 과정을 통해 얻은 rhBMP2-리세드로네이트 복합체의 스펙트럼 프로필(spectral profile) 결과에 미리 설정해 둔 레퍼런스 값을 이용하여 매핑(mapping) 과정을 거치면 rhBMP2-리세드로네이트 복합체 구성성분이 설정된 색(파란색 및 빨간색)으로 표시되는 원리를 이용하여 관찰하였다.

(6) FT-IR (Fourier transform infrared spectroscopy)

FT-IR(Fourier transform infrared spectroscopy)은 시료에 적외선을 조사하였을 때 주파수 변화에 따라 시료분자 골격의 진동, 회전에 대응하는 에너지의 흡수를 측정하는 방법이다. 유기화합물을 구성하는 작용기는 고유의 진동스펙트럼을 나타내므로 흡수 스펙트럼으로부터 시료의 정성 및 정량분석이 가능하다. 이에, 본 실험에서는 FT-IR을 이용하여 반응에 참여한 작용기에 대한 정보와 곡선 맞춤(curve fitting) 기법을 접목시켜 1600-1700cm^-1범위의 스펙트럼에서 도 5에 개시된 바와 같이, BMP2의 2차 구조 변화여부를 확인하였다. 보다 구체적으로, 모든 시료들을 KBr 분말과 혼합하고, 7.54 ton/cm²의 압력으로 디스크를 준비하였다. 시료들의 스펙트럼은 상기와 같이 FT-IR 분광광도계(Varian 1000 FT-IR, Varian, USA)를 이용하여 얻었으며, 각 시료 별로 4 cm^- ¹의 해상도에서 총 32개의 검사가 수행되었다. 모든 스펙트럼은 아마이드 I 지역(1600~1690 cm^- ¹)에서 2차 유도체화 및 Omnic software (Nicolet, Waltham, MA)를 통해 분석되었고, 도치된 2차 유도체화 스팩트럼은 가우스 밴즈 프로필과 맞아떨어졌다. 또한, 아마이드 I 지역에서 각 성분들의 구역은, 모든 피크들의 지역의 총합으로 나누어 성분의 피크 구역을 계산함으로써 결정하였으며, 그 결과는 %로 표시하였다.

(7) 원 자외선 원편광이색분광법(Far-ultraviolet CD; Far-ultraviolet circular dichroism)

직선편광의 편광면을 회전시키는 성질을 광학활성이라 하고 이러한 현상을 선광이라 한다. 단백질 및 핵산과 같은 생체분자의 경우 광학활성을 지니고 있으며 직선편광에 노출시켰을 때 시료에 의하여 파장변화에 따라 선광도가 변화하는데, 원편광이색분광법(circular dicroism, CD)은 파장변화에 따른 선광도 변화를 측정하여 생체분자의 입체구조를 분석하는 방법이다. CD 스펙트럼에서, 원자외선 영역(178-260 nm)에서의 흡수는 펩타이드 본드와 관련이 있고, 220 nm 및 190 nm에서의 흡수는 각각 n→π^* 전이 및 π→π^* 전이와 관련이 있다. 이 구역의 CD 스펙트럼의 변화는 단백질의 형태에 민감하다.

본 실험에서는 CD를 이용하여 네이티브(native) rhBMP2와 복합체 형성에 참여한 rhBMP2 간의 선광도 차이를 통해 2차 구조 변화 여부를 확인하였다.

구체적으로, 상기 실시예 1에서 제조한 복합체를 증류수에 분산시킨 다음 pH를 조절하여 두 약물을 해리시킨 용액과 1mM HCl에 용해된 6.54 μM의 rhBMP2 용액(0.17 mg/mL; 대조군)을 준비하였다. 원심분리 필터 디바이스(Amicon Ultra, 3000 MWCO, Millipore Corp., USA)를 사용하여 CD 스펙트럼 측정 시 방해가 될 수 있는 부형제 등을 제거하였고, 1 mm 경로-길이 셀(path-length cell)에 준비해놓은 시료를 질소 공기하에서 담은 다음, Jasco J-715 부분광편광계(spectropolarimeter; JASCO, Tokyo, Japan)에 장착하고 원자외선(190~250nm) 파장대에서 CD값 변화를 모니터링하였다. 이때 100 nm/min의 스캔 속도로 6번의 검사가 축적되었고, 모인 스펙트럼들은 백그라운드 버퍼로 교정하였다. 2차 구조 성분의 함량은 Jasco 2차 구조 측정 프로그램(secondary structure estimation program)을 통해 계산하였다.

2. 실험 결과

(1) 입자도(Particle size) 및 PI(Polydispersity index) 측정

제조된 rhBMP2-리세드로네이트 복합체의 입자크기는 약 326 ± 149 nm 이며, PI 값은 0.2~0.3 이었다. 또한, 반응 종결 시간을 확인한 결과, 도 1에 나타난 바와 같이, 대략 3시간 후에 복합체 형성 반응이 완결되며, 온도는 반응 종결 시간에 영향을 미치지 않는 것을 확인할 수 있었다. 또한, PI 값을 미루어 볼 때, 균일한 입자분포도를 보이는 것을 확인할 수 있었다.

(2) 전자현미경(Electron Microscope)을 이용한 형태 관찰

복합체의 형태를 관찰한 결과, 도 2에 나타난 바와 같이, rhBMP2-리세드로네이트 복합체는 표면이 매끈한 구형의 입자로 비교적 균질한 입자분포를 보이며 입자도 분석 결과와 같은 약 300 nm 전후의 입자크기를 보였다((A) 내지 (C): 5000X 배율의 TEM 이미지, (D) 내지 (F): 25000X 배율의 SEM 이미지).

(3) Cytoviva ^TM 어댑터가 장착된 초분광 현미경을 이용하여 복합체 관찰

도 3에 나타난 바와 같이, 복합체 내에 파란색으로 설정된 rhBMP2와 빨간색으로 설정된 리세드로네이트가 오버래핑(overlapping) 되는 것을 확인하였다. 이러한 결과는 rhBMP2와 리세드로네이트 사이의 상호 영향을 미치고 있음을 알 수 있다.

(4) FT-IR (Fourier transform infrared spectroscopy)

두 약물간의 반응과 관련한 작용기 확인 및 rhBMP2의 구조적 견고성을 확인한 결과, 도 4에 나타난 바와 같이, 두 약물의 반응을 통해 형성된 rhBMP2-리세드로네이트의 스펙트럼에서 P=O 피크(1300-1240cm^-1)의 이동(shift)과 P-O 피크(1088-920cm^-1)의 감소가 확인되었다. 또한, 스펙트럼에는 1,134 cm^-1 근처에서 포스페이트 에스터(-POO^-)기의 대칭적 스트레칭 진동 및 1,385cm^-1 근처에서 C-P 기의 진동에 의해 야기된 구별되는 피크가 나타났는데, 이러한 피크들은 리세드로네이트의 특징적인 피크였다. 이러한 결과는 리세드로네이트의 포스페이트에스터 기의 음전하가 BMP2의 양전하를 띠는 아민그룹과의 상호작용하는 것을 나타낸다.

또한, FT-IR 실험은 구조적인 변화에 대한 정보 또한 제공해주는데, 단백질과 아마이드 I 및 II 밴드의 구조적 안정성들이 가장 두드러진 진동성 밴드로 나타나고, 또한 단백질의 구조를 분석하는 데에 사용된다. 먼저 아마이드 I 밴드(1,600~1,690 cm^-1)는 오버래핑되는 성분 밴드들(α-헬릭스, β-시트, 턴, 랜덤)의 합으로서 대부분 폴리펩타이드 백본의 C=O(80%) 스트레칭 진동과 관련이 있고, 그 밴드의 형상은 단백질 구조에 아주 민감하다. 대조적으로, 아마이드 II 밴드(1,480~1575 cm^- ¹)는 CN- 스트레칭 및 N-H 벤딩 진동과 관련이 있다.

도 5에는, 아마이드 I 지역(1600~1690 cm-1)에서 곡선 맞춤 결과와 복합체로부터의 BMP2의 2차 유도체화 스펙트럼이 나타나있다. 빨간 곡선은 곡선 맞춤 접근에 의해 확인된 서로 다른 구조적 성분들에 대응하는 오리지널 스펙트럼 및 피크이다. 복합체의 BMP2는 1656 cm^-1에서 약한 밴드를 나타내는데, 이는 α-헬릭스를 의미하며, 1627 cm^-1에서 나타나는 강한 밴드는 β-시트와 관련이 있다. 게다가, 1672 cm^-1 및 1646 cm^-1에서의 밴드들은 각각 무질서 구조 및 베타-턴으로 식별된다. BMP2의 구조적 성분 피크의 파상수(wavenumber)는 복합체에서의 BMP2와 하기 <표 1>에 나타난 바와 같이, 서로 밀접한 상관관계를 나타낸다. BMP2의 구조적 요소들의 상대적인 퍼센티지를 나타낸 하기 표 1을 참조하면, BMP2의 2차 구조는 10.7%의 α-헬릭스 구조, 24.4%의 β-시트 구조를 포함함을 나타낸다.

즉, 하기 표 1 및 도 5에 따르면, 네이티브 BMP2의 2차 구조 성분비와 복합체 내 rhBMP2의 2차 구조 성분비가 일치하는 것을 확인할 수 있었다. 이는 복합체 형성에 따른 rhBMP2의 구조적 변화가 없음을 보여주는 결과라 할 수 있다.

conformations	native BMP2 ^‡		BMP2 in complex
conformations	Position ^a (cm ^-1 )	Area ^b ( % )	Position (cm ^-1 )	Area ( % )
α-Helix	1656-1658	12±1	1656	10.7
β-Sheet	1615-1640	26±4	1627	24.4
unordered	1642-1648	10±1	1646	40.3
β-turn	1660-1673	26±2	1672	12.9
β-antiparallel	1680-1692	26±3	1686	11.7

(^‡: 네이티브 BMP2의 구조적 비율은 Nie et al 을 참조하였음, ^a: 아마이드 I 밴드에서의 최대 파상수, ^b: 아마이드 I 밴드에서 2차 구조 성분의 퍼센티지 구역)

(5) CD (circular dichroism)

rhBMP2-리세드로네이트 복합체 제조과정 중 rhBMP2의 구조적 변화를 확인하기 위해 CD를 수행한 결과, 도 6에 개시된 바와 같이, 모든 스펙트럼들은 198 nm 및 218 nm에서 최소값을 나타낸다는 특징을 보였다. 게다가, 스펙트럼의 모양은 대부분 베타-시트 구조를 포함하는 전형적인 단백질을 나타냈다. 즉, 네이티브 BMP2와 복합체를 해리하여 얻은 rhBMP2간의 α-헬리컬(helical; 218nm) 및 랜덤 코일(random coil; 198nm)의 구조변화가 없었다. 각 2차 구조의 정량적 함량은 CD 스펙트럼에 기반하여, Jasco 이차 구조 계산 프로그램을 이용하여 퍼센테지로 나타내었다. 하기 <표 2>를 참조하면, 각 샘플들의 2차 구조는 네이티브 BMP2 및 재용해된 BMP2 사이에 우수한 상관 관계가 있음을 나타내며, 이는 복합체 제조과정 및 제조 후 복합체 내 단백질의 구조적 안정성이 유지되는 것을 보여주는 결과라 할 수 있다.

	네이티브 BMP2 in 1 mM HCl (%)	복합체로부터 재용해된 BMP2 (동결 건조 처리) (%)	복합체로부터 재용해된 BMP2 (동결 건조 비처리)(%)
α-Helix	2.6	0.0	0.0
β-Sheet	51.9	50.5	55.1
Turn	6.3	4.0	2.6
Random	39.2	45.5	42.3
Total	100.0	100.0	100.0

다만, CD에서 측정된 2차 구조에 관한 결과는 FT-IR과 약간 다른데, 이 두 결과는 단백질의 구조적 변화를 해석하기 하는 데에 상호 보완적으로 사용된다. FT-IR에서 얻은 2차 구조의 함량 값과 CD에서 얻은 값이 다르다고 하더라도, 분광광도계적 분석에 있어서 복합체 형성 과정 전후로 단백질이 2차 구조의 견고성을 유지하고 있다고 고려될 수 있다. 게다가, 동결 건조 과정은 구조적 변화를 유도하지 않았으며, 도 6을 참조하면, 샘플들의 차이점은 나타나지 않았다(실선 및 점선).

(6) 복합체 형성률(complexation efficiency)의 평가

복합체 형성률을 측정한 결과, rhBMP2와 리세드로네이트는 1:20의 분자량(molar ratio)으로 반응하며 rhBMP2는 95% 이상의 복합체 형성률을 보이는 것을 확인하였다.

(7) 복합체로부터 rhBMP2의 in vitro 방출특성 평가도

방출 매질 종류에 따라 rhBMP2의 방출양상이 달라지는데, 도 7에서 보아 알 수 있듯이 7일 동안 서로 다른 방출 매질에서의 복합체에서의 BMP2 방출 시간을 나타내는데, SBF에서는 복합체로부터 BMP2의 방출이 가장 빨랐고, 7일 후에는 복합체로부터 거의 100%의 단백질이 방출되었다. PBS에서 BMP2의 pH에 따른 방출 패턴에 따르면 높은 pH에서보다 낮은 pH에서의 방출이 더 빨랐다. 복합체에서 방출된 BMP2의 양은 약 39%(PBS, pH 7.4) 및 81%(PBS, pH 4.8)이었으며, 이러한 실험 결과를 바탕으로, 복합체 형성을 통해 rhBMP2의 방출제어가 가능함을 확인하였다.

<실시예 3> rhBMP2-리세드로네이트 복합체가 rhBMP2의 활성에 미치는 영향 평가; SDS-폴리아크릴아미드겔전기영동(SDS-PAGE)

rhBMP2의 구조적 안정성을 확인하기 위해 전기영동 분석을 수행하였다. 구체적으로, 분석은 XCell SureLock　 Mini-cell gel running tank와 NuPAGE　 MES SDS running buffer(invitrogen GmbH, Karlsruhe, Germany)을 이용하였다. 복합체가 포함된 동일한 시료 두 개를 준비한 다음, 하나의 시료에 BoltTM LDS 샘플 버퍼를 처리하여 비-환원 샘플(non-reduced sample)을 제조하고, 또 하나의 시료에 BoltTM 샘플 환원제(sample reducing agent)를 처리하여 환원된 샘플을 제조하였다. 이후, 샘플을 70℃에서 10분간 가열한 다음 원심분리하고, NuPAGE　Novex Bis-Tris pre-cast gel(4~12 %, 1 mm)의 각 래인(lane)에 20 ul를 로딩하였다. 200V의 전압조건에서 35분간 전기영동을 실시한 다음 실버 염색 키트(silver staining kit; Komabiotech, Seoul, Korea)를 이용하여 단백질 밴드를 확인하였다.

그 결과, 도 8에 나타난 바와 같이, 네이티브 rhBMP(비환원 형태)와 복합체 형성 후 재용해된 rhBMP2(약 26 kDa; 호모다이머)는 전기영동 겔 상에서 동일한 단백질 밴드 패턴을 보였다(도 8B 및 D). 이는 단량체들 사이의 이황화 결합이 유지됨을 보여준다. 그리고 환원제(reducing agent)를 처리했을 때, 네이티브 rhBMP2와 재가용된 rhBMP2 샘플에서 동일한 분자량의 단량체 밴드(monomer band; 약 13 kDa)가 확인되었으며(8A 및 C), 복합체에서 얻은 재가용된 rhBMP2 샘플에는 고분자량 종(high molecular weight species)이 함유되어 있지 않은 것을 확인하였다(Lane 1, Lane 5: 기준 마커, Lane 2, Lane 6: 비환원 네이티브 rhBMP2, Lane 3, LAne 7: 동결건조 비처리-복합체에서 해리된 rhBMP2, Lane 4, 8: 동결건조 처리-복합체에서 해리된 rhBMP2).

<실시예 4> In vitro 세포-기반 활성 어세이(cell-based activity assay)

1. 실험 방법

(1) C2C12 세포 배양 및 조골세포로의 분화

상기 실시예 1에서 개시한 방법대로, rhBMP2-리세드로네이트 외에, 비스포스포네이트에 속하는 다른 화합물(알렌드로네이트, 졸레드로네이트, 이반드로네이트)을 사용하여 복합체를 더 제조하였고, 상기 복합체들의 in vitro 세포-기반 활성 확인을 위해 뮤린 C2C12 골격계 근아세포(skeletal myoblast)를 사용하였다. C2C12 세포는 10 %(v/v) 우태아혈청(fetal bovine serum; FBS), 100 U/ml 페니실린 및 100 μg/ml 스트렙토마이신이 함유된 DMEM(Dulbeccos Modified Eagles Medium)을 이용하여 37℃, 5% CO₂ 조건에서 배양하였으며, 일주일에 세 번씩 배지를 갈아주었다. 조골세포로 분화시키기 위해 샘플과 2 % (v/v) FBS를 함유한 DMEM을 사용하여 배양하였고, 또한 세포 배양 배지는 세포를 실험에 알칼라인 포스파타아제(ALP) 실험에 사용할 때까지 매일 갈아주었다.

(2) 세포 생존율 확인

rhBMP2-비스포스포네이트 복합체의 세포독성 유무 확인 및 세포에 처리할 시료 농도의 확인을 위해 MTT 어세이를 수행하였다. 96 웰 플레이트에 2 × 10³ cells/well 이 되도록 C2C12 골격계 근아세포를 분주한 다음 24시간 동안 37℃, 5 % CO₂ 조건에서 배양하였다. 배양 후, 준비된 세포에 2 % FBS를 함유한 DMEM와 복합체가 포함된 시료를 처리하고 48시간(2일)동안 37℃, 5% CO₂ 조건에서 다시 배양한 뒤, 시료를 제거하고 PBS를 이용하여 세척한 다음 티아졸릴 블루 테트라졸리움 브로마이드(thiazolyl blue tetrazolium bromide; MTT) 용액을 처리하였으며, 2시간 동안 37℃, 5% CO₂ 조건에서 배양하였다. 이후, 포르마잔 크리스탈이 생성되면 디메틸 설폭시드(dimethyl sulfoxide; DMSO) 용액을 첨가하여 크리스탈을 용해시키고 5분간 교반하였다. VERSA 맥스 마이크로플레이트 리더기(max microplate reader; Molecular Devices, Sunnyvale, CA)를 이용하여 560 nm에서 흡광도를 측정하고 대조군 대비 % cell viability로 결과를 산출하였다. 이때, 모든 샘플들에서 BMP2 300 ng/ml와 함께 동등하게 배양되었고, 각 비스포스포네이트의 처리량은 알렌드로네이트 및 졸레드로네이트가 0.1 μM, 아이반드로네이트가 1 μM, 및 리세드로네이트가 0.3 μM였다.

(3) 알칼라인 포스파타아제(ALP; alkaline phosphatase) 활성 측정

ALP는 조골세포(osteoblast)-특이적 마커로서 ALP 활성의 증가는 미분화 근육세포인 C2C12의 조골세포로 분화를 의미한다. 이에, rhBMP2-리세드로네이트 복합체의 조골세포로의 분화능을 ALP 활성 측정을 통해 확인하였다.

구체적으로, 12 웰 플레이트에 1 × 10⁴ cells/well 이 되도록 C2C12 골격계 근아세포를 준비한 다음 24시간 동안 37℃, 5 % CO₂ 조건에서 배양하였다. 준비된 세포에 2 % FBS를 함유한 DMEM와 복합체가 포함된 시료를 처리하고 7일 동안 37℃, 5 % CO₂ 조건에서 배양하였고, PBS를 이용하여 세척한 다음 세포 용혈 버퍼(cell lysis buffer; RIPA buffer, Thermo Scientific, Waltham, MA, USA)를 첨가하여 세포 용해를 유도하였다. 원심분리(12,000 rpm, 10 min, 4℃)하여 세포 용해물(cell lysate)을 분리하고, 세포 용해물 내 총 단백질 함량과 ALP 활성을 각각 바이신코닉(bicinchoninic acid; BCA) 방법과 LabAssay^TM ALP kit(Wako Pure Chemical Industries, Ltd., Osaka, Japan)를 이용하여 정량하였다. 이때, 실험은 총 3번 반복수행하였으며, ALP 활성은 아래의 식 2를 이용하여 산출하였고, 단백질의 양으로 표준화시켰으며, 단백질 함량당 방출된 p-니트로페놀의 mmol/L으로 표현하였다.

<식 2>

(4) 정량적 실시간 PCR(Quantitative real-time PCR; polymerase chain reaction)

ALP 및 타입 I 콜라겐은 초기 골아세포 분화(osteoblastic differentiation)에 발현되는 마커로서 해당 mRNA 발현을 실시간 PCR을 활용하여 정량하고자 하였다. 즉, 조골세포 분화와 관련한 mRNA 발현 정량을 통해 rhBMP2-리세드로네이트 복합체의 골분화능을 확인하였다.

구체적으로, 12 웰 플레이트에 1 × 10⁴ cells/well 이 되도록 C2C12 골격계 근아세포를 준비한 다음 24시간 동안 37℃, 5 % CO₂ 조건에서 배양하였다. 준비된 세포에 2% FBS를 함유한 DMEM와 샘플을 처리하고 3, 5, 7일 동안 37℃, 5 % CO₂ 조건에서 배양하였다. Accuzol^TM 시약(reagent)을 이용하여 총 RNA를 분리하였는데, 이때 RNA의 순도와 농도는 NanoDrop(Thermo Fisher Scientific, Wilmington, DE)을 이용해 측정하였고, 총 RNA, 올리고-dT18 primer, RevertAid^TM M-MuLV 역전사효소(Reverse Transcriptase)를 이용하여 첫 번째 가닥 cDNA(first-strand cDNA)를 합성하였다. 이렇게 합성한 cDNA 및 LightCycler 480 Real-Time PCR System (Roche Diagnostics, Meylan, France)을 이용하여 SYBR 그린(green)-기반 정량적 PCR 분석을 수행하였고, 이때 분석에 사용된 프라이머 염기서열은 아래의 <표 3>과 같았다.

유전자	종류	염기서열	서열번호
ALP	정방향	ATGGGCGTCTCCACAGTAAC	1
ALP	역방향	TCACCCGAGTGGTAGTCACA	2
Type 1 collagen	정방향	ACGTCCTGGTGAAGTTGGTC	3
Type 1 collagen	역방향	CAGGGAAGCCTCTTTCTCCT	4
GAPDH	정방향	AACTTTGGCATTGTGGAAGG	5
GAPDH	역방향	ACACATTGGGGGTAGGAACA	6

이때, 상대적인 양은 GAPDH-표준화된 2^-△△Ct를 통해 계산하였다.

2. 실험 결과

(1) 세포독성 확인

복합체의 세포 독성을 확인한 결과, 도 9에 나타난 바와 같이, 재용해된 BMP2 및 복합체는 100 내지 400 mg/nl의 범위에서 세포독성을 나타내지 않았다. 또한, 도 10에 나타난 바와 같이, 총 네 가지의 비스포스포네이트의 세포 독성을 확인한 결과, 0.5 μM의 비스포스포네이트, 즉 알렌드로네이트(Aln) 및 졸레드로네이트(Zol)는 80% 이하의 세포 생존율을 나타냈고, 반면에 다른 비스포스포네이트 화합물(아이반드로네이트; Iban, 리세드로네이트; Ris)들은 0.1 μM 내지 1 μM에서 세포 독성을 나타내지 않았다. 특히 리세드로네이트(Ris)의 경우 323.1 ~ 1615.1 ng/ml (0.1 ~ 5 uM) 농도범위에서 80 % 이상의 세포 생존율을 나타내었다.

(2) ALP(alkaline phosphatase) 활성 측정

조골세포 특이적 마커인 ALP의 증가된 활성은 C2C12 근아세포에서 조골세포 분화를 의미한다. 이에, rhBMP2-비스포스포네이트 복합체들의 효과를 확인하기 위해, ALP 함량변화를 kit를 이용하여 측정한 결과, 도 11에 나타난 바와 같이, 리세드로네이트, 알렌드로네이트, 조레드로네이트, 이반드로네이트들의 단독 처리 시에는 ALP 활성이 증가하지 않은 반면, 도 12에 나타난 바와 같이, BMP2 및 비스포스포네이트들의 조합을 함께 처리하는 경우, BMP2만을 단독 처리하는 것보다 ALP 활성이 더욱 크게 증가하였다.

이후, 복합체의 인 비트로 생활성을 C2C12 세포를 대상으로 7일간의 분화 시간 동안 ALP를 측정함으로써 확인하였다. 그 결과, 도 13에 나타난 바와 같이, 복합체에서 방출 및 재용해된 BMP2는 미분화된 C2C12 근아세포를 조골세포로 분화시키는 생활성이 여전히 유지됨을 확인하였다. 동등한 양의 BMP2 단독 처리 시와 비교하면 ALP의 양이 증가하였다.

이 결과를 바탕으로 볼 때, 복합체 형성을 통해 조골세포로의 분화능 유지뿐 아니라 리세드로네이트를 비롯한 비스포스포네이트에 의한 rhBMP2의 조골세포 분화능에 긍정적인 영향을 미친다는 것을 알 수 있었다.

(3) 정량적 실시간 PCR 결과

복합체로부터 방출 및 재용해된 BMP2의 조골세포 분화 활성을 확인하기 위하여, 조골세포 분화 초기 단계의 분자적 마커의 mRNA 발현 양을 정량적 실시간 PCR을 통해 확인한 결과, 도 14에 나타난 바와 같이, BMP2를 단독으로 처리했을 경우와 비교할 때 리세드로네이트 단독 처리 시 ALP 및 타입 I 콜라겐 mRNA는 증가하지 않았으며, 타입 I 콜라겐 mRNA 발현은 음성 대조군과 비교했을 때 감소하는 것을 확인하였다. 반면에, rhBMP2-리세드로네이트 복합체(Com) 및 복합체로부터 재용해된 rhBMP2(dis-Com) 처리는 ALP 및 타입 I 콜라겐 mRNA를 증가시키나 유의적 차이를 보이지 않았다. 이러한 결과는 인 비트로 ALP 활성 측정 실험의 결과와 일치한 것이었다.

<실시예 5> In vivo 골 형성(osteogenic) 효과 확인

1. 실험 방법

(1) 겔 시스템의 선정

높은 생체적합성을 지닌 히알루론산(hyaluronic acid; HA) 및 폴록사머 407 (Pluronic F-127, P407) 하이드로겔을 담체로 활용하였다. 폴록사머 407의 경우 온도감응특성으로 4℃ 냉장조건에서 균질액이 되도록 교반하여 제조하였고, 동물모델에 주입 직전 rhBMP2-리세드로네이트 복합체와 혼합하여 사용하였다.

(2) 수술 절차

40개체의 Sprague-Dawley(SD) 랫트(7주령)를 각 그룹으로 나누고 2.5% 트리브로모에탄올을 이용하여 마취한 다음, 하기 <표 4>에 나타난 바와 같이, rhBMP2-리세드로네이트 복합체를 포함하는 시료를 함유한 두 종류의 하이드로겔 시스템을 뒷다리 근육(왼쪽 :히알루론산, 오른쪽 : 폴록사머 407)에 주입하였다. 즉, 100 μl의 HY 하이드로겔 군을 랫트의 왼쪽 뒷다리 근육에, 100 μl의 P407 하이드로겔 군을 오른쪽 뒷다리에 주입하였다. 모든 시료들은 하이드로겔 당 105 μg의 BMP2를 포함하고 있었고, BMP2 및/또는 리세드로네이트를 포함하지 않는 하이드로겔은 음성 대조군(n=5)으로 사용하였다.

(B: BMP2 용액, BR-L: BMP2 및 저용량의 리세드로네이트의 혼합물, BR-H; BMP2 및 고용량의 리세드로네이트의 혼합물, C: 이온성 복합체, CR-H: 복합체 및 고용량의 리세드로네이트, HY: 히알루론산, P407: 폴록사머 407)

주입 후 4주가 지난 뒤, 각 랫트들을 다양한 실험에 활용하였으며, 모든 동물실험의 과정은 부산대학교 병원 동물 실험 윤리 위원회(PNUH-2014-059)에서 승인받은 대로 수행하였다.

(3) In vivo CT 스캐닝

상기에서 제조한 샘플을 함유한 겔 시스템을 뒷다리 근육에 주입한 뒤, 주입부위에서 신생골 생성여부를 확인하기 위해 CT 스캐닝을 수행하였다. 먼저, 아이소플루레인(Isoflurane; IFRAN LIQ, Hana Pharm. Co., Korea)을 이용하여 마취한 뒤, 마취된 랫트를 스캐너 위에 고정시켰다. 이후, small-animal imaging system (Inveon, Siemens Preclinical Solutions, Knoxville, TN, USA)을 이용하여 이미지를 촬영하였는데, 이때 80 kV 및 500 μA에서, 800 ms 시간에 노출되었으며, 40 μm 공간적 해상도의 조건 하에서 수행되었다.

CT 촬영을 통해 얻은 단층 X선 사진(tomographic image)에서 3-D 이미지를 얻기 위해 용적 측정 재구성(volumetric reconstruction)을 수행하고, 이미지 분석 소프트웨어(Image analysis software; Inveon Research Workplace (IRW) version 2.2, Siemens Medical Solutions USA Inc, Knoxville, USA)를 이용하여 신생골의 무기질화된 골 부피(mineralized bone volume; MBV, mm³)값을 산출하였다.

(4) 조직학적 평가(Histological evaluation)

신생골의 조직학적 평가를 수행하기 위해 CO₂를 이용하여 랫트를 희생시키고, 겔 시스템을 주입한 부위에서 신생골을 적출해 낸 다음 10 % 중성 완충 포르말린(neutral buffered formalin; Sigma, St. Louis, MO) 용액에 담가 고정시킨 후, 에틸렌 다이아민 테트라 아세트산(ethylene diamine tetra acetic acid; EDTA)을 이용하여 5일간 탈회하였다. 조직 샘플은 파라핀을 이용하여 포매(embedding)하고 4 μm 두께로 잘라 조직절편을 제조하였고, 슬라이드 글라스에 상기 조직 절편을 H&E(Hematoxylin & eosin) 염색한 다음 현미경(Olympus-X-71, Olympus America Inc, USA)으로 관찰하였다.

(5) 통계학적 분석

본 실험에서 모든 정량적 데이터는 평균±표준편차(SD)로 나타내었으며, 통계학적 분석은 일원분산분석(One-way ANOVA)를 통해 이루어졌다. 또한, 차이의 유의성은 일원분산분석에 의해, 다중비교 방법으로서 Student-Newman-Keuls test 및 Tukey를 이용하여 결정하였고, p < 0.05 값을 나타낼 때 통계학적으로 유의하다고 간주되었다.

2. 실험 결과

(1) in vivo CT 스캐닝

복합체 형성을 통한 골형성 증진과 화합물에 의한 상승효과를 확인하고자 동물 실험을 수행한 결과, 주입 4주 후 두 종류의 겔 시스템은 완전히 분해되며, 시료를 함유한 두 종류의 겔 시스템을 양쪽의 뒷다리 근육에 주입했을 때 주입 부위에서 신생골이 형성되었다. 구체적으로, 이소성(ectopic) 뼈의 경축(transaxial) 섹션 및 3차원 μCT 재건 이미지를 나타낸 도 15에 개시된 바와 같이, 섬유주(trabecular)와 같은 뼈 구조의 경축 섹션 이미지가 관찰되었으며, 이때 골수가 섬유주 내에서 발견되었다.

또한, 도 16에 나타난 바와 같이, 이소성 뼈의 생성이 음성 대조군 및 BMP2-프리 하이드로겔을 주입한 군을 제외한 모든 처리군에서 나타났다. 대표적인 경축 섹션 및 3D 이미지는 폴록사머 407(P407) 하이드로겔(오른쪽 뒷다리)에서 새롭게 생성된 뼈가 히알루론산 하이드로겔(왼쪽 뒷다리)에 비해 더 현저히 나타났음을 보여준다. 즉, 겔 시스템의 종류에 따라 생성된 신생골의 무기질화 된 골 부피(mineralized bone volume; MBV) 간 차이를 보이며, 히알루론산(HA) 겔 시스템 대비 폴록사머 407 (P407) 겔 시스템을 적용했을 때 신생골의 MBV값이 증가하였다.

스캔 이후, 신생골의 순부피(BV, mm³)를 골수 부위에서 멀리 떨어진 섬유주 같은 뼈 구조를 선택하여 측정되었다. 그 결과, 히알루론산-기반 하이드로겔의 처리 시에는 복합체 처리군의 BV가 용액 처리군보다 높았는데, 복합체의 BV가 BMP2 용액 처리군에 비해 약 2.0배 가량 증가하였다. BMP2 용액을 처리한 군에 리세드로네이트를 함께 처리한 경우에는 BMP2 용액과 비교했을 때 BV 값이 낮았다. 결과적으로, 도 17에 나타난 바와 같이, 히알루론산 기반 하이드로겔을 사용한 경우에 단순히 BMP2에 리세드로네이트를 첨가하더라도 골 형성 증가를 나타내지는 않았고 복합체를 처리한 군에서는 BV가 증가함을 알 수 있었다.

또한, 도 18에 나타난 바와 같이, 폴록사머-기반 하이드로겔 처리 시, BMP2 만 처리한 군 및 BMP2와 리세드로네이트를 혼합한 경우에 비하여 복합체를 처리하였을 때 BV가 증가하였다.

이러한 리세드로네이트의 상승효과는 리세드로네이트 자체의 골 형성 효과 또는 파골 세포 억제에 의한 가능성이 있을 수 있다.

(2) 조직학적 평가

신생골의 조직학적 평가 결과, 도 19(A)에 나타난 바와 같이, BMP2-프리 하이드로겔 처리 대조군에서는 겔 시스템에 의한 골 형성 반응 내지 염증 반응을 보이지 않았고, 하이드로겔은 주입 4주 후 완전히 분해되었다.

또한, 대조군을 제외한 모든 처리군에서 H&E 염색으로 신생골이 관찰되었고, 주입 부위는 숙주 근육으로 둘러싸인 활성화된 조골세포와 조혈 골수를 포함한 새로운 골질 섬유주로 대체되었다(도 19(B) 및 (C)).이러한 결과는 상기 CT 스캐닝 실험 결과와 일치하는 것이었다.

이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 즉, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다.

<110> INDUSTRY ACADEMIC COOPERATION FOUNDATION KEIMYUNG UNIVERSITY <120> {Complex Consist of Recombinant Human Bone Morphogenetic Protein and Composition Comprising the Same} <130> ADP-2017-0397 <160> 6 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 1 atgggcgtct ccacagtaac 20 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 2 tcacccgagt ggtagtcaca 20 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 3 acgtcctggt gaagttggtc 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 4 cagggaagcc tctttctcct 20 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 5 aactttggca ttgtggaagg 20 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 6 acacattggg ggtaggaaca 20

Claims

재조합 인간 골 형성 단백질 2(rhBMP2)의 양전하를 띠는 아민기와, 비스포스포네이트(bisphosphonate)의 음전하를 띠는 인산기가 이온결합하여 생성된 것을 특징으로 하는 복합체.
제 1 항에 있어서, 상기 비스포스포네이트는 리세드로네이트(risedronate), 모노소듐 알렌드로네이트, 디소듐 파미드로네이트, 모노소듐 올파드로네이트, 아미노-알렌드로네이트, 아미노-디메틸-알렌드로네이트, 아미노-파미드로네이트, 아미노-올파드로네이트, 아미노-에티드로네이트(amino-etidronate), 네리드로네이트(neridronate), 에티드로네이트(etidronate), 클로드로네이트(clodronate), 이반드로네이트(ibandronate), 인카드로네이트(incadronate), 졸렌드로네이트(zolendronate), 알렌드로네이트(alendronate) 및 이들의 혼합물로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 복합체.
제 1 항에 있어서, 상기 복합체는 rhBMP2의 등전점(pI)±1의 pH를 나타내는 rhBMP2 용액에 비스포스포네이트 용액을 적가하여 반응시킴으로써 제조되는 것을 특징으로 하는 복합체.
제 1 항에 있어서, 상기 복합체는 조골세포의 분화를 촉진함으로써 골 형성을 증진시키는 것을 특징으로 하는 복합체.
제 4 항에 있어서, 상기 복합체는 알칼라인 포스파타아제(ALP) 및 타입 I 콜라겐의 발현을 향상시킴으로써 조골세포의 분화를 촉진시키는 것을 특징으로 하는 복합체.
제 1 항에 따른 복합체를 유효성분으로 포함하는 골 생성 증진용 조성물.
제 6 항에 있어서, 상기 조성물은 복합체를 구성하는 비스포스포네이트 외에 자유 비스포스포네이트를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 골 생성 증진용 조성물.
제 1 항에 따른 복합체를 유효성분으로 포함하는 골 형성 단백질 2(BMP2) 전달용 조성물.
제 8 항에 있어서, 상기 복합체는 rhBMP2을 서방출하는 특성을 나타내는 것을 특징으로 하는 골 형성 단백질 2(BMP2) 전달용 조성물.
제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 따른 복합체를 유효성분으로 포함하는 뼈 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물.
제 10 항에 있어서, 상기 뼈 질환은 골다공증, 골수염, 골연화증, 암세포의 골전이에 의한 골 손상, 추간판 탈출증, 섬유성 골이형성증, 클리펠-파일 증후군 및 낭성 섬유뼈염으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 뼈 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물.
제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 따른 복합체를 유효성분으로 포함하는 뼈 질환 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물.
제 6 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 따른 조성물이 함유된 이식재를 포함하는 의료기기.
제 13 항에 있어서, 상기 이식재는 방출 조절 매트릭스로서 히알루로닉산, 콜라겐, 덱스트란설페이트, 콘드로이친설페이트, 폴록사며, 카보머, 셀룰로오스계 고분자, 메타크릴레이트계 고분자, 폴리락틱산(poly lactic acid; PLA), 폴리글리콜산(poly glycolic acid; PGA), 폴리카플로락톤(poly caprolactone) 및 폴리메틸메타아크릴레이트(poly methyl metha acrylate)로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 고분자를 포함하는 것을 특징으로 하는 의료기기.
제 13 항에 있어서, 상기 이식재는 하이드록시 아파타이트(Hydroxyapatite, HA), 인산칼슘(calcium phosphate), 삼칼슘인산(Tri-calcium phosphate, TCP), 사칼슘인산(Tetra-calcium phosphate), 황산칼슘(calcium phosphate), 탈회골기질(Demineralized Bone matrix, DBM), 골형성 단백질(Bone Morphogenic Protein, BMP), 혈소판 풍부 혈장(Platelet-rich plasma, PRP), 골세포 내 성장 인자 및 이들의 조합으로 구성되는 군에서 선택되는 어느 하나 이상을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 의료기기.
제 13 항에 있어서, 상기 이식재는 하이드로겔(Hydrogel) 상 또는 페이스트(Paste) 상으로 주입 가능하도록 제공되는 것을 특징으로 하는 의료기기.