KR20180023874A - 골재생 또는 골형성 촉진용 펩타이드 및 그 용도 - Google Patents

골재생 또는 골형성 촉진용 펩타이드 및 그 용도 Download PDF

Info

Publication number
KR20180023874A
KR20180023874A KR1020170108652A KR20170108652A KR20180023874A KR 20180023874 A KR20180023874 A KR 20180023874A KR 1020170108652 A KR1020170108652 A KR 1020170108652A KR 20170108652 A KR20170108652 A KR 20170108652A KR 20180023874 A KR20180023874 A KR 20180023874A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
seq
peptide
bone
amino acid
artificial
Prior art date
Application number
KR1020170108652A
Other languages
English (en)
Other versions
KR102012380B1 (ko
Inventor
윤원준
Original Assignee
윤원준
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 윤원준 filed Critical 윤원준
Publication of KR20180023874A publication Critical patent/KR20180023874A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR102012380B1 publication Critical patent/KR102012380B1/ko

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/04—Peptides having up to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • A61K38/08—Peptides having 5 to 11 amino acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/04—Peptides having up to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • A61K38/10—Peptides having 12 to 20 amino acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/08—Drugs for skeletal disorders for bone diseases, e.g. rachitism, Paget's disease
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
    • C07K7/06—Linear peptides containing only normal peptide links having 5 to 11 amino acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
    • C07K7/08—Linear peptides containing only normal peptide links having 12 to 20 amino acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Abstract

본원은 골재생 또는 골형성 촉진 펩타이드 또는 이를 포함하는 조성물을 개시한다. 본원에 따른 펩타이드 또는 이를 포함하는 조성물은 이종골 및 동종골에서 골재생 및 골형성능을 갖으며, 발생과정에서 골형성도 촉진한다. 또한 이소성 골화증을 나타내지 않는다. 따라서 본원에 따른 펩타이드를 포함하는 조성물은 골재생 및 골형성능이 필요한 다양한 질환의 치료에 적용될 수 있다. 아울러 본원에 따른 펩타이드는 BMP-2를 대체하거나 소량의 BMP-2와 함께 사용하여 안전성을 확보할 수 있다.

Description

골재생 또는 골형성 촉진용 펩타이드 및 그 용도 {Peptide stimulating bone regeneration or formation and its use}
본원은 골재생 및 골형성을 촉진할 수 있는 기술이다.
전세계적인 인구 고령화 경향에 따라 2050년 경에는 60세 이상의 인구가 전체의 21.8%에 달할 것으로 전망되며, 이에 따라 노화, 대사성질환 등을 원인으로 하는 골격계 질환은 지속적으로 증가할 것으로 생각된다.
이러한 노년층 및 골다공증환자에서 골절이 발생할 경우 상처부위의 유합율이 매우 낮을 수 있고, 특히 70세 이상 고령의 골다공증 환자의 경우 골절이 발생하면 삶의 질 저하 등으로 인한 매우 높은 사망률을 나타낸다고 알려져 있다.
따라서 골절을 효과적이고 신속하게 극복하는 의료기술은 중대한 사회적 현안이다. 골조직은 감염, 외상, 질환 등으로 손상이 되면 자연적으로 치유되는 속도가 매우 느리고, 노화가 될수록 그 속도는 더욱 감소하며, 회복 기간 동안 환자의 고통이 매우 크다는 점에서 조직재생을 유도하여 빠르고 정확한 기능회복 및 치유 유도가 어떤 질환보다도 중요하다.
국내에서만 연간 골재생 유도 치료가 필요한 환자는 200만명에 이르며, 이와 관련된 건강보험 및 의료비 지출도 1조원이 넘을 뿐만 아니라, 골조직 손실로 인한 사회경제적 손실은 이보다 훨씬 클 것으로 예상된다.
따라서, 골조직의 재생을 효과적으로 유도할 수 있는 골이식재의 개발은 보건의료적 측면 및 사회경제적 측면에서도 매우 중요한 가치를 지닌다 (Dimitriou et al., BMC Medicine 2011, 9:66).
효과적 골조직 재생을 위해서는 골전도(Osteoconductive) 물질, 골유래(Osteogenic) 물질, 및 골유도(Osteoinductive) 물질이 필요하다.
골전도 물질로는 일정 기계적 강도를 갖는 하이드록시 인산칼슘 등의 뼈와 유사한 환경을 제공할 수 있는 물질이 사용되며, 이와 함께 골유래의 골형성 세포 집단 및 골유도성 바이오활성 인자가 함께 사용된다.
WO 2009-093240은 골재생용 에리쓰로포이에틴 및 파이브로넥틴 조성물을 개시한다. 또한 현재 골유도성 바이오활성 인자로서 가장 널리 사용되는 것이 BMP-2, 4 및 7 단백질을 들 수 있다. 특히 BMP-2는 2002년 FDA 승인을 얻어 경추유합, 요추유합, 및 치조골 재생을 위한 목적으로 사용되고 있다. 하지만 다음과 같은 많은 부작용이 문제점으로 지적되고 있다. 예를 들면 염증성 부작용으로 가관절, 골흡수로 인한 골형성 억제(오히려 골밀도를 더 악화시킴), 상처치료 지연, 통증을 유발하아며 이는 BMP-2 투여환자의 85%에서 나타나는 대표적 부작용이다. 또한 이소성골화증은 근육의 석회화. 사출부작용, 기도막힘(경추 수술환자, 사망)은 돌이킬 수 없는 치명적인 부작용이다. 아울러 사출 부작용의 경우 전체 환자의 1.5% 수준에서 발병하고 있다. 또한 5mg 이상 사용할 경우 24개월 내에 희귀암을 포함한 약 20 여종의 암이 발병하는 것으로 알려져 있으며, 집단의 5% 빈도로 발병한다. 또한 치과 분야에서는 통증에 대한 부작용이 심하게 나타나는 것으로 알려져 있다.
따라서 BMP-2는 그 부작용의 심각성으로 인해 더 이상의 용용에 한계가 있을 것으로 판단된다. 그 결과 안전성 및 유효성이 확보된 BMP-2 부작용 극복 또는 이를 대체할 수 있는 기술은 사회적 경제적 파장이 매우 클 것으로 전망되고 있다. 하지만 BMP-2만큼 효과적이고 강력한 약물 후보는 현재까지 개발되어 있지 않다.
본원은 부작용이 없이 효과적으로 골형성 및 골재생을 촉진할 수 있는 기술을 제공하고자 한다.
한 양태에서 본원은 하기 화학식 IV의 펩타이드를 포함하는 골재생 또는 골형성 촉진용 펩타이드 또는 이를 포함하는 약학 조성물을 제공한다.
[화학식 IV]
[X12]1-15 -[X1- X2- X3- X4- X5]m- [X6- X7- X8- X9- X10- X11]n,
상기 [X1- X2- X3- X4- X5]m에서,
상기 X1 은 임의의 아미노산이고,
상기 X2, X3 및 X4 는 L, V, I, E, G 및 A 중 어느 하나의 아미노산으로, 각각 동일 또는 상이하며, 상기 X2, X3 또는 X4 중 하나 이상은 결여될 수 있으며,
상기 X5 는 K 또는 R의 아미노산 이고,
상기 m은 1 내지 5의 정수이며, 두 개 이상 포함하는 경우, 각 펩타이드의 아미노산 서열은 동일 또는 상이하며,
상기 [X6- X7- X8- X9- X10- X11]n에서,
상기 [X6- X7- X8- X9- X10- X11]은 결여될 수 있거나, 또는
상기 X6 는 F, Y 및 W 중 어느 하나의 아미노산이고,
상기 X7 는 K 또는 R의 아미노산이고,
상기 X8 는 A, M 및 I 중 어느 하나의 아미노산이고,
상기 X9 는 L, M 및 G 중 어느 하나의 아미노산이고,
상기 X10 는 임의의 아미노산이고,
상기 X11 는 C, S 및 T 중 어느 하나의 아미노산이고,
상기 X8 및 X9 또는 상기 X10 및 X11 중 하나 이상은 결여될 수 있으며,
상기 n은 1 또는 2이고,
상기 X12 는 F, K 또는 R 이고,
상기 아미노산은 D- 또는 L- 형의 천연 또는 비천연 아미노산 또는 그 유도체임.
일 구현예에서 X1 의 임의의 아미노산은 S, T, C, P, N 또는 Q이다.
또 다른 구현예에서 상기 X2- X3- X4 는 AAA, EEE, LVG, LVA, LVL, LVV, LLA, LLL, 또는 LLV 이다.
또 다른 구현예에서 상기 [X1- X2- X3- X4- X5]의 펩타이드는 하기 중 어느 하나이다: QLVVK (서열번호 1), QEEEK (서열번호 2), QAAAK (서열번호 3), NLVVK (서열번호 4), SLVVK (서열번호 5), QVVVK (서열번호 70), QIVVK (서열번호 71), QAVVK (서열번호 72), QLLVK (서열번호 73), QLIVK (서열번호 74), QLAVK (서열번호 75), QLVLK (서열번호 76), QLVIK (서열번호 77), QLVAK (서열번호 78), 또는 QLVVR (서열번호 79).
또 다른 구현예에서 상기 [X6- X7- X8- X9- X10- X11]의 펩타이드는 하기 중 어느 하나이다: FRALPC (서열번호 6), FREEPC (서열번호 7), FRVVPC (서열번호 8), FEALPC (서열번호 9), YRALPC (서열번호 10), WRALPC (서열번호 11), FRALP (서열번호 12), FRAL(서열번호 13), FRPC (서열번호 14) 또는 FR.
본원에 따른 펩타이드는 두 개 이상이 연결될 수 있다.
일 구현예에서 펩타이드는 서열번호 15 내지 33, 37 내지 69 중 어느 하나로 표시된다.
일 구현예에서 상기 본원의 펩타이드의 N 말단에 5개 내지 20개의 K 또는 R을 추가로 포함할 수 있다.
또 다른 양태에서, 상기 화학식 IV에서 X1 은 극성의 Q, N, S, T, P 또는 C 이고, 상기 X2, X3 및 X4 는 각각 동일 또는 상이한 소수성의 L, V, I, 또는 A 이고, 상기 X5 는 양하전된 K 또는 R 이고, 상기 [X6- X7- X8- X9- X10- X11]에서, X8 및 X9 또는 상기 X10 및 X11 중 하나 이상은 결여될 수 있으며, FRALPC (서열번호 6), FREEPC (서열번호 7), FRVVPC (서열번호 8), FEALPC (서열번호 9), YRALPC (서열번호 10), WRALPC (서열번호 11), FRALP (서열번호 12), FRAL(서열번호 13), 또는 FRPC (서열번호 14), 또는 FR 이고, 상기 X12 는 양하전된 K 또는 R 이고, 상기 m 및 n은 각각 1 또는 2이고, m 또는 n이 2인 경우, 각 펩타이드의 아미노산 서열은 동일 또는 상이하며, 상기 아미노산은 D- 또는 L- 형의 천연 또는 비천연 아미노산일 수 있다.
일 구현예에서 상기 X2- X3- X4 는 LVV, AAA, LVA, LVL, LLA, LLL, 또는 LLV 일 수 있다.
다른 구현예에서 상기 [X1- X2- X3- X4- X5]의 펩타이드는 하기 중 어느 하나이다: QLVVK (서열번호 1), QAAAK (서열번호 3), NLVVK (서열번호 4), 또는 SLVVK (서열번호 5), QVVVK (서열번호 70), QIVVK (서열번호 71), QAVVK (서열번호 72), QLLVK (서열번호 73), QLIVK (서열번호 74), QLAVK (서열번호 75), QLVLK (서열번호 76), QLVIK (서열번호 77), QLVAK (서열번호 78), 또는 QLVVR (서열번호 79).
일 구현예에서 상기 펩타이드는 서열번호 17, 19, 20, 21, 24, 25, 26, 27, 30, 31, 32, 33, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 46, 47, 48, 50, 51, 52, 또는 54 이다.
일 구현예에서 상기 펩타이드의 N 말단에 5개 내지 20개의 K 또는 R을 추가로 포함할 수 있다.
또 다른 양태에서 본원은 서열번호 15 내지 69 중 어느 하나로 표시되는 아미노산 서열의 펩타이드 또는 이를 포함하는 골재생 또는 골형성 촉진용 약학 조성물을 제공한다.
본원에 개시된 펩타이드의 N 또는 C-말단은 비반응성기로 치환될 수 있다.
본원에 따른 조성물 또는 약학조성물은 골소실로 인해 골밀도의 증가가 필요한 질환의 치료 또는 예방에 사용되며, 상기 질환은 골절, 치조골 재생, 관절성형술, 척추유합 또는 골낭포를 포함하나 이로 제한되는 것은 아니다.
또 다른 양태에서 본원은 본원에 개시된 펩타이드 또는 이를 포함하는 약학조성물을 골형성 또는 골형성 촉진에 필요한 대상체에게 유효한 양으로 투여하는 단계를 포함하는, 골재생 또는 골형성 촉진 방법을 제공한다.
또 다른 양태에서 본원은 본원에 개시된 펩타이드의 골형성 또는 골형성 촉진용 용도를 제공한다.
본원에 따른 펩타이드 또는 이를 포함하는 조성물은 이종골 및 동종골에서 골재생 및 골형성능을 갖으며, 발생과정에서 골형성도 촉진한다. 또한 이소성 골화증을 나타내지 않는다. 따라서 본원에 따른 펩타이드를 포함하는 조성물은 골재생 및 골형성능이 필요한 다양한 질환의 치료에 적용될 수 있다. 아울러 본원에 따른 펩타이드는 BMP-2를 대체하거나 소량의 BMP-2와 함께 사용하여 안전성을 확보할 수 있다.
본원에 따른 효과를 정리하면, 이로 제한되는 것은 아니나, BMP-2와 유사하거나 더 빠른 골회복 속도를 보인다.(따라서 BMP-2기술을 대체할 수 있고,BMP-2 보다 비용이 저렴하고, 기존의 골대체재 (bone substitutes) 또는 골이식재와 함께 사용될 수 있어, 기존 기술들의 단독 사용보다 높은 회복수준을 기대할 수 있게 하는 새로운 유효성분이다. 또한 기존의 다른 골유도성 골전도성 대체재 등과 비교하여 가장　간단한 구조식으로 인해 합성, 보관, 안정성 등에서 장점이 있고 골조직에 대한 흡착 또는 부착성이 있는 펩타이드여서, 외과적 수술에 사용하는 것은 물론, 다양한 국소투여 등 다양한 임상투여　방법이 가능하다.
도 1은 마우스를 이용한 이종골 골재생 실험에서 본원에 따른 펩타이드 처리에 의한 형성된 경조직(hard tissue) 형성의 정량적 분석 결과이다. H&E 염색을 통하여 경조직 특이적 고밀도 염색부위의 면적을 측정하여 분석하였다. 대조군은 식염수로 처리하였으며, 비교군으로 BMP-2, 및 본원에 따른 펩타이드와 rhBMP-2를 혼합하여 사용하였다.
도 2는 마우스를 이용한 이종골 골재생 실험에서 재생된 조직의 골화조직에 대한 면역조직화학염색 결과이다. 면역염색은 경조직의 생물학적 석회화 시기에 특이적으로 발현되는 표지자인 Osteocalcin에 대한 항체염색이다.
도 3은 마우스를 이용한 이종골 골재생 실험에서 재생된 경조직 내의 혈관형성을 혈액세포 및 혈관의 표지자인 CD31에 대한 항체를 이용한 면역조직화학염색 결과이다. 이 결과는 혈관의 형성을 통해 형성된 조직이 활성을 유지하는지에 대한 평가를 위해 조사되었다.
도 4는 래트를 이용한 두개골 결손모델을 이용한 골재생능 분석실험에서 손상된 두개골에 대한 처리 후 3주 및 5주째 촬영한 삼차원 렌더링 이미지 결과이다. 대조군은 식염수로 처리하였으며, 비교군으로 BMP-2, 및 본원에 따른 펩타이드와 BMP-2를 혼합하여 사용하였다.
도 5는 래트를 이용한 두개골 결손모델을 이용한 골재생 능 분석실험에서 신생골조직의 부피(bone volume)를 정량적으로 측정한 결과이다.
도 6은 래트를 이용한 두개골 결손모델을 이용한 골재생능 분석실험에서 신생골조직내의 다양한 골형성 인자 도는 표지자에 대한 발현을 정량적으로 분석한 결과이다.
도 7은 이소성골화증에 관한 부작용을 조사하기 위한 분석결과이다. 마우스의 왼쪽 대퇴근에는 BMP-2를 이식하고 오른쪽 대퇴근에는 본원의 펩타이드를 이식하여 4주 후 uCT 분석 후 근조직의 석회화를 삼차원 렌더링이미지로 분석한 결과이다.
도 8은 발생과정에서 골형성 촉진 분석실험을 micro-CT로 분석한 결과이다.
도 9는 발생과정에서 골형성 촉진 분석실험을 WSS(Whole Skeletal Staining) 분석 결과이다.
도 10은 발생과정에서 골형성 촉진 분석실험을 각 실험군별 배아의 hindlimb을 분리한 다음 H&E 염색한 후 조직학적 골조직형성을 분석한 결과이다.
도 11은 발생과정에서 골형성 촉진 분석실험을 각 실험군별 배아의 hindlimb을 분리한 다음 Alcian blue 염색 결과이다.
도 12는 골형성촉진에 중대한 생물학적 기전인 세포의 소수성표면에 대한 표면부착분석 결과로써 펩타이드 농도에 따른 변화를 분석한 결과이다. 부착된 세포의 정량적 분석은 표면에 부착되어 있는 세포의 DNA를 정량화함으로써 조사하였다.
도 13은 골형성촉진에 중대한 생물학적 기전인 세포의 소수성표면에 대한 표면부착분석 결과로써 시간에 다른 펩타이드의 세포부착촉진효과를 분석한 결과이다.
도 14는 뼈와 같은 경도가 높은 단단한 구조물 지지체 위에서 세포의 부착 형태에 관한 일련의 변화를 조사한 결과이다. 지지체는 치과용 임플란트재료로 사용되는 티타늄을 사용하였다.
도 15는 뼈와 같은 경도가 높은 단단한 구조물 지지체 위에서 세포가 차지하는 부착면적을 공초점 현미경 분석을 통하여 측정함으로써 펩타이드의 부착촉진에 대한 효과를 나타낸 결과이다. 지지체는 다양한 강도와 표면 특성을 지니는 정형외과용 티타늄을 사용하였다.
도 16은 뼈와 같은 경도가 높은 단단한 구조물 지지체 위에서 세포가 차지하는 부착면적을 실측정함으로써 펩타이드의 부착촉진에 대한 정량적 분석을 나타낸 결과이다.
도 17은 뼈와 같은 경도가 높은 단단한 구조물 지지체 위에서 세포의 표면 부착 분포(distribution) 양상 변화를 조사한 결과이다. 이 결과는 높은 경도 지지체로써 지르코니아(Zirconia)를 사용한 결과이다.
도 18은 도면에 나타낸 다양한 분석결과를 근거로 본원의 펩타이드가 골재생을 유도하는 작용기전을 도식화한 것이다.
도 19는 본원에 따른 펩타이드(가로축 표시)세포부착을 촉진하는 다양한 펩타이드의 골형성 촉진 효과를 실험한 것으로 임신한 마우스에 주입하였을 때 태자의 골형성을 촉진하는 능력이 있음을 나타내는 결과이며, 가로축은 서열번호를 나타낸다.
한 양태에서 본원은 하기 화학식 I로 표시되는 골재생 및/또는 골형성능을 갖는 펩타이드에 관한 것이다.
[화학식 I]
[X1- X2- X3- X4- X5]m
상기 화학식 I에서
상기 X1 은 임의의 아미노산 또는 극성의 비하전된 아미노산이고,
상기 X2, X3 및 X4 는 L, V, I, E, G 및 A 중 어느 하나의 아미노산으로, 각각 동일 또는 상이하며, 상기 X2, X3 또는 X4 중 하나 이상은 결여될 수 있으며,
상기 X5 는 양하전된 아미노산이고,
상기 m은 1 내지 5의 정수이며, 두 개 이상 포함하는 경우, 각 펩타이드의 아미노산 서열은 동일 또는 상이하며, 상기 아미노산은 D- 또는 L- 형의 천연 또는 비천연 아미노산 또는 그 유도체이다.
본원에 사용된 용어 아미노산은 20개의 천연에서 발견되는 아미노산 및 비천연 아미노산, 생체내에서 번역 후에 변형되는 아미노산 예를 들면 포스포세린 및 포스포쓰레오닌; 및 2-아미노아디프산, 하이드록시라이신, 노르-발린, 노르-루이신과 같은 기타 희귀 아미노산; 생체내 안정성 향상을 위해 변형된 것을 포함하며, 거울상 이성질체인 D- 및 L-형태를 모두 포함하는 것이다.
본원에서 양하전 아미노산, 음하전된 아미노산, 극성의 비하전된 아미노산 및 비극성의 지방족 아미노산은 당업계에 공지되어 있으며, 당업자라면 적절한 것을 선택할 수 있을 것이다.
일 구현예에서, 양하전된 아미노산은 K 또는 R이다.
다른 구현예에서, 음하전된 아미노산은 D 또는 E이다.
또 다른 구현예에서 극성의 비하전된 아미노산은 S, T, C, P, N 또는 Q이다.
또 다른 구현예에서 비극성의 지방족 아미노산은 G, A, L, V, M 또는 I이다.
본원에서 사용된 용어 천연 및 비천연에서 전자는 세포, 조직 또는 생체내에서 발견되는 형태의 화합물을 칭하는 것이고, 후자는 이러한 화합물에 다양한 목적을 위해 인위적 변형이 가해진 것을 의미한다.
본원에서 사용된 용어 펩타이드 또는 폴리펩타이드는 서로 교환적으로 사용되며, 아미노산의 단위체가 공유결합으로 연결된 분자를 일컫는 것이다. 이는 원(native) 아미노산 또는 그 분해 산물, 합성 펩타이드, 재조합 방식으로 제조된 펩타이드, 펩타이드 모방체(전형적으로 합성 펩타이드), 및 펩토이드 및 세미펩토이드와 같은 펩타이드 유사체와 또는 생체내 안정성 향상을 위해 변형된 것을 포함한다. 이러한 변형은 이로 제한하는 것은 아니나, N-말단 변형, C-말단 변형, CH2-NH, CH2-S, CH2-S=O, CH2-CH2와 같은 펩타이드 결합 변형, 백본 변형, 측쇄 변형을 포함한다. 펩타이드 모방체 화합물을 제조하는 방법은 기술분야에 공지된 것으로, 예를 들면 Quantitative Drug Design, C.A. Ramsden Gd., Choplin Pergamon Press (1992)에 기재된 내용을 참조할 수 있다.
본원에 따른 화학식 I의 화합물은 제 1 영역으로써 표면간의 결합에 관여할 뿐만 아니라 서열의 갯수를 다양하게 적용함에 따라 본원에 개시된 다양한 목적에 사용될 수 있다. 제 1 영역은 소수성 특성을 가짐으로써 표면의 분자간 소수성결합, 또는 세포와의 소수성 결합에 관여하며, 펩타이드의 2차구조에 영향을 줄 수 있는 핵심 영역으로써 후술하는 다른 기능영역의 분자특성을 잘 유지하게 해준다.
본원에 따른 펩타이드에서 제 1 영역은 5개의 아미노산으로 구성되며, 이러한 단위체가 한 개 이상 포함될 수 있으며, 두 개 이상 포함하는 경우, 각 단위체는 상이하거나 동일할 수 있다. 단위체의 개수는 펩타이드의 제조, 보관, 전달 또는 후술하는 본원에 따른 펩타이드의 효능과 용도를 위해 다양한 기능화(functionalization)를 유도할 수 있는데, 이 과정에서 단위체는 다양한 경우의 수로 변형될 수 있다. 예를 들면 1 내지 10개, 1 내지 9개, 1 내지 8개, 1 내지 7개, 1 내지 6개, 1 내지 5개, 1 내지 4개, 1 내지 3개, 1 내지 2개, 또는 1개를 포함한다.
화학식 I에서 X1 은 임의의 아미노산이고, 일 구현예에서는 극성의 비하전된 아미노산, 또는 다른 구현예에서는 S, T, C, P, N 또는 Q이다.
화학식 I에서 X2, X3 및 X4 는 각각 L, V, I, E, G 및 A 중 하나로, 각 잔기는 동일 또는 상이할 수 있으며, 상기 X2, X3 또는 X4 중 하나 이상은 결여될 수 있으며, X2- X3- X4 서열은 예를 들면 AAA, EEE, LVG, LVA, LVL, LVV, LLA, LLL, 또는 LLV 등 일 수 있으나, 이로 제한하는 것은 아니다. 다른 구현예에서 상기 화학식 I은 X1-LVV-X5, X1-AAA-X5 또는 X1-EEE-X5 일 수 있다.
일구현예에서 화학식 I의 서열은 QLVVK (서열번호 1), QEEEK (서열번호 2), QAAAK (서열번호 3), NLVVK (서열번호 4), SLVVK (서열번호 5), QVVVK (서열번호 70), QIVVK (서열번호 71), QAVVK (서열번호 72), QLLVK (서열번호 73), QLIVK (서열번호 74), QLAVK (서열번호 75), QLVLK (서열번호 76), QLVIK (서열번호 77), QLVAK (서열번호 78), 또는 QLVVR (서열번호 79) 로 표시되나, 이로 제한되는 것은 아니다.
다른 측면에서 본원은 하기 화학식 II의 화합물, 또는 상기 화학식 I의 화합물에 하나 이상의 하기 화학식 II의 화합물을 추가로 포함하는 펩타이드에 관한 것이다.
[화학식 II]
[X6- X7- X8- X9- X10- X11]n,
상기 화학식 II에서
X6 는 F, Y 및 W 중 어느 하나의 아미노산이고,
X7 는 K 또는 R의 아미노산이고,
X8 는 A, M 및 I 중 어느 하나의 아미노산이고,
X9 는 L, M 및 G 중 어느 하나의 아미노산이고,
X10 는 임의의 아미노산이고,
X11 는 C, S 및 T 중 어느 하나의 아미노산이고,
상기 X8 및 X9 또는 상기 X10 및 X11 중 하나 이상은 결여될 수 있으며,
상기 n은 1 또는 2이고, 상기 아미노산은 D- 또는 L- 형의 천연 또는 비천연 아미노산 또는 그 유도체이다.
상기 화학식 II의 화합물은 상기 화학식 I의 화합물의 아미노 말단 (N-말단) 또는 카르복시 말단 (C-말단), 또는 N-말단 및 C-말단 모두에 연결될 수 있다.
본원에 따르면 상기 화학식 II의 화합물은 제 2 영역으로서, 펩타이드 단일 분자로써 존재할 경우 제 1 영역과 함께 알파-헬릭스 구조를 쉽게 만들 수 있는 특성을 지닌 서열로 쉽게 해리될 수 있는 친수성 특성을 부여한다.
화학식 I의 제 1 영역과 화학식 II의 제 2 영역은 각각 1개 이상 포함될 수 있으며, 그 배열도 다양할 수 있다. 예를 들면 화학식 I 및 II의 펩타이드가 각각 한 개 이상씩 연결되어, 화학식 I- II의 펩타이드, 화학식 I-화학식 I-화학식 II-화학식 II의 구조를 갖거나 또는 예를 들면 화학식 I 및 II의 펩타이드가 각각 한 개씩 순차적으로 연결되고, 이것이 다시 연결되어, 화학식 I-화학식 II-화학식 I-화학식 II와 같은 구조를 포함할 수 있거나, 또는 화학식 I-화학식 II- 화학식 I, 또는 화학식 II-화학식 I- 화학식 II와 같은 구조를 포함할 수 있다. 상기 구조에서 화학식 I 및 II의 순서가 바뀔 수 있다.
본원의 일 구현예에서 상기 화학식 II의 펩타이드는 FRALPC (서열번호 6), FREEPC (서열번호 7), FRVVPC (서열번호 8), FEALPC (서열번호 9), YRALPC (서열번호 10), WRALPC (서열번호 11), FRALP (서열번호 12), FRAL (서열번호 13), 또는 FRPC (서열번호 14) 또는 FR로 표시된다.
다른 측면에서 본원의 화학식 I의 펩타이드, 또는 화학식 I과 II를 모두 포함하는 펩타이드는, 화학식 III의 X12 1-15 으로 표시되는 제 3 영역을 그 N 또는 C 말단에 추가로 포함할 수 있으며, 상기 X12는 양 또는 음하전된 임의의 아미노산이다.
일 구현예에서 상기 화학식 III에서 양하전된 아미노산은 K 또는 R, 또는 F, K 또는 R이다.
다른 구현예에서 상기 화학식 III에서 상기 음하전된 아미노산은 D 또는 E이다.
또 다른 구현예에서, 본원은 하기 화학식 IV로 표시되는 화학식 III-I-II가 연결된 하기 화학식의 펩타이드 또는 이를 포함하는 골재생 또는 골형성 촉진용 성물에 관한 것이다.
[화학식 IV]
[X12]1-15 -[X1- X2- X3- X4- X5]m- [X6- X7- X8- X9- X10- X11]n,
상기 화학식 IV에 포함된 각 잔기에 대한 설명은 앞서 기술한 바를 참조할 수 있다.
또는 상기 화학식 IV에 있어서,
상기 [X1- X2- X3- X4- X5]m에서,
상기 X1 은 임의의 아미노산이고,
상기 X2, X3 및 X4 는 L, V, I, E, G 및 A 중 어느 하나의 아미노산으로, 각각 동일 또는 상이하며, 상기 X2, X3 또는 X4 중 하나 이상은 결여될 수 있으며,
상기 X5 는 K 또는 R의 아미노산 이고,
상기 m은 1 내지 5의 정수이며, 두 개 이상 포함하는 경우, 각 펩타이드의 아미노산 서열은 동일 또는 상이하며,
상기 [X6- X7- X8- X9- X10- X11]n에서,
상기 [X6- X7- X8- X9- X10- X11]n은 결여될 수 있거나, 또는
상기 X6 는 F, Y 및 W 중 어느 하나의 아미노산이고,
상기 X7 는 K 또는 R의 아미노산이고,
상기 X8 는 A, M 및 I 중 어느 하나의 아미노산이고,
상기 X9 는 L, M 및 G 중 어느 하나의 아미노산이고,
상기 X10 는 임의의 아미노산이고,
상기 X11 는 C, S 및 T 중 어느 하나의 아미노산이고,
상기 X8 및 X9 또는 상기 X10 및 X11 중 하나 이상은 결여될 수 있으며,
상기 n은 1 또는 2이고,
상기 X12 는 양하전된 K 또는 R 이고, 상기 아미노산은 D- 또는 L- 형의 천연 또는 비천연 아미노산 또는 그 유도체이다.
일 구현예에서 상기 화학식 IV의 폴리펩타이드는 두 분자 이상이 연결될 것일 수 있으며 예를 들면 두 개의 분자가 N-C 방향으로 연결된 것일 수 있다.
다른 구현예에서 상기 화학식 IV에서 X1 의 임의의 아미노산은 극성의 S, T, C, P, N 또는 Q일 수 있고, 상기 X2- X3- X4 는 AAA, EEE, LVG, LVA, LVL, LVV, LLA, LLL, 또는 LLV 일 수 있고, 상기 [X1- X2- X3- X4- X5]의 펩타이드는 QLVVK (서열번호 1), QEEEK (서열번호 2), QAAAK (서열번호 3), NLVVK (서열번호 4), SLVVK (서열번호 5), QVVVK (서열번호 70), QIVVK (서열번호 71), QAVVK (서열번호 72), QLLVK (서열번호 73), QLIVK (서열번호 74), QLAVK (서열번호 75), QLVLK (서열번호 76), QLVIK (서열번호 77), QLVAK (서열번호 78), 또는 QLVVR (서열번호 79) 일 수 있고, 상기 [X6- X7- X8- X9- X10- X11]의 펩타이드 FRALPC (서열번호 6), FREEPC (서열번호 7), FRVVPC (서열번호 8), FEALPC (서열번호 9), YRALPC (서열번호 10), WRALPC (서열번호 11), FRALP (서열번호 12), FRAL(서열번호 13), FRPC (서열번호 14) 또는 FR 일 수 있다.
또 다른 구현예에서 상기 조건을 만족하는 펩타이드는 서열번호 15 내지 33, 또는 37 내지 69 중 어느 하나의 아미노산 서열일 수 있다.
또 다른 구현예에서, 화학식 IV의 펩타이드에서 상기 X1 은 극성의 Q, N, S, T, P 또는 C 이고, 상기 X2, X3 및 X4 는 각각 동일 또는 상이한 소수성의 L, V, I, 또는 A 이고, 상기 X5 는 양하전된 K 또는 R 이고, 상기 [X6- X7- X8- X9- X10- X11]에서, X8 및 X9 또는 상기 X10 및 X11 중 하나 이상은 결여될 수 있으며, FRALPC (서열번호 6), FREEPC (서열번호 7), FRVVPC (서열번호 8), FEALPC (서열번호 9), YRALPC (서열번호 10), WRALPC (서열번호 11), FRALP (서열번호 12), FRAL(서열번호 13), 또는 FRPC (서열번호 14), 또는 FR 이고, 상기 X12 는 양하전된 K 또는 R 이고, 상기 m 및 n은 각각 1 또는 2이고, m 또는 n이 2인 경우, 각 펩타이드의 아미노산 서열은 동일 또는 상이하며, 상기 아미노산은 D- 또는 L- 형의 천연 또는 비천연 아미노산이다.
이 경우 상기 X2- X3- X4는 LVV, AAA, LVA, LVL, LLA, LLL, 또는 LLV 일 수 있다.
나아가 이 경우 상기 [X1- X2- X3- X4- X5]는 QLVVK (서열번호 1), QAAAK (서열번호 3), NLVVK (서열번호 4), SLVVK (서열번호 5), QVVVK (서열번호 70), QIVVK (서열번호 71), QAVVK (서열번호 72), QLLVK (서열번호 73), QLIVK (서열번호 74), QLAVK (서열번호 75), QLVLK (서열번호 76), QLVIK (서열번호 77), QLVAK (서열번호 78), 또는 QLVVR (서열번호 79) 일 수 있다.
일 구현예에서 상기 조건을 만족하는 펩타이드 서열은 서열번호 17, 19, 20, 21, 24, 25, 26, 27, 30, 31, 32, 33, 37, 38, 39, 40. 41, 42, 43, 44, 46. 47, 48, 50, 51, 52 또는 54의 아미노산 서열을 가진다.
또 다른 양태에서 본원은 서열번호 15 내지 69 중 어느 하나로 표시되는 세포 골재생 또는 골형성 촉진능을 갖는 펩타이드 또는 이를 포함하는 골형성 또는 골재생 촉진용 조성물에 관한 것이다.
본원에 개시된 펩타이드는 본원에서 합성된 다양한 변이를 갖는 서열 및 실험결과를 근거로 하기 기술된 사항을 고려하여, 가능한 변이를 도입하여 생성된 서열로 그 효과 또한 본원 실시예에 기재된 것과 같이 본원에서 개시된 것으로부터 예측가능하며, 따라서 본원의 범위에 포함되는 것이다.
하지만 본원에 따른 펩타이드는 위와 같은 서열로 한정되는 것이 아니며, 이의 생물학적 균등물(biologically equivalents)을 포함하는 것이다. 생물학적 균등물이란, 본원에 개시된 아미노산 서열에 추가적인 변형을 가하였으나, 본원에 따른 폴리펩타이드와 실질적으로 동일한 활성을 갖는 것이다.
이러한 변형은, 예를 들어 아미노산 서열 잔기의 결실, 삽입 및/또는 치환을 포함한다. 이러한 아미노산 변이는 아미노산 곁사슬 치환체의 상대적 유사성, 예컨대, 소수성, 친수성, 전하, 크기 등에 기초하여 이루어진다. 아미노산 곁사슬 치환체의 크기, 모양 및 종류에 대한 분석에 의하여, 아르기닌, 라이신과 히스티딘은 모두 양전하를 띤 잔기이고; 알라닌, 글라이신과 세린은 유사한 크기를 갖으며; 페닐알라닌, 트립토판과 타이로신은 유사한 모양을 갖는다. 따라서, 이러한 것을 고려하면, 아르기닌, 라이신과 히스티딘; 알라닌, 글라이신과 세린; 그리고 페닐알라닌, 트립토판과 타이로신은 생물학적으로 기능 균등물이라 할 수 있다.
일 구현예에서는 본원에 따른 폴리펩타이드에 보존적 아미노산 치환이 일어난 것을 포함한다. 보존적 아미노산 치환(conservative amino acid substitution)이란 특정 폴리펩타이드가 갖는 활성을 실질적으로 영향을 미치거나 감소시키지 않는 치환을 의미하는 것으로 예를 들면 1개 이상의 아미노산 잔기에서 보존적 치환이 일어난다.
보존적 아미노산 치환은 당업계에 알려진 것으로 예를 들면 Blosum (BLOcks SUbstitution Matrix) 기반한 표 1에 기재된 바와 같으며, Creighton (1984) Proteins. W. H. Freeman and Company (Eds); 및 Henikoff, S.; Henikoff, J.G. (1992). "Amino Acid Substitution Matrices from Protein Blocks". PNAS 89 (22): 10915-10919. doi:10.1073/pnas.89.22.10915; WO2009012175 A1 등에 기재된 것을 참조할 수 있다.
[표 1]
Figure pat00001
따라서 본원은 서열번호 1 내지 69로 표시되는 서열 및 상기 서열에 보존적 치환이 일어난 것을 포함하는 것이다.
또한 아미노산 변이를 도입하는 데 있어서, 아미노산의 소수성 인덱스(hydropathic index)가 고려될 수 있다. 각각의 아미노산은 소수성과 전하에 따라 소수성 인덱스가 부여되어 있다: 아이소루이신(+4.5); 발린(+4.2); 루이신(+3.8); 페닐알라닌(+2.8); 시스테인/시스타인(+2.5); 메티오닌(+1.9); 알라닌(+1.8); 글라이신(-0.4); 쓰레오닌(-0.7); 세린(-0.8); 트립토판(-0.9); 타이로신(-1.3); 프롤린(-1.6); 히스티딘(-3.2); 글루타메이트(-3.5); 글루타민(-3.5); 아스파르테이트(-3.5); 아스파라긴(-3.5); 라이신(-3.9); 및 아르기닌(-4.5).
상기와 같은 소수성 인덱스는 특히 단백질의 상호적인 생물학적 기능(interactive biological function)을 부여하는 데 있어서 중요하다. 유사한 소수성 인덱스를 가지는 아미노산으로 치환하여야 유사한 생물학적 활성을 보유할 수 있다는 것은 공지된 사실이다. 소수성 인덱스를 참조하여 변이를 도입시키는 경우, 바람직하게는 ±2 이내, 보다 바람직하게는 ±1 이내, 보다 더 바람직하게는 ±0.5 이내의 소수성 인덱스 차이를 나타내는 아미노산간의 치환이 유리하다.
또한 유사한 친수성 수치(hydrophilicity value)를 가지는 아미노산 사이의 치환이 균등한 생물학적 활성을 갖는 단백질을 초래한다는 것도 잘 알려져 있다.
예를 들면 미국 특허 제4,554,101호에 개시된 바와 같이, 다음의 친수성 값이 각각의 아미노산 잔기에 부여되어 있다: 아르기닌(+3.0); 라이신(+3.0); 아스팔테이트(+3.0±1); 글루타메이트(+3.0±1); 세린(+0.3); 아스파라긴(+0.2); 글루타민(+0.2); 글라이신(0); 쓰레오닌(-0.4); 프롤린(-0.5±1); 알라닌(-0.5); 히스티딘(-0.5); 시스테인(-1.0); 메티오닌(-1.3); 발린(-1.5); 루이신(-1.8); 아이소루이신(-1.8); 타이로신(-2.3); 페닐알라닌(-2.5); 트립토판(-3.4).
또한 본원에 따른 펩타이드의 활성을 전체적으로 변경시키지 않는 아미노산 치환은 당해 분야에 공지되어 있다 (H. Neurath, R.L.Hill, The Proteins, Academic Press, New York, 1979). 예를 들면 가장 통상적으로 일어나는 치환은 아미노산 잔기 Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Thr/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu 및 Asp/Gly 간의 치환을 들 수 있다.
따라서, 상술한 바와 같은 생물학적 균등 활성을 갖는 변이를 고려한다면 본원에 개시된 아미노산 서열 또는 이를 코딩하는 핵산분자는 본원에 개시된 것과 실질적 동일성을 갖는 것도 포함된다. 실질적 동일성은 본원에 개시된 서열과 임의의 다른 서열을 최대한 대응되도록 얼라인하고, 당업계에서 통상적으로 이용되는 알고리즘을 이용하여 얼라인된 서열을 분석한 경우에, 최소 61%의 상동성, 보다 바람직하게는 70%의 상동성, 보다 더 바람직하게는 80%의 상동성, 가장 바람직하게는 90%의 상동성을 나타내는 서열을 의미한다. 서열비교를 위한 얼라인먼트 방법은 당업계에 공지되어 있다. 예를 들면 Smith and Waterman, Adv. Appl. Math. (1981) 2:482; Needleman and Wunsch, J. Mol. Bio. (1970) 48:443; Pearson and Lipman, Methods in Mol. Biol. (1988) 24:307-31; Higgins and Sharp, Gene (1988) 73:237-44; Higgins and Sharp, CABIOS (1989) 5:151-3; Corpet et al., Nuc. Acids Res. (1988) 16:10881-90; Huang et al., Comp. Appl. BioSci. (1992) 8:155-65 및 Pearson et al., Meth. Mol. Biol. (1994) 24:307-31에 개시되어 있다. NCBI Basic Local Alignment Search Tool(BLAST)(Altschul et al., J. Mol. Biol. (1990) 215:403-10)은 NBCI 등에서 접근 가능하며, blast, blastp, blasm, blastx, tblastn 및 tblastx와 같은 서열 분석 프로그램과 연동되어 이용할 수 있다. BLSAT는 www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/에서 접속 가능하며, 이 프로그램을 이용한 서열 상동성 비교 방법은 www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/blast_help.html에서 확인할 수 있다.
일 구현예에서, 상술한 본원에 따른 펩타이드는 N 또는 C-말단, 특히 C-말단이 화학 비반응성기 예를 들면 NH2 등과 같은 기로 치환되어 안정성을 높일 수 있다.
다른 측면에서 본원은 또한 상술한 본원에 따른 폴리펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 벡터 및 상기 재조합 벡터가 도입된 세포에 관한 것으로, 상기 벡터 및 세포는 당업계에 공지된 것으로 당업자라면 적절한 것을 선택할 수 있을 것이다.
본원에 따른 펩타이드 또는 이를 포함하는 조성물은 이종골 및 동종골에서 골재생 및 골형성능을 갖으며, 발생과정에서 골형성도 촉진한다. 또한 이소성 골화증을 나타내지 않는다.
따라서 본원에 따른 화학식 I, II, 또는 IV의 펩타이드 또는 이를 포함하는 조성물은 골재생 또는 골형성, 또는 골재생 또는 골형성 촉진, 또는 골재생 또는 골형성이 필요한 다양한 질환의 치료에 적용될 수 있다.
본원에서 “골재생”이란 소실된 골조직의 치유로 골형성 촉진을 포함하는 것이다. 본원에서 촉진이란 이로 제한하는 것은 아니다, 골조직, 골세포 또는 골매트릭스 등의 양을 증가시키거나 또는 양이 증가되는 시간을 단축시키는 것으로, 골절의 치료 효과 등으로 확인할 수 있다.
이러한 측면에서 골재생 또는 골형성은 상호 교환적으로 사용될 수 있다.
뼈는 단단한 환경이 제공되면 스스로 회복이 가능한 조직으로 알려져 있다. 따라서 골재생이 필요한 부위에 뼈와 유사한 환경을 제공해 주면 회복이 되는 특수한 조직이다. 단단한 환경 즉 뼈가 잘 성장할 수 있는 환경적 특성을 기술적 용어로 골전도성(osteoconductive) 이라 하며 가공된 뼈조각, 단단한 폴리머 등의 제품이 개발되어 환경을 제공하는 매개체(이식재)로 사용되어 왔다.
하지만 외부로부터 주입한 골전도성 물질이 완전한 골회복을 위한 자극하는 수준에는 못 미치며 아직 생체내에서 발생하는 골전도성 특징 그에 반응하는 생물학적 기전 등에 대해서는 모르는 사실이 많은 것으로 생각된다. 골전도와 함께 골조직에서 직접 유래한(Osteogenic) 물질 역시 기술적 한계를 크게 극복하는 수준은 아니며, 골유도(Osteoinductive) 물질로 사용되는 것은 BMP-2, 4,7 역시 많은 한계를 가지고 있다.
본원에 따른 펩타이드는, 본 이론으로 제한하는 것은 아니나, 생체내에서 골전도성을 크게 강화시키고, 그 결과가 골유도성 성장인자의 발현도 촉진 시킬 수 있는 것으로 판단된다. 예를 들어 세포의 부착을 촉진하여, 골의 전도성을 높이고 그 결과 골유도성 성장인자의 발현도 촉진 시킬 수 있는 것으로 판단되며 골재생을 위한 다양한 기전을 촉진 시키는 것으로 판단된다.
일반적으로 골전도성은 뼈의 물리화학적 성질을 모방해서 지지체역할을 해주는 경우가 대부분이고, 그 자체로 유효성분을 가지는 건 아니다. 이에 반해 본원의 펩타이드는 그 자체로 유효성분이 될 수 있어, 이러 측면에서 골전도성을 강화시키기는 하지만, 지지체로 작용하는 골전도성 물질 자체는 아니라고 할 수 있다. 본원에 따르면, 결과적으로 기존의 골유도성 성분이 없는 상태에서 전도성 물질과 혼합했음에도 재생이 증가했고, 이는 결국 전도성을 강화한 것이다.
본원에 따른 펩타이드는 골소실의 신속한 회복을 가져올 수 있다는 측면에서 BMP-2를 대체할 수 있다. 본원에 따른 펩타이드는 속도 및 골량에서 BMP-2에 필적하거나 더 우수한 골재생 결과를 나타낸다.
따라서 다른 양태에서 본원에 따른 펩타이드를 포함하는 골재생 및/또는 골형성 촉진용 약학 조성물 도는 골재생 또는 골형성 촉진이 필요한 질환 치료 또는 예방용 약학 조성물을 제공한다.
본원에서 “치료”는 본 발명의 조성물을 포유동물에 투여하여 골재생 또는 골형성의 촉진이 필요한 질환 또는 질병의 발전을 지연 억제, 경감 또는 제거하는 것을 의미한다.
본원에서 “예방”은 본 발명의 조성물을 포유동물에 투여하여 골재생 또는 골형성의 촉진이 필요한 질환 또는 질병의 발생을 억제하는 것을 의미한다.
본원에 따른 펩타이드는 낮은 골밀도로 인해 골절의 위험이 상주하여 골밀도의 증가가 필요한 다양한 질환에 사용될 수 있다.
본원에서 골재생 및 골형성 촉진이 필요한 질환은 이로 제한하는 것은 아니나, 골절, 치조골 재생, 관절성형술, 척추유합, 및 골낭포/골종양을 포함하며, 이러한 질환으로 인해 뼈의 자연적 회복이 어려워 골이식과 같은 외과적 수술이 필요한 다양한 질환의 치료 또는 예방에 사용될 수 있다.
추가로 본원에 따른 펩타이드 또는 조성물이 사용될 수 있는 질환은 이로 제한하는 것은 아니나, 폐쇄형, 개방형 및 불유합형 골절; 폐쇄 및 개방 골절 감소시 최대 골밀도를 향상을 통한 예방적 치료; 성형 외과 또는 성형 외과 수술에서 뼈 치유 촉진; 비 시멘트 정형외과 수술 및 치과 임플란트 후 뼈 성장의 자극; 폐경 전 여성의 최대 골밀도 상승; 성장 결핍의 치료; 1차 또는 2차 부갑상선 항진증의 치료; 암과 같은 골 용해성 뼈 질환의 치료; 치주 질환 및 결함 치료 및 기타 치아 복구 과정; 신연골형성술 동안 뼈 형성 증가; 노화와 관련된 골다공증, 폐경기 후 골다공증, 글루코 코르티코이드 유도 골다공증 또는 폐색성 골다공증 등을 포함한다.
당업자라면 당업계에 공지된 다양한 방법을 사용하여 증상 또는 질환의 지연, 억제, 경감 또는 제거를 판단할 수 있을 것이다.
본 발명의 펩타이드는 또는 약학 조성물은 선천적, 외상 또는 외과 절제(예를 들어, 암 치료) 또는 성형외과 수술 후의 골재생의 촉진을 위해 사용될 수 있다.
또한 본 발명의 펩타이드는 기존의 임의의 골대체재 (bone substitutes)와도 혼용되어 사용할 수 있고 골대체재 단독 사용보다 높은 회복수준을 기대할 수 있다.
다른 구현예에서 본원에 따른 펩타이드는 BMP-2를 대체하여 또는 BMP-2와 함께 사용되어, BMP-2가 사용되는 다양한 질환의 치료 또는 예방에 사용될 수 있다.
본원의 약학 조성물은 유효성분으로 본원에 따른 펩타이드에 약학적 또는 생리학적으로 허용 가능한 담체를 1종 이상 포함하여 제조할 수 있다.
본원에서 사용된 용어 담체란 사용되는 투여량 및 농도에 노출되는 세포 또는 포유동물에 무독성인 약학적으로 허용가능한 담체, 부형제, 또는 안정화제를 의미하는 것이다. 이러한 담체의 예로는 식염수, 링거액, 완충 식염수, 포스페이트, 시트레이트 및 다른 유기산과 같은 완충액, 아스코르브산을 비롯한 산화방지제, 저분자량(약 10 잔기 미만) 폴리펩타이드, 단백질, 예를 들어 혈청 알부민, 젤라틴 또는 면역글로불린; 친수성 중합체, 예를 들어폴리비닐피롤리돈, 아미노산, 예를 들어 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 아르기닌 또는 라이신, 단당류, 이당류 및 글루코스, 만노스 또는 덱스트린을 비롯한 기타 비경구투여(예를 들어, 정맥 내, 피하, 복강 내 또는 국소에 적용)할 수 있으며, 특히 비경구 투여가 바람직하다. 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형탄수화물, 킬레이트화제, 예를 들어 EDTA, 당 알콜, 예를 들어 만니톨 또는 소르비톨, 염 형성 카운터 이온, 예를 들어 나트륨, 및(또는) 비이온계 계면활성제, 예를 들어 트윈, 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 및 플루로닉스(PLURONICS)를 들 수 있다.
필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있으며, 표적 기관에 특이적으로 작용할 수 있도록 표적 기관 특이적 항체 또는 기타 리간드를 상기 담체와 결합시켜 사용할 수 있다. 더 나아가 당해 기술분야의 적정한 방법으로 또는 레밍턴의 문헌(Remington's Pharmaceutical Science(최근판), Mack Publishing Company, Easton PA)에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 질환에 따라 또는 성분에 따라 바람직하게 제형화 할 수 있다.
본원의 조성물은 특히 비경구 투여하거나, 구체적 방법은 투여경로 및 시간에 따라 달라질 수 있고, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다.
비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁용제, 유제, 동결건조제제, 좌제 등이 포함된다.
비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세롤, 젤라틴 등이 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여한다. 본 발명에 있어서, “약학적 또는 치료적으로 유효한 양”은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효용량 수준은 환자의 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명의 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기한 요소들을 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
구체적으로, 본 발명에 따른 조성물의 유효량은 환자의 나이, 성별, 체중에 따라 달라질 수 있으며, 일반적으로는 체중 1㎏ 당 0.01μg 내지 100mg, 바람직하게는 0.01μg 내지 10mg을 매일 또는 격일 투여하거나 1일 1 내지 3회로 나누어 투여할 수 있다. 그러나 투여 경로, 비만의 중증도, 성별, 체중, 연령 등에 따라서 증감될 수 있으므로 상기 투여량이 어떠한 방법으로도 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
본원의 조성물은 본원에 따른 펩타이드 이외에 추가로 동일 또는 유사한 기능을 나타내는 유효성분을 1종 이상 또는 유효성분의 용해성 및/또는 흡수성을 유지/증가시키는 화합물을 추가로 함유할 수 있다.
또한 본원의 조성물은 질환의 치료를 위하여 단독으로, 또는 수술, 약물치료 및 생물학적반응조절제를 사용하는 방법들과 병용하여 사용할 수 있다.
본원의 펩타이드는 또한 이의 약학적으로 활성인 염의 형태로 투여될 수 있다. 적절한 약학적으로 활성인 염은 산부가염 및 알칼리염 또는 알칼리 토금속염을 포함한다. 예를 들면, 나트륨, 칼륨, 리튬, 마그네슘 또는 칼슘염이 얻어질 수 있다.
본원에 따른 펩타이드의 약학적으로 허용가능한 염은 독성을 나타내는 부작용 없이 모 펩타이드(parent peptide)의 원하는 생물 활성을 가진다. 이와 같은 염의 예로는 (a) 예컨대, 염산, 브롬화수소산, 황산, 인산, 질산 등과 같은 무기산으로 형성된 산 부가염; 및 예컨대 아세트산, 옥살산, 타르타르산, 숙신산, 말레산, 푸마르산, 글루콘산, 시트르산, 말산, 아스코르브산, 벤조산, 탄닌산, 파모산, 알긴산, 폴리글루탐산, 나프탈렌설폰산, 나프탈렌 디설폰산, 폴리갈락투론산 등과 같은 유기산으로 형성된 염; (b) 아연, 칼슘, 비스무트, 바륨, 마그네슘, 알루미늄, 구리, 코발트, 니켈, 카드뮴 등과 같은 다가 금속 양이온으로부터 형성된 염기부가염; 또는 N,N'- 디벤질에틸렌디아민 또는 에틸렌디아민으로부터 형성된 유기 양이온으로부터 형성된 염기 부가염; 또는 (c) 예컨대 아연 탄닌염 등과 같은 (a)와 (b)의 조합물 등을 들 수 있다.
다른 양태에서 본원은 또한 본원에 따른 펩타이드 또는 이를 포함하는 조성물을 이용한 골재생 또는 골형성 촉진 방법을 제공한다.
또 다른 양태에서 본원은 또한 본원에 따른 약학조성물 또는 펩타이드를 골형성 또는 골재생이 필요한 대상체에게 유효한 양으로 투여하는 단계를 포함하는 골재생 또는 골형성 방법, 또는 이의 촉진이 필요한 질환의 치료 방법을 제공한다.
본 방법에 포함되는 질환, 유효성분, 투여량, 및 투여 방법은 앞서 언급한 바를 참조할 수 있다.
본원에 따른 약학조성물 또는 방법이 사용되는 대상체는 예를 들면, 개, 소, 말, 영장류 및 사람을 포함하는 포유류를 포함하나 이로 제한하는 것은 아니다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위해서 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐 본 발명이 하기의 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예
실시예 1. 본원에 따른 펩타이드의 제조
본원에 사용된 펩타이드는 9-플루오르닐메틸옥시카보닐(9-fluorenylmethyloxycarbonyl) (Fmoc) 방법을 통하여 합성된 것으로 주문제작 하였다 (루젠 Sci, 대한민국; 펩트론, 대한민국). 펩타이드 효과의 재연성 검증을 위하여 두 개의 회사를 통해 각각 3회(루젠) 그리고 2회(펩트론)의 펩타이드 합성을 수행하였으며, 각각의 합성물에 대해 독립된 실험을 통해 분석을 하였으며, 합성회차별로 동일한 결과를 수득하였다.
실시예 2. 골새쟁의 주요기전인 세포부착에 미치는 펩타이드의 효과
본원에 따른 펩타이드(서열번호 17)의 이종골 모델에서 골재생 능력 촉진능을 테스트하기 위하여 다음과 같은 실험을 수행하였다.
표 2의 각 조건에 해당하는 성분을 갖는 이식재를 사용하여, 다음과 같은 4그룹의 아래 기술한 바와 같이 면역결핍마우스의 등에 이식하였으며, 이식 후 3주 및 6주에 걸쳐 새롭게 형성된 경조직을 분석하였다. 사용된 용량은 다음과 같다: Geistlich Bio-Oss: 100mg; hDPSC (human dental pulp stem cell): 5x106 cells; 본원에 따른 펩타이드: 10μg; 및 BMP-2 (BD Science): 2μg (Kevin et al., Adv Drug Deliv Rev. 2012; 64: 1277-1291).
[표 2]
Figure pat00002
동물실험은 6주령 된 숫컷의 면역결핍마우스(immunocompromised mice, NIH-bg-nu/nu-xid, Harlan Sprague Dawley, Indianapolis, IN, USA)를 마취시킨 후 등 부위를 절개하고 피하에 상기 각의 조성물을 0.5% 피브린겔(fibrin gel)과 함께 삽입하고 다시 봉합하였다. 펩타이드와 BMP-2는 식염수 용액에 희석하여 사용하였으며 대조군은 동일 부피의 식염수 용액을 사용하였다. 수술 전 후 생쥐의 몸무게에 유의한 변화는 나타나지 않았으며, 사료의 소모에도 유의한 차이를 보이지 않았다. 수술 전 후 실험동물의 사육과 관리는 서울대학교 실험동물센터의 기준을 따랐다.
상기와 같이 각 조성물 이식 후 3주 및 6주째 마우스를 희생하여 이식부위를 분리하여 4% para-formaldehyde 용액에 고정시켰다. 이어 10% EDTA 용액에서 탈회(decalcification) 후 조직을 파라핀에 포매(embedding)시킨 후 절편을 얻어 H&E 염색 및 면역염색을 실시하였다. 면역염색은 경조직 표지자인 Osteocalcin 검출로써 확인하였으며 그 밖에도 혈관분석을 위하여 CD31에 대한 항체를 이용하였다. 새롭게 형성된 경조직의 정량적 분석은 H&E 염색으로부터 기존에 소개된 방법 (Lee et al., Biomaterials 2011; 32: 9696-9706)을 따랐다.
본원에 따른 펩타이드 처리에 의한 경조직 형성 수준 증가 결과는 도 1에 기재되어 있다. 도 1에 따르면 3주째 각 조건별 경조직 형성을 분석한 결과 펩타이드 처리에 의한 경조직 형성량이 현저하게 증가되어 있음을 확인할 수 있었다. 양성대조군으로 사용된 BMP-2 처리군의 경우 음성대조군에 비해 경조직 재생이 증가해 있었으나 본원의 펩타이드 처리군에서 더욱 두드러진 조직재건이 관찰되었다. 한편, 혼합처리군(펩타이드 + BMP-2)에서는 펩타이드 단독처리에는 못 미치지만 BMP-2 단독 처리군에 비해서는 약 1.8배 증가하는 것으로 나타났다. 이종골 이식모델에서는 펩타이드 단독처리만으로 가장 빠른 속도의 경조직 발달을 관찰할 수 있었다. 6주째 경조직 형성을 분석한 결과 여전히 펩타이드 단독에 의해 가장 높은 수준의 경조직 발달이 관찰되었고 혼합처리군의 경우 미미한 차이는 있지만 펩타이드 단독처리군 수준의 경조직 발달이 진행되었음을 확인할 수 있었다. BMP-2 처리군의 경우 경조직 발달이 음성대조군에 비해 뚜렷한 증가를 보이나 펩타이드 단독 또는 혼합처리군에 비해 수준이 낮은 것으로 조사되었다.
본원에 따른 펩타이드 처리에 의한 경조직의 조직학적 분석 및 관찰 결과는 도 2에 기재되어 있다. 도 2에 따르면 재생된 조직의 골화조직을 조직학적으로 검증하기 위하여 osteocalcin (OC, 골석회화의 표지자)을 면역조직화학염색법으로 조사한 결과 성숙된 자연적인 뼈에서 발견되는 osteocyte의 형태의 조직발달과 석회화된 조직의 분포양상을 뚜렷하게 확인할 수 있었다. 또한 골유도인자 BMP-2처리에 의한 조직 재생과 비교하였을 때에도 본원에 따른 펩타이드 의해 재생된 경조직의 특징이 차이가 없음을 확인할 수 있었다.
본원에 따른 펩타이드처리에 의한 혈관형성 결과는 도 3에 기재되어 있다. 도 3에 따르면 이종골 재생모델을 통하여 새로이 형성된 경조직 내에는 혈관형성 또는 혈액공급 역시 잘 발달되어 있음을 확인하였다. 이종골 이식분야에서 혈액의 원활한 공급은 조직재생 전반에 큰 영향을 미치는 것으로 알려져 있으며 임상에서는 이식 후 경조직재생의 성공을 결정짓는 주요 요인이기도 하다. 혈액세포 및 혈관의 표지자인 CD31에 대한 면역조직화학염색법으로 조사한 결과 경조직 재생 수준(도 1)에 비례하여 혈관형성 역시 잘 발달되어 있음을 확인할 수 있었다. 특히 양성대조군(BMP-2)과 비교하여 본원에 따른 펩타이드가 포함된 그룹에서 우수한 혈관형성 결과를 나타냈다.
이상의 결과로부터 본원에 따른 펩타이드는 이종골 이식모델에서 골재생에 탁월한 효과를 나타냄을 알 수 있고, 따라서 다양한 이종골 이식분야에 응용할 수 있으며, BMP-2의 단점을 극복 또는 보완하여 신속한 골재생에 효과적으로 사용될 수 있을 것으로 본다.
실시예 3. 두개골 결손모델에서 골재생 촉진능 분석
두개골 결손모델에서 본원에 따른 펩타이드의 골재생 능력을 측정하기 위하여 다음과 같이 실험을 수행하였다.
우선 표 3의 각 조건에 해당하는 성분을 갖는 이식재를 사용하여, 동물모델은 실험용래트(백서)를 사용하였다. 호르몬 변화에 따른 오차결과를 피하기 위하여 8주령 숫컷 백서를 사용하였다. 실험동물 사육조건은 서울대학교 실험동물연구소에서 관련 지침을 준수하여 수행하였다. 표3의 조건에 해당하는 이식재를 준비한 후 외과적으로 백서의 두개골에 일정크기의 파손을 유도하였다. 이식 후 3주 및 5주째 새롭게 형성된 골조직을 조사하였다. 골재생 유효성분인 펩타이드와 MP-2는 식염수 용액에 희석하여 사용하였으며 대조군은 동일 부피의 식염수 용액을 사용하였다. 사용된 용량은 다음과 같다: ACS (absorbable collagen sponge)(Kevin et al., Adv Drug Deliv Rev. 2012; 64: 1277-1291): 8mm diameter; 본원에 따른 펩타이드: 100μg/ ACS disc; rhBMP-2: 2μg/ ACS disc.
[표 3]
Figure pat00003
동물실험은 실험용쥐(백서, Rat)를 마취시킨 후 두개골 파손모델을 만들었다. 정수리 부분의 피부를 절개한 후 두개골 전체부위를 노출시켜 수술을 진행하였다. 다이아몬드 천공드릴(diamond-coated trephine drill bit)을 이용하여 8mm 직경의 조직을 제거하였다. 두개골 손상(defect) 후 미리 준비된 ACS를 파손부위에 이식하였고 신속하게 절개부위를 봉합하였다. 손상된 조직의 크기는 8mm 직경 크기로써 이는 백서에서는 상처부위가 잘 회복되지 않는 수준의 심각한 손상(critical defect)에 해당한다. 심각한 것으로 정의된 손상은 약의 유효성을 평가하는데 훌륭한 모델로 알려져 있다. 수술 중 뇌척수경막(dura mater) 손상이 발생하지 않도록 주의해서 수술을 진행하였으며, 뇌척수경막 손상은 육안관찰 또는 과다출혈 등을 근거로 판단할 수 있다. 수술 전 후 백서의 몸무게에 유의한 변화는 나타나지 않았으며, 사료의 소모에도 유의한 차이를 보이지 않았다.
분석은 micro-CT 방법을 사용하였으며 수술 후 각각 3주 및 5주차에 백서(Rat)를 희생한 후 두개골을 적출하였다. 이어 식염수로 간단히 세척 후 분리하여 4% para-formaldehyde 용액에 고정시켰으며 이후 micro-CT 분석을 실시하였다. 새로 형성된 재생골의 정량적 분석은 손상 부위 내에서 관찰되는 석회화 조직의 부피를 측정하여 골재생의 정도를 평가하였다.
본원에 따른 펩타이드 처리에 의한 골재생 효과에 대한 결과는 도 4 및 5에 기재되어 있다. 도 4 및 도 5는 각각 손상된 두개골 부위에 대한 삼차원 렌더링 이미지 및 신생골조직의 부피를 나타낸다. 이에 따르면 두개골 결손모델에서 본원에 따른 펩타이드에 의해 결손 부위의 골재생이 유의미하게 증가하는 것으로 나타났다. 전구세포의 골세포분화 유도능을 나타내는 BMP-2 처리 그룹과 비교하였을 때 이에 필적하는 효과를 나타내고 있다. 뿐만 아니라 BMP-2와 펩타이드를 혼합하였을 경우에도 상가효과(additive effect)를 나타내는 것으로 확인되었다. 이러한 결과는 본원에 따른 펩타이드 단독 또는 기존의 골재생을 촉진할 수 있는 유효물질과 함께 사용하여 골재생을 더욱 촉진할 수 있음을 나타낸다.
골재생효과에 대한 분자마커의 발현을 조사한 결과는 도 6에 기재되어 있다. 이 결과는 3주 5주에 새롭게 형성된 조직을 적출한 후 RNA를 분리하고 다시 cDNA합성을 통하여 각 유전자에 대한 quantitative realtime PCR을 수행한 결과이다. 유전자 발현의 경우 대체로 3주차에서 좀 더 높은 수준이 검출되었다. 대체적으로 BMP-2, 본원의 펩타이드, 혼합의 그룹에서 대조군보다 높은 수준의 골형성관련 유전자발현이 검출되었다. 한편, 조골세포의 최종 분화단계인 osteocyte의 형성은 골조직의 완전한 성숙을 판가름하는 매우 중요한 기준이 될 수 있는데 Dmp1(dentin matrix protein 1)은 osteocyte의 주요 표지자이다. 흥미롭게도 이 표지자는 본원의 펩타이드 처리 그룹에서만 유의미한 증가를 보이고 있는데 이는 더욱 우수한 골의 질을 결정하는 결과로 해석될 수 있다.
실시예 4. 이소성 골화증 ( ectopic bone formation 또는 heterotrophic ossification) 부재 분석
이소성 골화증에 대한 효과를 분석하기 위하여 같이 실험을 수행하였다.
우선 본원에 따른 펩타이드 또는 BMP-2를 ACS에 흡착시켜 이식재를 준비하였다. ACS는 5mm 직경의 디스크를 사용하였으며 펩타이드 또는 BMP-2는 모두 식염수에 녹여 사용하였다. BMP-2는 2μg의 양을 사용하였고 펩타이드는 BMP-2의 300배 수준인 600μg을 실험에 사용하였다.
동물실험을 위해 생후 6주령의 수컷 마우스의 왼쪽 대퇴부 근육에 BMP-2를 포함하는 이식재를 삽입하였고 오른쪽 대퇴부에는 본원에 따른 펩타이드를 포함하는 이식재를 삽입하였다. 체내 삽입은 흡입 마취 후 대퇴부의 표피와 근막을 차례로 절개한 후 준비된 이식재를 삽입하였다. 수술 전후 그리고 희생 직전 몸무게 및 사료 소모량에서 유의미한 변화는 나타나지 않았다. 수술 후 8주 경과 후 동물을 안락사 시킨 후 micro-CT 분석을 통해 근육의 석회화(이소성골화증)를 관찰하였다. 실험동물은 모두 10수를 사용하였다.
결과는 도 7에 기재되어 있다. 이에 따르면 대퇴근육에 주입한 각 유효성분에 의한 이소성골화증을 비교 분석한 결과 BMP-2를 삽입한 왼쪽 다리의 경우 모든 개체(n=10)에서 뚜렷한 이소성골화증이 나타난 반면 펩타이드가 이식된 오른쪽 대퇴부에서는 모든 개체에서 이소성골화증 소견이 보이지 않았다. 이러한 결과는 본원의 펩타이드에 의한 골재생 효과가 BMP-2에 견줄만한 효과를 보이지만 안전성 면에서 이소성 골화증 증상이 나타나지 않으므로 BMP-2보다 더욱 안전적인 유효성분으로 활용될 수 있음을 나타내는 결과이다.
실시예 5. 발생과정에서 골형성 촉진 분석
발생과정에서의 골형성 촉진능은 다음과 같이 분석하였다.
이를 위해 E14.5일 배아를 임신한 어미 마우스 (C57BL/6, 10주령, Orienbio, Korea)에 10mg/kg의 본원에 따른 펩타이드를 복강에 주사하였고 이틀 후 (E16.5) 임신한 마우스를 희생하여 배아를 분리한 후 골형성능을 분석하였다.
E14.5 시기부터 배아는 완성한 골형성 속도를 보이는 주요 스테이지에 해당한다. 골형성능은 micro-CT 분석, 전체 골격 염색(Whole skeletal staining, WSS) 및 그 밖의 조직염색으로 분석하였다. 구체적으로 배아를 4% para-formaldehyde 수용액에서 고정 후 수술 후 micro-CT 분석을 실시하였으며 이 후 조직을 파라핀에 고정한 후 조직학적 분석을 실시하였다. 조직염색은 H&E 염색과 alcian blue 염색을 각각 실시하였다. 또한 whole skeletal staining 역시 에탄올 고정 후 석회화 조직은 aiizarine red 그리고 연골은 alcian blue로 염색하여 전체적인 석회화 정도를 분석하였다.
결과는 도 8 내지 도 11에 기재되어 있다.
도 8은 micro-CT 분석결과로 이에 따르면 배아상태의 골조직은 많은 부분에 있어서 미성숙 단계로 발달되어 있는 상태이다. 따라서 배아발생 과정의 단위부피당 골밀도는 여전히 미약한 상태이며 micro-CT 분석에서도 주변의 연조직과의 밀도차이가 크게 구분되지 않는 특성이 있다. 이러한 특성을 고려하여 배아단계의 분석은 골형성에 긍정적인 영향을 줄 수 있는 약물(신약 또는 의료기기의 유효성분)을 평가하는데 중요한 평가모델이 되어 왔다. 펩타이드 처리 후 배아단계에서 형성된 골조직을 micro-CT로 분석한 결과 골조직의 밀도가 두드러지게 증가되어 있었을 뿐만 아니라 그 결과 골격구조의 뚜렷한 발달양상을 관찰할 수 있었다. 반면 대조군의 경우 경조직과 주변 연조직 간의 경계가 불투명하였으며 이 결과는 아직 골의 성숙이 초기상태임을 나타내는 결과이다.
도 9는 WSS (Whole Skeletal Staining) 분석 결과로, E14.5일 배아 전체 골조직을 alizarine red 염색 및 alcian blue 염색을 실시한 결과 micro-CT 분석 결과에서 나타난 양상과 유사한 결과를 확인할 수 있었다. 본원에 따른 펩타이드 처리군에서 더욱 뚜렷한 석회화 조직을 나타내는 Alizarine red 염색이 더욱 발달되어 있음을 확인할 수 있었다. 이는 골석회화 수준이 본원에 따른 펩타이드에 의해 뚜렷히 증가하여 골형성능이 촉진되어 있음을 나타내는 결과이다.
도 10 및 도 11은 각 실험군별 배아의 hindlimb을 분리한 다음 파라핀 고정후 H&E 염색 (도 10) 및 Alcian blue 염색 (도 11)을 통하여 석회화 조직 및 연골을 각 각 염색하여 석회화 및 골형성 특징을 조사한 결과이다. WSS 분석에서 석회화 된 조직의 뚜렷한 발달이 본원에 따른 펩타이드에 의해 나타남을 확인하였으나 조직학적 분석에서도 이에 대한 근거는 더욱 확실하게 드러나고 있다. 즉 골조직이 보이는 조직학적 형태가 본원에 따른 펩타이드 처리그룹에서 더욱 뚜렷한 양상을 나타내고 있으며 길이성장 면에서도 다양한 골조직 부위에서 증가되어 있음을 확인 할 수 있었다. 또한 골형성의 완성단계에 나타나는 secondary ossification center가 형성됨을 확인할 수 있었다. 한편, H&E 염색에서 연골조직의 조직학적 특징 역시 본원에 따른 펩타이드에 의해 더욱 두드러진 차이를 보이고 있는데 이는 연골의 성장 역시 증가됨을 암시하는 결과이다. 배아발달 과정에서 골조직의 분화는 연골의 성숙이 이 선행된 후 다시 연골이 골조직으로 분화되는 과정을 거친다. 따라서 연골의 성숙도가 증가할수록 골형성에 긍정적인 영향을 미치는 것으로 잘 알려져 있다. 이러한 결과를 좀 더 구체적으로 분석하기 위하여 연골조직 염색을 위한 alcian blue 염색을 수행한 결과 연골 세포의 세포외 기질 부위의 염색이 더욱 강하게 나타나며 연골의 성장 또는 발달이 진행됨에 따라 나타나는 조직학적 특성 (연골 성장에 따른 부위별 형태, 연골세포의 모양 등) 이 본원에 따른 펩타이드 처리군에서 더욱 두드러지게 나타난다.
실시예 6. 골재생에 필수적인 기전인 세포부착 촉진
골재생에 있어서 중요한 생리학적 기전 중 하나가 바로 골전도성(osteoconductive) 이다. 세포의 부착을 높이는 기술은 골전도성을 높임으로써 나타나는 하나의 결과이기도 하다. 특히 골이식은 이러한 측면에서 본다면 골전도성에 관한 총체적 기술이라고도 할 수 있다.
본원의 펩타이드를 통한 세포부착성의 증가는 도 12 내지 도 17에 나타내었다. 도 12는 소수성표면에 대한 세포의 부착효율성을 조사하여 보았다. 소수성 표면은 일반적으로 세포의 부착이나 부착에 대한 반응성이 현저히 낮은데 이러한 표면환경은 다양한 이식재료에서 나타날 수 있는 특징이기 때문이다. 도 12에 나타난 결과처럼 인간의 골조직재생에 직접적으로 관여하는 것으로 알려진 중간엽줄기세포의 경우 펩타이드를 첨가할 경우 효과적인 부착이 유도되었다. 최소 1uM 이상에서는 상당한 수준의 부착이 관찰된다. 한편 10uM 농도의 펩타이드가 첨가될 경우 시간에 따른 부착의 양상을 광학현미경으로 관찰한 결과 대조군의 경우 240분이 지나고서도 대부분의 세포가 부착되지 못하고 있는 상태로 유지되지만 펩타이드 처리군의 경우 5분부터 50% 이상의 세포가 표면을 인식해서 부착이 발생함을 관찰할 수 있다. 이러한 결과는 생체내 세포의 결합이 유도되기 힘든 다양한 이식재료에 에를 들어 할로겐(halogens)에 의한 표면처리된 소재와 같은 생체조직 또는 세포의 접근을 용이하게 할 수 있는 소재로 사용되어 이식재와 조직간의 상호작용을 더욱 촉진하는 목적으로 사용되어 질 수 있다.
도 14는 인체에 이식되는 가장 대표적인 소재 중 하나인 티타늄 표면에서의 세포 부착을 관찰한 결과이다. 이 경우 세포부착의 형태를 관찰하기 위하여 rhodamine phalloidin과 DAPI 염색을 실시하였다. 또한 관찰은 공초점 현미경을 통해 분석하였다. 이 때 사용한 세포주는 티타늄 재질에 비교적 잘 반응하는 조골세포를 사용하였는데 형태학적 양상은 펩타이드 처리군에서 더욱 뚜렷한 차이를 보여주고 있었는데 세포의 돌기(protrusion)현상은 초기부터 아주 분명하게 나타난다. 조골세포의 티타늄 표면에서의 부착은 본원의 펩타이드가 존재할 경우 약 60분 전후로 완전한 성숙에 도달하는데 반해 대조군의 경우 60분 이상 경과하여도 여전히 라운드 모양을 유지하고 있으며 세포내 액틴염색의 경우 cortical actindl 여전히 높은 수준으로 관찰되고 있다. 이러한 결과를 보면 본원의 펩타이드에 세포가 노출 될 경우 더욱 빠른 시간에 넓은 면적의 세포분포를 기대해 볼 수 있는데 이를 분석한 결과를 도 15와 도 16에 나타내었다. 도 15는 성분에 조금씩 차이를 지닌 정형외과용 티타늄 표면에 대하여 조골전구세포의 부착 양상을 관찰한 결과인데 펩타이드 처리군과 대조군 간에는 뚜렷한 차이점을 볼 수 있다 즉 펩타이드 처리군의 경우 세포의 넓고 역동적인 분포양상을 볼 수 있을 뿐만 아니라 차지하는 표면 면적 역시 넓다는 것을 확인할 수 있다. 실제 각 세포당 차지하는 면적을 측정하여 box plot으로 나타낸 결과를 도 16에 나타내었다. 대조군의 경우 500-1,000 um2 수준의 면적을 나타낸 반면 펩타이드 처리군의 경우 1,500-3,000 um2 수준의 면적을 차지함을 확인할 수 있었다. 즉 평균적으로 약 3배에 달하는 수준의 면적 변화가 나타났다. 이 결과는 적어도 티타늄과 같은 이식재에 대한 세포의 차지 면적이 3배 이상이라는 점과 이 결과는 상당한 수준의 유합율 차이로 나타날 수 있다. 앞서 소개된 이종골이식과 두개골 재생모델에서 본원의 펩타이드에 의해 골형성이 더욱 증가한 결과는 바로 이러한 이유로 설명될 수 있다. 이식재료 표면에 조골세포 또는 골분화능을 가진 세포의 표면 부착양상을 좀 더 거시적 관점에서 관찰하기 위하여 직경 10mm 크기의 지르코니아(Zirconia) 표면에 세포를 대조군과 펩타이드 처리군으로 나누고 72시간 배양 후 세포분화 핌 분포를 확인하기 위하여 ALP(alkaline phosphotase, bone marker enzyme)를 염색하여 관찰하였다. 그 결과는 도 17에 나타내었다. 대조군의 경우 중간엽줄기세포 (hMSC) 뿐만 아니라 골수유래 미분화줄기세포 (ST-2) 모두에서 비숫한 경향성을 보이는데 전체적인 분포보다는 일정 영역에 밀집되어 분화된 세포가 나타난 결과이다. 반면 펩타이드 처리군의 경우 이식재 대부분의 영역으로 골고루 분산되어 있음이 관찰 되었다. 이는 초기 부착기전이 활성화됨으로써 세포와 이식재와의 상호작용에 크게 영향을 미친다는 사실을 의미한다. 또한 이는 외부에서 적용된 이식재에 국한되는 기전은 아니다. 왜냐하면, 즉 앞서 기술한 골전도성을 더욱 증폭하기 위한 방안으로 제작된 이식재는 개발되어 왔지만, 사실상 골조직 환경은 그 자체로써 완벽한 골전도성을 가진 구조체이므로 펩타이드가 생체 골조직에 직접 결합하는 이상 (제 1 특허) 외부소재에 의존하지 않는 골재생 또는 치료에도 활용될 수 있을 것이다.
실시예 7. 본원에 따른 다양한 펩타이드의 골재생능 분석
앞서 기술한대로 뼈와 같은 단단한 구조체 또는 세포의 부착이 어려운 표면에서 본원의 펩타이드는 부착을 촉진함으로써 재생을 위한 핵심기전을 일으킨다. 특히 골조직이 가지는 높은 경도의 표면에서 부착을 증대시킴으로써 골세포의 분화 역시 촉진될 수 있었다 (도 18 도식참고). 그러므로 이번에는 현재까지 본원에서 개발해온 다양한 접착성펩타이드를 미분화 줄기세포와 함께 혼합하여 골전도성을 가지는 티타늄표면에서 배양한 후 골세포의 분화능을 측정하였으며 도 19는 그 결과를 나타내었다. 직경 10mm의 치과용 티타늄 디스크에 트립신으로 처리된 2 x 104 세포/ml를 펩타이드(10uM)와 함께 혼합하여 6시간 동안 배양한 후 조골세포 분화배지로 교체하여 48시간 동안 배양 후 티타늄 디스크만 회수하여 세포를 용해한 후 ALP 활성을 측정하였다. 결과에서 보듯이 세포의 부착을 일으키는 모든 펩타이드에서 대조군(C)에 비해 높은 수준의 ALP 활성이 측정되었다. 특히 N-말단에 양전하를 띄는 15개의 아르기닌 잔기를 포함하는 서열번호 41 [(R)15-QLVVKFRALPC]의 경우 가장 높은 ALP 활성을 나타내었다.
<110> YOON, WON JOON <120> Peptide stimulating bone regeneration or bone formation and its use <130> DP201707007P <150> KR 2016-0109232 <151> 2016-08-26 <160> 79 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial <400> 1 Gln Leu Val Val Lys 1 5 <210> 2 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial <400> 2 Gln Glu Glu Glu Lys 1 5 <210> 3 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial <400> 3 Gln Ala Ala Ala Lys 1 5 <210> 4 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial <400> 4 Asn Leu Val Val Lys 1 5 <210> 5 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial <400> 5 Ser Leu Val Val Lys 1 5 <210> 6 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial <400> 6 Phe Arg Ala Leu Pro Cys 1 5 <210> 7 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial <400> 7 Phe Arg Glu Glu Pro Cys 1 5 <210> 8 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial <400> 8 Phe Arg Val Val Pro Cys 1 5 <210> 9 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial <400> 9 Phe Glu Ala Leu Pro Cys 1 5 <210> 10 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial <400> 10 Tyr Arg Ala Leu Pro Cys 1 5 <210> 11 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial <400> 11 Trp Arg Ala Leu Pro Cys 1 5 <210> 12 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial <400> 12 Phe Arg Ala Leu Pro 1 5 <210> 13 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial <400> 13 Phe Arg Ala Leu 1 <210> 14 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial <400> 14 Phe Arg Pro Cys 1 <210> 15 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial <400> 15 Arg Gln Leu Val Val Lys 1 5 <210> 16 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial <400> 16 Phe Arg Ala Leu Pro Cys Arg Gln Leu Val Val Lys 1 5 10 <210> 17 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial <400> 17 Arg Gln Leu Val Val Lys Phe Arg Ala Leu Pro Cys 1 5 10 <210> 18 <211> 24 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial <400> 18 Arg Gln Leu Val Val Lys Phe Arg Ala Leu Pro Cys Arg Gln Leu Val 1 5 10 15 Val Lys Phe Arg Ala Leu Pro Cys 20 <210> 19 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial <400> 19 Arg Gln Leu Val Val Lys Phe Arg Ala Leu Pro 1 5 10 <210> 20 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial <400> 20 Arg Gln Leu Val Val Lys Phe Arg Ala Leu 1 5 10 <210> 21 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial <400> 21 Lys Gln Leu Val Val Lys Phe Arg Ala Leu Pro Cys 1 5 10 <210> 22 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial <400> 22 Arg Gln Lys Phe Arg Ala Leu Pro Cys 1 5 <210> 23 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial <400> 23 Arg Gln Glu Glu Glu Lys Phe Arg Ala Leu Pro Cys 1 5 10 <210> 24 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial <400> 24 Arg Gln Ala Ala Ala Lys Phe Arg Ala Leu Pro Cys 1 5 10 <210> 25 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial <400> 25 Arg Gln Leu Val Val Lys Phe Arg Pro Cys 1 5 10 <210> 26 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial <400> 26 Arg Gln Leu Val Val Lys Phe Arg Glu Glu Pro Cys 1 5 10 <210> 27 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial <400> 27 Arg Gln Leu Val Val Lys Phe Arg Val Val Pro Cys 1 5 10 <210> 28 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial <400> 28 Arg Gln Glu Glu Glu Lys Phe Arg Glu Glu Pro Cys 1 5 10 <210> 29 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial <400> 29 Glu Gln Leu Val Val Glu Phe Glu Ala Leu Pro Cys 1 5 10 <210> 30 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial <400> 30 Arg Gln Leu Val Val Lys Tyr Arg Ala Leu Pro Cys 1 5 10 <210> 31 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial <400> 31 Arg Gln Leu Val Val Lys Trp Arg Ala Leu Pro Cys 1 5 10 <210> 32 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial <400> 32 Arg Asn Leu Val Val Lys Phe Arg Ala Leu Pro Cys 1 5 10 <210> 33 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial <400> 33 Arg Ser Leu Val Val Lys Phe Arg Ala Leu Pro Cys 1 5 10 <210> 34 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial <400> 34 Arg Gln Leu Val Val Gln Leu Val Val Lys Phe Arg Ala Leu Pro Cys 1 5 10 15 <210> 35 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial <400> 35 Arg Gln Leu Val Val Gln Leu Val Val Gln Leu Val Val Lys Phe Arg 1 5 10 15 Ala Leu Pro Cys 20 <210> 36 <211> 24 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial <400> 36 Arg Gln Leu Val Val Gln Leu Val Val Gln Leu Val Val Gln Leu Val 1 5 10 15 Val Lys Phe Arg Ala Leu Pro Cys 20 <210> 37 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial <400> 37 Arg Gln Leu Val Val Lys Phe Arg Ala Leu Pro Cys Phe Arg Ala Leu 1 5 10 15 Pro Cys <210> 38 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial <400> 38 Arg Arg Gln Leu Val Val Lys Phe Arg Ala Leu Pro Cys 1 5 10 <210> 39 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial <400> 39 Arg Arg Arg Arg Arg Gln Leu Val Val Lys Phe Arg Ala Leu Pro Cys 1 5 10 15 <210> 40 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial <400> 40 Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Gln Leu Val Val Lys Phe 1 5 10 15 Arg Ala Leu Pro Cys 20 <210> 41 <211> 26 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial <400> 41 Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Gln 1 5 10 15 Leu Val Val Lys Phe Arg Ala Leu Pro Cys 20 25 <210> 42 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial <400> 42 Arg Gln Val Val Val Lys Phe Arg Ala Leu Pro Cys 1 5 10 <210> 43 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial <400> 43 Arg Gln Ile Val Val Lys Phe Arg Ala Leu Pro Cys 1 5 10 <210> 44 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial <400> 44 Arg Gln Ala Val Val Lys Phe Arg Ala Leu Pro Cys 1 5 10 <210> 45 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial <400> 45 Arg Gln Glu Val Val Lys Phe Arg Ala Leu Pro Cys 1 5 10 <210> 46 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial <400> 46 Arg Gln Leu Leu Val Lys Phe Arg Ala Leu Pro Cys 1 5 10 <210> 47 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial <400> 47 Arg Gln Leu Ile Val Lys Phe Arg Ala Leu Pro Cys 1 5 10 <210> 48 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial <400> 48 Arg Gln Leu Ala Val Lys Phe Arg Ala Leu Pro Cys 1 5 10 <210> 49 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial <400> 49 Arg Gln Leu Glu Val Lys Phe Arg Ala Leu Pro Cys 1 5 10 <210> 50 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial <400> 50 Arg Gln Leu Val Leu Lys Phe Arg Ala Leu Pro Cys 1 5 10 <210> 51 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial <400> 51 Arg Gln Leu Val Ile Lys Phe Arg Ala Leu Pro Cys 1 5 10 <210> 52 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial <400> 52 Arg Gln Leu Val Ala Lys Phe Arg Ala Leu Pro Cys 1 5 10 <210> 53 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial <400> 53 Arg Gln Leu Val Glu Lys Phe Arg Ala Leu Pro Cys 1 5 10 <210> 54 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial <400> 54 Arg Gln Leu Val Val Arg Phe Arg Ala Leu Pro Cys 1 5 10 <210> 55 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial <400> 55 Arg Gln Leu Val Val Lys Phe Lys Ala Leu Pro Cys 1 5 10 <210> 56 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial <400> 56 Arg Gln Leu Val Val Glu Phe Glu Ala Leu Pro Cys 1 5 10 <210> 57 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial <400> 57 Arg Gln Leu Val Val Lys Phe Arg Leu Leu Pro Cys 1 5 10 <210> 58 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial <400> 58 Arg Gln Leu Val Val Lys Phe Arg Ile Leu Pro Cys 1 5 10 <210> 59 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial <400> 59 Arg Gln Leu Val Val Lys Phe Arg Val Leu Pro Cys 1 5 10 <210> 60 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial <400> 60 Arg Gln Leu Val Val Lys Phe Arg Glu Leu Pro Cys 1 5 10 <210> 61 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial <400> 61 Arg Gln Leu Val Val Lys Phe Arg Ala Ala Pro Cys 1 5 10 <210> 62 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial <400> 62 Arg Gln Leu Val Val Lys Phe Arg Ala Ile Pro Cys 1 5 10 <210> 63 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial <400> 63 Arg Gln Leu Val Val Lys Phe Arg Ala Val Pro Cys 1 5 10 <210> 64 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial <400> 64 Arg Gln Leu Val Val Lys Phe Arg Ala Glu Pro Cys 1 5 10 <210> 65 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial <400> 65 Arg Gln Glu Glu Glu Glu Phe Glu Glu Glu Pro Cys 1 5 10 <210> 66 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial <220> <221> VARIANT <222> (11) <223> any amino acids <400> 66 Arg Gln Leu Val Val Lys Phe Arg Ala Leu Xaa Cys 1 5 10 <210> 67 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial <400> 67 Arg Gln Leu Val Val Lys Phe Arg Ala Leu Pro Ser 1 5 10 <210> 68 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial <400> 68 Arg Gln Leu Val Val Lys Phe Arg Ala Leu Pro Thr 1 5 10 <210> 69 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial <220> <221> VARIANT <222> (12) <223> any amino acids <400> 69 Arg Gln Leu Val Val Lys Phe Arg Ala Leu Pro Xaa 1 5 10 <210> 70 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial <400> 70 Gln Val Val Val Lys 1 5 <210> 71 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial <400> 71 Gln Ile Val Val Lys 1 5 <210> 72 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial <400> 72 Gln Ala Val Val Lys 1 5 <210> 73 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial <400> 73 Gln Leu Leu Val Lys 1 5 <210> 74 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial <400> 74 Gln Leu Ile Val Lys 1 5 <210> 75 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial <400> 75 Gln Leu Ala Val Lys 1 5 <210> 76 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial <400> 76 Gln Leu Val Leu Lys 1 5 <210> 77 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial <400> 77 Gln Leu Val Ile Lys 1 5 <210> 78 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial <400> 78 Gln Leu Val Ala Lys 1 5 <210> 79 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial <400> 79 Gln Leu Val Val Arg 1 5

Claims (17)

  1. 하기 화학식의 펩타이드를 포함하는 골재생 또는 골형성 촉진용 약학 조성물:
    [X12]1-15 -[X1- X2- X3- X4- X5]m- [X6- X7- X8- X9- X10- X11]n,
    상기 [X1- X2- X3- X4- X5]m에서,
    상기 X1 은 임의의 아미노산이고,
    상기 X2, X3 및 X4 는 L, V, I, E, G 및 A 중 어느 하나의 아미노산으로, 각각 동일 또는 상이하며, 상기 X2, X3 또는 X4 중 하나 이상은 결여될 수 있으며,
    상기 X5 는 K 또는 R의 아미노산 이고,
    상기 m은 1 내지 5의 정수이며, 두 개 이상 포함하는 경우, 각 펩타이드의 아미노산 서열은 동일 또는 상이하며,
    상기 [X6- X7- X8- X9- X10- X11]n에서,
    상기 [X6- X7- X8- X9- X10- X11]은 결여될 수 있거나, 또는
    상기 X6 는 F, Y 및 W 중 어느 하나의 아미노산이고,
    상기 X7 는 K 또는 R의 아미노산이고,
    상기 X8 는 A, M 및 I 중 어느 하나의 아미노산이고,
    상기 X9 는 L, M 및 G 중 어느 하나의 아미노산이고,
    상기 X10 는 임의의 아미노산이고,
    상기 X11 는 C, S 및 T 중 어느 하나의 아미노산이고,
    상기 X8 및 X9 또는 상기 X10 및 X11 중 하나 이상은 결여될 수 있으며,
    상기 n은 1 또는 2이고,
    상기 X12 는 F, K 또는 R 이고,
    상기 아미노산은 D- 또는 L- 형의 천연 또는 비천연 아미노산 또는 그 유도체임.
  2. 제 1 항에 있어서,
    상기 X1 의 임의의 아미노산은 S, T, C, P, N 또는 Q인, 골재생 또는 골형성 촉진용 약학 조성물.
  3. 제 1 항에 있어서,
    상기 X2- X3- X4 는 AAA, EEE, LVG, LVA, LVL, LVV, LLA, LLL, 또는 LLV 인, 골재생 또는 골형성 촉진용 약학 조성물.
  4. 제 1 항에 있어서,
    상기 [X1- X2- X3- X4- X5]의 펩타이드는 하기 중 어느 하나인, 골재생 또는 골형성 촉진용 약학 조성물: QLVVK (서열번호 1), QEEEK (서열번호 2), QAAAK (서열번호 3), NLVVK (서열번호 4), SLVVK (서열번호 5), QVVVK (서열번호 70), QIVVK (서열번호 71), QAVVK (서열번호 72), QLLVK (서열번호 73), QLIVK (서열번호 74), QLAVK (서열번호 75), QLVLK (서열번호 76), QLVIK (서열번호 77), QLVAK (서열번호 78), 또는 QLVVR (서열번호 79).
  5. 제 1 항에 있어서,
    상기 [X6- X7- X8- X9- X10- X11]의 펩타이드는 하기 중 어느 하나인, 골재생 또는 골형성 촉진용 약학 조성물:
    FRALPC (서열번호 6), FREEPC (서열번호 7), FRVVPC (서열번호 8), FEALPC (서열번호 9), YRALPC (서열번호 10), WRALPC (서열번호 11), FRALP (서열번호 12), FRAL(서열번호 13), FRPC (서열번호 14) 또는 FR인, 골재생 또는 골형성 촉진용 약학 조성물.
  6. 제 1 항에 있어서, 상기 펩타이드는 두 개 이상이 연결된 것인, 골재생 또는 골형성 촉진용 약학 조성물.
  7. 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 펩타이드는 하기 중 어느 하나의 서열로 표시되는 골재생 또는 골형성 촉진용 약학 조성물:
    RQLVVK (서열번호 15);
    FRALPCRQLVVK (서열번호 16);
    RQLVVKFRALPC (서열번호 17);
    RQLVVKFRALPCRQLVVKFRALPC (서열번호 18);
    RQLVVKFRALP(서열번호 19);
    RQLVVKFRAL(서열번호 20);
    KQLVVKFRALPC (서열번호 21);
    RQKFRALPC (서열번호 22);
    RQEEEKFRALPC (서열번호 23);
    RQAAAKFRALPC (서열번호 24);
    RQLVVKFRPC (서열번호 25);
    RQLVVKFREEPC (서열번호 26);
    RQLVVKFRVVPC (서열번호 27);
    RQEEEKFREEPC (서열번호 28);
    EQLVVEFEALPC (서열번호 29);
    RQLVVKYRALPC (서열번호 30);
    RQLVVKWRALPC (서열번호 31);
    RNLVVKFRALPC (서열번호 32);
    RSLVVKFRALPC (서열번호 33);
    RQLVVK-(FRALPC)2 (서열번호 37);
    (R)2-QLVVKFRALPC (서열번호 38);
    (R)5-QLVVKFRALPC (서열번호 39);
    (R)10-QLVVKFRALPC (서열번호 40) ;
    (R)15-QLVVKFRALPC (서열번호 41).
    RQVVVKFRALPC (서열번호 42);
    RQIVVKFRALPC (서열번호 43);
    RQAVVKFRALPC (서열번호 44);
    RQEVVKFRALPC (서열번호 45);
    RQLLVKFRALPC (서열번호 46);
    RQLIVKFRALPC (서열번호 47);
    RQLAVKFRALPC (서열번호 48);
    RQLEVKFRALPC (서열번호 49);
    RQLVLKFRALPC (서열번호 50);
    RQLVIKFRALPC (서열번호 51);
    RQLVAKFRALPC (서열번호 52);
    RQLVEKFRALPC (서열번호 53);
    RQLVVRFRALPC (서열번호 54);
    RQLVVKFKALPC (서열번호 55);
    RQLVVEFEALPC (서열번호 56);
    RQLVVKFRLLPC (서열번호 57);
    RQLVVKFRILPC (서열번호 58);
    RQLVVKFRVLPC (서열번호 59);
    RQLVVKFRELPC (서열번호 60);
    RQLVVKFRAAPC (서열번호 61);
    RQLVVKFRAIPC (서열번호 62);
    RQLVVKFRAVPC (서열번호 63);
    RQLVVKFRAEPC (서열번호 64);
    RQEEEEFEEEPC (서열번호 65);
    RQLVVKFRALXC (서열번호 66);
    RQLVVKFRALPS (서열번호 67);
    RQLVVKFRALPT (서열번호 68); 또는
    RQLVVKFRALPX (서열번호 69).
  8. 제 7 항에 있어서,
    상기 펩타이드의 N 말단에 5개 내지 20개의 K 또는 R을 추가로 포함하는 것인, 골재생 또는 골형성 촉진용 약학 조성물.
  9. 제 1 항에 있어서,
    상기 X1 은 극성의 Q, N, S, T, P 또는 C 이고,
    상기 X2, X3 및 X4 는 각각 동일 또는 상이한 소수성의 L, V, I, 또는 A 이고,
    상기 X5 는 양하전된 K 또는 R 이고,
    상기 [X6- X7- X8- X9- X10- X11]에서, X8 및 X9 또는 상기 X10 및 X11 중 하나 이상은 결여될 수 있으며, FRALPC (서열번호 6), FREEPC (서열번호 7), FRVVPC (서열번호 8), FEALPC (서열번호 9), YRALPC (서열번호 10), WRALPC (서열번호 11), FRALP (서열번호 12), FRAL(서열번호 13), 또는 FRPC (서열번호 14), 또는 FR 이고,
    상기 X12 는 양하전된 K 또는 R 이고,
    상기 m 및 n은 각각 1 또는 2이고, m 또는 n 이 2인 경우, 각 펩타이드의 아미노산 서열은 동일 또는 상이하며, 상기 아미노산은 D- 또는 L- 형의 천연 또는 비천연 아미노산인, 골재생 또는 골형성 촉진용 약학 조성물.
  10. 제 9 항에 있어서,
    상기 X2- X3- X4 는 LVV, AAA, LVA, LVL, LLA, LLL, 또는 LLV 인, 골재생 또는 골형성 촉진용 약학 조성물.
  11. 제 9 항에 있어서,
    상기 [X1- X2- X3- X4- X5] 의 펩타이드는 하기 중 어느 하나인, 골재생 또는 골형성 촉진용 약학 조성물:
    QLVVK (서열번호 1), QAAAK (서열번호 3), NLVVK (서열번호 4), 또는 SLVVK (서열번호 5), QVVVK (서열번호 70), QIVVK (서열번호 71), QAVVK (서열번호 72), QLLVK (서열번호 73), QLIVK (서열번호 74), QLAVK (서열번호 75), QLVLK (서열번호 76), QLVIK (서열번호 77), QLVAK (서열번호 78), 또는 QLVVR (서열번호 79) 인, 골재생 또는 골형성 촉진용 약학 조성물.
  12. 제 9 항에 있어서,
    상기 펩타이드는 하기 서열로 표시되는 것인, 골재생 또는 골형성 촉진용 약학 조성물:
    RQLVVKFRALPC (서열번호 17);
    RQLVVKFRALP(서열번호 19);
    RQLVVKFRAL(서열번호 20);
    KQLVVKFRALPC (서열번호 21);
    RQAAAKFRALPC (서열번호 24);
    RQLVVKFRPC (서열번호 25);
    RQLVVKFREEPC (서열번호 26);
    RQLVVKFRVVPC (서열번호 27);
    RQLVVKYRALPC (서열번호 30);
    RQLVVKWRALPC (서열번호 31);
    RNLVVKFRALPC (서열번호 32);
    RSLVVKFRALPC (서열번호 33);
    RQLVVK-(FRALPC)2 (서열번호 37);
    (R)2-QLVVKFRALPC (서열번호 38);
    (R)5-QLVVKFRALPC (서열번호 39);
    (R)10-QLVVKFRALPC (서열번호 40);
    (R)15-QLVVKFRALPC (서열번호 41);
    RQVVVKFRALPC (서열번호 42);
    RQIVVKFRALPC (서열번호 43);
    RQAVVKFRALPC (서열번호 44);
    RQLLVKFRALPC (서열번호 46);
    RQLIVKFRALPC (서열번호 47);
    RQLAVKFRALPC (서열번호 48);
    RQLVLKFRALPC (서열번호 50);
    RQLVIKFRALPC (서열번호 51);
    RQLVAKFRALPC (서열번호 52); 또는
    RQLVVRFRALPC (서열번호 54).
  13. 제 12 항에 있어서,
    상기 펩타이드의 N 말단에 5개 내지 20개의 K 또는 R을 추가로 포함하는 것인, 골재생 또는 골형성 촉진용 약학 조성물.
  14. 서열번호 15 내지 69 중 어느 하나로 표시되는 아미노산 서열의 펩타이드를 포함하는 골재생 또는 골형성 촉진용 약학 조성물.
  15. 제 1 항 내지 제 14 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 펩타이드의 N 또는 C-말단은 비반응성기로 치환된 것인, 골재생 또는 골형성 촉진용 약학 조성물.
  16. 제 1 항 내지 제 14 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 약학 조성물은 골소실로 인해 골밀도의 증가가 필요한 질환의 치료 또는 예방에 사용되며, 상기 질환은 골절, 치조골 재생, 관절성형술, 척추유합 또는 골낭포를 포함하는 것인, 골재생 또는 골형성 촉진용 약학 조성물.
  17. 제 1 항 내지 제 14 항 중 어느 한 항에 따른 약학 조성물을 인간을 제외한 동물에 투여하는 단계를 포함하는 골재생 또는 골형성 촉진 방법.


KR1020170108652A 2016-08-26 2017-08-28 골재생 또는 골형성 촉진용 펩타이드 및 그 용도 KR102012380B1 (ko)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020160109232 2016-08-26
KR20160109232 2016-08-26

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20180023874A true KR20180023874A (ko) 2018-03-07
KR102012380B1 KR102012380B1 (ko) 2019-08-20

Family

ID=61245095

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020170108652A KR102012380B1 (ko) 2016-08-26 2017-08-28 골재생 또는 골형성 촉진용 펩타이드 및 그 용도

Country Status (6)

Country Link
US (1) US20230181677A1 (ko)
EP (1) EP3505529A4 (ko)
JP (1) JP6998068B2 (ko)
KR (1) KR102012380B1 (ko)
CN (1) CN109863163B (ko)
WO (1) WO2018038582A1 (ko)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110013566A (zh) * 2019-05-24 2019-07-16 大连医科大学附属第一医院 一种复合骨修复材料的制备方法

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20110014955A (ko) * 2009-08-06 2011-02-14 가부시기가이샤쯔바기모도체인 케이블류 보호 안내 장치

Family Cites Families (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4554101A (en) 1981-01-09 1985-11-19 New York Blood Center, Inc. Identification and preparation of epitopes on antigens and allergens on the basis of hydrophilicity
US6184205B1 (en) * 1994-07-22 2001-02-06 University Of North Carolina At Chapel Hill GRB2 SH3 binding peptides and methods of isolating and using same
JP3906924B2 (ja) 2003-02-28 2007-04-18 独立行政法人農業生物資源研究所 絹タンパクから細胞生育ペプチドの抽出と利用
KR101013999B1 (ko) * 2004-03-19 2011-02-14 재단법인서울대학교산학협력재단 표면에 골조직 형성 증진 펩타이드가 고정된 차폐막 및임플란트
US8329421B2 (en) 2007-07-13 2012-12-11 Ventana Medical Systems, Inc. Methods of predicting response of a neoplasm to an EGFR inhibitor and detecting interactions between EGFR and an EGFR regulatory protein
WO2009093240A2 (en) 2008-01-24 2009-07-30 Ademex Ltd. Erythropoietin and fibronectin compositions for bone regeneration
KR100879704B1 (ko) * 2008-06-11 2009-01-22 오스템임플란트 주식회사 골유착 및 골형성을 증진시키는 올리고펩타이드
CN103509108B (zh) * 2013-08-07 2015-02-25 浙江大学 利用特征十二多肽制备家蚕丝素蛋白特异抗体的方法
CN103665142A (zh) * 2013-11-20 2014-03-26 北京博恩康生物科技有限公司 一种诱导成骨短肽及其制备方法和用途
KR101637497B1 (ko) * 2014-12-19 2016-07-07 (주)케어젠 골형성 펩타이드 및 이의 용도
KR101794401B1 (ko) * 2015-03-26 2017-11-06 윤원준 접착성 펩타이드 및 그 용도

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20110014955A (ko) * 2009-08-06 2011-02-14 가부시기가이샤쯔바기모도체인 케이블류 보호 안내 장치

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110013566A (zh) * 2019-05-24 2019-07-16 大连医科大学附属第一医院 一种复合骨修复材料的制备方法

Also Published As

Publication number Publication date
JP2019534241A (ja) 2019-11-28
EP3505529A4 (en) 2020-05-13
JP6998068B2 (ja) 2022-01-18
EP3505529A1 (en) 2019-07-03
WO2018038582A1 (ko) 2018-03-01
KR102012380B1 (ko) 2019-08-20
US20230181677A1 (en) 2023-06-15
CN109863163A (zh) 2019-06-07
CN109863163B (zh) 2023-07-21

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EP2446862B1 (en) Amphiphilic peptides and hydrogel matrices thereof for bone repair
EP3419678B1 (en) Trizonal membranes for periosteum regeneration
HUT65499A (en) Method for the preparation of bone supplementing material with fgf
JPH09505305A (ja) 骨形成促進生成物および骨形成方法
KR20050010778A (ko) 결합조직 자극 펩티드
US8871900B2 (en) Fibroblast growth factor (FGF) analogs and uses thereof
US11000570B2 (en) Isoform Nell-1 peptide
Zhang et al. Advancing collagen-based biomaterials for oral and craniofacial tissue regeneration
Lin et al. Augmentation of osseous phenotypes in vivo with a synthetic peptide
KR102012380B1 (ko) 골재생 또는 골형성 촉진용 펩타이드 및 그 용도
KR20110120425A (ko) 디히드록시벤조산 유도체를 포함하는 골이식용 또는 골충진용 조성물
Al-Qutub et al. Guided Bone Regeneration Using Biphasic Calcium Phosphate With Adjunct Recombinant Human Bone Morphogenetic Protein-2 With and Without Collagen Membrane in Standardized Calvarial Defects in Rats: A Histologic and Biomechanical Analysis.
AU2015220785B2 (en) Implant comprising FGF-18
KR101950115B1 (ko) 재조합 인간 뼈 형성 단백질-2 및 비스포스포네이트로 이루어진 복합체, 이를 포함하는 조성물
EP3564255A1 (en) Dual functional novel peptide having cell permeability and bone tissue regeneration ability, and use thereof
US11596712B2 (en) Autologous bone graft substitute composition
Trybek et al. Osteogenic activity of lactoferrin and its application in contemporary dentistry
Tansık Bioactive Peptide Nanofibers for Bone Tissue Regeneration
Hideo et al. Recombinant collagen polypeptide as a versatile bone graft biomaterial
Al-Kindi et al. Guided Bone Regeneration Using Biphasic Calcium Phosphate With Adjunct Recombinant Human Bone Morphogenetic Protein-2 With and Without Collagen Membrane in Standardized Calvarial Defects in Rats: A Histologic and Biomechanical Analysis
Pina et al. 3.2 Osteoconductive properties of brushite-forming Zn-and ZnSr-substituted β-TCP bone cements
Wang et al. Guided Bone Regeneration Using Biphasic Calcium Phosphate With Adjunct Recombinant Human Bone Morphogenetic Protein-2 With and Without Collagen Membrane in Standardized Calvarial Defects in Rats: A Histologic and Biomechanical Analysis
Mardirosian Effects of Bone Morphogenetic Protein (rhBMP-2) and Platelet Derived Growth Factor (rhPDGF-BB) on Ectopic Bone Formation In Rats
Chae et al. The clinical effects of anorganic bovine-derived hydroxyapatite matrix (Abm)/cell binding peptide (P-15) in human periodontal defects
CN101098717A (zh) 用于修复骨折的补充的基质

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
N231 Notification of change of applicant
E902 Notification of reason for refusal
E90F Notification of reason for final refusal
E701 Decision to grant or registration of patent right
GRNT Written decision to grant