CN112601533A - 将含有源自干细胞的外泌体的培养液作为有效成分包含的关节炎预防或治疗用组合物 - Google Patents
将含有源自干细胞的外泌体的培养液作为有效成分包含的关节炎预防或治疗用组合物 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及含有源自干细胞的外泌体的培养液作为有效成分的关节炎预防或治疗用组合物，具体地本发明涉及一种在干细胞培养液中接种TNF‑α、在1‑8％的氧浓度条件下培养获得的含有源自干细胞的外泌体的培养液作为有效成分包含的关节炎预防或者治疗用药物组合物。根据本发明的含有源自干细胞的外泌体的培养液包含大量含软骨再生促进因子等功能性有效成分的外泌体，从而确认与现有的用于治疗关节炎的干细胞移植方法及用通常的干细胞培养条件下获得的培养液处理相比，具有显著优异的关节炎治疗效果。从而根据本发明的含有源自干细胞的外泌体的培养液具有能够有效地用作关节炎治疗的新型治疗剂的效果。
Description
技术领域
本发明涉及含由干细胞分泌的外泌体的培养液作为有效成分包含的关节炎预防或治疗用组合物。
背景技术
关节炎是诱发疼痛、强直、运动功能不全的最为常见的疾病之一。类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis,RA)是对II型胶原(collagen II)自身免疫反应导致的炎症疾病，伴随着关节浮肿和疼痛。相较于此，骨关节炎(osteoarthritis,OA)以关节的退行性病变为特征，诱发软骨细胞和组织的破坏导致的疼痛和关节变形。尤其是随着骨关节炎的老化和细胞凋亡，软骨细胞(chondrocytes)的数量和功能低下加速了如肽聚糖(肽聚糖(peptidoglycans，PG))、II型胶原(collagen II)及聚蛋白多糖(aggrecan)等正常细胞外基质(extracellular matrix,ECM)的成分和结构(architecture)的消逝加速。另外，目前为止的类风湿性关节炎治疗中主要处方了用于缓解疼痛和炎症的镇痛消炎剂，还未开发出能够根本解决免疫反应的根源治疗剂。且能够阻止骨关节炎的进行并使其康复的治疗剂也没有被公开过，只能依赖暂时缓解疼痛或者手术治疗。
鉴于此，近来利用骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSC)的能够保护和再生关节的新型治疗战略正在引起人们极大的关注。尤其，有报道称骨髓间充质干细胞能够从骨髓、脂肪、脐带血等多种组织中获得，自我分裂和增殖能力优异，在体外和体内能够分化为软骨组织，因此能够代替损伤的关节。实际上，近来已经证明脐带血干细胞(umbilical cord blood stem cells,UCBSC)和脂肪干细胞(adipose tissue stemcells,ASC)在骨关节炎动物模型和临床试验中，在无副作用的情况下通过关节的疼痛缓解和软骨细胞再生改善关节损伤。但是与自体同源干细胞(autologous stem cells)相比，高剂量注射同种异体干细胞(allogeneic stem cells)或异种干细胞(heterogenic stemcells)时通常发生关节腔内渗出物储留的问题，作为解决该问题的方法正在进行仅注入培养液(conditioned medium,CM)而不是直接移植干细胞的恢复软骨损伤的技术研究。已知干细胞具有释放细胞因子(cytokines)、趋化因子(chemokines)、生长因子(growthfactors,GF)、神经营养因子(neurotrophic factors,NF)等多种分泌因子(secretoryfactors)而发挥促进损伤组织的恢复的旁分泌(paracrine effect)效果的优点，尤其是如脐带血干细胞、脂肪干细胞、骨髓干细胞(bone marrow stem cells,BMSC)等从骨髓间充质干细胞中游离的凝血栓蛋白2(thrombospondin 2,TSP2)能够将干细胞分化为软骨细胞、促进软骨细胞的增殖，从而康复骨关节炎。但是干细胞培养液内的软骨再生促进因子等功能性成分的浓度过低，而仅依靠干细胞培养液的给予存在实际关节炎治疗效果低于直接移植干细胞的问题。由此，本发明的发明人着眼于当有效功能性成分从干细胞分泌时以脂质层内外泌体(exosomes)的形态分泌，采用正常(通常)的干细胞的培养方法外泌体分泌量非常少，从而确立了能够提高外泌体分泌量的新的培养条件，为此本发明中，将羊水干细胞(amniotic fluid stem cells,AFSC)、羊膜干细胞(amniotic membrane stem cells,AMSC)、胎盘干细胞(placental stem cells,PSC、脐带血干细胞(umbilical cord bloodstem cells,UCBSC)、神经干细胞(neural stem cells,NSC)、少突胶质前体细胞(oligodendrocyte progenitor cells,OPC)、脂肪干细胞(adipose tissue stem cells,ASC)和骨髓干细胞(bone marrow stem cells,BMSC)与肿瘤坏死因子(tumor-necrosisfactor-，TNF-α)一同在低氧培养条件下培养富含外泌体培养液(exosome-richconditioned medium,ERCM)，确认上述培养液的优异关节炎治疗效果，从而完成了本发明。
发明内容
发明目的
本发明的目的在于，提供一种含有源自干细胞的外泌体的培养液作为有效成分包含的关节炎预防或治疗用药物组合物。
技术方案
为了达到上述本发明目的，本发明提供含有源自干细胞的外泌体的培养液作为有效成分包含的关节炎预防或治疗用药物组合物
此外，根据本发明一实施例，所述含有源自干细胞的外泌体的培养液是接种TNF-α、在1-8％的氧浓度条件下培养获得的。
此外，根据本发明一实施例，TNF-α是以5-500ng/ml的浓度处理，所述培养是培养12-72小时。
此外，根据本发明一实施例，所述干细胞是选自由神经干细胞,少突胶质前体细胞,脂肪干细胞,羊膜干细胞,羊水干细胞,胎盘干细胞,脐带血干细胞及骨髓干细胞组成的组中的。
此外，根据本发明一实施例，所述神经干细胞是永生化神经干细胞CBNU-NSC细胞株(保藏编号：KCTC12635BP)，所述羊水干细胞是永生化羊水干细胞CBNU-AFSC细胞株(保藏编号：KCTC12634BP)，所述突胶质前体细胞是永生化少突胶质前体细胞CBNU-NSC.olig2细胞株(保藏编号：KCTC12636BP)。
此外，根据本发明一实施例，所述神经干细胞的细胞数可以是1x104～1x106。
此外，根据本发明一实施例，所受关节炎选自由骨关节炎(Osteoarthritis)、类风湿性关节炎(Rheumatoid Arthritis)、纤维肌痛(Fibromyalgia)、痛风(gout)及狼疮(lupus)组成的组中。
发明效果
本发明涉及含有源自干细胞的外泌体的培养液作为有效成分的关节炎预防或治疗用组合物，具体地本发明涉及一种在干细胞培养液中接种TNF-α、在1-8％的氧浓度条件下培养获得的含有源自干细胞的外泌体的培养液作为有效成分包含的关节炎预防或者治疗用药物组合物。根据本发明的含有源自干细胞的外泌体的培养液包含大量含软骨再生促进因子等功能性有效成分的外泌体，从而确认与现有的用于治疗关节炎的干细胞移植方法及用通常的干细胞培养条件下获得的培养液处理相比，具有显著优异的关节炎治疗效果。从而根据本发明的含有源自干细胞的外泌体的培养液具有能够有效地用作关节炎治疗的新型治疗剂的效果。
附图说明
图1是诱导骨关节炎的组、用本发明的富含源自干细胞的外泌体的培养液处理的组及用对照组干细胞培养液处理的组的X射线(X-ray)分析照片；白色箭标表示内侧股骨髁骨赘；白色箭头表示股骨或者胫骨变形；白色箭标表示胫骨刺(骨棘)变尖。
图2是用肉眼观察诱导骨关节炎的组、用本发明的富含源自干细胞的外泌体的培养液处理的组及用对照组干细胞培养液处理的组的骨关节炎症状程度的照片。图3中黑色箭头表示糜烂及溃疡；白色箭头表示半月板粘连。
图3是用显微镜观察诱导骨关节炎的组、用本发明的富含源自干细胞的外泌体的培养液处理的组及用对照组干细胞培养液处理的组的结果，白色箭头表示被苏木素(hematoxylin)染紫的软骨细胞层；黑色箭头表示被番红O(safranin O)染红的肽聚糖(peptidoglycans，PG)层。
具体实施方式
本发明为了将干细胞更有效地用作关节炎治疗剂的材料而进行研究的过程中，作为增进源自干细胞的有效成分的获得和效能的方法，确认了从干细胞增加外泌体的分泌而获得的含有源自干细胞的外泌体的培养液能够有效地预防或治疗关节炎。
从而本发明的特征在于提供含有源自干细胞的外媒体的培养液作为有效成分包含的关节炎预防或治疗用药物组合物。
根据本发明的能够从干细胞增加外泌体分泌的方法，可以包括在干细胞培养液中接种TNF-α、在低氧浓度条件下培养的步骤；优选，包括TNF-α以5-500ng/mL的浓度处理，在1-8％的氧浓度条件下培养12-72小时的步骤。更优选，包括在干细胞培养液中以50ng/mL的浓度接种TNF-α，在5％的氧浓度条件下培养24小时的步骤。
本发明中，所述“干细胞”是指还未分化为特定细胞的细胞，具有在需要的情况下能够分化为神经、血液、软骨等构成身体的所有种类的细胞的能力的细胞。
本发明中，能够分泌外泌体的干细胞的种类可以为神经干细胞、少突胶质前体细胞,脂肪干细胞,羊膜干细胞,羊水干细胞,胎盘干细胞,脐带血干细胞或骨髓干细胞，但不限于此。
根据本发明一实施例，所述神经干细胞使用了永生化神经干细胞CBNU-NSC细胞株(保藏编号：KCTC12635BP)，所述羊水干细胞使用了永生化羊水干细胞CBNU-AFSC细胞株(保藏编号：KCTC12634BP)，所述突胶质前体细胞使用了永生化少突胶质前体细胞CBNU-NSC.olig2细胞株(保藏编号：KCTC12636BP)。
这是因为原代培养羊水干细胞和神经系干细胞(神经干细胞、少突胶质前体细胞)对低氧环境脆弱而具有容易凋亡的问题，为了干细胞大量分泌捕集功能成分的外泌体，需要将干细胞在低氧条件下培养，作为解决此问题的方法，本发明的发明人将在低氧环境下容易凋亡的羊水干细胞和神经系干细胞重组为永生化干细胞，分别制造了具有永生化特征的干细胞，从而使得干细胞的生存性提高且能够获得充分的富含外泌体培养液。
所述神经干细胞使用了永生化神经干细胞CBNU-NSC细胞株(保藏编号：KCTC12635BP)，所述羊水干细胞使用了永生化羊水干细胞CBNU-AFSC细胞株(保藏编号：KCTC12634BP)，所述突胶质前体细胞使用了永生化少突胶质前体细胞CBNU-NSC.olig2细胞株(保藏编号：KCTC12636BP)，本发明的发明人在本申请申请日之前已从爆仓机构获得了保藏编号，对于这些永生化细胞株本发明发明人以申请专利获得了专利权，各永生化细胞株的制造内容可以参考下面记载的授权专利文献。
另外，“外泌体(exosome)”是包含精妙的RNA和蛋白质搬运物质的小尺寸(30-150nm)的小胞，是从多个种类的细胞分泌的膜结构的小囊体。对于外泌体的分泌、吸收、组成的确切分子机制和功能的研究还不全，但是已知为起到结合其他细胞及组织的膜构成要素、传递蛋白质及RNA的功能。
由此可以知道，本发明的发明人为了提高干细胞或包含于干细胞培养液中的有效成分的体内吸收率，究明了将由脂质构成的脂质体与有效成分嫁接的、相比现有技术更有效的从干细胞能够大量分泌外泌体的条件，即在干细胞培养液中接种TNF-α、在1-8％的氧浓度培养的条件，这种培养条件能够解决根据脂质体嫁接方法的额外处理过程、外部物质的污染及捕集脂质体时培养液成分的编制等问题。
从而，在干细胞培养液中接种TNF-α、在1-8％的氧浓度条件下培养干细胞时，能够增加干细胞的外泌体分泌而能够生产富含外泌体的培养液，同时能够从干细胞大量生产外泌体。
尤其是，本发明的发明人在研究从干细胞促进外泌体分泌的促进剂的过程中，从众多物质中得知TNF-α有效促进外泌体分泌，确认了能够最大限度分泌外泌体的TNF-α的适当接种量为5-500ng/mL浓度进行处理。
超过上述范围接种时，可能会发生损伤干细胞而细胞无法发挥正常功能的问题；相反，不足上述范围的量接种时，存在外泌体的分泌量不足的问题。
干细胞与巨噬细胞(macrophages)相同依赖TNF-α移动并活化。相比活化的巨噬细胞分泌活性氧自由基(active oxygen radicals)供给流入体内的微生物和肿瘤，活化的干细胞分泌生长因子(growth factors,GF)和神经生长因子(neurotrophic factors,NF)而保护并再生组织。
这种GF/NF蛋白质被查明为被外泌体包裹分泌。从而本发明中在干细胞培养过程中接种TNF-α时，能够促进大量含GF/NF的外泌体的分泌，从而能够获得含大量GF/NF的外泌体。
此外，作为从干细胞诱导具有关节炎治疗效能的外泌体的大量分泌的要件，确认有必要在比正常浓度(约21％氧)显著低的氧浓度下培养，优选接种TNF-α后，在1-8％的低氧浓度下培养12-72小时。氧浓度条件不足1％时，可能会对细胞的正常政治和生长产生问题；超过8％时，外泌体的分泌不充分。从而优选在1-8％的低氧条件下实施，更优选在5％的氧浓度下培养。
此外，根据本发明的方法，所受干细胞培养液只要是用于培养干细胞的培养基均可使用，但本发明名的一实施例中使用了杜尔贝科改良伊格尔培养基(DMEM，Dulbecco’smodified Eagle’s medium)。
所述以5-500ng/mL的浓度接种TNF-α的干细胞的细胞数优选为1x104-1x106。
如上所述，以本发明的条件培养干细胞时，能够促进和增进含有在干细胞增殖过程中分泌的干细胞的细胞增殖、分化、再生相关基因、蛋白质、生长因子等生理活性物质的外泌体，相比一般的干细胞培养液获得方法(即没有在TNF-α及低氧条件下的实施培养的方法)，能够显著增加外泌体的分泌及生产量。
此外，本发明还确认了用本发明的方法获得的源自干细胞的外泌体具有关节炎预防或治疗效果，根据本发明的一实施例，以通过前十字韧带切除术诱导骨关节炎的兔动物模型为对象，将本发明的富含源自干细胞的外泌体的培养液并在21％的样条件下培养获得的含有源自干细胞的外泌体的培养液(正常培养液)分别给予关节腔内，分析了关节炎症状的改善程度。
结果，确认了相比作为对照组的正常培养液处理组，用本发明的富含源自干细胞的外泌体的培养液斥力的组，在不同种类干细胞中均显示出具有显著优异的关节炎改善及治疗效果，能够抑制关节表面的损伤和软骨细胞的消逝，防止半月板粘连、股骨和胫骨变形及骨赘形成等关节变形，并具有能够再生损伤的软骨的效果。
不仅如此，成为关节炎的诱发及症状恶化的原因的炎症细胞因子的抑制，与作为对照组使用的正常培养液处理组相比，本发明的富含源自干细胞的外泌体的培养液处理的组显著优异(参照表5)。
从而，本发明的发明人确认了根据本发明的含有源自干细胞的外泌体的培养液与现有的干细胞本身或者在普通干细胞培养条件(21％的氧条件下培养)下获得的含有外泌体的培养液，能够以更优异的效果预防或治疗关节炎。
因此，本发明可以提供含有源自干细胞的外泌体的培养液作为有效成分包含的关节炎的预防或治疗用药物组合物，所述关节炎可以是骨关节炎(Osteoarthritis)、类风湿性关节炎(Rheumatoid Arthritis)、纤维肌痛(Fibromyalgia)、痛风(gout)或狼疮(lupus)，但不限于此。
此外，本发明中所述药物组合物还可以进一步包含根据通常方法的适当载体、赋形剂或稀释剂。本发明的药物组合中可包含的载体、赋形剂及稀释剂可以使用乳糖、右旋糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露醇、木糖醇、赤藓糖醇、麦芽糖醇、淀粉、金合欢树胶、褐藻酸盐、明胶、磷酸钙、硅酸钙、纤维素、甲基纤维素、非晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、羟苯甲酯、羟苯丙酯、滑石、硬脂酸镁及矿物油等，但不限于此。
根据本发明的药物组合物，可以分别通过通常的方法制剂化为散剂、颗粒剂、片剂、胶囊剂、混悬液、乳剂、糖浆、气雾剂等经口剂型、外用剂、栓剂或灭菌注射溶液的形态而使用。具体地，制剂化时可以使用一般使用的填充剂、增量剂、结合剂、湿润剂、崩解剂、表面活性剂等稀释剂或赋形剂而调制。
用于经口给药的固体制剂包括片剂、丸剂、散剂、颗粒剂、胶囊剂等，这种固体制剂可以通过在上述本发明的药物组合物中混合一种以上的赋形剂，例如淀粉、碳酸钙(calcium carbonate)、蔗糖(sucrose)、乳糖(lactose)、明胶等而调制。此外，除了单纯的赋形剂之外，还可以使用硬脂酸镁、滑石等润滑剂。
用于经口给药的液状制剂有混悬剂、内用液剂、乳剂、糖浆剂等，除了通常使用的单纯稀释剂如水、液体石蜡之外，还可以包含不同的赋形剂，例如湿润剂、甜味剂、芳香剂、保存剂等。
用于非经口给药的制剂包括灭菌水溶液、非水溶剂、混悬剂、乳剂、冷冻干燥制剂及栓剂。非水溶剂、混悬剂可以使用丙二醇(propylene glycol)、聚乙二醇、橄榄油等植物油、油酸乙酯等可注射的酯等。栓剂的基质可以使用合成脂肪酸酯(witepsol)、聚乙二醇、吐温(tween)61、可可脂、月桂酸甘油酯、甘油明胶等。此外，作为非经口给药制剂优选注射用安瓶等注射剂、注入袋等注入剂及气雾剂等喷雾剂等，所述注射用安瓶可以在即将使用之前与注射液混合调制，注射液可以使用生理盐水、葡萄糖、林格氏液等。此外，注入袋可以使用聚氯乙烯或聚乙烯材质的。
本发明的组合物可以通过多种途径给药到个体。所有给药方式都是可预想的，例如，可以通过经口、直肠或静脉、肌肉、皮下、子宫内膜或关节内注射而给药，优选向需要治疗的个体的病变部位直接给药。
本发明的药物组合物可以根据包括所使用的特定有效成分的活性、年龄、体重、一般健康状况、性别、定食、给药时间、给药途径、排出率、药物配伍及需要预防或治疗的特定疾病的重症等多种要因而进行多种变更，所述药物组合物的给药量可以根据患者的状态、体重、疾病程度、药物形态、给药途径及时间不同，但是可以由本领域技术人员适当选择，可以每天给药0.0001至50mg/kg或0.001至50mg/kg。给药可以一天一次，也可以分为数次进行。上述给药量在任何方面都不限制本发明的范围。根据本发明的药物组合物可以剂型化为丸剂、糖衣片、胶囊、液剂、凝胶、糖浆、浆、混悬剂。
具体实施方式
以下，通过实施例进一步详细说明本发明。这些实施例仅是为了更具体说明本发明，本发明的范围并不由这些实施例限定。
准备例：干细胞
以下实施例中为了获得富含用于确认关节炎治疗效果与否的有效成分外泌体的干细胞培养液，干细胞使用了如下的细胞。
首先，永生化羊水干细胞(AFSC)、永生化神经干细胞(NSC)及永生化少突胶质前体细胞(OPC)是本发明发明人已经制造为永生化细胞株而确立的细胞株，各个细胞株已从微生物保藏机构获得了保藏编号，分别使用了永生化神经干细胞CBNU-NSC细胞株(保藏编号：KCTC12635BP，韩国授权专利号第10-1719274号)，永生化羊水干细胞CBNU-AFSC细胞株(保藏编号：KCTC12634BP，韩国授权专利号第10-1719274号)及永生化少突胶质前体细胞CBNU-NSC.olig2细胞株(保藏编号：KCTC12636BP，韩国授权专利号第10-1740357号)，上述永生化细胞株的制造方法可以参考各个细胞株的授权专利的内容。此外，在本发明的实施例及实验例中羊水干细胞使用了永生化羊水干细胞CBNU-AFSC细胞株，神经干细胞使用了永生化神经干细胞CBNU-NSC细胞株，少突胶质前体细胞使用了永生化少突胶质前体细胞CBNU-NSC.olig2细胞株，并进行了分析。此外，羊膜干细胞(AMSC)、胎盘干细胞(PSC)及脐带血干细胞(UCBSC)是将在正常生产过程中经产妇同意采取的干细胞分别收集使用；脂肪干细胞(ASC)和骨髓干细胞(BMSC)是分别使用了通过53岁和50岁正常女性腹部脂肪抽吸手术和骨髓穿刺，并分别经过器官伦理委员会(Institutional Review Board,IRB)审议和获得本人的同意书后采取的干细胞。
<实施例1>
1-1干细胞的培养及富含外泌体培养液的获取
将准备的上述干细胞(1x 106细胞/mL)分别接种于杜尔贝科改良伊格尔培养基(DMEM)，在5％的二氧化碳(CO2)供给培养基中在37℃培养24小时。之后，为了从干细胞获取富含外泌体培养液(ERCM)，在上述培养基中以50ng/mL的浓度添加TNF-α，氧浓度降低到5％，培养24小时后，收集培养液用过滤器过滤，之后在低温下浓缩10倍，获得了根据本发明的富含源自干细胞的外泌体的培养液。
作为比较例，在分别从干细胞获得富含外泌体培养液的过程中，所述实施例1的过程中除了TNF-α(50ng/mL)处理和氧(O2)浓度维持为21％的状态之外，按照与实施例1相同的方法实施，获取了作为比较例(对照组)使用的通常方法(正常的方法)的干细胞正常培养液(CM)。
1-2培养液内有效分泌因子含量分析
取干细胞培养液超声处理5分钟破碎外泌体后，使用安装了丙烯葡聚糖凝胶过滤色谱柱(Sephacryl gel filtration column)的蛋白液相色谱仪(protein liquidchromatograph)，分析了主要功能性分泌因子脑源性神经营养因子(brain-derivedneurotrophic factor，BDNF)、神经生长因子(nerve grown factor，NGF)、血小板衍生生长因子(platelet-derived growth factor，PDGF)、转化生长因子-β(transforming growthfactor-β，TGF-β)及血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)的含量。分析结果确认，羊水干细胞培养液中含有大量HGF，还含有相当多量的BDNF、TGF及VEGF。羊膜干细胞也分泌了大量的HGF和相当多量的VEGF，胎盘干细胞除了HGF之外分泌了相对少量的蛋白质成分；相较于此，脐带血干细胞分泌了大量的HGF和VEGF。有意思的是，神经系细胞神经干细胞和少突胶质前体细胞除了BDNF、NGF及PDGF，还分泌了一定量的TGF，少突胶质前体细胞还分泌了相当多辆的HGF。相较于此，确认骨髓干细胞分泌了中等量的HGF和PDGF。
此外，还确认了干细胞用TNF-α和低氧处理获得的本发明的富含外泌体培养液内所有干细胞相比正常培养液(对照组)内的浓度，含有2.5-3.5倍高含量的有效因子，可以知道对各种疾病的治疗显示更加优异的效能(参照下表1)。
【表1】
培养液内有效成分含量
<实验例1>
本发明的富含源自干细胞的外泌体培养液的关节炎治疗效果的分析
1-1实验动物用兔的饲养
出生后8个月龄(3.5kg)的雄性新西兰白兔(New Zealand white，NZW)经过2周的实验室驯化过程后使用。每个兔用笼子中分别收容1只实验动物，动物实验室的环境调节为温度23±2℃、相对湿度55±10％、换气次数12次/小时、照明周期12小时(07:00-19:00)、光照度150-300lux进行饲养。饲料自由摄取作为实验动物用供应的小粒子型(pallet)固体饲料Purina Rabbit
和灭菌纯化水，本实验在忠北大学实验动物研究支援中心的动物实验伦理委员会(Institutional Animal Care and Use Committee,IACUC)的承认下，按照该机构的标准操作指南书(Standard Operation Procedures,SOP)来实施。
1-2通过前十字韧带切断术(anterior cruciate ligament transection,ACLT)
的骨关节炎的诱导和根据本发明的富含源自干细胞的外泌体培养液的给药
以上述1-1中饲养的兔为对象，肌肉注射氯胺酮(ketamine)50mg/kg和赛拉嗪(xylazine)5mg/kg进行全身麻醉，去除右侧膝盖周边的毛后用聚维酮碘(Betadine)和70％的乙醇消毒皮肤，在无菌状态下开始手术。
切开皮肤，切开(内侧关节到达法)筋膜和关节囊后，如下图所示弯折髌骨(膝盖骨)露出前十字韧带。利用外科手术刀切断前十字韧带的中间实质部位和内侧半月板胫骨韧带(medial meniscotibial ligament，MMTL)及外侧半月板胫骨韧带(lateralmeniscotibial ligament,LMTL)，然后进行了缝合。
手术后3天期间，每天肌肉注射2次抗生素Foxolin(韩国三进制药生产，10mg/kg)和镇痛剂Maritrol(韩国第一制药生产，3mg/kg)，之后3天继续处方Foxolin每日一次。关节炎诱导手术8周后，将上述实施例1中获得的根据本发明的富含源自干细胞的外泌体培养液(ERCM)和对照组正常培养液(CM)，按照每只兔0.1ml的量以每周2日的间隔，连续8周给药至关节腔内。
上图中，F：股骨(femur)、T：胫骨(tibia)、MM：内侧半月板(medial meniscus)、ACL：前十字韧带(anterior(cranial)cruciate ligament)、MMTL：内侧半月板胫骨韧带(medial meniscotibial ligament)、LMTL：：外侧半月板胫骨韧带(lateralmeniscotibial ligament)。
1-3放射线学上的治疗效能评价
八周的骨关节炎诱导期间和8周的富含源自干细胞的外泌体培养液(ERCM)及对照组培养液(CM)给药后，通过X-射线(X-ray)摄像按照Modified Kellgren-Lawrence等级(KLscore)分析了骨关节炎指数(osteoarthritis scores)。作为分析指标的KL score以内侧股骨髁骨赘(osteophytes in medial femoral condyle,0-5)、股骨或胫骨变形(deformity of femur or tibia,0-5分)、胫骨刺(骨棘)变尖(sharpening of tibialspine,0-5分)3个指标之和(0-15分)，评价了治疗效能。
经分析，以兔作为动物模型通过前十字韧带和内外侧半月板胫骨韧带切断诱导骨关节炎8周之后进行放射线检查，确认内侧股骨髁骨赘、内侧胫骨变形及胫骨刺变尖的异常症状(病变)在总分15分中获得10.1分，诱导了严重的关节炎。
向上述诱导了骨关节炎的兔关节腔内给药将干细胞在21％的氧浓度下培养而获得的对照组正常培养液(CM，每只兔0.1mL)，以每2日为间隔持续8周时，在放射线分析中以神经干细胞(病变平均6.0分)≥少突胶质前体细胞(6.1分)>脂肪干细胞(6.4分)>羊水干细胞(6.8分)>羊膜干细胞(7.1分)≥脐带血干细胞(7.3分)>胎盘干细胞(8.5分)＝骨髓干细胞(8.5分)的顺序显示出优异的治疗效能。
另外，将在干细胞培养基中添加TNF-α(50ng/mL)、在5％的低氧浓度下培养获得的本发明的富含外泌体培养液(ERCM)给药时，所有干细胞显示相比对照组培养液的给药更加优异的治疗效能，以神经干细胞(病变平均4.8分)≥少突胶质前体细胞(5.0分)≥脂肪干细胞(5.2分)≥羊水干细胞(5.4分)>羊膜干细胞(5.7分)>脐带血干细胞(6.2分)>胎盘干细胞(6.8分)≥骨髓干细胞(6.9分)的顺序显示出治疗效能。
【表2】
放射线学观察评价结果
*相比骨关节炎(ACLT)诱导组具有显著性差异(P<0.05)；#相比正常培养液具有显著性差异(P<0.05).
1-4肉眼观察的治疗效能评价
富含源自干细胞的外泌体培养液(ERCM)及对照组培养液(CM)的8周给药期间结束后，处死动物，通过内侧关节到达法露出膝关节实验部位，注意不对软骨造成损伤的情况下，去除髌骨周边的软组织，摘取了包括实验部位的股骨的髁上部。肉眼观察膝关节的浮肿、裂伤、骨棘形成、滑膜肥厚，实施了奥德里斯克评分(O'Driscoll scoring)分析，即观察并摄像软骨缺损部位的变化、软骨缺损部位的表面状态、缺损临界部位与新生组织之间临界部位的连续性，以表面粗糙(roughness of surface,score 0～5)、半月板粘连(adhesion with meniscus,score 0～5)、关节肥大(hypertrophy of joint,score 0～5)、骨赘(osteophyte,score 0～5)4个指标之和(score 0～20)评价了治疗效能。
解剖诱导骨关节炎8周后的兔，按照上述方法实施对关节炎部位的肉眼检查，如下表3和图2所示，确认了表面粗糙、半月板粘连、关节肥大及骨赘形成的异常症状(病变)为以总分20分得到18.1分，确认了严重的损伤。向如上的诱导骨关节炎的兔关节腔内给药作为对照组使用的正常培养液时，以神经干细胞(病变平均13.4分)>少突胶质前体细胞(13.8)>羊水干细胞(14.3分)>脂肪干细胞(14.7分)>羊膜干细胞(15.4分)>脐带血干细胞(15.8分)>胎盘干细胞(16.3分)＝骨髓干细胞(16.3分)的顺序显示出肉眼分析的治疗效能。
另一方面，给药本发明的富含源自干细胞的外泌体培养液时，所有干细胞相比作为用作对照组的正常培养液给药组具有更加优异的治疗效能，以神经干细胞(病变平均9.9分)≥少突胶质前体细胞(10.0分)>脂肪干细胞(10.7分)>羊水干细胞(11.2分)>羊膜干细胞(12.6分)>脐带血干细胞(13.1分)>胎盘干细胞(13.4分)≥骨髓干细胞(13.5分)的顺序显示病变症状的程度显著得到改善。
【表3】
肉眼观察评价结果
*相比骨关节炎(ACLT)诱导组具有显著性差异(P<0.05).#相比正常培养液组具有显著性差异(P<0.05).
1-5显微镜观察的治疗效能的评价
将上述实施例中获得的兔子关节组织在10％的中性福尔马林中固定，经60天用EDTA脱钙后，制作了石蜡切片。之后，用苏木素(hematoxylin)和伊红(eosin)(H&E)染色，进行摄像，软骨生成面积利用显微镜影响分析软件ImageJ 5.1，以软骨再生部位/切断面宽度的比例进行了定量分析。
此外，通过对软骨内peptidoglycals(PG)的番红O(safranin O)/固绿(fastgreen)染色分析了透明软骨(hyaline cartilage)的稳定性。即，从上述染色结果以结构(structure,0-11分)、软骨细胞数(cellularity,0-4分)、
(cluster,score0～5)、软骨细胞成分(PG,0-6分)4种指标之和(0-24分)评价了对软骨损伤程度的治疗效能。
【表4】
软骨细胞损伤的组织病理学观察指标
经分析，将关节炎诱导组织用H&E和番红O(safranin O)进行染色在显微镜下进行价差，软骨结构、软骨细胞数、细胞簇(cluster)形成及肽聚糖(peptidoglycans，PG)(PG)含量等充实度异常症状也以总分24分获得17.2分，显示出严重的水平。向上述的诱导骨关节炎的兔关节腔内给药正常培养液时，以神经干细胞(病变平均13.1分)>少突胶质前体细胞(13.7分)>脂肪干细胞(14.2分)>羊膜干细胞(14.8分)>脐带血干细胞(15.5分)≥羊水干细胞(15.6分)>胎盘干细胞(16.3分)＝骨髓干细胞(16.3分)的顺序显示出显微镜分析的治疗效果。
另一方面，给药本发明的富含源自干细胞的外泌体培养液时，所有干细胞相比作为用作对照组的正常培养液给药组显示出更加优异的病变症状改善，尤其是以神经干细胞(病变平均10.4分)≥脂肪干细胞(10.5分)>少突胶质前体细胞(10.9分)>羊水干细胞(11.7分)≥羊膜干细胞(11.9分)>脐带血干细胞(12.8分)>骨髓干细胞(14.0分)>胎盘干细胞(14.3分)的顺序显示，可以知道本发明富含源自干细胞的外泌体培养液对关节炎治疗非常有效(参照图3及表5)。
【表5】
显微镜观察分析结果
*相比骨关节炎(ACLT)诱导组具有显著性差异(P<0.05).#相比正常培养液具有显著性差异(P<0.05).
1-6炎症细胞因子的分析
为了炎症因子的分析，在关节腔马上开口之前向关节腔内注射0.1mL的生理盐水，进行5次左右的活塞运动后，采集了0.1-0.2mL的稀释的关节腔液。
经分析，显示诱导关节炎的关节腔内细胞因子TNF-α、IL-6及IL-8的含量相比正常软骨内的浓度增加2倍以上，向诱导关节炎的兔关节腔内给药对照组正常培养液时，显示出炎症细胞因子的含量减少的效果。
相对效果而言，羊水干细胞、脐带血干细胞、神经干细胞及脂肪干细胞相比少突胶质前体细胞、羊膜干细胞、胎盘干细胞及骨髓干细胞显示出更加优异的炎症细胞因子减少效能。另一方面，给药本发明的富含源自干细胞的外泌体培养液时，所有干细胞相比对照组正常培养液给药组显示出显著优异的炎症细胞因子减少效果，具体地，羊水干细胞、神经干细胞、少突胶质前体细胞相比脐带血干细胞、羊膜干细胞、胎盘干细胞及骨髓干细胞，显示出更加优异的炎症细胞因子抑制效果(参照下表6)。
【表6】
关节腔液内炎症细胞因子的浓度
*相比骨关节炎(ACLT)诱导组具有显著性差异(P<0.05).#相比正常培养液组具有显著性差异(P<0.05).
1-7统计学分析
所有实验结果以mean±SEM表示，组别间差异利用oneway analysis of variance(ANOVA)(SPSS 12.0version)分析，P值<0.05不足时，判断为具有统计学的显著性差异。
以上，通过围绕本发明的优选实施例说明了本发明。但是，对于本领域技术人员来说明确的在不超出本发明本质特性的范围之内，本发明可以通过进行多种变形形态实施。从而，所示出的实施例并不能视为对本发明的限定，而应当理解为是对本发明的说明。本发明的范围示于权利要求书中而不是上述说明中，与其等同的范围内的所有差异应当理解为属于本发明的保护范围。
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保藏机构名称:韩国生命工学研究院
保藏编号:KCTC12634BP
保藏日期:20140725
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Claims (7)
1.一种将含有源自干细胞的外泌体的培养液作为有效成分包含的关节炎预防或治疗用药物组合物。
2.根据权利要求1所述的关节炎预防或治疗用药物组合物，其中，所述含有源自干细胞的外泌体的培养液是通过在干细胞培养液中接种TNF-α、在1-8％的氧浓度条件下培养获得的。
3.根据权利要求2所述的关节炎预防或治疗用药物组合物，其中，TNF-α以5-500ng/ml的浓度处理，所述培养实验以12-72小时培养。
4.根据权利要求1所述的关节炎预防或治疗用药物组合物，其中，所述干细胞选自由神经干细胞、少突胶质前体细胞、脂肪干细胞、羊膜干细胞、羊水干细胞、胎盘干细胞、脐带血干细胞及骨髓干细胞组成组中。
5.根据权利要求4所述的关节炎预防或治疗用药物组合物，其中，所述神经干细胞是永生化神经干细胞CBNU-NSC细胞株(保藏编号：KCTC12635BP)，所述羊水干细胞是永生化羊水干细胞CBNU-AFSC细胞株(保藏编号：KCTC12634BP)，所述突胶质前体细胞是永生化少突胶质前体细胞CBNU-NSC.olig2细胞株(保藏编号：KCTC12636BP)。
6.根据权利要求1所述的关节炎预防或治疗用药物组合物，其中，所述干细胞的细胞数为1x104～1x106。
7.根据权利要求1所述的关节炎预防或治疗用药物组合物，其中，所述关节炎选自由骨关节炎、类风湿性关节炎、纤维肌痛、痛风及狼疮组成的组中。
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| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| GR01 | Patent grant | ||
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