KR20160022119A - 아토피 피부염 개선, 주름 개선 및 미백활성을 갖는 불멸화 세포주 및 이의 용도 - Google Patents

아토피 피부염 개선, 주름 개선 및 미백활성을 갖는 불멸화 세포주 및 이의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 아토피 피부염 개선, 주름 개선 및 미백활성을 갖는 불멸화 세포주 및 이의 용도에 관한 것이다. 본 발명에 따르면 재차 줄기세포를 채취하지 않고 끊임없이 계대배양하면서 동일한 성분을 함유한 배양액을 얻을 수 있고, 본 발명에 따른 불멸화 줄기세포 배양액은 비만세포 탈과립과 염증성 cytokines을 억제하여 가려움증을 완화하고 아토피 피부염 개선 효과를 나타내고, 콜라겐 분해효소 활성을 억제하여 주름 개선 효과를 나타내고, 티로시나아제 활성과 멜라닌 생성을 억제하여 미백 효과를 나타낸다.

Description

아토피 피부염 개선, 주름 개선 및 미백활성을 갖는 불멸화 세포주 및 이의 용도{Immortalized cell lines producing factors improving atopic dermatitis, wrinkle and whitening, and use thereof}
본 발명은 아토피 피부염 개선, 주름 개선 및 미백활성을 갖는 불멸화 세포주 및 이의 용도에 관한 것이다.
최근 도시인들의 생활환경이 변화함에 따라 집안의 카펫에 서식하는 진드기, 습도 저하로 인한 먼지, 주변국의 사막화 및 공업화에 의해 날아오는 황사 및 미세먼지, 애완동물의 털, 꽃가루, 새로운 과일 및 음식, 식품첨가물 등 면역 과민반응(hypersensitivity)을 유발하는 다양한 알레르겐(allergen)에 노출될 기회가 점차 커지고 있다.
아토피(atopy)는 최근 들어, 유병률이 급격히 증가함에 따라 그 위험성이 크게 부각되고 있는 과민증(hypersensitivity)의 일종으로, 면역학적 관점에서는 면역글로불린E(immunoglobulin E, Ig E)와 알레르겐(allergen)의 면역반응에 의한 주요증상을 동반하는 유전경향이 강한 알레르기성 질환군으로 정의된다. 특히, 아토피의 대표적 증상인 아토피 피부염(atopic dermatitis)은 전 인구의 0.5%-1%, 어린이의 5-10%가 심각한 증상을 호소하고 있지만, 유전적인 요인과 면역계 결핍에 관련 있는 것으로 추정될 뿐 아직 정확한 원인은 밝혀진 바 없고, 환경 및 식생활 개선을 통해 다소 완화되는 것으로 기대될 뿐 근본적인 치료방법이 전무한 실정이다.
아토피 피부염은 유아와 소아에서 가장 흔한 염증성 피부질환으로 극심한 가려움증을 비롯한 피부건조증, 발진, 진물, 부스럼딱지, 비늘 같은 껍질이 있는 피부(인비늘) 등을 수반하며, 이로 인한 정서적 불안, 스트레스, 긴장, 좌절, 분노의 감정과 함께 기타 알레르기 질환인 두드러기, 금속 알레르기, 천식이나 알레르기성 비염 등을 동반하는 경우가 빈번하다. 또한 최근에는 성인에서도 아토피 피부염이 증가하고 있으며, 성인에서 아토피 피부염의 위험 인자로 얼굴과 목에 병변이 있는 경우나 동물, 꽃가루, 니켈 알레르기가 있는 경우 등이 제시되고 있다.
현재 아토피 피부염 치료를 위하여 사용되는 치료제들로는 국소 스테로이드제, 면역억제제, 항히스타민제, 항생제, 비스테로이드제를 비롯한 기타 진정제와 신경안정제 등이 사용되고 있으나, 이들 약물들의 사용으로 인한 다양한 부작용이 보고되고 있을 뿐만 아니라, 아토피성 피부염에 대한 근본적인 치료제는 아니므로 이들을 지속적으로 적용하기가 곤란하다.
한편, 최근 줄기세포가 세포대체, 뇌보호 및 면역조절 기전을 통해 비가역적 뇌손상을 개선시켜 주는 것으로 밝혀졌다. 예를 들어, 신경줄기세포(neural stem cells, NSC)을 혈관 내로 주사했을 때 말초 면역계를 조절함으로써 자가면역병(autoimmune disease)인 다발성 경화증(multiple sclerosis, MS) 모델에서 동물의 임상증상을 완화시키는 것으로 보고되었다. 또한 뇌실 내로 주사한 신경줄기세포는 뇌세포를 보호하고 손상된 세포를 대체함으로써 중주이상을 개선시켜 주는 것으로 나타났다. 이러한 결과는 줄기세포가 면역조절 기능을 통해 자가면역병 및 과민반응을 개선해 줌을 시사한다. 아토피 피부염은 대표적인 제1형 과민반응이므로 Th1과 Th2 cells이 관여하는 피부과민반응을 예방하고 치료해 줄 수 있을 것으로 기대된다.
난치성 질환의 치료효능에 더하여, 줄기세포나 그 배양액은 항산화 및 창상치유 효능을 가지고 있는 것으로 알려졌다. 특히 지방간엽줄기세포는 콜라겐 생성을 촉진시키고 분해를 억제하여 피부주름을 개선해 줌은 물론, 최근에는 피부미백 효능이 알려져 피부미용을 위한 새로운 소재로 관심을 모으고 있다.
한국등록특허 제1,070,730호
이에, 본 발명자들은 지방줄기세포(adipose-derived stem cells, ADSC), 불멸화 신경줄기세포(CBNU-NSC), 불멸화 신경줄기세포 유래 희돌기교전구세포(CBNU-NSC.olig2) 및 불멸화 양수줄기세포(CBNU-AFSC) 배양액이 비만세포(mast cells) 및 아토피 피부염 모델동물에서 히스타민 분비와 피부 염증을 완화시키고, 콜라겐 분해효소인 MMP-1과 티로시나아제(tyrosinase)를 억제함으로써 피부 주름개선 및 미백 효능을 나타낸다는 사실을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
따라서 본 발명의 목적은 지방줄기세포(ADSC), 불멸화 신경줄기세포(CBNU-NSC), 불멸화 신경줄기세포 유래 희돌기교전구세포(CBNU-NSC.olig2) 또는 불멸화 양수줄기세포(CBNU-AFSC) 배양액을 유효성분으로 포함하는 아토피 피부염 개선, 주름개선 또는 미백용 조성물을 제공하는데 있다.
또한 본 발명의 다른 목적은 반복적으로 줄기세포를 채취할 필요가 없도록 하는 불멸화 줄기세포주의 제조방법을 제공하는데 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 신경줄기세포 또는 양수줄기세포를 v-myc 인코딩 레트로바이러스 벡터(v-myc-encoding retroviral vector)로 처리하여 얻은 충북대학교 불멸화 신경줄기세포주(Chungbuk National University-neural stem cells, CBNU-NSC) 또는 양수줄기세포주(Chungbuk National University-amniotic fluid stem cells, CBNU-AFSC)를 제공한다.
또한, 본 발명은 신경줄기세포를 Olig2 전사인자 인코딩 레트로바이러스 벡터(Olig2 transcription factor-encoding retroviral vector)로 처리하여 분화 유도하여 얻은 충북대학교 불멸화 희돌기교전구세포주(Chungbuk National University-neural stem cell-derived oligodendrocyte progenitor cells, CBNU-NSC.olig2)를 제공한다.
또한, 본 발명은 불멸화 신경줄기세포주(CBNU-NSC), 불멸화 신경줄기세포 유래 희돌기교전구세포주(CBNU-NSC.olig2) 및 불멸화 양수줄기세포주(CBNU-AFSC)로 이루어진 군 중에서 선택된 어느 하나의 줄기세포 배양액을 유효성분으로 포함하는 아토피 피부염 개선, 주름개선 또는 미백용 조성물을 제공한다.
본 발명의 일실시예에 따르면, 상기 불멸화 신경줄기세포 또는 상기 불멸화 양수줄기세포는 신경줄기세포 또는 양수줄기세포를 v-myc 인코딩 레트로바이러스 벡터로 불멸화시킨 것일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 따르면, 상기 불멸화 신경줄기세포 유래 희돌기교전구세포주는 상기 불멸화 신경줄기세포를 Olig2 전사인자 인코딩 레트로바이러스 벡터(Olig2 transcription factor-encoding retroviral vector)로 처리하여 분화유도한 것일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 따르면, 상기 배양액은 다음과 같은 특성을 나타내는 것일 수 있다.
1) 세포에 직접 작용하여 아토피 원인물질 분비 차단;
2) 비만세포 탈과립 유도제(degranulator)인 Compound 48/80로 유도된 급성 전신성 쇼크 반응 억제;
3) 히스타민으로 유도된 가려움증 완화;
4) lgE 생성 감소, 비만세포(mast cells) 침윤 억제, 히스타민 유리 억제, IL-4 감소.
본 발명의 일실시예에 따르면, 상기 배양액은 콜라겐 분해효소 활성을 억제하는 특성을 나타내는 것일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 따르면, 상기 배양액은 티로시나아제 활성을 억제하는 특성 및 멜라닌 생성을 억제하는 특성을 나타내는 것일 수 있다.
본 발명에 따르면 신경줄기세포와 양수줄기세포에 v-myc 종양유전자(oncogene)를 도입하여 불멸화 세포주(immortalized cell lines)를 확립하고, 신경줄기세포를 희돌기교전구세포로 분화유도하여 재차 줄기세포를 채취하지 않고 끊임없이 계대배양하면서 동일한 성분을 함유한 배양액을 얻을 수 있다는 효과가 있다. 또한, 본 발명에 따른 불멸화 줄기세포 배양액은 아토피 원인물질 분비 차단, 비만세포 탈과립 유도제인 Compound 48/80로 유도된 급성 전신성 쇼크 반응 억제, 히스타민으로 유도된 가려움증 완화, lgE 생성 감소, 비만세포(mast cells) 침윤 억제, 히스타민 유리 억제, IL-4 감소 활성을 나타내어 아토피 피부염 개선 효과를 갖는다. 또한, 본 발명에 따른 불멸화 줄기세포 배양액은 콜라겐 분해효소 활성을 억제하여 주름 개선 효과를 나타내고, 티로시나아제 활성을 억제하고, 멜라닌 생성을 억제하여 미백 효과를 나타낸다.
도 1은 본 발명의 일실시예에 따른 줄기세포 불멸화 및 분화유도 과정을 나타낸 그림이다. (A) 줄기세포 불멸화를 위한 v-myc 인코딩 레트로바이러스 벡터. (B) 불멸화 줄기세포의 정상적인 인간 염색체 분석 핵형. (C) 불멸화 신경줄기세포(CVNU-NSC)가 줄기세포임을 확인해 주는 네스틴(nestin) 및 CD133 양성 면역염색상. (D) 불멸화 신경줄기세포로부터 분화된 CBNU-NSC.olig2가 희돌기교전구세포임을 확인해 주는 O4 및 CNPase 양성 면역염색상.
도 2는 본 발명의 일실시예에 따른 히스타민으로 유도된 가려움증에 대한 줄기세포 배양액의 방어효과를 나타낸 그래프이다.
도 3은 본 발명의 일실시예에 따른 히스타민으로 유도된 피부 출혈반응(Evan’s blue 누출)에 대한 줄기세포 배양액의 방어효과를 나타낸 그래프이다.
도 4는 본 발명의 일실시예에 따른 OVA/alum + OVA으로 유발한 만성 아토피 피부염 모델에서 줄기세포 배양액의 피부염 완화 효과를 나타낸 그래프이다.
도 5는 본 발명의 일실시예에 따른 OVA/alum + OVA으로 유발한 만성 아토피 피부염 모델에서 줄기세포 배양액의 혈청 IgE 억제 효과를 나타낸 그래프이다.
도 6은 본 발명의 일실시예에 따른 OVA/alum + OVA으로 유발한 만성 아토피 피부염 모델에서 줄기세포 배양액의 혈청 histamine 억제 효과를 나타낸 그래프이다.
도 7은 본 발명의 일실시예에 따른 OVA/alum + OVA으로 유발한 만성 아토피 피부염 모델에서 줄기세포 배양액의 혈청 IL-4 억제 효과를 나타낸 그래프이다.
도 8은 본 발명의 일실시예에 따른 MMP-1 활성도에 대한 줄기세포 배양액의 억제효과를 나타낸 그래프이다.
도 9는 본 발명의 일실시예에 따른 티로시나아제 활성도에 대한 줄기세포 배양액의 억제효과를 나타낸 그래프이다.
도 10은 본 발명의 일실시예에 따른 멜라닌 세포(melanocytes)에서의 멜라닌 생산에 대한 줄기세포 배양액의 억제효과를 나타낸 그래프이다.
이하 첨부된 도면을 참조하여 본 발명의 실시예들을 상세히 설명한다. 이하의 설명에 있어, 당업자에게 주지 저명한 기술에 대해서는 그 상세한 설명을 생략할 수 있다. 또한, 본 발명을 설명함에 있어서, 관련된 공지 기능 또는 구성에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있다고 판단되는 경우에는 그 상세한 설명을 생략할 수 있다. 또한, 본 명세서에서 사용되는 용어(terminology)들은 본 발명의 바람직한 실시예를 적절히 표현하기 위해 사용된 용어들로서, 이는 사용자, 운용자의 의도 또는 본 발명이 속하는 분야의 관례 등에 따라 달라질 수 있다.
따라서, 본 용어들에 대한 정의는 본 명세서 전반에 걸친 내용을 토대로 내려져야 할 것이다. 명세서 전체에서, 어떤 부분이 어떤 구성요소를 "포함"한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성 요소를 더 포함할 수 있는 것을 의미한다.
본 발명은 아토피 피부염 개선, 주름 개선 및 미백활성을 갖는 불멸화 세포주 및 이의 제조방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 아토피 피부염 개선, 주름 개선 및 미백활성을 갖는 불멸화 세포주, 불멸화 줄기세포 배양액을 유효성분으로 포함하는 아토피 피부염 개선, 주름 개선 또는 미백용 조성물을 제공한다.
따라서, 본 발명은 신경줄기세포 또는 양수줄기세포를 v-myc 인코딩 레트로바이러스 벡터)로 처리하여 얻은 불멸화 신경줄기세포주 또는 양수줄기세포주를 제공한다.
또한, 본 발명은 신경줄기세포를 Olig2 전사인자 인코딩 레트로바이러스 벡터(Olig2 transcription factor-encoding retroviral vector)로 처리하여 분화유도하여 얻은 불멸화 희돌기교전구세포주를 제공한다.
줄기세포는 계대배양 과정에서 노화되고 증식이 느려져 지속적으로 균일하고 우수한 배양액을 얻으려면 고통과 윤리적인 문제가 따르는 반복적인 채취가 요구된다. 따라서 본 발명에서는 아토피 피부염 개선, 주름 개선 및 미백효능을 나타내는 불멸화 신경줄기세포, 불멸화 신경줄기세포 유래 희돌기교전구세포 및 불멸화 양수줄기세포가 일차배양(primary culture) 또는 계대배양(passage) 과정에서 증식능이 떨어지고 배양액 내 유효성분 함량이 감소하는 문제점을 극복하고 우수한 배양액을 안정적으로 확보하기 위해서, 신경줄기세포와 양수줄기세포에 v-myc 종양유전자(oncogene)를 도입하고, 신경줄기세포를 희돌기교전구세포로 분화유도하여 불멸화 세포주(immortalized cell lines)를 확립하였으며, 보다 구체적으로 CBNU-NSC, CBNU-NSC.olig2 및 CBNU-AFSC 세포주를 확립하였다. 이러한 불멸화 세포주는 재차 줄기세포를 채취하지 않고 끊임없이 계대배양하면서 동일한 성분을 함유한 배양액을 얻을 수 있다는 장점이 있어 기능성 신소재로 그 응용성이 크다.
본 발명에서는 아토피 피부염 개선, 주름 개선 및 미백에 효과적인 소재를 탐색하기 위해 지방줄기세포(adipose-derived stem cells, ADSC), 불멸화 신경줄기세포주(CBNU-NSC), 불멸화 신경줄기세포 유래 희돌기교전구세포주(CBNU-NSC.olig2) 및 불멸화 양수줄기세포주(CBNU-AFSC) 등 다양한 줄기세포 배양액의 효능을 비교하였으며, 일예로 비만세포(mast cells) 및 아토피 피부염 모델동물에서 히스타민 분비와 피부 염증을 완화시켜 주는지를 평가하였다. 또한, 콜라겐 분해효소인 matrix metalloproteinase-1 (MMP-1)과 티로시나아제(tyrosinase)를 억제함으로써 피부 주름 개선 및 미백 효능을 나타내는지를 이미 그 효능이 알려진 지방줄기세포와 비교 평가하였다.
그 결과, 불멸화 신경줄기세포, 불멸화 신경줄기세포 유래 희돌기교전구세포 및 불멸화 양수줄기세포의 우수한 효능을 확인하였다.
이에, 본 발명은 불멸화 신경줄기세포주(CBNU-NSC), 불멸화 신경줄기세포 유래 희돌기교전구세포주(CBNU-NSC.olig2) 및 불멸화 양수줄기세포주(CBNU-AFSC)로 이루어진 군 중에서 선택된 어느 하나의 줄기세포 배양액을 유효성분으로 포함하는 아토피 피부염 개선, 주름 개선 또는 미백용 조성물을 제공한다.
본 발명에서 상기 불멸화 신경줄기세포 또는 상기 불멸화 양수줄기세포는 신경줄기세포 또는 양수줄기세포를 v-myc 인코딩 레트로바이러스 벡터로 불멸화시킨 것일 수 있다.
또한, 상기 불멸화 신경줄기세포 유래 희돌기교전구세포는 상기 불멸화 신경줄기세포를 Olig2 전사인자 인코딩 레트로바이러스 벡터(Olig2 transcription factor-encoding retroviral vector)로 처리하여 분화유도한 것일 수 있다.
아토피 피부염을 유발하는 데에는 여러세포들(T lymphocytes, Langerhans cells, eosinophils, keratinocytes)과 인자(cytokines과 immunoglobulins, 특히 IgE)들이 관여하는 것으로 알려져 있다.
초기단계에서 아토피 과민반응 유발 알레르겐(allergen)은 IL-4와 같은 사이토카인을 분비하는 Th2 타입의 T세포를 유도한다. 이어 IgE를 포함하는 항체를 생산하는 B 세포와 반응한다. 알레르겐이 비만세포(mast cells) 표면의 Fcε 수용체I에 cross-link되어 있는 IgE와 반응하면 비만세포로부터 히스타민이 유리되어 즉각적인 과민반응, 즉 아나필락시스 쇼크반응(anaphylaxis)이 유발된다. 아토피 피부염에서 Th2 타입의 T세포가 IL-4를 다량으로 생산하고, 이는 플라즈마 세포(plasma cells)로 하여금 IgE 생산을 촉진시킨다. 그러므로 가장 효과적인 항알러지 및 항아토피 후보물질로는 비만세포로부터의 히스타민 유리를 억제함은 물론, 초기 Th2 타입의 T세포와 후기 Th1 타입의 T세포를 포함한 Th 세포의 활성화를 차단하는 것이 필요하다.
본 발명의 일 실시예에서는 인간에서 실제적으로 문제가 되고 있는 만성 아토피 피부염 동물모델을 이용하여 줄기세포 배양액의 개선효능을 평가하였다. OVA/alum + OVA로 유도되는 아토피 피부염에 모델에서 OVA 감작군에서는 다양한 피부 염증 및 비후와 더불어 비만세포 침윤이 유도되었으며, 혈청 분석결과 총 IgE 수준의 유의한 상승이 관찰되어 후보물질 탐색을 위한 만성 아토피 적합모델로 확인되었다.
또한, 본 발명에서는 줄기세포 배양액의 확실한 아토피 피부염 개선효능을 검증하기 위해 배양액 원액과 더불어 10배 농축액을 제조함으로써 임상적용 가능성을 확인하였다. 또한, 작용기전을 규명하기 위해 비만세포의 이탈과립(degranulation)으로부터의 전신성 쇼크반응, 국소성 가려움증 및 출혈반응, 피부염증 및 매개물질에 대해 분석하였다.
분석한 결과들을 종합해 보면, 본 발명에 따른 불멸화 양수줄기세포, 불멸화 신경줄기세포 유래 희돌기교전구세포, 불멸화 양수줄기세포 배양액 농축액은 첫째, 세포에 직접 작용하여 아토피 원인물질 분비를 차단하는 것으로 나타났고, 둘째, 비만세포의 탈과립 유도제인 Compound 48/80로 유도된 급성 전신성 쇼크반응을 억제함으로써 체내에서도 급성 과민반응을 완화시켜 주는 것으로 확인되었으며, 셋째, 히스타민으로 유도된 가려움증을 완화시켜 주는 것으로 확인되어 임상에서 가장 고통스러운 증상을 효과적으로 해결해 줄 수 있는 가능성을 제시하였고, 넷째, 만성 아토피 피부염 모델에서 IgE 생성을 감소시키고, 비만세포의 침윤을 억제하고, 히스타민 유리를 억제함은 물론 IL-4를 감소시킴으로써 피부염증을 완화시키는 것으로 나타났다.
따라서 본 발명에 따른 상기 불멸화 줄기세포 배양액은 일련의 제1형 과민반응 유발 전 과정에서 단계별 억제효과를 발휘함으로써 새로운 아토피 피부염 개선 후보물질로서의 가능성이 충분한 것으로 확인되었다.
한편, 나이가 들고 자외선과 같은 유해환경에 노출될 기회가 많아짐에 따라 피부 주름과 착색 및 기미/주근깨가 증가하고 있어 피부 미용개념에 있어 주름 개선 및 미백에 대한 관심이 고조되고 있다. 많은 항산화 천연물을 활용한 주름 개선 및 미백용 소재가 개발되고 있지만, 최근 줄기세포 배양액의 피부염 및 주름 개선과 미백 효능이 주목을 받고 있다. 특히 줄기세포에 의한 피부재생 효과가 배양액 내 성장/영양인자(growth/trophic factors)에 의한 것으로, 이들 성분이 자기 피부 기저층의 줄기세포를 활성화하여 세포성장주기를 빠르게 함으로써 근원적으로 젊은 피부로 되돌려 줄 수 있다는 의학적 가설에 따라 기대감이 높다.
본 발명에서는 다양한 줄기세포 배양액을 피부 콜라겐(collagen)을 분해하여 주름 형성에 직접 관여하는 MMP-1에 적용한 결과, 기존에 피부 주름개선용으로 사용되어 온 지방줄기세포 배양액에 비해 본 발명에 따른 불멸화 신경줄기세포 배양액이 더 높은 억제효과를 나타냈으며, 불멸화 신경줄기세포 유래 희돌기교전구세포 배양액은 불멸화 신경줄기세포 배양액 보다 더 효과적인 것으로 나타났다. 특히, 불멸화 양수줄기세포 배양액은 가장 강력하게 MMP-1을 억제하여 주름 개선에 유용하게 이용될 수 있다.
MMP-1 억제효과에 더하여 티로신(tyrosine)으로부터 멜라닌(melanin)을 합성하여 피부를 검게 만드는 효소인 티로시나아제(tyrosinase)의 억제에 있어서도 기존에 미백효능이 알려진 지방줄기세포에 비해 본 발명에 따른 불멸화 신경줄기세포, 불멸화 신경줄기세포 유래 희돌기교전구세포 및 불멸화 양수줄기세포가 더 우수한 억제효과를 보여 주었으며, 더 나아가 멜라닌세포(melanocytes)에 직접 적용했을 때에도 불멸화 양수줄기세포 > 불멸화 신경줄기세포 유래 희돌기교전구세포 > 불멸화 신경줄기세포의 순으로 멜라닌 생산을 탁월하게 억제하였다. 따라서 본 발명의 불멸화 양수줄기세포 배양액은 주름 개선은 물론, 미백에 있어서도 우수한 효과를 나타낸다.
한편, 본 발명의 아토피 피부염 개선, 주름 개선 또는 미백용 조성물은 화장료 조성물일 수 있다.
본 발명의 화장료 조성물에 포함되는 성분은 유효성분으로서의 불멸화 신경줄기세포, 불멸화 신경줄기세포 유래 희돌기교전구세포 또는 불멸화 양수줄기세포의 배양액 이외에 화장품 조성물에 통상적으로 이용되는 성분들을 포함하며, 예컨대 항산화제, 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료 및 향료와 같은 통상적인 보조제, 그리고 담체를 포함한다. 또한, 상기 화장료 조성물은 그 효과를 증진시키기 위하여 피부 흡수촉진 물질을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 화장료 조성물은 당업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있으며, 예를 들어, 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 파우더, 비누, 계면활성제-함유 클린싱, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션 및 스프레이 등으로 제형화될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 보다 상세하게는, 유연 화장수, 영양 화장수, 영양 크림, 마사지 크림, 에센스, 아이 크림, 클렌징 크림,클렌징 포옴, 클렌징 워터, 팩, 스프레이 또는 파우더의 제형으로 제조될 수 있다. 본 발명의 제형이 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는 담체 성분으로서 동물성유, 식물성유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 또는 산화아연 등이 이용될 수 있다.
본 발명의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록시드, 칼슘 실리케이트 또는 폴리아미드 파우더가 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로히드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진체를 포함할 수 있다. 본 발명의 제형이 용액 또는 유탁액인 경우에는 담체 성분으로서 용매, 용해화제 또는 유탁화제가 이용되고, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌글리콜, 1,3-부틸글리콜오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르가 있다. 본 발명의 제형
이 현탁액인 경우에는 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상의 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 등이 이용될 수 있다. 본 발명의 제형이 계면-활성제 함유 클린징인 경우에는 담체 성분으로서 지방족 알코올 설페이트, 지방족 알코올 에테르 설페이트, 설포숙신산 모노에스테르, 이세티오네이트, 이미다졸리늄 유도체, 메틸타우레이트, 사르코시네이트, 지방산 아미드 에테르 설페이트, 알킬아미도베타인, 지방족 알코올, 지방산 글리세리드, 지방산 디에탄올아미드, 식물성 유, 라놀린 유도체 또는 에톡실화 글리세롤 지방산 에스테르 등이 이용될 수 있다.
또한, 본 발명의 조성물은 약제학적 조성물로 제조될 수 있다.
본 발명의 조성물이 약제학적 조성물로 제조되는 경우, 본 발명의 약제학적 조성물은 약제학적으로 허용되는 담체를 포함한다. 본 발명의 약제학적 조성물에 포함되는 약제학적으로 허용되는 담체는 제제 시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 약제학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제,향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 약제학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences (19th ed., 1995)에 상세히 기재되어 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 쥐, 생쥐, 가축, 인간 등의 포유동물에 경구 또는 비경구 등의 다양한 경로로 투여할 수 있으며, 예컨대 경구, 직장, 정맥, 근육, 피하, 자궁 내, 경막하, 뇌 내 또는 뇌실 내 주사에 의해 투여할 수 있다. 바람직하게는 비경구 투여 중 경피 투여, 보다 바람직하게는 도포에 의한 국부 투여(topical application) 방식으로 적용된다.
본 발명의 약제학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다.본 발명의 약제학적 조성물의 투여량은, 경구형 제형인 경우 성인 기준으로 0.1-100 ㎎/kg의 양을 1일 1회 내지 수회 투여할 수 있으며, 외용제인 경우에는 성인 기준으로 1일당 1.0 내지 3.0 ml의 양으로 1일 1 내지 5회 도포하여 1개월 이상 계속 하는 것이 좋다. 다만, 상기 투여량은 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
본 발명의 약제학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 산제, 과립제, 정제, 캅셀제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 연고, 크림 등의 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액 등을 비롯하여 약제학적 제제에 적합한 어떠한 형태로든 사용할 수 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위해서 일 실시예를 제공한다. 다만, 하기의 실시예들은 본 발명의 이해를 돕기 위한 것일 뿐, 본 발명이 아래의 실시예에 의해서 한정되는 것은 아니다.
< 실시예 1>
줄기세포 채취, 불멸화 및 분화유도
지방줄기세포(adipose-derived stem cells, ADMSC)는 53세의 정상인 여성으로부터 복부 지방흡입술을 통해, 신경줄기세포(NSC)는 임신 15주에 유산된 태아의 뇌로부터, 양수줄기세포(AFSC)는 임신 말기 정상적인 임산부로부터 각각의 기관윤리위원회(IRB) 심의를 거쳐 환자 및 보호자의 동의서를 받아 채취하였다.
신경줄기세포와 양수줄기세포의 특성을 유지함으로써 안정적으로 동일한 배양액을 얻기 위하여, v-myc-encoding retroviral vector를 사용하여 불멸화한 신경줄기세포주(CBNU-NSC)와 불멸화한 양수줄기세포주(CBNU-AFSC)를 확립하였다. 즉, pLSN.v-myc-encoding retroviral vector를 사용하여 PA317 amphotropic packaging cell line을 감염시키고, 성공적으로 감염된 retroviral particles을 가진 PA317 producer cell line, 즉 PASK1.2를 얻었다. 이러한 PASK1.2를 이용하여 줄기세포를 불멸화하고 puromycin 저항성 클론을 선별하여 확장시켰다.
한편, 불멸화 신경줄기세포주(CBNU-NSC)를 Olig2 전사인자 인코딩 레트로바이러스 벡터(Olig2 transcription factor-encoding retroviral vector)로 처리하여 얻은 불멸화 신경줄기세포주 유래 희돌기교전구세포주(CBNU-NSC.olig2)를 확립하였다. 즉, pLHCX.Olig2-encoding retroviral vector를 사용하여 PA317 amphotropic packaging cell line을 감염시켰다. 이 packaging cells의 상등액을 신경줄기세포(CBNU-NSC)에 접종하고 puromycin 저항성 클론을 선별하여 확장시켰다.
확립된 세포주에 대해 네스틴(nestin), CD133, O4, CNPase 등에 대한 면역염색으로 줄기세포와 희돌기교전구세포임을 확인하였다(도 1 참조).
또한, 상기 본 발명에서 제조한 불멸화 줄기세포주들은 2014년 7월 25일자로 KCTC 기관에 각각 기탁하여 균주 기탁번호를 부여받았는데, 불멸화 신경줄기세포주(CBNU-NSC)는 기탁번호 KCTC12635BP로 부여받았고, 양수줄기세포주(CBNU-AFSC)는 기탁번호 KCTC12634BP로 부여받았으며, 신경줄기세포를 Olig2 전사인자 인코딩 레트로바이러스 벡터(Olig2 transcription factor-encoding retroviral vector)로 처리하여 분화유도하여 얻은 불멸화 희돌기교전구세포주(CBNU-NSC.olig2)는 기탁번호 KCTC12636BP로 부여받았다.
< 실시예 2>
실험동물
암컷 ICR 마우스(6주령, 25-30 g)를 코아텍(경기도 평택)으로부터 공급받아 약 1주간 실험실 순화과정을 거친 후 사용하였다. 동물을 마우스용 케이지에 5마리씩 수용하고, 동물실험실의 환경을 온도 23±2℃, 상대습도 55±10%, 환기횟수 12 회/시간, 조명주기 12시간(07:00-19:00), 조도 150-300 lux로 조절하였다. 실험동물용 pellet형 고형사료인 Purina Rat Chow를 바이오피아(경기도 군포)로부터 공급받아 급여하였으며, 음수는 멸균정제수를 자유롭게 섭취하도록 하였다. 본 실험은 충북대학교 실험동물연구지원센터의 동물실험윤리위원회(Institutional Animal Care and Use Committee, IACUC)의 승인 하에 동 기관의 표준작업지침서(Standard Operation Procedures, SOP)에 따라 수행되었다.
< 실시예 3>
아토피 피부염 개선효능 시험평가(1)
<3-1> β- 헥소사미니다제 분비 억제효과
과립의 지표인 β-헥소사미니다제(β-hexosaminidase)를 분석하여 비만세포(mast cells) 분비를 측정하였다. 비만세포주인 RBL-2H3 세포를 48-웰 플레이트(2.5×105 cells/well)에 분주하고, 12시간 동안 1 μg/mL IgE를 처리한 후 HEPES 버퍼로 4회 세척하였다. 배양세포에 시험물질인 줄기세포 배양액(원액 또는 10배 농축액 1%)을 가하고, 이어서 0.1% BSA 함유 세포외버퍼(extracellular buffer)에 희석한 DNP-BSA (400 ng/mL)로 처리한 다음 37℃에서 1시간 동안 배양하였다. 이후, 50 μL의 상층액에 200 μL의 1 mM p-니트로페닐 N-아세틸-베타-D-글루코사민(p-nitrophenyl N-acetyl-βbeta-D-glucosamine)을 가하고 37℃에서 3시간 반응시켰다. 500 μL의 0.05 M 소듐 카보네이트 버퍼(sodium carbonate buffer)를 가하여 효소반응을 정지시키고, 405 nm에서 흡광도로 β-헥소사미니다제의 분비량을 측정하였다.
그 결과, 하기 표 1을 참조하면, 비만세포주인 RBL-2H3 세포를 IgE로 감작시켰을 때 분비되는 β-헥소사미니다제에 대해 이에 비해 지방줄기세포(ADSC) 배양액을 1%의 농도로 처리했을 때는 약 8%, 10배 농축액을 처리했을 때는 약 19%의 약한 억제효과를 보여 주었다. 이에 비해 불멸화 신경줄기세포(CBNU-NSC) 배양액을 1%의 농도로 처리했을 때는 약 10%, 10배 농축했을 때는 약 23%의 억제효과를 보여 주었다. 불멸화 신경줄기세포 유래 희돌기교전구세포(CBNU-NSC.olig2) 배양액은 원액으로는 약 21%, 농축액으로는 약 42%의 억제효과가 나타나 불멸화 신경줄기세포와 비교하여 더 우수한 억제효과를 나타내었다. 특히, 불멸화 양수줄기세포(CBNU-AFSC)는 원액과 농축액에서 각각 34%와 55.5%의 억제효과를 나타내 가장 우수한 것으로 확인되었다.
IgE로 유도된 RBL-2H3 세포로부터의 β-헥소사미니다제 유리에 대한 배양액의 방어효과
줄기세포 농축비율 투여농도(%) IgE(μg/mL) 분비율(%)
용 매 - 1 1 100
지방줄기세포
(ADSC)		 1 1 1 92.1
10 1 1 80.8
불멸화 신경줄기세포
(CBNU-NSC)		 1 1 1 90.3
10 1 1 77.4
불멸화 희돌기교전구세포
(CBNU-NSC.olig2)		 1 1 1 79.1
10 1 1 58.3
불멸화 양수줄기세포
(CBNU-AFSC)		 1 1 1 65.7
10 1 1 44.5
<3-2> Compound 48/80 유도 전신성 아나필락시스반응 억제효능
RBL-2H3 세포에서의 탈과립(degranulation) 억제효과에 근거하여 동물에서의 전신성 아나필락시스 쇼크반응 억제효능을 평가하고자 하였다.
이를 위해, 마우스에 시험물질인 줄기세포 배양액(원액 또는 10배 농축액 0.1 mL/mouse)을 복강 내로 주사하고, 30분 후 비만세포 탈과립 유도제인 Compound 48/80 (8 mg/kg)를 복강 내로 주사하였다. 1시간 동안 전신적인 아나필락시스 반응에 따른 동물의 사망률을 기록하였다.
그 결과, 하기 표 2를 참조하면, 비만세포 탈과립 유도제로 알려진 Compound 48/80를 8 mg/kg의 용량으로 복강 내로 투여했을 때 모든 동물이 쇼크로 사망하였는데, 원액의 지방줄기세포 배양액은 효과가 없었으나, 농축액을 0.1 mL/mouse의 용량으로 사전에 투여했을 때는 50%만이 사망하였다. 이에 비해 불멸화 신경줄기세포 배양 원액을 투여했을 때는 사망률이 66.7%로 감소하였으며, 10배 농축액을 투여했을 때는 33.3%로 더욱 줄어들었다. 불멸화 희돌기교전구세포 배양액은 더 효과가 좋아서, 원액과 농축액 투여 후 사망률이 각각 50%와 16.7%로 감소하였다. 한편, 불멸화 양수줄기세포는 원액 투여시 50%로 사망률을 낮추었으며, 특히 농축액 투여시에는 모든 동물이 생존하여 가장 우수한 것으로 나타났다.
Compound 48/80으로 유도된 전신성 아나필락시스 쇼크반응에 대한 줄기세포 배양액의 방어효과
줄기세포 농축비율 투여량
(mL/mouse)		 Compound 48/80(mg/kg) 사망률(%)
용 매 - 0.1 8 10/10 (100)
지방줄기세포
(ADSC)		 1 0.1 8 4/6 (100)
10 0.1 8 3/6 (50.0)
불멸화 신경줄기세포
(CBNU-NSC)		 1 0.1 8 4/6 (66.7)
10 0.1 8 2/6 (33.3)
불멸화 희돌기교전구세포
(CBNU-NSC.olig2)		 1 0.1 8 3/6 (50.0)
10 0.1 8 1/6 (16.7)
불멸화 양수줄기세포
(CBNU-AFSC)		 1 0.1 8 3/6 (50.0)
10 0.1 8 0/6 (0.0)
<3-3> 히스타민 유도 가려움증 및 피부출혈 억제효능
히스타민으로 유도된 가려움증에 대한 줄기세포 배양액의 완화효과를 평가하기 위하여, 마우스의 등 부위를 제모하고, 50 μL 줄기세포 배양액(10배 농축액)과 동량(50 μL)의 히스타민(histamine dihydrochloride; 0.5 μg/site) 혼합액을 피내로 주사하였다. 이어 0.25 mL의 Evan’s blue 용액(0.5%)을 혈관 내로 주사하였다. 30분 동안 가려움증으로 인해 뒷발로 긁는 횟수(scratching behavior)를 측정하였다. 또한, 가려움증 측정 후 피부를 절제하여 Evan’s blue를 포름아마이드로 추출하여 혈관 누출량을 측정하였다.
그 결과, 도 2를 참조하면, 히스타민(0.5 μg/site)을 마우스의 피내로 주사했을 때 30분간 평균 85회의 긁는 횟수를 나타냈다. 이러한 가려움증에 대해 지방줄기세포(ADSC) 배양 농축액(50 μL)을 혼합 투여했을 때는 긁는 횟수가 70회로 유의하게(17.6%) 줄어들었다. 이에 비해 불멸화 신경줄기세포 배양액은 61회로, 불멸화 희돌기교전구세포 배양액은 48회로 탁월하게 감소시키는 것으로 나타났다. 특히 불멸화 양수줄기세포 배양 농축액은 39회로 감소시켜 가장 우수한 것으로 나타났다.
또한, 도 3을 참조하면, 히스타민으로 가려움증이 유발된 마우스 피부에서의 피부 출혈반응을 Evan’s blue 누출량으로 정량한 결과, 히스타민만을 투여했을 때는 2.70 μg/site의 Evan’s blue가 누출되었는데, 지방줄기세포 배양 농축액을 혼합 투여했을 때는 누출량이 2.30 μg/site로 14.8% 감소한 것을 확인하였다. 이에 비해 불멸화 신경줄기세포 배양액과 희돌기교전구세포 배양액은 각각 1.67 μg/site와 1.33 μg/site로 유의하게 감소시켰다. 특히 불멸화 양수줄기세포 배양액 투여시에는 1.13 μg/site로 탁월하게 감소하여 가장 우수한 것으로 나타났다.
< 실시예 4>
아토피 피부염 개선효능 시험평가(2)
<4-1> 만성 아토피 유발 및 시험물질 투여
마우스에 10 μg ovalbumin/4 mg aluminum hydroxide (OVA/alum in 200 μL saline)를 1주일 간격으로 총 3회(0, 7 및 14일) 복강 내로 투여함으로써 감작을 유도하였다. 마지막 감작 7일 후(21일) 100 μL 줄기세포 배양액(10배 농축액)과 동량(100 μL)의 OVA (100 μg)를 sterile gauze 패치 (1.5×1.5 cm)에 점적하여 제모한 마우스의 등에 적용하고 transparent dressing을 이용하여 고정하였다. 패치는 2일에 한 번씩 교체하였으며 총 14일(21-35일) 동안 유지하였다.
<4-2> 피부병변의 평가
피부병변은 패치를 제거하고 24시간 후 다음의 지표에 따라 점수화하였다. 증상(symptoms): 1, 발적 및 출혈(erythema & hemorrhage); 2, 부종(edema); 3, 인설 및 미란(excoriation & erosion); 4, 건조(dryness). 정도(score): 0, 무증상(no sign); 1, 미약(mild); 2, 중등도(moderate); 3, 심함(severe). 각각의 증상에 대한 score의 합을 개체별 피부염 점수(dermatitis score)로 하였다.
그 결과, 도 4를 참조하면, OVA/alum + OVA로 유발한 만성 아토피 피부염 모델에서 다양한 정도의 홍반, 부종, 인설, 건조증상 등의 피부병변이 유발되어 그 정도를 dermatitis score로 평가한 결과 4.16점에 달하는 것으로 나타났다. 이에 비해 지방줄기세포와 불멸화 신경줄기세포 배양 농축액을 도포했을 때는 각각 3.15점과 3.02점으로 다소 완화되었지만 유의성이 인정되지 않았다. 이에 비해 희돌기교전구세포 배양액 도포시에는 2.36점으로 크게 완화되었으며, 불멸화 양수줄기세포 배양액은 1.62점으로 낮추어 탁월한 아토피 피부염 개선효과를 보여 주었다.
<4-3> 조직병리학적 평가
부검시 피부 병변부위의 일부를 채취하여 Bouin's solution에 고정한 후 파라핀 절편을 만들어 헤마톡실린&에오신(hematoxylin & eosin)으로 염색하였다. 광학현미경을 이용하여 염증세포의 침윤정도를 평가하였다. 상피증식(epidermal hyperplasia)을 평가하기 위해 상피 두께를 이미지 분석 소프트웨어 프로그램(ImagePartner, Seoul, Korea)을 이용하여 측정하였다. 또한, 비만세포의 침윤정도를 평가하기 위해 조직절편을 산성의 톨루이딘 블루(toluidine blue, pH 4.0)로 염색하고, ×1,000 배율의 high-power fields (HPFs) 하에서 20개 시야의 비만세포를 계수하였다.
그 결과, 하기 표 3을 참조하면, OVA/alum + OVA으로 유발한 만성 아토피 피부에서 OVA 첩포 부위에 상피증식과 함께 진피(dermis)의 염증세포 침윤(inflammatory cell infiltration)이 확인되었다. 특히 톨루이딘 블루로 염색했을 때 진피(dermis) 조직 내에 많은 수의 비만세포가 분포함으로써 면역 과민반응이 확인되었다. 이러한 알레르기 반응에 대해 지방줄기세포와 불멸화 신경줄기세포 배양 농축액의 도포는 다소의 완화효과를 나타냈으며, 특히 희돌기교전구세포 배양액은 유의한 개선효과를 보여 주었다. 특히 불멸화 양수줄기세포는 가장 탁월한 피부염증 및 비만세포 침윤 억제효능을 나타내었다.
OVA/alum + OVA으로 유발한 만성 아토피 피부염 모델에서 줄기세포 배양액의 상피세포 두께 및 비만세포 침윤 억제 효과
줄기세포 OVA/alum
+ OVA		 상피두께
(μm, ×100)		 총 비만세포수 (×1,000)
정상동물 26.7±3.5 1.22±0.21
아토피 유발동물 + 66.5±6.7* 4.35±1.25*
지방줄기세포
(ADSC)		 + 56.7±8.7 3.28±0.85
불멸화 신경줄기세포
(CBNU-NSC)		 + 44.8±9.5 3.32±0.85
불멸화 희돌기교전구세포
(CBNU-NSC.olig2)		 + 38.9±6.7# 2.85±0.34#
불멸화 양수줄기세포
(CBNU-AFSC)		 + 38.8±2.9# 2.41±0.63#
<4-4> 혈청 total IgE , IL -4 및 histamine 농도 측정
부검 시 복대정맥으로부터 채혈한 혈액을 3,000 rpm으로 20분간 원심분리하여 혈청을 얻었다. 혈청 내 총 IgE는 마우스 IgE ELISA 키트(Immunology Consultant Laboratory, Inc., Newberg, USA)로, IL-4는 마우스 IL-4 ELISA 키트(Koma Biotechnology, Inc., Seoul, Korea)로, 그리고 히스타민 농도를 히스타민 ELISA 키트(Labor Diagnostika Nord GmbH & Co. KG, Eichenhain, Germany)을 이용하여 분석하였다.
그 결과, 도 5 내지 도 7을 참조하면, 만성 아토피 피부에서 OVA 감작 마우스의 혈청 총 IgE, 히스타민 및 IL-4 농도는 정상 대조군에 비하여 크게 증가하였다. 이러한 혈청 allergy 반응 지표는 줄기세포 배양 농축액 도포로 완화되었는데, 지표 간에 약간의 차이가 있긴 하지만 전반적으로 불멸화 양수줄기세포 ≥ 불멸화 신경줄기세포 유래 희돌기교전구세포 > 불멸화 신경줄기세포 ≥ 지방줄기세포의 순으로 우수한 것으로 확인되었다.
< 실시예 5>
피부 주름 개선효능 평가
피부 주름 개선효능을 콜라겐을 분해하여 소멸시키는 콜라게나제(collagenase) 효소 중의 하나인 matrix metalloproteinase-1 (MMP-1)에 대한 억제효능으로 평가하였다. Bovine tendon collagen (25 mg)을 0.05 M tris(hydroxymethyl)-methyl-2-aminoethane sulfonate (TES) buffer에 녹인 후 37℃에서 15분간 정치시켰다. 이어 콜라겐 type-1과 시험물질인 줄기세포 배양액(10배 농축액 1%)을 첨가한 뒤 5시간 동안 추가로 반응시켰다. 반응액 0.2 mL를 취하여 1 mL의 A buffer [4% ninhydrin in Methyl Cellosolve (2-methoxyethanol) + 0.2 M sodium citrate with 0.71 mM stannous chloride, pH 0.5]에 첨가하였다. 20분간 끓인 뒤 n-프로판올을 첨가하고, 15분간 정치한 후 600 nm에서 흡광도로 효소의 활성도를 측정하였다.
그 결과, 도 8을 참조하면, 콜라겐은 분해하여 피부주름의 원인을 제공하는 MMP-1의 활성도를 지방줄기세포 배양 농축액은 73.6%로 유의하게 억제하는 것으로 나타났다. 이에 비해 불멸화 신경줄기세포와 희돌기교전구세포 배양액은 더 우수하여, 각각 61.2%와 56.6%로 억제하였다. 특히 불멸화 양수줄기세포 배양액은 MMP-1 활성도를 48.1%로 억제하여 가장 우수하였다. 따라서 피부주름 개선효과에 있어서 불멸화 양수줄기세포 > 불멸화 신경줄기세포 유래 희돌기교전구세포 > 불멸화 신경줄기세포 > 지방줄기세포의 순으로 우수한 것으로 확인되었다.
< 실시예 6>
피부 미백효능 시험평가
<6-1> 티로시나제 억제효능
티로신으로부터 멜라닌을 생산하는 데에 관여하는 효소인 티로시나아제에 대한 줄기세포 배양액의 억제효능을 평가하였다. 시험관에 0.1 M phosphate-buffered saline (PBS), 시험물질인 줄기세포 배양액(10배 농축액 1%) 및 mushroom tyrosinase (1,500-2,000 U/mL)를 순서대로 넣고, 이 용액에 1.5 mM 티로신 액을 넣은 후 37℃에서 15분 동안 반응시켰다. ELISA reader를 이용하여 490 nm에서 흡광도로 효소의 활성도를 측정하였다.
그 결과, 도 9를 참조하면, 티로신으로부터 멜라닌을 생산하는 데에 관여하는 티로시나아제의 활성도에 대해서도 지방줄기세포 배양 농축액은 73.5%로 유의하게 억제하였다. 이에 비해 불멸화 신경줄기세포와 희돌기교전구세포 배양액은 더 우수하여, 각각 58.7%와 49.2%로 억제하였다. 특히 불멸화 양수줄기세포 배양액은 tyrosinase 활성도를 39.6%로 억제하여 가장 탁월하였다.
<6-2> 세포 내 melanin 생산 억제효능
Murine melanoma B16 F10 세포를 10% fetal bovine serum (FBS)이 함유된 DMEM 배지로 6-웰 플레이트에 1×105 cells/well로 접종한 후 37℃에서 세포가 well 바닥에 약 80% 이상 부착될 때까지 배양하였다. 배지를 제거하고 시험물질인 줄기세포 배양액(10배 농축액 1%)이 함유된 DMEM 배지로 교체한 후 72시간 동안 추가로 배양하였다. 배지를 제거한 세포를 PBS로 세척하고, 트립신으로 처리하여 세포를 회수하였다. Hematocytometer를 이용하여 세포수를 측정한 후 10,000 rpm으로 10분간 원심분리한 다음 상등액을 제거하여 펠렛을 확보하였다. 세포 펠렛을 60℃에서 건조한 후 10% dimetyl sulfoxide (DMSO)가 함유된 1 M NaOH 용액(100 μL)을 멜라닌을 용출시켰다. Microplate reader로 490 nm에서 흡광도를 측정하여 세포수당 멜라닌의 양을 구하였다.
그 결과, 도 10을 참조하면, melanocytes에서의 직접적인 멜라닌 생산에 대한 억제효능에 있어서도 지방줄기세포 배양 농축액이 61.2%로 억제한 데 비해, 불멸화 신경줄기세포, 희돌기교전구세포 및 양수줄기세포 배양 농축액은 각각 56.5%, 44.3% 및 31.6%로 억제하는 것으로 나타났다.
따라서 피부 미백효과에 있어서도 불멸화 양수줄기세포 > 불멸화 신경줄기세포 유래 희돌기교전구세포 > 불멸화 신경줄기세포 > 지방줄기세포의 순으로 우수한 것으로 확인되었다.
이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.
한국생명공학연구원 KCTC12635BP 20140725 한국생명공학연구원 KCTC12634BP 20140725 한국생명공학연구원 KCTC12636BP 20140725

Claims (8)

  1. 신경줄기세포 또는 양수줄기세포를 v-myc 인코딩 레트로바이러스 벡터(v-myc-encoding retroviral vector)로 처리하여 얻은 불멸화 신경줄기세포주(CNU-NSC; 기탁번호 KCTC12635BP) 또는 양수줄기세포주(CBNU-AFSC; 기탁번호 KCTC12634BP).
  2. 신경줄기세포를 Olig2 전사인자 인코딩 레트로바이러스 벡터(Olig2 transcription factor-encoding retroviral vector)로 처리하여 분화유도하여 얻은 불멸화 희돌기교전구세포주(CBNU-NSC.olig2; 기탁번호 KCTC12636BP).
  3. 불멸화 신경줄기세포(CNU-NSC), 불멸화 신경줄기세포 유래 희돌기교전구세포(CNU-NSC.olig2) 및 불멸화 양수줄기세포(CNU-AFSC)로 이루어진 군 중에서 선택된 어느 하나의 줄기세포 배양액을 유효성분으로 포함하는 아토피 피부염 개선, 주름 개선 또는 미백용 조성물.
  4. 제3항에 있어서,
    상기 불멸화 신경줄기세포 또는 상기 불멸화 양수줄기세포는 신경줄기세포 또는 양수줄기세포를 v-myc 인코딩 레트로바이러스 벡터(v-myc-encoding retroviral vector)로 불멸화시킨 것을 특징으로 하는 아토피 피부염 개선, 주름 개선 또는 미백용 조성물.
  5. 제3항에 있어서,
    상기 불멸화 신경줄기세포 유래 희돌기교전구세포는 상기 불멸화 신경줄기세포를 Olig2 전사인자 인코딩 레트로바이러스 벡터(Olig2 transcription factor-encoding retroviral vector)로 처리하여 분화유도한 것을 특징으로 하는 아토피 피부염 개선, 주름 개선 또는 미백용 조성물.
  6. 제3항에 있어서,
    상기 배양액은 다음과 같은 특성을 나타내는 것을 특징으로 하는 아토피 피부염 개선, 주름 개선 또는 미백용 조성물;
    1) 세포에 직접 작용하여 아토피 원인물질 분비 차단;
    2) 비만세포 탈과립 유도제인 Compound 48/80로 유도된 급성 전신성 쇼크 반응 억제;
    3) 히스타민으로 유도된 가려움증 완화;
    4) lgE 생성 감소, 비만세포(mast cells) 침윤 억제, 히스타민 유리 억제, IL-4 감소.
  7. 제3항에 있어서,
    상기 배양액은 콜라겐 분해효소 활성을 억제하는 특성을 나타내는 것을 특징으로 하는 아토피 피부염 개선, 주름 개선 또는 미백용 조성물.
  8. 제3항에 있어서,
    상기 배양액은 티로시나아제 활성을 억제하는 특성 및 멜라닌 생성을 억제하는 특성을 나타내는 것을 특징으로 하는 아토피 피부염 개선, 주름 개선 또는 미백용 조성물.
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