KR20200125859A - 불멸화 줄기세포 유래 엑소좀 풍부 배양액 및 장미꽃봉오리 추출물을 유효성분으로 포함하는 기능성 조성물 - Google Patents

불멸화 줄기세포 유래 엑소좀 풍부 배양액 및 장미꽃봉오리 추출물을 유효성분으로 포함하는 기능성 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 불멸화 줄기세포 유래 엑소좀 풍부 배양액 및 장미꽃봉오리 추출물을 유효성분으로 포함하는 기능성 조성물에 관한 것으로, 구체적으로 본 발명에 따른 불멸화 줄기세포 유래 엑소좀 풍부 배양액 및 장미꽃봉오리 추출물을 유효성분으로 포함하는 조성물은 비만세포 과립분비 억제, 혈청 내 면역글로불린 IgE 억제, 혈청 내 히스타민 억제, 가려움증 개선 활성이 우수하고 티로시나제 억제 활성 및 멜라닌 생성 억제 활성이 우수하여, 아토피 피부염 개선, 피부주름 개선 및 미백 활성을 갖는 화장료 조성물의 제조에 사용할 수 있을 뿐만 아니라 아토피 피부염과 색소 침착 질환의 예방 또는 치료를 위한 약학적 조성물의 제조에 유용하게 사용할 수 있다.

Description

불멸화 줄기세포 유래 엑소좀 풍부 배양액 및 장미꽃봉오리 추출물을 유효성분으로 포함하는 기능성 조성물{Functional composition comprising exosome-rich conditioned medium of immortalized stem cells and rosebud extracts}
본 발명은 불멸화 줄기세포 유래 엑소좀 풍부 배양액 및 장미꽃봉오리 추출물을 유효성분으로 포함하는 기능성 조성물에 관한 것으로, 구체적으로 불멸화 줄기세포 유래 엑소좀 풍부 배양액 및 장미꽃봉오리 추출물을 유효성분으로 포함하는 아토피 피부염 개선, 미백 개선 또는 주름개선 활성을 갖는 기능성 화장료 조성물, 약학적 조성물 및 식품 조성물에 관한 것이다.
최근 도시인들의 생활환경이 변화함에 따라 집안의 카펫에 서식하는 진드기, 건조한 기후, 공업화 및 환경오염으로 인한 미세먼지, 반려동물의 털, 꽃가루, 식품첨가물 등등 면역 과민반응을 유발하는 다양한 알러젠에 노출되는 기회가 점차 커지고 있다. 이중 아토피 피부염(atopic dermatitis)은 영유아에서 10~20%, 성인에서 1~3%의 비율로 발병하고 있고, 최근 유병율이 꾸준히 증가하는 추세이다. 웰빙을 추구하는 현대인들에 있어서 피부주름 개선, 보습, 미백 등은 피부미용적인 측면에서 자외선을 차단하고 노화를 방지해 줄 수 있는 다양한 기능성 화장품류의 사용으로 상당한 효과를 얻을 수 있지만, 아토피 피부염은 지속적인 항원의 작용으로 인해 심각한 피부염과 가려움증은 물론 그로 인한 심리적 스트레스가 유발되는 중증 질환으로 치료가 매우 어렵고 치료 및 개선을 위해서는 장기간의 시간이 필요하다.
또한, 알러지 반응은 우리 몸의 과도한 면역반응으로, 기전적으로 4가지 유형 중 하나이다. 제1형 과민반응으로 알려진 아토피는 면역글로불린 E (immunoglobulin E, IgE)에 의해 비만세포(mast cells) 등이 과도하게 활성화되는 것이 특징이다. 초기단계에서 아토피 과민반응을 유발하는 알러젠은 2형 helper T 세포(Th2 cells)를 활성화시킨다. 이어 면역글로불린 E를 포함하는 항체를 생산하는 B-세포와 반응한다. 알러젠이 비만세포 표면의 Fcε receptor I (FcεRI)에 교차연결되어 있는 면역글로불린 E와 반응하면 비만세포로부터 히스타민(histamine)이 유리되어 즉각적인 과민반응, 즉 아나필락시스 쇼크반응(anaphylaxis)이 유발된다. 아토피 피부염에서 Th2 세포가 IL-4를 다량으로 생산하고, 이는 형질세포(plasma cells)로 하여금 면역글로불린 E 생산을 촉진시킨다. 그러므로 가장 효과적인 항알러지 및 항아토피 후보물질로는 비만세포로부터의 히스타민 유리를 억제함은 물론, 초기 Th2 세포와 후기 Th1 세포를 포함한 Th 세포의 활성화를 차단하는 물질이 될 수 있다.
한편, 최근에는 줄기세포(stem cells)가 면역조절 기전을 통해 아토피 피부염을 개선시켜 주는 것으로 밝혀졌다. 예를 들어, 제대혈줄기세포(umbilical cord blood stem cells, UCBSC)를 피하로 주사하면 장기간 아토피 피부염의 재발을 방지할 수 있고, 신경줄기세포(neural stem cells, NSC)를 혈관 내로 주사했을 때 말초 면역계를 조절함으로써 자가면역질환인 다발성 경화증을 완화시켜 주는 것으로 밝혀졌다. 이러한 결과는 줄기세포가 면역조절 기능을 통해 과민반응 및 자가면역질환을 개선해 줄 수 있다는 것을 시사한다. 따라서 줄기세포는 제1형 과민반응이며 Th2 세포가 관여하는 아토피 피부염을 예방하고 치료해 줄 수 있을 것으로 기대된다.
나아가 줄기세포 또는 줄기세포의 배양액은 항산화, 피부재생 및 창상치유 효능을 가지고 있는 것으로 알려져 있고, 특히 지방줄기세포(adipose-derived stem cslls, ADSC)는 콜라겐 생성을 촉진시키고 분해를 억제하여 피부주름을 개선해 줌은 물론, 최근에는 피부미백 효능이 알려져 피부미용을 위한 새로운 소재로 관심을 모으고 있다.
하지만 줄기세포의 주름개선 및 미백효능은 줄기세포 자체를 피하에 주사하여 얻어진 결과이며, 줄기세포 배양액(conditioned medium, CM)을 피부에 도포하여 효능을 확인한 연구결과는 아직 없다. 이는 줄기세포 배양액 내 유효성분이 미량인데다 주로 단백질로 구성되어 있어 피부를 잘 침투하지 못하기 때문이다. 이에 피부 침투율 개선 효과의 증진과 함께 줄기세포가 갖는 유용한 효능을 최대화 할 수 있는 기술의 개발이 필요한 실정이다.
한편, 종래 알려진 미백 효과를 나타내는 성분으로는 아스코르브산인산에스테르염, 하이드로퀴논 유도체, 태반 추출물, 코지산, 엘라그산 등이 있으며, 이들 성분을 배합한 화장품 조성물이 일반적이다. 특히 근래에는 태반 추출물을 이용한 미백 화장품이 각광받고 있으나, 이런 태반 추출물은 그 공급량이 한정적이고 윤리적인 문제와 결합하여 그 사용이 제한적이다. 따라서 효과적인 새로운 미백 성분의 개발에 관심이 높아지고 있다.
이에 식물에 함유된 폴리페놀 등에 미백 효과가 있는 것으로 알려지면서 이를 사용하는 화장품 조성물이 제안되고 있고, 또한, 플라바논류, 하이드록시플라본류의 미백 효과에 대해서도 연구 결과가 보고되고 있다. 이처럼 피부에 자극이 적고 친환경적인 천연 식물 유래의 기능성 화장품에 대한 관심이 집중되고 있다.
한편, 장미오일(rose oils)은 진하고 독특한 향으로 인해 널리 애용되는 향수의 원료이다. 하지만 장미오일의 의약학적인 효능은 알려진 바 없다.
이에 본 발명자들은 아토피 피부염, 미백 및 주름 개선활성을 갖는 우수한 소재를 발굴하기 위해 연구하던 중, 줄기세포와 장미추출물에 대한 연구 수행 결과 줄기세포를 불멸화줄기세포로 제조하고 상기 불멸화줄기세포로부터 유래되는 엑소좀 풍부 배양액과 장미꽃봉오리의 추출물을 동시에 사용할 경우 아토피 피부염, 미백 및 주름 개선효과가 월등히 우수함을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
대한민국 등록특허 제10-1934485호
따라서 본 발명의 목적은 불멸화 줄기세포 유래 엑소좀 풍부 배양액 및 장미꽃봉오리 추출물을 유효성분으로 포함하는, 기능성 화장료 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 아토피 피부염 개선, 피부주름 개선 및 미백 활성을 갖는 화장료 조성물의 제조방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 불멸화 줄기세포 유래 엑소좀 풍부 배양액 및 장미꽃봉오리 추출물을 유효성분으로 포함하는 아토피 피부염의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 불멸화 줄기세포 유래 엑소좀 풍부 배양액 및 장미꽃봉오리 추출물을 유효성분으로 포함하는 색소 침착 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 불멸화 줄기세포 유래 엑소좀 풍부 배양액 및 장미꽃봉오리 추출물을 유효성분으로 포함하는, 아토피 피부염 개선, 피부주름 개선 또는 미백 활성을 갖는 식품 조성물을 제공하는 것이다.
상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위해서, 본 발명은 불멸화 줄기세포 유래 엑소좀 풍부 배양액 및 장미꽃봉오리 추출물을 유효성분으로 포함하는, 기능성 화장료 조성물을 제공한다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 불멸화 줄기세포는 불멸화 양수줄기세포, 불멸화 신경줄기세포 또는 불멸화 희소돌기교전구세포일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 불멸화 양수줄기세포는 불멸화 양수줄기세포인 CBNU-AFSC 세포주 (기탁번호: KCTC12634BP)이고, 상기 불멸화 신경줄기세포는 불멸화 신경줄기세포인 CBNU-NSC 세포주 (기탁번호: KCTC12635BP)이고, 상기 불멸화 희소돌기교전구세포는 불멸화 희소돌기교전구세포인 CBNU-NSC.olig2 세포주 (기탁번호: KCTC12636BP)일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 불멸화 줄기세포 유래 엑소좀 풍부 배양액은 불멸화 줄기세포를 함유한 배양액에 TNF-α 및 인터페론 감마(IFN-γ)를 처리하고, 1~5%의 저산소농도 조건 하에서 12~72시간 배양하여 수득한 것일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 TNF-α는 3~100 ng/ml의 농도로 처리하고, 상기 인터페론 감마(IFN-γ)는 1~10 U/ml의 농도로 처리하는 것일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 불멸화 줄기세포는 1x104~1x107 세포수일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 장미꽃봉오리 추출물은 건조하고 분쇄한 장미꽃봉오리에 메탄올을 첨가하고 초음파 처리하여 수득한 메탄올 초음파 추출물에 에탄올, 부탄올 및 에틸아세테이트로 이루어진 군 중에서 선택되는 어느 하나의 용매를 첨가하여 추출 및 분획화하여 수득한 용매 분획물일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 메탄올은 80% 메탄올을 사용한 것이고, 에탄올, 부탄올 또는 에틸아세테이트는 70% 에탄올, 70% 부탄올 또는 70% 에틸아세테이트를 사용한 것일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 장미꽃봉오리는 아이스윙(Rosa hybrida Icewing), 온누리(Rosa hybrida Onnuri), 콜로라도(Rosa hybrida Colorado) 및 덩굴장미(Rosa multiflora Platyphylla thory)로 이루어진 군 중에서 선택되는 장미의 장미꽃봉오리일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 화장료 조성물은 아토피 피부염 개선, 피부주름 개선 또는 미백 활성을 갖는 것일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 화장료 조성물은 스킨로션, 스킨소프너, 스킨토너, 아스트린젠트, 로션, 밀크로션, 모이스쳐 로션, 영양로션, 마사지크림, 영양크림, 모이스처크림, 핸드크림, 파운데이션, 에센스, 영양에센스, 팩, 비누, 클렌징폼, 클렌징로션, 클렌징크림, 바디로션, 바디클렌저, 세안제, 트리트먼트, 미용액, 미용팩, 연고제, 겔제, 리니멘트제, 액제, 패치 및 분무제로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나의 제형일 수 있다.
또한 본 발명은, (1) 불멸화 줄기세포를 함유한 배양액에 TNF-α 및 인터페론 감마(IFN-γ)를 동시에 처리하고, 1~5%의 저산소농도 조건 하에서 12~72시간 배양하여 불멸화 줄기세포 유래 엑소좀 풍부 배양액을 수득하는 단계; (2) 건조하고 분쇄한 장미꽃봉오리에 메탄올을 첨가하고 초음파 처리하여 수득한 메탄올 초음파 추출물에 에탄올, 부탄올 및 에틸아세테이트로 이루어진 군 중에서 선택되는 어느 하나의 용매를 첨가하고 추출 및 분획화하여 장미꽃봉오리의 메탄올 추출물에 대한 용매 분획물을 수득하는 단계; 및 (3) 상기 (1) 단계에서 수득한 불멸화 줄기세포 유래 엑소좀 풍부 배양액 및 상기 (2) 단계에서 수득한 장미꽃봉오리의 메탄올 추출물에 대한 용매 분획물을 혼합하는 단계를 포함하는, 아토피 피부염 개선, 피부주름 개선 및 미백 활성을 갖는 화장료 조성물의 제조방법을 제공한다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 불멸화 줄기세포는 불멸화 양수줄기세포인 CBNU-AFSC 세포주 (기탁번호: KCTC12634BP), 불멸화 신경줄기세포인 CBNU-NSC 세포주 (기탁번호: KCTC12635BP) 또는 불멸화 희소돌기교전구세포인 CBNU-NSC.olig2 세포주 (기탁번호: KCTC12636BP)일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 (1) 단계에서 TNF-α는 3~100 ng/ml의 농도로 처리하고, 상기 인터페론 감마(IFN-γ)는 1~10 U/ml의 농도로 처리하는 것일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 (3) 단계에서 불멸화 줄기세포 유래 엑소좀 풍부 배양액에 상기 (2) 단계에서 수득한 장미꽃봉오리의 메탄올 추출물에 대한 용매 분획물은 에탄올을 이용하여 수득한 분획물일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 (3) 단계에서 장미꽃봉오리의 메탄올 추출물에 대한 용매 분획물은 5~100㎍/㎖의 농도로 첨가하여 혼합하는 것일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 (3) 단계에서 불멸화 줄기세포 유래 엑소좀 풍부 배양액은 화장료 조성물 총 중량%에 대하여 1~3중량%로 첨가하여 혼합하는 것일 수 있다.
또한 본 발명은 불멸화 줄기세포 유래 엑소좀 풍부 배양액 및 장미꽃봉오리 추출물을 유효성분으로 포함하는, 아토피 피부염의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 조성물은 비만세포 과립분비 억제, 혈청 내 면역글로불린 IgE 억제, 혈청 내 히스타민 억제 및 가려움증 개선 활성을 갖는 것일 수 있다.
또한 본 발명은 불멸화 줄기세포 유래 엑소좀 풍부 배양액 및 장미꽃봉오리 추출물을 유효성분으로 포함하는, 색소 침착 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 색소 침착 질환은 주근깨, 노인성 반점, 간반, 기미, 갈색 또는 흑점, 일광 색소반, 푸른 흑피증, 약물 사용 후의 과다색소침착, 조직경화치료법에 따른 후유증, 임신성 갈색반, 경구 피임약을 복용한 여성에서의 흑피증, 찰상 및 화상을 비롯한 상처 또는 피부염으로 인한 염증 후 과다 색소 침착, 광독성 반응 또는 다른 유사한 소형의 고정 색소성 병변 중 하나 이상일 수 있다.
또한 본 발명은 불멸화 줄기세포 유래 엑소좀 풍부 배양액 및 장미꽃봉오리 추출물을 유효성분으로 포함하는, 아토피 피부염 개선, 피부주름 개선 또는 미백 활성을 갖는 식품 조성물을 제공한다.
본 발명에 따른 불멸화 줄기세포 유래 엑소좀 풍부 배양액 및 장미꽃봉오리 추출물을 유효성분으로 포함하는 조성물은 비만세포 과립분비 억제, 혈청 내 면역글로불린 IgE 억제, 혈청 내 히스타민 억제, 가려움증 개선 활성이 우수하고 티로시나제 억제 활성 및 멜라닌 생성 억제 활성이 우수하며, 줄기세포 유래 성분의 피부침투 문제를 극복하여 유효성분의 활성을 극대화시킬 수 있어 아토피 피부염 개선, 피부주름 개선 및 미백 활성을 갖는 화장료 조성물의 제조에 유용하게 사용할 수 있을 뿐만 아니라 아토피 피부염과 색소 침착 질환의 예방 또는 치료를 위한 약학적 조성물의 제조에도 유용하게 사용할 수 있다.
도 1은 정상 산소농도(20%) 조건 및 엑소좀 풍부 배양액 제조 조건(10 U/mL IFN-γ, 50 ng/mL TNF-α 및 3% 저산소농도)에서 비불멸화 신경줄기세포(NSC)와 불멸화 신경줄기세포주(CBNU-NSC)의 배양 시간에 따른 생존율 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 2는 아토피 피부염 유발물질인 Compound-48/80(Comp-48/80)으로 유도된 가려움증 유발 마우스에 비불멸화 줄기세포 정상배양액; 불멸화 줄기세포 정상배양액; 불멸화 줄기세포 엑소좀 풍부 배양액; 및 불멸화 줄기세포 엑소좀 풍부 배양액에 장미꽃봉오리 추출물을 첨가한 혼합물;을 각각 처리한 후, 개선 정도를 분석한 결과로서, 본 발명의 도 2를 포함하는 그래프 결과에서 빗금 그래프는 비불멸화 줄기세포 정상배양액 단독 처리군을 나타낸 것이고, 체크무늬 그래프는 불멸화 줄기세포 정상배양액 단독 처리군을 나타낸 것이며, 회색 그래프는 본 발명의 불멸화 줄기세포 엑소좀 풍부 배양액을 단독 처리한 군을 나타낸 것이고, 검정 그래프는 본 발명의 불멸화 줄기세포 엑소좀 풍부 배양액과 장미꽃봉오리의 메탄올 추출물의 에탄올 분획물(활성분획)을 함께 처리한 것을 나타낸 것이다. 또한, 본 발명의 도면에 나타낸 그래프에서 CBUN-AFSC는 불멸화 양수줄기세포주를, CBNU-NSC는 불멸화 신경줄기세포주를, CBNU-NSC.olig2는 불멸화 희소돌기교전구세포주를 나타낸 것이다.
도 3은 난백알부민(ovalbumin)으로 만성 아토피 피부염이 유발된 마우스 모델에 비불멸화 줄기세포 정상배양액, 불멸화 줄기세포 정상배양액, 불멸화 줄기세포 엑소좀 풍부 배양액 및 불멸화 줄기세포 엑소좀 풍부 배양액과 장미꽃봉오리 활성분획의 혼합물을 처리한 각 군에 대한 피부염 완화정도를 분석한 결과이다.
도 4는 난백알부민(ovalbumin)으로 만성 아토피 피부염이 유발된 마우스 모델에서 비불멸화 줄기세포 정상배양액, 불멸화 줄기세포 정상배양액, 불멸화 줄기세포 엑소좀 풍부 배양액 및 불멸화 줄기세포 엑소좀 풍부 배양액과 장미꽃봉오리 활성분획의 혼합물을 처리한 각 군에서의 혈청 immunoglobin E (IgE) 억제효과를 분석한 결과이다.
도 5는 난백알부민으로 유발된 만성 아토피 피부염 모델에서 비불멸화 줄기세포 정상배양액, 불멸화 줄기세포 정상배양액, 불멸화 줄기세포 엑소좀 풍부 배양액 및 불멸화 줄기세포 엑소좀 풍부 배양액과 장미꽃봉오리 활성분획의 혼합물을 처리한 각 군에서의 혈청 히스타민(histamine) 억제효과를 분석한 결과이다.
도 6은 콜라겐(collagen) 분해효소인 MMP-1 활성도에 대한 비불멸화 줄기세포 정상배양액, 불멸화 줄기세포 정상배양액, 불멸화 줄기세포 엑소좀 풍부 배양액 및 불멸화 줄기세포 엑소좀 풍부 배양액과 장미꽃봉오리 활성분획의 혼합물을 처리한 각 군에서의 MMP-1 활성 억제 효과를 분석한 결과이다.
도 7은 멜라닌(melanin) 합성효소인 tyrosinase 활성도에 대한 비불멸화 줄기세포 정상배양액, 불멸화 줄기세포 정상배양액, 불멸화 줄기세포 엑소좀 풍부 배양액 및 불멸화 줄기세포 엑소좀 풍부 배양액과 장미꽃봉오리 활성분획의 혼합물을 처리한 각 군에서의 tyrosinase 활성 억제 효과를 분석한 결과이다.
도 8은 멜라닌생성세포(melanocytes)에 대해 비불멸화 줄기세포 정상배양액, 불멸화 줄기세포 정상배양액, 불멸화 줄기세포 엑소좀 풍부 배양액 및 불멸화 줄기세포 엑소좀 풍부 배양액과 장미꽃봉오리 활성분획의 혼합물을 처리한 각 군에서의 멜라닌 생성 억제효과를 분석한 결과이다.
본 발명은 줄기세포의 배양액과 장미꽃봉오리의 추출물을 이용하여 아토피 피부염 개선, 주름 개선 또는 피부 미백 활성이 우수한 새로운 기능성 화장품의 원료를 개발하기 위해 연구하던 중, 불멸화 줄기세포 유래 엑소좀 풍부 배양액 및 장미꽃봉오리 추출물을 함께 유효성분으로 포함하는 조성물이 우수한 아토피 피부염 개선 효과, 주름 개선 효과 및 피부 미백 효과를 나타냄을 확인하였다.
따라서 본 발명은 불멸화 줄기세포 유래 엑소좀 풍부 배양액 및 장미꽃봉오리 추출물을 유효성분으로 포함하는, 기능성 화장료 조성물을 제공함에 특징이 있다.
한편, 상기‘줄기세포’는 특정 세포로 분화가 진행되지 않은 세포로서, 필요한 경우, 신경, 피부, 혈액, 근육, 골, 연골 등 신체를 구성하는 모든 종류의 세포로 분화할 능력을 가진 세포를 말하며, 최근에는 기능성 화장품, 의약품 등 다양한 산업분야에서 줄기세포를 이용하려는 연구가 시도되고 있다.
기능성 화장품의 제조에 있어서도 줄기세포를 이용하려는 연구가 활발히 진행되고 있는데, 현재까지 진행되고 있는 대부분의 연구는 줄기세포 자체를 피하에 주사하여 주름개선 및 미백효능을 얻은 결과이며, 줄기세포의 배양액을 이용하여 확인된 결과가 없는 상태이고, 특히 줄기세포 배양액 내 유효성분이 미량이고 주로 단백질로 구성되어 있어 피부를 잘 침투하지 못하는 문제점이 있다.
이에 본 발명자들은 줄기세포 유래의 유효성분을 함유하고 있는 배양액을 효과적으로 이용하기 위해 이들 성분의 피부 침투율 개선을 위한 방법으로, 줄기세포로부터 분비되는 단백질 함유 엑소좀(exosomes)을 파괴하지 않고 줄기세포를 활성화시켜 엑소좀을 다량 분비할 수 있는 최적의 조건을 규명하기 위한 연구를 진행하였다.
또한, 본 발명에서는 줄기세포를 이용하여 엑소좀을 다량 분비할 수 있는 조건을 특정하고 줄기세포를 배양하였는데, 본 발명의 엑소좀 다량 분비 조건에서는 줄기세포의 생존율이 현저하게 감소되는 문제점이 있음을 확인함에 따라 일반 줄기세포 자체를 이용하는 데에는 한계가 있음을 확인하였다.
이에 이를 개선할 수 있는 방법으로 줄기세포를“불멸화 줄기세포”로 제조하고 이를 사용하는 방법을 고안하였는데, 구체적으로 본 발명자들은 줄기세포가 갖는 특성은 그대로 유지하면서 지속적인 계대 배양 시에도 증식능이 떨어지지 않고 높은 생존율을 유지할 수 있도록 각각의 줄기세포에 v-myc oncogene을 도입하여 불멸화 줄기세포주(immortalized cell line)을 확립하였고, 이러한 본 발명의 불멸화 줄기세포주는 일반 줄기세포와 달리 본 발명의 엑소좀 다량 분비 조건 하에서도 사멸하지 않고 높은 생존율을 보이며 엑소좀을 다량 분비할 수 있음을 확인하였다.
따라서 본 발명의 아토피 피부염 개선, 주름 개선 또는 피부 미백 활성이 우수한 기능성 화장료 및 약학적 조성물은 유효성분으로 상기 본 발명의 불멸화 줄기세포 유래 엑소좀 풍부 배양액을 포함한다는 점에 특징이 있다.
한편, ‘엑소좀(exosomes)’은 정교한 RNA 및 단백질 운반물질이 들어있는 작은 크기(30~150 nm)의 소포로, 여러 종류의 세포들로부터 분비되는 막 구조의 소낭체이다. 엑소좀의 분비, 흡수, 조성에 대한 정확한 분자기전과 기능에 대해 아직까지 충분히 연구되지 못한 실정이며, 다만, 다른 세포 및 조직에 결합하는 막 구성요소, 단백질 및 RNA를 전달하는 역할을 하는 것으로 알려져 있다.
이에 본 발명자들은 줄기세포 배양액 내 유효성분의 피부 흡수율을 높이기 위해, 지질로 구성된 인공 리포좀(liposomes)으로 유효성분을 포집하는 종래 기술에 비해 더욱 효과적인 방법으로 줄기세포로부터 엑소좀이 다량 분비될 수 있는 조건을 규명하였고, 이러한 조건을 적용할 경우, 리포좀 접목 방법에 따른 별도의 처리과정, 낮은 유효성분 포집율, 외부 물질의 오염 및 리포좀 포집 시 배양액 성분의 변질과 같은 문제점을 해결할 수 있음을 알 수 있었다.
따라서 본 발명에 따른 상기 불멸화 줄기세포는 줄기세포 유래의 엑소좀을 파괴하지 않으면서 엑소좀을 다량 분비할 수 있고, 불멸화 줄기세포의 세포사멸이 유도되지 않은 본 발명에서 확립한 배양 조건으로 배양할 수 있는데, 상기 배양 조건은 불멸화 줄기세포 또는 불멸화 줄기세포가 함유된 배양액에 IFN-γ 및 TNF-α을 함께 처리하고 저산소농도 조건 하에서 배양하는 단계를 포함하며, 바람직하게는 IFN-γ는 1~10 U/mL의 농도로 처리하고, TNF-α는 3~100 ng/mL의 농도로 처리하며, 1~5%의 저산소농도 조건 하에서 12~72시간 배양하는 것일 수 있다.
특히 본 발명자들은 불멸화 줄기세포를 활성화시켜 엑소좀의 분비를 촉진할 수 있는 촉진제를 연구하던 중, 많은 후보물질들 중에서 IFN-γ 및 TNF-α를 동시에 처리했을 때 가장 효과적으로 엑소좀 분비가 촉진되는 것을 확인할 수 있었으며, 최대로 엑소좀을 대량 분비할 수 있는 조건은 IFN-γ을 1~10 U/mL의 양으로 처리하고, TNF-α는 3~100 ng/mL의 양으로 처리할 경우가 바람직하다는 것을 알 수 있었다.
IFN-γ 및 TNF-α 처리양을 상기 기술된 범위를 초과하여 처리하게 되면, 불멸화 줄기세포에 손상을 주어 세포가 정상적인 기능을 발휘하지 못하는 문제점이 생길 수 있고, 반면 상기 범위에 미치지 못하는 농도로 처리할 경우 엑소좀의 분비량이 충분치 못한 문제점이 생긴다.
줄기세포는 대식세포(macrophages)와 마찬가지로 IFN-γ에 의해 감작된 후 TNF-α에 의해 활성화되고 이동한다. 활성화된 대식세포는 활성산소 라디칼(active oxygen radicals)을 분비하여 체내에 유입된 미생물과 종양을 공격하는 데 비해, 활성화된 줄기세포는 성장인자(growth factors, GF)와 신경영양인자(neurotrophic factors, NF)를 분비하여 조직을 보호하고 재생한다. 이러한 GF/NF 단백질은 엑소좀에 싸여 분비되는 것으로 알려져 있다. 따라서 본 발명에서는 불멸화 줄기세포로부터 다량의 GF/NF 함유 엑소좀을 수득할 수 있는 조건으로 IFN-γ을 1~10 U/mL로 처리하고 동시에 TNF-α를 3~100 ng/mL 처리할 경우라는 것을 확인할 수 있었다.
또한, 본 발명의 불멸화 줄기세포로부터 다량의 엑소좀 분비를 유도할 수 있는 또 다른 요건으로 정상농도(약 20%)보다 현저히 낮은 산소농도 하에서의 배양이 필요하다는 것을 확인하였는데, IFN-γ와 TNF-α 처리 후, 1~5%의 저산소 조건 하에서 12~72시간 배양하는 것이 바람직함을 알 수 있었다. 이때 산소농도 조건이 1% 미만일 경우 세포의 정상적인 증식 및 성장에 문제를 발생시킬 수 있으며, 5%를 초과할 경우 엑소좀 분비가 충분하지 않을 수 있다. 따라서 1~5%의 저산소 조건 하에서 수행하는 것이 바람직하고, 더욱 바람직하게는 3%의 산소농도로 배양하는 것이 좋다.
또한, 본 발명에 따른 방법에서 상기 불멸화 줄기세포의 배양액은 줄기세포를 배양하는 배지라면 모두 사용가능하며, 본 발명의 일실시예에서는 DMEM (Dulbecco’s modified Eagle’s medium) 배지를 사용하였다.
또한 본 발명에서 상기 IFN-γ (1~10 U/mL)와 TNF-α (3~100 ng/mL)로 처리되어지는 불멸화 줄기세포는 바람직하게 1x104~1x107 세포수로 사용할 수 있다.
이와 같이 본 발명의 조건으로 불멸화 줄기세포를 배양할 경우, 불멸화 줄기세포가 증식하는 과정에서 분비되는 세포증식, 분화, 재생관련 유전자, 단백질, 성장인자 등 생리활성 물질들을 함유하고 있는 엑소좀의 분비를 촉진 및 증진시킬 수 있으며, 일반 줄기세포 배양액 수득 방법(즉 IFN-γ, TNF-α 및 저산소농도 조건 하에서의 배양을 수행하지 않은 방법)에 비해 엑소좀의 분비 및 생산량을 월등히 증가시킬 수 있음을 알 수 있었다.
또한 불멸화하지 않은 줄기세포의 경우, IFN-γ와 TNF-α의 처리 및 저산소농도 조건 하에서는 세포생존율이 매우 떨어져 충분한 양의 엑소좀을 얻을 수 없으므로, 본 발명의 불멸화 줄기세포를 이용할 경우에만 다량의 엑소좀, 또는 다량의 엑소좀 함유 배양액(즉, 엑소좀 풍부 배양액)을 수득할 수 있다.
본 발명에서 사용할 수 있는 상기 불멸화 줄기세포는 줄기세포를 불멸화시킨 불멸화 줄기세포라면 모두 사용할 수 있으며, 이에 제한되지는 않으나, 불멸화 양수줄기세포, 불멸화 양막줄기세포, 불멸화 태반줄기세포, 불멸화 제대혈줄기세포, 불멸화 지방줄기세포, 불멸화 골수줄기세포, 불멸화 신경줄기세포, 불멸화 희소돌기교전구세포일 수 있다.
바람직하게 상기 불멸화 줄기세포는, 불멸화 양수줄기세포, 불멸화 신경줄기세포 또는 불멸화 희소돌기교전구세포일 수 있고, 더욱 바람직하게는 불멸화 양수줄기세포는 불멸화 양수줄기세포인 CBNU-AFSC 세포주 (기탁번호: KCTC12634BP)이고, 상기 불멸화 신경줄기세포는 불멸화 신경줄기세포인 CBNU-NSC 세포주 (기탁번호: KCTC12635BP)이고, 상기 불멸화 희소돌기교전구세포는 불멸화 희소돌기교전구세포인 CBNU-NSC.olig2 세포주 (기탁번호: KCTC12636BP)일 수 있다.
나아가 본 발명의 아토피 피부염 개선, 주름 개선 또는 피부 미백 활성이 우수한 기능성 화장료 조성물은 다른 유효성분으로 장미꽃봉오리 추출물을 포함한다는 점에 특징이 있다.
본 발명의 상기 “장미꽃봉오리 추출물”은 당업계에 공지된 추출 및 분리하는 방법을 사용하여 장미꽃봉오리로부터 추출 및 분리하여 수득한 것을 사용할 수 있으며, 본 발명에서 정의된 추출물은 적절한 용매를 이용하여 장미꽃봉오리로부터 추출한 것이며, 예를 들어, 장미꽃봉오리의 조추출물, 극성용매 가용 추출물 또는 비극성용매 가용 추출물을 모두 포함한다.
상기 장미꽃봉오리로부터 추출물을 수득하기 위한 적절한 용매로는 산업적으로 사용 가능한 유기용매라면 어느 것을 사용해도 무방하며, 물 또는 유기용매를 사용할 수 있으며, 이에 제한되지는 않으나, 예를 들어, 정제수, 메탄올(methanol), 에탄올(ethanol), 프로판올(propanol), 이소프로판올(isopropanol), 부탄올(butanol) 등을 포함하는 탄소수 1 내지 4의 알코올, 아세톤(acetone), 에테르(ether), 벤젠(benzene), 클로로포름(chloroform), 에틸아세테이트(ethyl acetate), 메틸렌클로라이드(methylene chloride), 헥산(hexane) 및 시클로헥산(cyclohexane) 등의 각종 용매를 단독으로 혹은 혼합하여 사용할 수 있다. 바람직하게는 정제수(물) 또는 메탄올을 사용할 수 있으며, 본 발명의 일실시예에서는 메탄올을 이용하였다.
추출 방법으로는 열수추출법, 냉침추출법, 환류냉각추출법, 용매추출법, 수증기증류법, 초음파추출법, 용출법, 압착법 등의 방법 중 어느 하나를 선택하여 사용할 수 있다. 또한, 목적하는 추출물은 추가로 통상의 분획 공정을 수행할 수도 있으며, 통상의 정제 방법을 이용하여 정제될 수도 있다.
바람직하게 본 발명의 상기 추출물은 장미꽃봉오리의 메탄올 추출물에 용매로서 에탄올, 부탄올, 또는 에틸아세테이트를 첨가하고 추출하여 수득한 장미꽃봉오리의 용매 분획물일 수 있다.
더욱 바람직하게 본 발명의 상기 장미꽃봉오리 추출물은, 건조하고 분쇄한 장미꽃봉오리에 메탄올을 첨가하고 28~30℃의 온도에서 1~2시간 동안 초음파 처리하여 수득한 추출물을 40~50℃ 온도에서 건조한 후, 여기에 다시 에탄올, 부탄올, 또는 에틸아세테이트를 첨가한 후, 50~55℃에서 1~2시간 동안 분획하여 수득한 것일 수 있다.
특히 본 발명에서는 장미꽃봉오리로부터 아토피 피부염 개선, 주름 개선 또는 미백 활성을 갖는 유효성분을 효과적으로 다량 추출하기 위해, 장미꽃봉오리의 메탄올 추출물에 초음파 처리를 수행하였는데, 초음파 처리 시 28℃ 온도 미만에서 1시간 미만으로 추출을 수행할 경우, 장미꽃봉오리로부터 유효성분의 추출이 미비한 문제점이 있으며, 반면, 30℃ 초과 온도에서 2시간을 초과하여 추출을 수행하게 되면, 활성성분이 활성을 잃거나 변성이 되어 목적하는 기능을 발휘할 수 없는 문제점이 발생한다.
본 발명의 일실시예에서는 상기 장미꽃봉오리의 메탄올 추출물로부터 용매 분획물을 수득하기 위해 70% 에탄올, 70% 부탄올 또는 70% 에틸아세테이트를 사용하였다.
또한, 상기 장미꽃봉오리는 아이스윙(Rosa hybrida Icewing), 온누리(Rosa hybrida Onnuri), 콜로라도(Rosa hybrida Colorado) 및 덩굴장미(Rosa multiflora Platyphylla thory)로 이루어진 군 중에서 선택되는 장미의 꽃봉오리를 사용할 수 있다.
본 발명의 기능성 화장료 조성물에 함유되는 유효성분인 상기 불멸화 줄기세포 유래 엑소좀 풍부 배양액은 상기 조성물 총 중량% 기준으로 1~3 중량%로 함유될 수 있고, 상기 장미꽃봉오리 추출물은 5~100 ㎍/㎖의 농도로 함유될 수 있다.
상기 불멸화 줄기세포 유래 엑소좀 풍부 배양액과 상기 장미꽃봉오리 추출물이 본 발명의 조성물에 대하여 상기 범위 미만으로 함유될 경우, 아토피 피부염 개선, 피부주름 개선 또는 미백 활성이 미비한 문제가 있고, 반면 상기 범위를 초과하여 함유하게 될 경우, 첨가량에 비례한 효과의 증진이 나타나지 않아 비경제적일 뿐만 아니라, 2가지 유효성분들 간에 상호작용에 의해 상기 활성들이 오히려 낮아지는 문제점이 있는 바, 각 유효성분들은 상기 기술된 범위로 상기 조성물 내에 함유되는 것이 중요하다.
본 발명의 일실시예에서는, 불멸화 줄기세포 유래 엑소좀 풍부 배양액 및 장미꽃봉오리 추출물의 처리에 따른 아토피 피부염 개선, 주름 개선 또는 미백활성 여부를 분석하기 위해, 불멸화 줄기세포 유래 엑소좀 풍부 배양액에 본 발명의 장미꽃봉오리 추출물(활성 분획물)을 첨가한 혼합액을 아토피 피부염이 유발된 마우스에 처리한 후, 개선 정도를 확인하였는데, 본 발명의 불멸화 줄기세포 유래 엑소좀 풍부 배양액 및 장미꽃봉오리 추출물을 함께 처리한 경우가 이들을 각각 단독처리한 경우에 비해 히스타민(histamine) 분비와 피부염증을 효과적으로 완화시켜 아토피 피부염 개선 효과가 월등히 우수한 것으로 나타났고, 본 발명의 불멸화 줄기세포 배양액을 사용한 군이 비불멸화 줄기세포 배양액을 사용한 군에 비해서도 더 우수한 개선 효과가 있음을 확인하였다.
뿐만 아니라, 피부 주름의 원인이 되는 콜라겐(collagen) 분해효소인 MMP-1 (matrix metalloproteinase-1)과 색소침착의 원인이 되는 티로시나제 활성 억제 및 멜라닌 생성 억제 효과에 있어서도 불멸화 줄기세포 유래 엑소좀 풍부 배양액 및 장미꽃봉오리 추출물을 함께 처리한 경우가 이들을 각각 단독 처리한 경우에 비해 월등히 우수한 효과가 있음을 확인하였다.
따라서 본 발명의 불멸화 줄기세포 유래 엑소좀 풍부 배양액 및 장미꽃봉오리 추출물을 유효성분으로 포함하는 기능성 화장료 조성물은 아토피 피부염 개선, 피부주름 개선 또는 미백 활성을 갖는다.
본 발명에 따른 상기 화장료 조성물은 스킨로션, 스킨소프너, 스킨토너, 아스트린젠트, 로션, 밀크로션, 모이스쳐 로션, 영양로션, 마사지크림, 영양크림, 모이스처크림, 핸드크림, 파운데이션, 에센스, 영양에센스, 팩, 비누, 클렌징폼, 클렌징로션, 클렌징크림, 바디로션, 바디클렌저, 세안제, 트리트먼트, 미용액, 미용팩, 연고제, 겔제, 리니멘트제, 액제, 패치 및 분무제로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나의 제형인 것이나, 특정 제형에 한정되는 것은 아니고 통상적인 화장료 조성물의 제형으로 제조될 수 있다.
상기 각각의 제형에 첨가물 역시 한정되지 않으며 화장료 분야의 일반적인 첨가물이 첨가될 수 있다. 상기 화장료 분야의 일반적인 첨가물의 예로는 항생제, 결합제, 붕해제, 희석제, 활택제, 안정제, 보존료, 향료, 유분, 물, 계면활성제, 보습제, 저급알콜, 증점제, 킬레이트제, 색소 및 방부제로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상을 들 수 있다.
또한, 본 발명은 아토피 피부염 개선, 피부주름 개선 및 미백 활성을 갖는 화장료 조성물의 제조방법을 제공할 수 있다.
상기 방법은 바람직하게, (1) 불멸화 줄기세포를 함유한 배양액에 TNF-α 및 인터페론 감마(IFN-γ)를 동시에 처리하고, 1~5%의 저산소농도 조건 하에서 12~72시간 배양하여 불멸화 줄기세포 유래 엑소좀 풍부 배양액을 수득하는 단계; (2) 건조하고 분쇄한 장미꽃봉오리에 메탄올을 첨가하고 초음파 처리하여 수득한 메탄올 초음파 추출물에 에탄올, 부탄올 및 에틸아세테이트로 이루어진 군 중에서 선택되는 어느 하나의 용매를 첨가하고 추출 및 분획화하여 장미꽃봉오리의 메탄올 추출물에 대한 용매 분획물을 수득하는 단계; 및 (3) 상기 (1) 단계에서 수득한 불멸화 줄기세포 유래 엑소좀 풍부 배양액 및 상기 (2) 단계에서 수득한 장미꽃봉오리의 메탄올 추출물에 대한 용매 분획물을 혼합하는 단계를 포함한다.
상기 방법에서 사용할 수 있는 불멸화 줄기세포는 앞서 기술한 불멸화 줄기세포의 내용과 동일하며, 가장 바람직하게는 불멸화 양수줄기세포인 CBNU-AFSC 세포주 (기탁번호: KCTC12634BP), 불멸화 신경줄기세포인 CBNU-NSC 세포주 (기탁번호: KCTC12635BP) 또는 불멸화 희소돌기교전구세포인 CBNU-NSC.olig2 세포주 (기탁번호: KCTC12636BP)를 사용할 수 있다.
또한, 상기 (1) 단계에서 TNF-α는 3~100 ng/ml의 농도로 처리하고, 상기 인터페론 감마(IFN-γ)는 1~10 U/ml의 농도로 처리할 수 있으며, 상기 (3) 단계에서 불멸화 줄기세포 유래 엑소좀 풍부 배양액에 상기 (2) 단계에서 수득한 장미꽃봉오리의 메탄올 추출물에 대한 용매 분획물은 에탄올을 이용하여 수득한 분획물일 수 있다. 또한, 상기 (3) 단계에서 장미꽃봉오리의 메탄올 추출물에 대한 용매 분획물은 5~100㎍/㎖의 농도로 첨가하여 혼합할 수 있고, 불멸화 줄기세포 유래 엑소좀 풍부 배양액은 화장료 조성물 총 중량%에 대하여 1~3중량%로 첨가하여 혼합할 수 있다.
나아가 본 발명은 불멸화 줄기세포 유래 엑소좀 풍부 배양액 및 장미꽃봉오리 추출물을 유효성분으로 포함하는, 아토피 피부염의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공할 수 있다.
본 발명의 불멸화 줄기세포 유래 엑소좀 풍부 배양액 및 장미꽃봉오리 추출물을 유효성분으로 포함하는 조성물은 비만세포 과립분비 억제, 혈청 내 면역글로불린 IgG 억제, 혈청 내 히스타민 억제 및 가려움증 개선 활성이 우수한 특징이 있어, 아토피 피부염을 효과적으로 예방, 개선 및 치료할 수 있다.
또한, 본 발명은 불멸화 줄기세포 유래 엑소좀 풍부 배양액 및 장미꽃봉오리 추출물을 유효성분으로 포함하는, 색소 침착 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공할 수 있다.
본 발명의 일실시예에서는 본 발명의 불멸화 줄기세포 유래 엑소좀 풍부 배양액 및 장미꽃봉오리 추출물을 함유하는 조성물은 색소가 과다 침착된 피부에 적용되었을 때, 피부에서 멜라닌 세포가 억제되는 것을 효과적으로 억제, 예방할 수 있으며, 보다 구체적으로 멜라닌 합성 억제 및 티로시나제 활성 억제를 통해 피부에 침착된 멜라닌을 제거하여 색소 침착과 관련된 질환, 병변을 효과적으로 제거할 수 있다.
상기 색소 침착 질환은, 피부에 비정상적으로 생성된 멜라닌에 의해 유발될 수 있는 모든 질환, 병변을 제한 없이 포함할 수 있으며, 바람직하게는 주근깨, 노인성 반점, 간반, 기미, 갈색 또는 흑점, 일광 색소반, 푸른 흑피증, 약물 사용 후의 과다색소침착, 조직경화치료법에 따른 후유증, 임신성 갈색반, 경구 피임약을 복용한 여성에서의 흑피증, 찰상 및 화상을 비롯한 상처 또는 피부염으로 인한 염증 후 과다 색소 침착, 광독성 반응 또는 다른 유사한 소형의 고정 색소성 병변 중 하나 이상일 수 있다.
상기 약학적 조성물은 약학적으로 허용되는 담체를 첨가하여 제제화할 수 있으며, 제제화에 관한 내용은 Remington's Pharmaceutical Science (최근판), Mack Publishing Company, Easton PA의 문헌을 참조할 수 있다.
상기 약학적으로 허용 가능한 담체는 의약 발명 부분에 속하는 통상의 기술자에게 의약 조성물 제조시 통상적으로 사용되는 것을 의미한다. 예를 들어, 락토오즈, 덱스트로오즈, 수크로오스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로오즈, 메틸 셀룰로오즈, 미정질 셀룰로오스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유 등이 있다. 또한, 약학적으로 허용되는 담체는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 포함한다.
예를 들어, 국소투여에 적합한 약학적 담체 및/또는 부형제는 본 발명에 따르면 피부 투여용 약학제제(예를 들어 피부질환 치료제)와 관련하여 해당 기술 분야의 당업자에 공지된 통상적인 담체 및/또는 부형제인 것이 바람직하다.
경구 투여를 위한 고형 제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제 및 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형 제제는 본 발명의 약학적 조성물에 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면, 전분, 탄산칼슘, 수크로오스, 락토오스 및 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한, 단순한 부형제 이외에 마그네슘, 스티레이드, 탈크 같은 윤활제도 사용될 수 있다.
경구 투여를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제 및 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제 및 보존제 등이 포함될 수 있다.
피부 투여를 위해 언급할 수 있는 예로는 더스팅 파우더, 에멀젼, 현탁액, 오일, 스프레이, 연고, 그리지 연고, 크림 페이스트, 겔, 폼, 또는 용액을 생성시키는데 적합하고, 경피 약물 전달체(TTS: Transdermal Therapeutic System)에 적합한 담체 및/또는 부형제가 있다.
본 발명의 국소용 약학제제는 반고체상 제형일 수 있으며 특히 연고(용액 연고, 현탁액 연고), 크림, 겔 또는 페이스트가 있다. 유상에 주로 사용되는 것은 지방 알콜, 예를 들면 라우릴 알코올, 세틸 알코올, 스테아릴 알코올, 지방산, 예를 들면 팔미트산 또는 스테아르산, 액상 또는 고체상 파라핀 또는 오조케라이트, 액상 내지 고체상 왁스, 예를 들면 이소프로필 미리스테이트, 천연 지방 또는 일부 합성 지방, 예를 들면 코코넛 지방산 트리글리세라이드, 경화유, 예를 들면 수소화된 피넛 또는 캐스터 오일, 또는 글리세롤의 지방산 부분 에스테르, 예를 들면 글리세롤 모노스테아레이트 또는 글리세롤 디스테아레이트가 있다. 적합한 유화제로는 계면활성제, 예를 들어 비이온성 계면활성제, 예를 들면 폴리알코올 또는 이것의 산화에틸렌 부가물의 지방산 에스테르, 예컨대 폴리글리세롤 지방산 에스테르 또는 폴리옥시에틸렌 소르비탄 지방산 에스테르, 소르비탄 지방산 에스테르, 예컨대 소르비탄 올레에이트 및/또는 소르비탄 이소스테아레이트 등, 이소스테아레이트, 스테롤, 또는 폴리옥시에틸렌 지방 알콜 에테르 또는 지방산 에스테르, 예를 들어 음이온성 계면활성제, 예를 들면 지방 알코올 설포네이트의 알칼리 금속염, 예컨대 나트륨 라우릴 설페이트, 나트륨 세틸 설페이트 또는 나트륨 스테아릴 설페이트가 있으며 이들은 상기 지방 알코올, 예를 들면 세틸 알코올 또는 스테아릴 알코올의 존재 하에서 일반적으로 사용된다. 이 중에서도 특히 크림 건조를 방지하는 제제, 예를 들면 폴리알코올, 예컨대 글리세롤, 소르비톨, 프로필렌 글리콜 및/또는 폴리에틸렌 글리콜을 수상에 첨가하거나 또는 보존제, 향료 등을 수상에 첨가하는 것이 가능하다.
본 발명의 약학제제는 무수상태의 연고일 수 있고, 국소용도에 적합하고 체온상태에서 액체인 파라핀, 특히 저점도 파라핀을 함유하거나, 또는 상기 천연지방 또는 부분합성 지방, 예를 들면, 코코넛 지방산 트리글리세라이드, 경화유, 예를 들면 수소화된 피넛 도는 캐스터 오일, 글리세롤의 지방산 부분 에스테르, 예를 들면 글리세롤 모노스테아레이트 및 디스테아레이트, 실리콘, 예를 들면 폴리메틸실록산, 예컨대 헥사메틸디실록산 도는 옥타메틸트리실록산을 함유할 수 있으며, 예를 들어 수성크림과 관련되어 있고 수분 흡수 용량을 증가시키는 지방 알코올, 그리고 스테롤, 울 왁스, 다른 유화제 및/또는 기타 첨가제를 함유할 수 있다.
그러나 상기 열거된 약제학적으로 허용되는 담체 등으로 본 발명이 한정되는 것은 아니며, 이들은 단지 예시에 불과하다.
상기 약학적 조성물에 함유되는 유효성분의 적용량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여 경로 및 기간에 따라 다르지만, 경우에 따라 적절하게 선택될 수 있다. 예를 들면, 상기 유효성분을 1일 0.0001 내지 1000 mg/kg으로, 바람직하게는 0.1 내지 1000 mg/kg의 용량으로 투여될 수 있으며, 상기 적용은 하루에 한번 또는 수회 나누어 적용할 수도 있다. 또한, 상기 약학적 조성물은 조성물 총 중량에 대하여 상기 본 발명의 유효성분을 0.0001 내지 50 중량%로 포함할 수 있다.
상기 약학적 조성물은 인간 등의 포유동물에 다양한 경로로, 예를 들면, 경피, 경구, 정맥, 근육, 또는 피하 주사에 의해 적용될 수 있다.
또한 본 발명의 약학적 조성물은 유효성분 외에 피부 색소 침착의 개선, 완화, 치료 또는 예방을 나타내는 유효성분을 1종 이상 함유할 수 있다.
또한 본 발명의 약학적 조성물은 피부 색소 침착의 개선, 완화, 치료 또는 예방을 위하여 단독으로, 또는 수술, 호르몬 치료, 약물 치료 및 생물학적 반응 조절제를 사용하는 방법들과 병용하여 사용할 수 있다
나아가 본 발명은 불멸화 줄기세포 유래 엑소좀 풍부 배양액 및 장미꽃봉오리 추출물을 유효성분으로 포함하는, 아토피 피부염 개선, 피부주름 개선 또는 미백 활성을 갖는 식품 조성물을 제공할 수 있다.
본 발명의 식품 조성물은 유효성분인 불멸화 줄기세포 유래 엑소좀 풍부 배양액 및 장미꽃봉오리 추출물을 함유하는 것 외에 통상의 식품 조성물과 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다.
상술한 천연 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당, 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 상술한 향미제는 천연 향미제 (타우마틴), 스테비아 추출물(예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등) 및 합성 향미제 (사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다.
본 발명의 식품 조성물은 상기 약제학적 조성물과 동일한 방식으로 제제화되어 기능성 식품으로 이용하거나, 각종 식품에 첨가할 수 있다. 본 발명의 조성물을 첨가할 수 있는 식품으로는 예를 들어, 음료류, 육류, 초코렛, 식품류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 사탕류, 아이스크림류, 알코올 음료류, 비타민 복합제 및 건강보조식품류 등이 있다.
또한 상기 식품 조성물은 본 발명의 유효성분 외에 여러 가지 영양제, 비타민, 광물 (전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제 (치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그밖에 본 발명의 식품 조성물은 천연 과일 쥬스 및 과일 쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다.
또한, 본 발명은 불멸화 줄기세포 유래 엑소좀 풍부 배양액 및 장미꽃봉오리 추출물을 유효성분으로 포함하는, 아토피 피부염 개선, 피부주름 개선 또는 미백 활성을 갖는 건강기능식품을 제공할 수 있다.
본 발명의 건강기능식품은 정제, 캅셀, 분말, 과립, 액상, 환 등의 형태로 제조 및 가공할 수 있다.
본 발명에서 “건강기능식품”이라 함은 건강기능식품에 관한 법률 제6727호에 따른 인체에 유용한 기능성을 가진 원료나 성분을 사용하여 제조 및 가공한 식품을 말하며, 인체의 구조 및 기능에 대하여 영양소를 조절하거나 생리학적 작용 등과 같은 보건 용도에 유용한 효과를 얻을 목적으로 섭취하는 것을 의미한다.
본 발명의 건강기능식품은 통상의 식품 첨가물을 포함할 수 있으며, 식품 첨가물로서의 적합 여부는 다른 규정이 없는 한, 식품의약품안전청에 승인된 식품 첨가물 공전의 총칙 및 일반시험법 등에 따라 해당 품목에 관한 규격 및 기준에 의하여 판정한다.
상기 “식품 첨가물 공전”에 수재된 품목으로는 예를 들어, 케톤류, 글리신, 구연산칼슘, 니코틴산, 계피산 등의 화학적 합성물; 감색소, 감초추출물, 결정셀룰로오스, 고량색소, 구아검 등의 천연첨가물; L-글루타민산나트륨제제, 면류첨가알칼리제, 보존료제제, 타르색소제제 등의 혼합제제류 등을 들 수 있다.
예를 들어, 정제 형태의 건강기능식품은 본 발명의 유효성분을 부형제, 결합제, 붕해제 및 다른 첨가제와 혼합한 혼합물을 통상의 방법으로 과립화한 다음, 활택제 등을 넣어 압축성형하거나, 상기 혼합물을 직접 압축 성형할 수 있다. 또한 상기 정제 형태의 건강기능식품은 필요에 따라 교미제 등을 함유할 수도 있다.
캅셀 형태의 건강기능식품 중 경질 캅셀제는 통상의 경질 캅셀에 본 발명의 유효성분을 부형제 등의 첨가제와 혼합한 혼합물을 충진하여 제조할 수 있으며, 연질 캅셀제는 상기 본 발명의 유효성분을 부형제 등의 첨가제와 혼합한 혼합물을 젤라틴과 같은 캅셀기제에 충진하여 제조할 수 있다. 상기 연질 캅셀제는 필요에 따라 글리세린 또는 소르비톨 등의 가소제, 착색제, 보존제 등을 함유할 수 있다.
환 형태의 건강기능식품은 본 발명의 유효성분과 부형제, 결합제, 붕해제 등을 혼합한 혼합물을 기존에 공지된 방법으로 성형하여 조제할 수 있으며, 필요에 따라 백당이나 다른 제피제로 제피할 수 있으며, 또는 전분, 탈크와 같은 물질로 표면을 코팅할 수도 있다.
과립 형태의 건강기능식품은 본 발명의 유효성분과 부형제, 결합제, 붕해제 등을 혼합한 혼합물을 기존에 공지된 방법으로 입상으로 제조할 수 있으며, 필요에 따라 착향제, 교미제 등을 함유할 수 있다.
상기 건강기능식품은 음료류, 육류, 초코렛, 식품류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 사탕류, 아이스크림류, 알코올 음료류, 비타민 복합제 및 건강보조식품류 등일 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
< 준비예 >
① 불멸화 줄기세포의 준비
본 발명의 하기 실시예의 실험에 사용된 불멸화 줄기세포는 다음과 같은 세포들을 사용하였다. 먼저, 불멸화 양수줄기세포, 불멸화 신경줄기세포 및 불멸화 희소돌기교전구세포는 본 발명자가 이미 불멸화 세포주로 제조하여 확립한 세포주로서, 각 불멸화 세포주들은 미생물 기탁기관으로부터 기탁번호를 부여받았다. 구체적으로 하기 실시예에서 사용한 각 불멸화 줄기세포는, 불멸화 양수줄기세포인 CBNU-AFSC 세포주 (KCTC12634BP; 대한민국 등록특허 제10-1719274호), 불멸화 신경줄기세포인 CBNU-NSC 세포주 (KCTC12635BP; 대한민국 등록특허 제10-1719274호) 및 불멸화 희소돌기교전구세포인 CBNU-NSC.olig2 세포주를 (KCTC12636BP; 대한민국 등록특허 제10-1740357호 참조) 각각 사용하였고, 상기 불멸화 세포주들의 제조방법은 각 세포주에 대한 등록특허의 내용을 참고할 수 있다. 또한 하기 실시예예서 비교예로 사용한 비불멸화 줄기세포들은 신경줄기세포 및 불멸화 희소돌기교전구세포를 불멸화시키기 전의 각각의 초대배양세포를 사용하였다.
② 불멸화 줄기세포의 배양 및 엑소좀 풍부 배양액의 수득
상기 준비예 ①에서 준비한 각각의 불멸화 줄기세포(1 x 106 세포/mL) 및 비불멸화 줄기세포 각각을 Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) 배지에 접종하고 5% 이산화탄소(CO2) 공급 배양기에서 37℃의 온도로 24시간 동안 배양하였다. 이후 각 불멸화 줄기세포로부터 엑소좀이 풍부하게 함유된 배양액(exosome-rich conditioned medium, ERCM)을 수득하기 위해, 상기 배양 배지에 IFN-γ(10 U/mL) 및 TNF-α(50 ng/mL)를 동시에 처리하고 산소농도를 3%로 낮춘 후, 24시간 동안 배양한 다음, 각 배양액을 채취하여 필터로 거른 후 저온에서 10배 농축하여 본 발명에 따른 불멸화 줄기세포 유래의 엑소좀 풍부 배양액을 수득하였다. 이때 대조군으로 사용한 정상배양액(conditioned medium, CM)은 상기에서 사용한 불멸화 및 비불멸화 줄기세포 각각을 일반 세포 배양 조건인 37℃의 온도에서 산소(O2) 농도 20%를 유지한 상태로 24시간 배양한 후 배양액을 채취하여 필터로 거른 후 저온에서 10배 농축한 배양액을 사용하였다.
또한, 비교군으로서 비불멸화 줄기세포 및 불멸화 줄기세포의 각각의 줄기세포로부터 엑소좀이 함유된 배양액을 수득하는 과정에서, TNF-α(50 ng/mL)만 처리하고 산소(O2) 농도를 21%로 유지한 상태로 수행한 것으로 제외하고는 상기 기술된 동일한 방법으로 수득한 엑소좀 함유 배양액을 사용하였다.
③ 장미꽃봉오리의 추출물 제조
본 발명자들은 항산화, 아토피 피부염, 주름 및 미백 개선효과를 갖는 장미꽃봉오리 추출물을 수득하기 위해, 많은 장미 품종을 대상으로 항산화 성분의 함량이 높은 20여 종을 1차로 선별한 다음, 최종적으로 항산화, 아토피 피부염, 주름 및 미백 개선효과가 가장 우수한 아이스윙(Rosa hybrida Icewing), 온누리(Rosa hybrida Onnuri), 콜로라도(Rosa hybrida Colorado) 및 덩굴장미(Rosa multiflora Platyphylla thory)의 4개 종을 선정하였고, 천안 누리농산에서 친환경 재배된 장미를 공급받아 사용하였다. 상기 4가지 장미로부터 추출물을 수득하기 위해, 먼저 장미꽃봉오리를 건조시켰고, 건조된 장미꽃봉오리를 분쇄한 후 분쇄된 시료 중량의 10배에 해당하는 80% 메탄올을 각각 첨가한 다음, 초음파 추출장치를 이용하여 28℃에서 1시간 동안 초음파 추출을 수행하였다. 이후 초음파 추출물을 회전진공농축기를 이용하여 40℃에서 건조시켰고, 메탄올 추출 건조물을 다시 70% 에탄올, 70% 부탄올 또는 70% 에틸아세테이트로 50℃에서 1시간 동안 추출하여 각 장미꽃봉오리의 용매 추출 분획물을 수득하였다.
< 실시예 1>
엑소좀 풍부 배양액 수득을 위한 배양 조건에서 본 발명의 불멸화 줄기세포 및 비불멸화 줄기세포의 생존율 분석
본 발명자들은 엑소좀 풍부 배양액을 각 줄기세포로부터 수득하기 위한 배양조건(10 U/mL IFN-γ, 50 ng/mL TNF-α 및 3% 저산소농도에서 배양)으로 상기 준비예의 줄기세포들을 배양하였을 경우, 각 줄기세포(불멸화 줄기세포 및 비불멸화 줄기세포)의 생존율 여부를 측정하였다.
그 결과, 도 1에 나타낸 바와 같이, 정상 산소농도(20%) 배양 시에는 비불멸화 신경줄기세포와 불멸화 신경줄기세포주 모두 2일 동안 183%와 234%로 빠르게 세포 증식을 보인 반면, 엑소좀 풍부 배양액 제조 조건으로 배양한 경우에서는 비불멸화 신경줄기세포의 경우, 단지 15%만이 세포가 생존하고 대부분의 세포는 사멸한 것으로 나타났다. 한편 본 발명의 불멸화 신경줄기세포주는 96%의 생존율을 보여 대부분의 세포가 사멸하지 않고 저산소 조건 하에서도 우수한 저항성을 보이며 높은 세포 생존율을 보이는 것을 알 수 있었다. 이러한 결과는 비불멸화 신경줄기세포, 비불멸화 양수줄기세포 및 비불멸화 희소돌기교전구세포 모두에서 유사한 결과를 보였다.
따라서 이러한 결과를 통해, 엑소좀 풍부 배양액을 수득하기 위한 배양 조건인 10 U/mL IFN-γ, 50 ng/mL TNF-α 및 3% 저산소 농도 조건에서는 비불멸화 줄기세포는 대부분 세포 사멸이 유도되어 비불멸화 줄기세포의 배양액은 수득할 수 없음을 알 수 있었고, 본 발명의 불멸화 줄기세포를 상기 조건으로 배양한 경우에만 엑소좀 풍부 배양액을 수득할 수 있음을 알 수 있었다. 따라서 상기 조건에서 엑소좀 풍부 배양액을 수득하기 위해서는 불멸화 줄기세포를 사용하는 것이 중요한 요소임을 확인할 수 있었다.
< 실시예 2>
본 발명의 장미꽃봉오리의 추출물에 대한 항산화능 분석
상기 준비예 ③에서 수득한 장미꽃봉오리의 각 용매 추출 분획물에 대한 항산화능 분석을 위해, 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) 라디칼 소거능 분석을 수행하였다. 이를 위해 50 μg/mL 농도의 장미꽃봉오리 각 용매 추출 분획물 0.2 mL에 0.2 mM DPPH 용액 0.8 mL를 첨가하고 실온에서 30분간 방치한 후, 520 nm에서 흡광도를 측정하였다. DPPH 라디칼 소거 활성의 전자공여능은 장미꽃봉오리 분획물을 첨가한 군과 비첨가군의 흡광도 차이를 시료 1 g 중의 아스코르빅산 mg으로 표현하였다.
그 결과, 아이스윙, 온누리, 콜로라도 및 덩굴장미의 메탄올 추출물의 에탄올 분획물에 대한 DPPH 소거 항산화능은 각각 0.69±0.03, 0.72±0.03, 0.52±0.02 및 0.58±0.03 mg ascorbic acid equivalent/g로 확인되었고, 이러한 결과는 다른 품종의 항산화능 0.25~0.44 mg/ascorbic acid equivalent/g보다 높은 것으로 나타났다. 또한 상기 아이스윙, 온누리, 콜로라도 및 덩굴장미의 메탄올 추출물에 대한 각 용매 추출 분획물의 항산화 분석 결과, 메탄올 추출물에 대한 부탄올 분획물 및 에틸아세테이트 분획물에 비해 에탄올 분획물이 가장 우수한 항산화능이 있는 것을 확인하였다.
이후 본 발명자들은 항산화능이 우수한 것으로 확인된 상기 본 발명의 장미꽃봉오리 용매 추출 분획물을 본 발명의 불멸화줄기세포 유래 엑소좀 풍부 배양액과 함께 사용할 경우, 아토피 피부염, 미백 및 주름개선 효과가 있는지의 활성 여부를 하기 실시예들을 통해 확인하였다.
< 실시예 3>
본 발명의 불멸화 줄기세포 유래 엑소좀 풍부 배양액 및 장미꽃봉오리의 추출물 처리에 따른 비만세포 과립분비 억제 효능 분석
아토피 피부염의 원인이 되는 비만세포 과립 분비를 과립의 지표인 β-hexosaminidase를 측정하는 방법을 통해 분석하였다. 구체적으로, 비만세포주인 RBL-2H3 세포를 2.5×105 cells/well로 분주하고, 12시간 동안 1μg/mL의 IgE를 처리한 다음, 세척하였다. 이후 배양세포에 본 발명에 따른 불멸화 줄기세포 엑소좀풍부 배양액의 10배 농축액 각 1% (배지 내 최종농도, v/v)와 본 발명의 장미꽃봉오리의 메탄올 추출물의 에탄올 분획물(50 μg/mL)을 함께 처리하고, 이어 0.1% p-dinitrophenyl-bovine serum albumim (DNP-BSA, 400 ng/mL)를 처리한 후 37oC 에서 1시간 동안 배양하였다. 이후 상층액을 수득하고 50 μL의 상층액에 200 μL의 1 mM p-nitrophenyl N-acetyl-beta-D-glucosamine를 첨가하여 37oC에서 3시간 반응시키고, 500 μL의 소튬 카보네이트 버퍼를 첨가하여 효소반응을 정지시킨 다음, 405 nm에서의 흡광도로 β-hexosaminidase의 분비량을 측정하였다. 이때 대조군으로는 비불멸화 줄기세포 정상배양액 처리군을 사용하였고, 비교군으로 불멸화 줄기세포 정상배양액 처리군 및 본 발명의 불멸화 줄기세포 유래 엑소좀 풍부 배양액 단독 처리군을 사용하였다. 상기 실험에 사용한 각 대조군, 비교군 및 실험군에 대한 내용 및 분석 결과는 하기 표 1에 기재하였다.
Figure pat00001
분석 결과, 비만세포주인 RBL-2H3 세포를 IgE (1 μg/mL)로 감작시켰을 때 분비되는 βhexosaminidase에 대하여, 비불멸화 줄기세포에 비해 불멸화 줄기세포의 배양액 처리 시, βhexosaminidase의 분비율이 감소되는 것으로 나타났고, 또한 각 불멸화세포에 대한 엑소좀 풍부 배양액을 처리한 군이 정상배약에 처리 군에 비해 βhexosaminidase의 분비율 감소효과가 더 우수한 것으로 나타났으며, 각 불멸화세포에 대한 엑소좀 풍부 배양액 처리에 비해 본 발명의 불멸화 세포주 유래 엑소좀 풍부 배양액과 본 발명의 장미꽃봉오리 메탄올 추출물의 에탄올 분획물을 함께 처리한 군이 가장 우수하게 βhexosaminidase의 분비율을 억제시키는 것으로 나타났다.
구체적으로, 비불멸화 줄기세포 정상배양액 처리군들은 βhexosaminidase의 분비율 억제 정도가 11.8~28.8%인 것으로 나타난 것에 비해, 불멸화 줄기세포 정상배양액 처리 군은 더 높은 28.9~41.3%의 억제효과를 보였다. 한편, 불멸화 줄기세포 엑소좀 풍부 배양액 처리군의 경우, 양수줄기세포에서 50.5% 분비 억제율을, 신경줄기세포에서는 61.2% 분비 억제율을, 희소돌기교전구세포에서는 68.7%의 분비억제율을 보였고, 나아가 이들 불멸화 줄기세포의 엑소좀 풍부 배양액에 본 발명의 장미꽃봉오리 메탄올 추출물의 에탄올 분획물(50 μg/mL)을 첨가한 경우, βhexosaminidase의 분비 억제 효과가 훨씬 상승하여 각각 67.6% (불멸화 양수줄기세포), 74.2% (불멸화 신경줄기세포) 및 80.8% (불멸화 희소돌기세포)의 월등한 억제율을 보이는 것을 확인할 수 있었다.
따라서 이러한 결과를 통해 본 발명자들은 본 발명의 불멸화 줄기세포로부터 수득한 엑소좀 풍부 배양액 및 본 발명의 장미꽃봉오리 메탄올 추출물의 에탄올 분획물을 함께 포함하는 조성물은 βhexosaminidase의 분비 억제 효과가 매우 우수하여 아토피 피부염을 효과적으로 개선, 예방 또는 치료할 수 있음을 알 수 있었다.
< 실시예 4>
본 발명의 불멸화 줄기세포 유래 엑소좀 풍부 배양액 및 장미꽃봉오리의 추출물 처리에 따른 피부 가려움증 개선 효과 분석
본 발명자들은 본 발명의 불멸화 줄기세포 유래 엑소좀 풍부 배양액 및 장미꽃봉오리의 추출물의 피부 가려움증 개선 효과 여부를 확인하기 위해, 다음과 같은 방법으로 실험을 수행하였다.
<4-1> 실험동물 준비
암컷 ICR 마우스(6주령)를 코아텍으로부터 공급받아 약 1주간 실험실 순화과정을 거친 후 사용하였다. 동물을 마우스용 케이지에 5마리씩 수용하고, 동물실험실의 환경을 온도 23±2℃, 상대습도 55±10%, 환기횟수 12 회/시간, 조명주기 12시간(07:00-19:00), 조도 150-300 lux로 조절하였다. 실험동물용 펠렛형 고형사료인 Purina Rat Chow®를 바이오피아로부터 공급받아 급여하였으며, 음수는 멸균정제수를 자유롭게 섭취하도록 하였다. 본 실험은 충북대학교 실험동물연구지원센터의 동물실험윤리위원회(Institutional Animal Care and Use Committee, IACUC)의 승인 하에 동 기관의 표준작업지침서(Standard Operation Procedures, SOP)에 따라 수행되었다.
<4-2> Compound 48/80 유도 가려움증 유발 동물모델 제조 및 본 발명의 불멸화 줄기세포 유래 엑소좀 풍부 배양액 및 장미꽃봉오리의 추출물 처리에 따른 가려움증 억제 활성 분석
상기 <4-1>에서 준비한 마우스의 등 부위를 제모하고, 앞서 본 발명의 실시예에서 수득한 본 발명의 불멸화 줄기세포 엑소좀 풍부 배양액과 본 발명의 장미꽃봉오리 에탄올 분획물(50 μg/mL)의 혼합물 50 μL를 동량(50 μL)의 Compound-48/80 (50 μg/site) 용액과 함께 피하로 각각 주사하고, 30분 동안 마우수를 관찰하면서 가려움증으로 인해 뒷발로 긁는 횟수(scratching behavior)를 측정하였다. 이때 대조군으로는 상기 마우스에 Compound-48/80 (50 μg/site) 용액과 함께 비불멸화 줄기세포 정상배양액, 불멸화 줄기세포 정상배양액 및 본 발명에 따른 불멸화 줄기세포 엑소좀 풍부 배양액의 10배 농축액을 각각 투여한 군을 사용하였다.
<4-3> 만성 아토피 유발 및 시험물질 투여
상기 <4-1>에서 준비한 마우스에 10 μg ovalbumin을 200 μL 생리식염수에 용해하여 1주일 간격으로 총 3회(0, 7 및 14일) 복강 내로 투여함으로써 감작을 유도하였다. 마지막 감작 7일 후(21일째)에 본 발명의 불멸화 줄기세포 엑소좀 풍부 배양액과 본 발명의 장미꽃봉오리 에탄올 분획물(50 μg/mL)의 혼합물 100 μL와 동량(100 μL)의 ovalbumin (100 μg)를 sterile gauze patch (1.5 x 1.5 cm)에 점적하여 제모한 마우스의 등에 각각 적용하고 투명 드레싱(transparent dressing)을 이용하여 고정시켰고, 패취(Patch는 2일에 한 번씩 교체하였으며 총 14일(21일~35일째) 동안 유지시켰다.
<4-4> 피부병변의 평가
피부병변은 patch를 제거하고 24시간 후 다음의 지표에 따라 증상(symptoms)과 정도(degree score)를 점수화하였다.
[증상]
0점: 무증상(no sign)1
1점: 발적 및 출혈(erythema & hemorrhage)
2점: 부종(edema)
3점: 찰과장 및 미란(excoriation & erosion)
4점: 건조(dryness)
[정도]
0점: 무증상(no sign)
1점: 미약(mild)
2점: 중등도(moderate)
3점: 심함(severe)
상기 방법으로 측정된 각각의 증상에 대한 score의 합을 개체별 피부염 점수(dermatitis score)로 하였다.
분석 결과, Compound-48/80 (50 μg/site)을 마우스의 피하로 주사한 경우에는 30분간 평균 87회의 긁는 횟수를 나타낸 반면, 비불멸화 줄기세포 정상배양액 처리 시에는 63~73회로 가려움증이 조금 개선된 것으로 나타났다. 한편, 불멸화 줄기세포 정상배양액을 처리한 군에서는 긁는 횟수가 41~52회로 감소되어 비불멸화 줄기세포 정상배양액 처리군에 비해 더 좋은 개선 효과를 보였다. 비에 비해, 불멸화 줄기세포 엑소좀 풍부 배양액 처리 군의 경우, 불멸화 양수줄기세포 유래 엑소좀 풍부 배양액에서는 22회, 불멸화 신경줄기세포 유래 엑소좀 풍부 배양액에서는 26회, 불멸화 희소돌기교전구세포 유래 엑소좀 풍부 배양액에서는 18회로 우수한 억제효과를 나타냈다. 그러나, 이러한 가려움증 개선 효과에 대해 본 발명의 불멸화줄기세포 유래 엑소좀 풍부 배양액에 본 발명의 장미꽃봉오리 메탄올 추출물의 에탄올 분획물을 50 μg/mL의 농도로 추가한 혼합액 처리 시, 마우스의 긁는 횟수는 각각 8.7회(불멸화 양수줄기세포), 11.5회(불멸화 신경줄기세포) 및 7.1회(불멸화 희소돌기교전구줄기세포)로 가려움증이 탁월하게 개선되는 것을 확인할 수 있었다(도 2 참조).
또한, Ovalbumin으로 유발시킨 만성 아토피 피부염 발생에 따른 증상은 dermatitis score 지표로 3.88점(5.00점 만점)에 달하여 심각한 수준인 것으로 나타났다. 반면, 비불멸화 줄기세포 정상배양액 처리 시에는 2.9~3.4점으로 아토피 피부염 증상이 약간 개선된 것으로 나타났고, 불멸화 줄기세포 정상배양액 처리 군은 2.83~3.12점으로 더 좋은 개선 효과를 보였다. 비에 비해, 불멸화 줄기세포 엑소좀 풍부 배양액을 단독 처리한 군에서는 양수줄기세포에서 1.3점, 신경줄기세포에서 1.22점, 희소돌기교전구세포에서 1.13점으로 우수한 억제효과를 나타냈다. 한편, 본 발명의 불멸화 줄기세포의 엑소좀 풍부 배양액에 본 발명의 장미꽃봉오리 메탄올 추출물의 에탄올 분획물을 50 μg/mL의 농도로 첨가한 혼합물 처리 시, 만성 아토피 피부염의 증상이 월등히 개선되어 불멸화 양수줄기세포에서 0.9점, 불멸화 신경줄기세포에서 0.6점, 불멸화 희소돌기교전구세포에서 0.5점으로 증상을 탁월하게 완화시킬 수 있는 것으로 나타났다(도 3 참조).
< 실시예 5>
만성 아토피 피부염 모델에서 본 발명의 불멸화 줄기세포 유래 엑소좀 풍부 배양액 및 장미꽃봉오리의 추출물 처리에 따른 혈청 IgE 및 히스타민 억제효과 분석
상기 <실시예 4>에서 사용한 마우스 실험군들로부터 부검 시 복대정맥에서 혈액을 채혈하였고, 채혈한 혈액을 3,000 rpm으로 20분간 원심분리하여 혈청을 얻었다. 그런 뒤, 혈청 내 total IgE는 mouse IgE ELISA kit을 이용하여 측정하였고, 히스타민 농도는 histamine ELISA kit을 이용하여 분석하였다.
그 결과, 도 4에 나타낸 바와 같이, ovalbumin으로 유발시킨 만성 아토피 피부염 발생에 따른 혈청 IgE 농도는 42 ng/mL까지 상승하는 것으로 나타났고, 반면 비불멸화 줄기세포 정상배양액을 처리한 경우에는 혈청 IgE 농도가 34~38 ng/mL로 조금 낮아진데 반하여, 불멸화 줄기세포 정상배양액 처리군에서는 28.6~33.5 ng/mL로 혈청 IgE 농도가 더 낮아진 것으로 나타났다. 또한, 불멸화 줄기세포 엑소좀 풍부 배양액을 처리한 경우, 양수줄기세포 유래 엑소좀 풍부 배양액 처리군에서는 11 ng/mL, 신경줄기세포 유래 엑소좀 풍부 배양액 처리군에서는 21 ng/mL, 희소돌기교전구세포 유래 엑소좀 풍부 배양액 처리군에서는 19 ng/mL로 우수한 억제효과를 나타냈다. 그러나 이러한 억제 효과에 비해 본 발명의 불멸화 줄기세포 유래 엑소좀 풍부 배양액에 장미꽃봉오리 메탄올 추출물의 에탄올 분획물을 50 μg/mL의 농도로 첨가하여 처리한 군에서는 혈청 IgE 농도의 억제 활성이 훨씬 상승하여, 각각 2 ng/mL (불멸화 양수줄기세포), 7 ng/mL (불멸화 신경줄기세포) 및 5 ng/mL (불멸화 희소돌기교전구세포)로 IgE 농도가 월등하게 낮아지는 것으로 나타났다.
또한, 도 5에 나타낸 바와 같이, 혈청 내 히스타민 분석 결과 ovalbumin 유발 아토피 피부염에서 8.7 ng/mL까지 상승했지만, 비불멸화 줄기세포 정상배양액 처리 시에는 7.1~8.1 ng/mL로 약간 낮아진데 반하여, 불멸화 줄기세포 정상배양액은 5.8~6.8 ng/mL로 더 좋은 억제효과를 나타냈다. 불멸화 줄기세포 엑소좀 풍부 배양액을 처리한 군의 경우, 양수줄기세포에서는 2.47 ng/mL, 신경줄기세포에서는 4.02 ng/mL, 희소돌기교전구세포에서는 3.97 ng/mL로 우수한 억제효과를 나타냈다. 한편, 이러한 억제 효과에 비해 본 발명의 불멸화 줄기세포 유래 엑소좀 풍부 배양액에 본 발명의 장미꽃봉오리 메탄올 추출물의 에탄올 분획물을 50 μg/mL의 농도로 첨가한 혼합물을 처리한 경우, 혈청 내 히스타민 억제 효과가 월등히 상승하여 양수줄기세포에서는 1.3 ng/mL, 신경줄기세포에서는 1.5 ng/mL 및 희소돌기교전구세포에서는 1.2 ng/mL로 히스타민 농도가 탁월하게 감소되어 있음을 알 수 있었다.
이러한 결과를 통해 본 발명자들은 본 발명에 따른 방법으로 수득한 불멸화 줄기세포 엑소좀 풍부 배양액 및 장미꽃봉오리의 추출물을 함유한 혼합물이 아토피 피부염 유발물질에 의한 비만세포 과립 분비, 피부 가려움증, 혈청 IgE 및 히스타민 농도를 억제 및 개선하는 효과가 우수하고, 나아가 피부염 증상 억제효과가 우수하여 아토피 피부염 개선을 위한 화장품 및 의약품의 제조에 유용하게 사용될 수 있음을 알 수 있었다.
< 실시예 6>
본 발명의 불멸화 줄기세포 유래 엑소좀 풍부 배양액 및 장미꽃봉오리 추출물의 피부 주름 개선효과 분석
피부 주름 개선효능은 콜라겐을 분해하여 소멸시키는 콜라게나제(collagenases) 효소 중의 하나인 MMP-1 (collagenase-1)에 대한 억제효능으로 평가하였다. Bovine tendon collagen (25 mg)을 tris(hydroxymethyl)-methyl-2-aminoethane sulfonate (TES) 완충액에 녹인 후 37℃에서 15분간 정치시켰다. 이어 collagenase type-1과 시료를 혼합하고 5시간 동안 반응시켰는데, 이때 상기 시료는 비불멸화 줄기세포 정상배양액, 불멸화 줄기세포 정상배양액, 본 발명에 따른 불멸화 줄기세포 엑소좀 풍부 배양액의 10배 농축액 각 1%, 또는 본 발명의 불멸화 줄기세포 엑소좀 풍부 배양액에 장미꽃봉오리 메탄올 추출물의 에탄올 분획물을 첨가한 혼합물을 사용하였다. 이후 상기 반응이 완료되면 반응액 0.2 mL를 취하여 1 mL의 A 버퍼[4% ninhydrin in Methyl Cellosolve® (2-methoxyethanol) + 0.2 M sodium citrate with 0.71 mM stannous chloride, pH 0.5]에 첨가하고, 20분간 끓인 뒤 n-propanol을 첨가한 다음 15분간 정치시키고 600 nm에서의 흡광도를 측정하여 효소의 활성도를 분석하였다.
그 결과, 콜라겐을 분해하여 피부주름의 원인을 제공하는 효소인 MMP-1의 활성도에 대해, 비불멸화 양수줄기세포(AFSC)와 불멸화 양수줄기세포(CBNU-AFSC), 비불멸화 신경줄기세포(NSC)와 불멸화 신경줄기세포(CBNU-NSC), 비불멸화 희소돌기교전구세포(NSC.olig2)와 불멸화 희소돌기교전구세포(CBNU-NSC.olig2)로부터 수득한 줄기세포 배양액의 10배 농축액을 1%의 양으로 각각 처리한 결과, 비불멸화 줄기세포 정상배양액을 처리한 군은 17~29%의 MMP-1 억제활성을 보였고, 불멸화 줄기세포 정상배양액은 이보다 더 높은 37~47%의 MMP-1 억제활성을 보였다. 한편 불멸화 줄기세포의 엑소좀 풍부 배양액을 처리한 군에 대하여, 양수줄기세포의 경우에는 67% 억제 활성을, 신경줄기세포에서는 74%의 억제 활성을, 희소돌기교전구세포에서는 75%의 억제 활성을 보였다. 그러나 상기 결과들에 비해 본 발명의 불멸화 줄기세포 엑소좀 풍부 배양액에 본 발명의 장미꽃봉오리 추출물(메탄올 추출물의 에탄올 분획물)을 50 μg/mL의 농도로 첨가한 혼합물을 처리한 경우, MMP-1 억제 효과가 훨씬 상승하여 양수줄기세포의 경우에는 87%, 신경줄기세포에서는 89% 및 희소돌기교전구세포에서는 84%로 MMP-1에 대한 탁월한 억제효과를 나타내었다(도 6 참조).
이러한 결과를 통해, 본 발명의 방법으로 수득한 불멸화 줄기세포의 엑소좀 풍부 배양액 및 장미꽃봉오리 추출물을 함께 사용할 경우, MMP-1에 대한 우수한 억제 활성을 나타내어 피부 주름 개선을 위한 용도에 유용하게 사용될 수 있음을 알 수 있었다.
< 실시예 7>
본 발명의 불멸화 줄기세포 유래 엑소좀 풍부 배양액 및 장미꽃봉오리 추출물의 피부 미백효과 분석
<7-1> 티로시나제 억제 효능
티로신(tyrosine)으로부터 멜라닌 생산에 관여하는 효소인 티로시나제(tyrosinase)에 대한 억제효능 평가를 위해, 시험관에 0.1M PBS와 해당 시료 및 mushroom tyrosinase (1,500~2,000 U/mL)를 순서대로 넣고, 상기 용액에 1.5 mM tyrosine 용액을 첨가한 후, 37℃에서 15분 동안 반응시켰다. ELISA reader를 이용하여 490 nm에서의 흡광도로 효소의 활성도를 측정하였다. 이때 상기 시료로는 비불멸화 줄기세포 정상배양액, 불멸화 줄기세포 정상배양액, 본 발명에 따른 불멸화 줄기세포 엑소좀 풍부 배양액의 10배 농축액 각 1%, 본 발명의 불멸화 줄기세포 엑소좀 풍부 배양액과 본 발명의 장미꽃봉오리 메탄올 추출물의 에탄올 분획물(50 μg/mL)의 혼합물을 각각 사용하였다.
<7-2> 세포 내 멜라닌 생산 억제효능
Murine melanoma B16 F10 세포(멜라노사이트, melanocytes)를 10% FBS가 함유된 DMEM 배지에 1×105 cells/well로 접종한 후 37℃에서 세포가 well 바닥에 약 80% 이상 부착될 때까지 배양하였다. 배지를 제거하고 각각의 시료를 함유한 DMEM 배지로 교체한 후 72시간 동안 추가로 배양하였다. 이때 상기 시료는 상기 <7-1>에서 사용한 시료와 동일하다. 이후 세포를 회수하여 세포수를 측정한 후 10,000 rpm으로 10분간 원심분리한 다음, 상등액을 제거하고 펠렛을 확보하였다. 세포 펠렛을 60℃에서 건조한 후 10% DMSO (dimetyl sulfoxide)가 함유된 1M NaOH 용액(100 μL)으로 멜라닌을 용출시켰다. 이후 microplate reader로 490 nm에서 흡광도를 측정하여 세포수당 멜라닌의 양을 계산하였다.
그 결과, 티로신으로부터 멜라닌을 합성하여 색소침착의 원인을 제공하는 효소인 티로시나제의 활성도에 대한 분석 결과, 비불멸화 양수줄기세포(AFSC)와 불멸화 양수줄기세포(CBNU-AFSC), 비불멸화 신경줄기세포(NSC)와 불멸화 신경줄기세포(CBNU-NSC), 비불멸화 희소돌기교전구세포(NSC.olig2)와 불멸화 희소돌기교전구세포(CBNU-NSC.olig2)로부터 수득한 줄기세포 배양액의 10배 농축액을 1%의 양으로 처리한 경우, 비불멸화 줄기세포 정상배양액 처리군에서는 9~32%의 티로시나제 억제활성을 보였고, 불멸화 줄기세포 정상배양액을 처리한 군에서는 이보다 더 높은 25~56.5%의 티로시나제 억제 활성을 보였다. 비에 비해, 불멸화 줄기세포의 엑소좀 풍부 배양액을 처리한 군의 경우, 양수줄기세포에서는 45%, 신경줄기세포에서는 79%, 희소돌기교전구세포에서는 73%의 우수한 억제효과를 보였다. 그러나, 이에 비해 본 발명에 따른 불멸화 줄기세포의 엑소좀 풍부 배양액에 본 발명의 장미꽃봉오리 메탄올 추출물의 에탄올 분획물을 50 μg/mL 농도로 첨가하여 처리한 군에서는 티로시나제 억제 활성이 훨씬 상승하여 양수줄기세포에서는 79%, 신경줄기세포에서는 92% 및 희소돌기교전구세포에서는 87%의 탁월한 억제효과를 나타내었다(도 7 참조).
또한, 멜라노사이트에서의 직접적인 멜라닌 생산에 대한 억제효능을 분석한 결과, 비불멸화 줄기세포 정상배양액 처리 군에서는 13~34%의 억제효과를 보인 데 비해, 불멸화 줄기세포 정상배양액 처리군에서는 더 높은 35~51%의 억제효과를 나타냈다. 비에 비해, 불멸화 줄기세포 엑소좀 풍부 배양액은 양수줄기세포에서 54%, 신경줄기세포에서 69%, 희소돌기교전구세포에서 72%의 우수한 억제효과를 나타냈으며, 특히 본 발명의 불멸화 줄기세포의 엑소좀 풍부 배양액에 본 발명의 장미꽃봉오리 메탄올 추출물의 에탄올 분획물을 50 μg/mL의 농도로 추가하여 처리한 군에서는 멜라닌 생성 억제 효과가 월등히 상승하여 각각 양수줄기세포에서 83%, 신경줄기세포에서 89% 및 희소돌기교전구세포에서 94%의 탁월한 멜라닌 억제효과를 나타내었다(도 8 참조).
따라서 이러한 결과를 통해 본 발명자들은 본 발명에 따른 방법으로 수득한 불멸화 줄기세포 엑소좀 풍부 배양액과 장미꽃봉오리 추출물을 함께 사용할 경우, 티로시나제의 활성 및 멜라노사이트로부터의 멜라닌 생성을 동시에 매우 우수하게 억제할 수 있는 바, 이들을 피부 미백을 위한 화장품의 제조에 유용하게 사용될 수 있음을 알 수 있었다.
이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.
한국생명공학연구원 KCTC12634BP 20140725 한국생명공학연구원 KCTC12635BP 20140725 한국생명공학연구원 KCTC12636BP 20140725

Claims (22)

  1. 불멸화 줄기세포 유래 엑소좀 풍부 배양액 및 장미꽃봉오리 추출물을 유효성분으로 포함하는, 기능성 화장료 조성물.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 불멸화 줄기세포는 불멸화 양수줄기세포, 불멸화 신경줄기세포 또는 불멸화 희소돌기교전구세포인 것을 특징으로 하는, 기능성 화장료 조성물.
  3. 제2항에 있어서,
    상기 불멸화 양수줄기세포는 불멸화 양수줄기세포인 CBNU-AFSC 세포주 (기탁번호: KCTC12634BP)이고, 상기 불멸화 신경줄기세포는 불멸화 신경줄기세포인 CBNU-NSC 세포주 (기탁번호: KCTC12635BP)이고, 상기 불멸화 희소돌기교전구세포는 불멸화 희소돌기교전구세포인 CBNU-NSC.olig2 세포주 (기탁번호: KCTC12636BP)인 것을 특징으로 하는, 기능성 화장료 조성물.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 불멸화 줄기세포 유래 엑소좀 풍부 배양액은 불멸화 줄기세포를 함유한 배양액에 TNF-α 및 인터페론 감마(IFN-γ)를 처리하고, 1~5%의 저산소농도 조건 하에서 12~72시간 배양하여 수득한 것을 특징으로 하는, 기능성 화장료 조성물.
  5. 제4항에 있어서,
    상기 TNF-α는 3~100 ng/ml의 농도로 처리하고, 상기 인터페론 감마(IFN-γ)는 1~10 U/ml의 농도로 처리하는 것을 특징으로 하는, 기능성 화장료 조성물.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 불멸화 줄기세포는 1x104~1x107 세포수인 것을 특징으로 하는, 기능성 화장료 조성물.
  7. 제1항에 있어서,
    상기 장미꽃봉오리 추출물은 건조하고 분쇄한 장미꽃봉오리에 메탄올을 첨가하고 초음파 처리하여 수득한 메탄올 초음파 추출물에 에탄올, 부탄올 및 에틸아세테이트로 이루어진 군 중에서 선택되는 어느 하나의 용매를 첨가하여 추출 및 분획화한 용매 분획물인 것을 특징으로 하는, 기능성 화장료 조성물.
  8. 제7항에 있어서,
    상기 메탄올은 80% 메탄올을 사용한 것이고, 에탄올, 부탄올 또는 에틸아세테이트는 70% 에탄올, 70% 부탄올 또는 70% 에틸아세테이트를 사용한 것을 특징으로 하는, 기능성 화장료 조성물.
  9. 제1항에 있어서,
    상기 장미꽃봉오리는 아이스윙(Rosa hybrida Icewing), 온누리(Rosa hybrida Onnuri), 콜로라도(Rosa hybrida Colorado) 및 덩굴장미(Rosa multiflora Platyphylla thory)로 이루어진 군 중에서 선택되는 장미의 장미꽃봉오리인 것을 특징으로 하는, 기능성 화장료 조성물.
  10. 제1항에 있어서,
    상기 화장료 조성물은 아토피 피부염 개선, 피부주름 개선 또는 미백 활성을 갖는 것을 특징으로 하는, 기능성 화장료 조성물.
  11. 제1항에 있어서,
    상기 화장료 조성물은 스킨로션, 스킨소프너, 스킨토너, 아스트린젠트, 로션, 밀크로션, 모이스쳐 로션, 영양로션, 마사지크림, 영양크림, 모이스처크림, 핸드크림, 파운데이션, 에센스, 영양에센스, 팩, 비누, 클렌징폼, 클렌징로션, 클렌징크림, 바디로션, 바디클렌저, 세안제, 트리트먼트, 미용액, 미용팩, 연고제, 겔제, 리니멘트제, 액제, 패치 및 분무제로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나의 제형인 것을 특징으로 하는, 기능성 화장료 조성물.
  12. (1) 불멸화 줄기세포를 함유한 배양액에 TNF-α 및 인터페론 감마(IFN-γ)를 동시에 처리하고, 1~5%의 저산소농도 조건 하에서 12~72시간 배양하여 불멸화 줄기세포 유래 엑소좀 풍부 배양액을 수득하는 단계;
    (2) 건조하고 분쇄한 장미꽃봉오리에 메탄올을 첨가하고 초음파 처리하여 수득한 메탄올 초음파 추출물에 에탄올, 부탄올 및 에틸아세테이트로 이루어진 군 중에서 선택되는 어느 하나의 용매를 첨가하고 추출 및 분획화하여 장미꽃봉오리의 메탄올 추출물에 대한 용매 분획물을 수득하는 단계; 및
    (3) 상기 (1) 단계에서 수득한 불멸화 줄기세포 유래 엑소좀 풍부 배양액 및 상기 (2) 단계에서 수득한 장미꽃봉오리의 메탄올 추출물에 대한 용매 분획물을 혼합하는 단계를 포함하는,
    아토피 피부염 개선, 피부주름 개선 및 미백 활성을 갖는 화장료 조성물의 제조방법.
  13. 제12항에 있어서,
    상기 불멸화 줄기세포는 불멸화 양수줄기세포인 CBNU-AFSC 세포주 (기탁번호: KCTC12634BP), 불멸화 신경줄기세포인 CBNU-NSC 세포주 (기탁번호: KCTC12635BP) 또는 불멸화 희소돌기교전구세포인 CBNU-NSC.olig2 세포주 (기탁번호: KCTC12636BP)인 것을 특징으로 하는, 아토피 피부염 개선, 피부주름 개선 및 미백 활성을 갖는 화장료 조성물의 제조방법.
  14. 제12항에 있어서,
    상기 (1) 단계에서 TNF-α는 3~100 ng/ml의 농도로 처리하고, 상기 인터페론 감마(IFN-γ)는 1~10 U/ml의 농도로 처리하는 것을 특징으로 하는, 아토피 피부염 개선, 피부주름 개선 및 미백 활성을 갖는 화장료 조성물의 제조방법.
  15. 제12항에 있어서,
    상기 (3) 단계에서 불멸화 줄기세포 유래 엑소좀 풍부 배양액에 상기 (2) 단계에서 수득한 장미꽃봉오리의 메탄올 추출물에 대한 용매 분획물은 에탄올을 이용하여 수득한 분획물인 것을 특징으로 하는, 아토피 피부염 개선, 피부주름 개선 및 미백 활성을 갖는 화장료 조성물의 제조방법.
  16. 제12항에 있어서,
    상기 (3) 단계에서 장미꽃봉오리의 메탄올 추출물에 대한 용매 분획물은 5~100 ㎍/㎖의 농도로 첨가하여 혼합하는 것을 특징으로 하는, 아토피 피부염 개선, 피부주름 개선 및 미백 활성을 갖는 화장료 조성물의 제조방법.
  17. 제12항에 있어서,
    상기 (3) 단계에서 불멸화 줄기세포 유래 엑소좀 풍부 배양액은 화장료 조성물 총 중량%에 대하여 1~3 중량%로 첨가하여 혼합하는 것을 특징으로 하는, 아토피 피부염 개선, 피부주름 개선 및 미백 활성을 갖는 화장료 조성물의 제조방법.
  18. 불멸화 줄기세포 유래 엑소좀 풍부 배양액 및 장미꽃봉오리 추출물을 유효성분으로 포함하는, 아토피 피부염의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  19. 제18항에 있어서,
    상기 조성물은 비만세포 과립분비 억제, 혈청 내 면역글로불린 IgE 억제, 혈청 내 히스타민 억제 및 가려움증 개선 활성을 갖는 것을 특징으로 하는, 아토피 피부염의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  20. 불멸화 줄기세포 유래 엑소좀 풍부 배양액 및 장미꽃봉오리 추출물을 유효성분으로 포함하는, 색소 침착 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  21. 제20항에 있어서,
    상기 색소 침착 질환은 주근깨, 노인성 반점, 간반, 기미, 갈색 또는 흑점, 일광 색소반, 푸른 흑피증, 약물 사용 후의 과다색소침착, 조직경화치료법에 따른 후유증, 임신성 갈색반, 경구 피임약을 복용한 여성에서의 흑피증, 찰상 및 화상을 비롯한 상처 또는 피부염으로 인한 염증 후 과다 색소 침착, 광독성 반응 또는 다른 유사한 소형의 고정 색소성 병변 중 하나 이상인 것을 특징으로 하는, 색소 침착 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  22. 불멸화 줄기세포 유래 엑소좀 풍부 배양액 및 장미꽃봉오리 추출물을 유효성분으로 포함하는, 아토피 피부염 개선, 피부주름 개선 또는 미백 활성을 갖는 식품 조성물.
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