WO2022265150A1 - 불멸화 줄기세포의 엑소좀 풍부 배양액 및 보툴리눔 독소를 포함하는 기능성 조성물 - Google Patents

불멸화 줄기세포의 엑소좀 풍부 배양액 및 보툴리눔 독소를 포함하는 기능성 조성물 Download PDF

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stem cells
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exosome
skin
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김윤배
최은경
김태명
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충북대학교 산학협력단
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    • C12N2501/25—Tumour necrosing factors [TNF]

Definitions

  • the present invention relates to a functional composition
  • a functional composition comprising an exosome-rich culture medium of immortalized stem cells and a botulinum toxin.
  • the skin is the primary organ that protects or defends the human body, and is the widest organ covering the entire body surface and is composed of the epidermis, dermis, and subcutaneous tissue.
  • the stratum corneum which is located in the outermost layer of the epidermis, is composed of keratin and lipids, inhibits the penetration of harmful substances or evaporation of moisture, and protects the human body from bacteria or external stimuli.
  • the stratum corneum is shed every two weeks and is newly formed.
  • the skin is often damaged by various stress factors or stimuli such as ultraviolet rays.
  • various stress factors or stimuli such as ultraviolet rays.
  • the stratum corneum and the lipid layer are damaged by factors inducing skin damage, and transepidermal water loss rapidly increases.
  • skin dryness, wrinkle formation, itching, and inflammation due to bacterial infection may occur.
  • Human keratinocytes can produce and release various cytokines, including IL-1 ⁇ , IL-6, IL-8, and TNF- ⁇ , by external stimuli. mediates the inflammatory response.
  • Korean Patent Registration No. 10-2214378 relates to a composition for skin regeneration, wrinkle improvement, anti-inflammatory or skin whitening, wherein complanatoside A increases the total amount of collagen in skin fibroblasts, By inhibiting collagenase activity, increasing skin regeneration or wrinkle improvement effect, inhibiting nitric oxide production to exhibit anti-inflammatory effect, and reducing total amount of melanin to exhibit whitening effect, pharmaceutical composition, skin external preparation, cosmetic composition or health It is disclosed that it can be used as a functional food.
  • An object of the present invention is to provide a functional composition comprising an exosome-rich culture medium of immortalized stem cells and a botulinum toxin.
  • Another object of the present invention is to provide a use of an exosome-rich culture medium of immortalized stem cells and a botulinum toxin.
  • the present invention provides a functional composition comprising an exosome-rich conditioned medium (ERCM) of immortalized stem cells and a botulinum toxin.
  • ERCM exosome-rich conditioned medium
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for preventing or treating wounds comprising an exosome-rich culture medium of immortalized stem cells and a botulinum toxin as active ingredients.
  • the present invention provides a kit for preventing or treating wounds comprising a first composition containing an exosome-rich culture of immortalized stem cells as an active ingredient, and a second composition containing a botulinum toxin as an active ingredient.
  • the present invention provides a skin improvement method comprising administering an exosome-rich culture medium of immortalized stem cells and a botulinum toxin to a subject.
  • the present invention provides the use of an exosome-rich culture medium of immortalized stem cells and botulinum toxin for use in the preparation of a composition for skin improvement.
  • the present invention provides a method for preventing, improving or treating a wound comprising administering an exosome-rich culture medium of immortalized stem cells and a botulinum toxin to a subject.
  • the present invention provides a use of an exosome-rich culture medium of immortalized stem cells and a botulinum toxin for use in the manufacture of a drug for preventing, improving or treating wounds.
  • the functional composition according to the present invention inhibits the degradation of collagen and elastin, promotes synthesis, improves wrinkles, and promotes cell regeneration, thereby improving wrinkles, skin regeneration, improving skin elasticity, inhibiting skin aging, and suppressing wrinkles. It can be usefully used as a functional material for the back or for wound treatment.
  • FIG. 1 is a diagram showing the result of confirming CD9, an exosome marker present in an exosome-rich culture medium prepared in one embodiment of the present invention.
  • Figure 2 is a graph of the results of confirming the content of growth factors and neurotrophic factors present in the exosome-rich culture medium prepared in one embodiment of the present invention (* indicates a significant difference compared to the normal culture medium).
  • FIG 3 is a graph showing the effect of inhibiting the activity of the collagenase MMP-1 by the exosome-rich culture medium prepared in one embodiment of the present invention and botulinum toxin type A (* indicates a significant difference compared to normal activity). ).
  • FIG. 4 is a graph showing the effect of inhibiting the activity of the elastin-degrading enzyme MMP-12 by the exosome-rich culture medium prepared in one embodiment of the present invention and botulinum toxin type A (* indicates a significant difference compared to normal activity). ).
  • FIG 5 is a graph showing the effect of promoting collagen synthesis by the exosome-rich culture medium prepared in one embodiment of the present invention and botulinum toxin type A (* indicates a significant difference compared to normal culture conditions).
  • FIG. 6 is a graph showing the effect of promoting elastin synthesis by the exosome-rich culture medium prepared in one embodiment of the present invention and botulinum toxin type A (* indicates a significant difference compared to normal culture conditions).
  • FIG. 7 is a diagram showing the results of photographing the effect of improving skin wrinkles by the exosome-rich culture solution prepared in one embodiment of the present invention and botulinum toxin type A.
  • FIG 8 is a graph showing the quantitative results of the skin wrinkle improvement effect by the exosome-rich culture medium prepared in one embodiment of the present invention and botulinum toxin type A (* indicates a significant difference compared to UVB-induced skin wrinkles). ).
  • FIG. 9 is a diagram showing the result of photographing the skin regeneration effect by the exosome-rich culture solution prepared in one embodiment of the present invention and botulinum toxin type A.
  • the present invention provides a functional composition comprising an exosome-rich conditioned medium (ERCM) of immortalized stem cells and a botulinum toxin.
  • ERCM exosome-rich conditioned medium
  • the term 'stem cell' refers to an undifferentiated cell that is relatively less developed and has the ability to differentiate into a cell of a specific tissue.
  • Stem cells can be divided into pluripotent stem cells, multipotent stem cells, or unipotent stem cells based on their differentiation ability.
  • the stem cells can be classified into embryonic stem cells, adult stem cells, or induced pluripotent stem cells (iPSC) prepared from human somatic cells, depending on the cell of origin.
  • the stem cells according to the present invention may be adult stem cells.
  • adult stem cells refer to undifferentiated cells that are present in adult tissues or organs, capable of differentiating into desired cells, and capable of self-renewal.
  • the stem cells according to the present invention may be amniotic fluid-derived adult stem cells.
  • Immortalization' refers to cells that can continuously proliferate without going through normal cell aging and destruction processes in the process of cell subculture.
  • the proliferative capacity of cells decreases during subculture and the content of active ingredients in the culture medium decreases.
  • Immortalized cells can maintain constant proliferation capacity and active ingredient contents in the culture medium.
  • Immortalized stem cells according to the present invention can be prepared according to methods well known in the art. In addition, the preparation may be appropriately modified by a person skilled in the art to maximize desired properties of immortalized stem cells.
  • the immortalized stem cells according to the present invention may be immortalized human amniotic fluid-derived stem cells, and specifically, the immortalized stem cells may be cells deposited under Accession No. KCTC12634BP.
  • the term 'exosome-rich conditioned medium (ERCM)' refers to a culture medium obtained by culturing immortalized stem cells having the above-described characteristics. A method of culturing immortalized stem cells to obtain a culture solution having an increased content of exosomes is well known in the art.
  • the term 'exosome' refers to membrane-structured extracellular vesicles (EVs) secreted from various types of cells.
  • the exosomes bind to other cells or tissues and perform various functions such as delivering membrane components, proteins, and RNA, and may generally have an average diameter of about 50 to 200 nm.
  • the exosome can be identified using a marker protein included therein.
  • the marker protein may include all kinds of marker proteins known in the art, and specifically, the marker protein may be CD9.
  • the exosome-rich culture medium according to the present invention may be a culture medium obtained by culturing immortalized stem cells in a culture medium containing TNF- ⁇ .
  • the TNF- ⁇ is 3 to 100 ng / ml, 3 to 90 ng / ml, 3 to 80 ng / ml, 3 to 60 ng / ml, 10 to 100 ng / ml, 10 to 90 ng / ml, 10 to 80 ng/mL, 10 to 70 ng/mL, 10 to 60 ng/mL, 20 to 100 ng/mL, 20 to 90 ng/mL, 20 to 80 ng/mL, 20 to 70 ng/mL, 20 to 60 ng/mL, 30-100 ng/mL, 30-90 ng/mL, 30-80 ng/mL, 30-70 ng/mL, 30-60 ng/mL, 40-100 ng/mL, 40-90 ng/ml, 40 to 80 ng
  • the exosome-rich culture medium can be obtained by culturing immortalized stem cells under low oxygen concentration.
  • the low oxygen concentration may be a concentration lower than about 20%, which is an average oxygen concentration under a normal atmosphere.
  • the low oxygen concentration is 10% or less, 0.1 to 10%, 0.1 to 8%, 0.1 to 5%, 0.1 to 3%, 0.5 to 10%, 0.5 to 8%, 0.5 to 5%, 0.5 to 3% %, 1 to 10%, 1 to 8%, 1 to 5% or 1 to 3%.
  • the culture is 1 to 80 hours, 1 to 70 hours, 1 to 60 hours, 1 to 50 hours, 10 to 80 hours, 10 to 70 hours, 10 to 60 hours, 10 to 50 hours, 20 to 80 hours, 20 to 70 hours, 20 to 60 hours, 20 to 50 hours, 30 to 80 hours, 30 to 70 hours, 30 to 60 hours, 30 to 50 hours, 40 to 80 hours, 40 to 70 hours, 40 to 60 hours or It may be performed for 40 to 50 hours.
  • the exosome-rich culture medium according to the present invention may be filtered or concentrated to remove impurities, if necessary.
  • the exosome-rich culture medium may contain growth factors and neurotrophic factors.
  • the growth factors and neurotrophic factors may include all types of factors known in the art, and specifically, the growth factors and neurotrophic factors include bFGF (basic fibroblast growth factor), EFG (elongation factor G) , insulin-like growth factor (IGF), vascular endothelial growth factor (VEGF), platelet-derived growth factor (PDGF), and transforming growth factor- ⁇ (TGF- ⁇ ). More specifically, the growth factors and neurotrophic factors may include bFGF, EFG, IGF, VEGF, PDGF and TGF- ⁇ .
  • the term 'botulinum toxin' refers to a toxin protein having a molecular weight of about 150 kDa produced by a gram-positive anaerobic bacterium called Clostridium botulinum .
  • Clostridium botulinum There are a total of seven serotypes of the botulinum toxin, type A, type B, type C, type D, type E, type F, and type G, and depending on each serotype, the action site in the nerve may be different.
  • the botulinum toxin may be at least one selected from the group consisting of botulinum toxin types A, B, C, D, E, F, and G, and more specifically, botulinum toxin type A. .
  • the botulinum toxin type A can block the secretion of acetylcholine from nerve terminals of the cholinergic nervous system distributed in the skin to the neuromuscular junction.
  • the botulinum toxin may include isolated, extracted, or commercially available botulinum toxin, and may also include botulinum toxin variants or fusion proteins.
  • the variant of the botulinum toxin may include a part thereof as long as it has the activity of the botulinum toxin.
  • the variant may be a chemical or functional modification of one or more amino acid residues of the botulinum toxin.
  • the modification may be one or more amino acid residues being substituted, deleted or modified.
  • the composition according to the present invention contains 1 to 200 units, 1 to 150 units, 1 to 100 units, 1 to 50 units, 1 to 30 units, 1 to 10 units, 3 to 200 units, 3 to 150 units, 3 to 100 units , 3 to 50 units, 3 to 30 units or 3 to 10 units.
  • the composition according to the present invention uses a botulinum toxin mixed with or in combination with an exosome-rich culture medium of immortalized stem cells, so that a significant effect can be confirmed even when used in a small amount, and skin sagging, local paralysis, Side effects such as loss of muscle function can be eliminated.
  • the composition according to the present invention may be a composition for improving skin.
  • the skin improvement may be to improve skin damaged by various stimulants such as ultraviolet rays, aging, and stress.
  • the skin improvement may be to improve the skin by any one or more functions selected from the group consisting of skin regeneration, wrinkle improvement, skin elasticity improvement, skin aging inhibition, and wrinkle inhibition.
  • the composition may be a health functional food, a cosmetic composition or an external preparation for skin.
  • composition according to the present invention may be a health functional food for skin improvement, a cosmetic composition, or an external skin preparation.
  • the health functional food may be added to food as its active ingredient, the composition according to the present invention, or used together with other food or food ingredients.
  • the content of the active ingredient added may be determined according to the purpose, and may generally be 0.01 to 90 parts by weight of the total food weight.
  • the shape and type of the health functional food is not particularly limited.
  • the health functional food may be in the form of tablets, capsules, powders, granules, liquids and pills.
  • the health functional food may include various flavors, sweeteners, or natural carbohydrates as additional ingredients.
  • the sweetener may be a natural or synthetic sweetener, and examples of the natural sweetener include thaumatin and stevia extract.
  • examples of synthetic sweeteners include saccharin and aspartame.
  • the natural carbohydrates may be monosaccharides, disaccharides, polysaccharides, oligosaccharides and sugar alcohols.
  • the health functional food of the present invention in addition to the above-mentioned additional ingredients, nutrients, vitamins, electrolytes, flavoring agents, coloring agents, pectanes and salts thereof, alginic acid and salts thereof, organic acids, protective colloidal thickeners, pH adjusting agents, stabilizers, and preservatives , glycerin, alcohol, and the like may be further included. These components may be used independently or in combination.
  • the ratio of the additives may be selected in the range of 0.01 to 0.1 parts by weight per 100 parts by weight of the composition of the present invention.
  • the cosmetic composition may include 0.1 to 50% by weight, specifically 1 to 10% by weight of the composition according to the present invention, which is an active ingredient thereof.
  • the cosmetic composition may be applied directly to the skin for the purpose of skin improvement.
  • the cosmetic composition may be formulated into a conventional cosmetic formulation.
  • the cosmetic composition may be formulated as a solution, suspension, emulsion, paste, gel, lotion, cream, powder, soap, surfactant-containing cleansing, oil, powder foundation, emulsion foundation, wax foundation and spray.
  • it may be flexible lotion, nourishing lotion, nourishing cream, massage cream, essence, eye cream, cleansing cream, cleansing foam, cleansing water, pack, spray or powder.
  • the formulation of the cosmetic composition of the present invention is a paste, cream or gel, animal oil, vegetable oil, wax, paraffin, starch, tragacanth, cellulose derivative, polyethylene glycol, silicone, bentonite, silica, talc, zinc oxide or It may contain mixtures thereof.
  • the formulation of the cosmetic composition is a powder or spray, it may include lactose, talc, silica, aluminum hydroxide, calcium silicate, polyamide powder, or a mixture thereof.
  • chlorofluorohydrocarbon, propane/butane, or dimethyl ether may be further included.
  • a solvent, a solvating agent, an emulsifying agent, or a mixture thereof may be included as a carrier.
  • a solvent, a solvating agent, an emulsifying agent, or a mixture thereof examples thereof include water, ethanol, isopropanol, ethyl carbonate, ethyl acetate, benzyl alcohol, benzyl benzoate, propylene glycol, 1,3-butyl glycol oil, glycerol aliphatic esters, polyethylene glycol, and sorbitan fatty acid esters.
  • the formulation of the cosmetic composition of the present invention is a suspension
  • a liquid diluent such as water, ethanol or propylene glycol, an ethoxylated isostearyl alcohol, a suspending agent such as polyoxyethylene sorbitol ester and polyoxyethylene sorbitan ester, microcrystalline cellulose, aluminum metahydroxide, bentonite, agar, tragacanth or mixtures thereof.
  • the formulation of the cosmetic composition is surfactant-containing cleansing, aliphatic alcohol sulfate, aliphatic alcohol ether sulfate, sulfosuccinic acid monoester, isethionate, imidazolinium derivative, methyl taurate, sarcosinate, fatty acid as a carrier amide ether sulfates, alkalamidobetaines, fatty alcohols, fatty acid glycerides, fatty acid diethanolamides, vegetable oils, lanolin derivatives, ethoxylated glycerol fatty acid esters, or mixtures thereof.
  • the cosmetic composition of the present invention may include antioxidants, stabilizers, solubilizers, moisturizers, pigments, fragrances, sunscreens, coloring agents, surfactants, or mixtures thereof as adjuvants.
  • the adjuvant may be used as long as it is a material commonly used in the preparation of cosmetic compositions.
  • the skin external preparation may include a pharmaceutically acceptable carrier and excipient.
  • the carrier and excipient may include a preservative, a stabilizer, a hydration agent, an emulsification accelerator, and a buffer.
  • the excipient may be lactose, dextrin, starch, mannitol, sorbitol, glucose, saccharose, microcrystalline cellulose, gelatin, polyvinylpyrrolidone, or a mixture thereof.
  • the skin external preparation may be appropriately prepared according to a method well known in the art.
  • the skin external preparation may be prepared in the form of powder, gel, ointment, cream, liquid and aerosol.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for preventing or treating wounds comprising an exosome-rich culture medium of immortalized stem cells and a botulinum toxin as active ingredients.
  • the exosome-rich culture medium and botulinum toxin of immortalized stem cells included as active ingredients in the pharmaceutical composition according to the present invention may have the characteristics as described above.
  • the stem cells may be human amniotic fluid-derived stem cells, and specifically, the immortalized stem cells may be deposited under accession number KCTC12634BP.
  • the exosome-rich culture medium may be a culture medium obtained by culturing immortalized stem cells in a culture medium containing TNF- ⁇ .
  • the exosome-rich culture medium may be cultured under low oxygen concentration.
  • the botulinum toxin may be at least one selected from the group consisting of botulinum toxin types A, B, C, D, E, F, and G, and may specifically be botulinum toxin type A.
  • the term 'wound' refers to a state in which a living body is damaged, and a tissue constituting an internal or external surface of a living body, for example, skin, muscle, nerve tissue, bone, soft tissue, internal organ or vascular tissue
  • This segmentation or destruction may include both pathological conditions.
  • the wounds include abrasions, lacerated wounds, stab wounds, cut wounds, cut wounds, decubitus wounds, swollen wounds, tissue destruction by irradiation, penetrating wounds, gunshot wounds, burns, frostbite, surgical wounds, sutured areas after plastic surgery, chemical wounds, and the like. can include
  • the exosome-rich culture medium of the immortalized stem cells and the botulinum toxin may be formulated as individual components or formulated by mixing them.
  • the pharmaceutical composition according to the present invention may contain 0.1 to 95% by weight of an exosome-rich culture medium of immortalized stem cells and botulinum toxin, which are active ingredients, based on the total weight of the composition.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may further include at least one active ingredient exhibiting the same or similar function in addition to the above active ingredient.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may include carriers, diluents, excipients, or mixtures thereof commonly used in biological preparations.
  • Any pharmaceutically acceptable carrier may be used as long as it is suitable for delivering the composition in vivo.
  • the carrier is described in Merck Index, 13th ed., Merck & Co. Inc., saline, sterile water, Ringer's solution, dextrose solution, maltodextrin solution, glycerol, ethanol or mixtures thereof.
  • conventional additives such as antioxidants, buffers, bacteriostatic agents and the like may be added as needed.
  • diluents or excipients such as commonly used fillers, extenders, binders, wetting agents, disintegrants, and surfactants may be added.
  • the composition of the present invention may be formulated as an oral preparation or a parenteral preparation.
  • Oral preparations may include solid preparations and liquid preparations.
  • the solid preparation may be a tablet, pill, powder, granule, capsule or troche, and such a solid preparation may be prepared by adding at least one excipient to the composition.
  • the excipient may be starch, calcium carbonate, sucrose, lactose, gelatin or mixtures thereof.
  • the solid preparation may include a lubricant, examples of which include magnesium stearate and talc.
  • the liquid formulation may be a suspension, internal solution, emulsion or syrup. In this case, the liquid formulation may include excipients such as wetting agents, sweeteners, fragrances, and preservatives.
  • the parenteral formulation may include injections, suppositories, powders for respiratory inhalation, aerosols for sprays, powders and creams, and the like.
  • the injection may include a sterilized aqueous solution, a non-aqueous solvent, a suspending agent, an emulsion, and the like.
  • vegetable oils such as propylene glycol, polyethylene glycol, and olive oil, or injectable esters such as ethyl oleate may be used as non-aqueous solvents or suspending solvents.
  • the present invention provides a kit for preventing or treating wounds comprising a first composition containing an exosome-rich culture of immortalized stem cells as an active ingredient, and a second composition containing a botulinum toxin as an active ingredient.
  • the exosome-rich culture medium and botulinum toxin of immortalized stem cells included as active ingredients in the treatment kit according to the present invention may have characteristics as described above.
  • the stem cells may be human amniotic fluid-derived stem cells, and specifically, the immortalized stem cells may be deposited under accession number KCTC12634BP.
  • the exosome-rich culture medium may be a culture medium obtained by culturing immortalized stem cells in a culture medium containing TNF- ⁇ .
  • the exosome-rich culture medium may be cultured under low oxygen concentration.
  • the botulinum toxin may be at least one selected from the group consisting of botulinum toxin types A, B, C, D, E, F, and G, and may specifically be botulinum toxin type A.
  • the wound may have characteristics as described above.
  • the first composition and the second composition may have the characteristics of a pharmaceutical composition as described above. In addition, they may be administered concurrently, sequentially or in reverse order. Specifically, the exosome-rich culture medium of immortalized stem cells and botulinum toxin may be administered simultaneously. In addition, the botulinum toxin may be administered after administration of the exosome-rich culture medium of the immortalized stem cells. Furthermore, after administration of the botulinum toxin, an exosome-rich culture solution of the immortalized stem cells may be administered. At this time, when the exosome-rich culture medium of immortalized stem cells and the botulinum toxin are administered sequentially or in reverse order, the interval between administrations can be appropriately adjusted by a person skilled in the art.
  • the present invention provides a skin improvement method comprising administering an exosome-rich culture medium of immortalized stem cells and a botulinum toxin to a subject.
  • the exosome-rich culture medium and botulinum toxin of immortalized stem cells used as active ingredients in the skin improvement method according to the present invention may have characteristics as described above.
  • the stem cells may be human amniotic fluid-derived stem cells, and specifically, the immortalized stem cells may be deposited under accession number KCTC12634BP.
  • the exosome-rich culture medium may be a culture medium obtained by culturing immortalized stem cells in a culture medium containing TNF- ⁇ .
  • the exosome-rich culture medium may be cultured under low oxygen concentration.
  • the botulinum toxin may be at least one selected from the group consisting of botulinum toxin types A, B, C, D, E, F, and G, and may specifically be botulinum toxin type A.
  • the subject may be a mammal, specifically a human.
  • the administration may be oral or parenteral administration depending on the desired method.
  • Parenteral administration may include intraperitoneal, intrarectal, subcutaneous, intravenous, intramuscular or intrathoracic injection modes.
  • the parenteral administration may be applied to the skin.
  • the present invention provides the use of an exosome-rich culture medium of immortalized stem cells and botulinum toxin for use in the preparation of a composition for skin improvement.
  • the exosome-rich culture medium and botulinum toxin of immortalized stem cells used in the preparation of the composition for skin improvement according to the present invention may have characteristics as described above.
  • the stem cells may be human amniotic fluid-derived stem cells, and specifically, the immortalized stem cells may be deposited under accession number KCTC12634BP.
  • the exosome-rich culture medium may be a culture medium obtained by culturing immortalized stem cells in a culture medium containing TNF- ⁇ .
  • the exosome-rich culture medium may be cultured under low oxygen concentration.
  • the botulinum toxin may be at least one selected from the group consisting of botulinum toxin types A, B, C, D, E, F, and G, and may specifically be botulinum toxin type A.
  • the present invention provides a method for preventing, improving or treating a wound comprising administering an exosome-rich culture medium of immortalized stem cells and a botulinum toxin to a subject.
  • the exosome-rich culture medium and botulinum toxin of immortalized stem cells used in the method for preventing, improving or treating wounds according to the present invention may have the characteristics as described above.
  • the stem cells may be human amniotic fluid-derived stem cells, and specifically, the immortalized stem cells may be deposited under accession number KCTC12634BP.
  • the exosome-rich culture medium may be a culture medium obtained by culturing immortalized stem cells in a culture medium containing TNF- ⁇ .
  • the exosome-rich culture medium may be cultured under low oxygen concentration.
  • the botulinum toxin may be at least one selected from the group consisting of botulinum toxin types A, B, C, D, E, F, and G, and may specifically be botulinum toxin type A.
  • the subject may be a mammal, specifically a human.
  • the administration may be oral or parenteral administration depending on the desired method.
  • Parenteral administration may include intraperitoneal, intrarectal, subcutaneous, intravenous, intramuscular or intrathoracic injection modes.
  • the parenteral administration may be applied to the skin.
  • the administration may be administered in a pharmaceutically effective amount. This may vary depending on the type and severity of the disease, the activity of the drug, the patient's sensitivity to the drug, the administration time, the route of administration, the treatment period, and the drugs used simultaneously.
  • the active ingredient according to the present invention may be administered in an amount of 0.0001 to 1,000 mg/kg, specifically 0.001 to 500 mg/kg, and the administration may be once or several times a day.
  • administration may be performed alone or in combination with other therapeutic agents.
  • administration can be sequential or simultaneous.
  • the present invention provides a use of an exosome-rich culture medium of immortalized stem cells and a botulinum toxin for use in the manufacture of a drug for preventing, improving or treating wounds.
  • the exosome-rich culture medium and botulinum toxin of immortalized stem cells used in the manufacture of drugs for the prevention, improvement or treatment of wounds according to the present invention may have characteristics as described above.
  • the stem cells may be human amniotic fluid-derived stem cells, and specifically, the immortalized stem cells may be deposited under accession number KCTC12634BP.
  • the exosome-rich culture medium may be a culture medium obtained by culturing immortalized stem cells in a culture medium containing TNF- ⁇ .
  • the exosome-rich culture medium may be cultured under low oxygen concentration.
  • the botulinum toxin may be at least one selected from the group consisting of botulinum toxin types A, B, C, D, E, F, and G, and may specifically be botulinum toxin type A.
  • Immortalized stem cells were cultured to obtain an exosome-rich conditioned medium (ERCM) in the following manner.
  • ERCM exosome-rich conditioned medium
  • ⁇ 10 6 cells/ml of immortalized amniotic stem cells (accession number KCTC12634BP) were cultured using DMEM (Dulbecco's modified Eagle's medium) culture medium under conditions of 5% CO 2 and 37°C. After 24 hours, 50 ng/ml of TNF- ⁇ was added to the culture medium, and the culture medium was further cultured for 48 hours by lowering the oxygen concentration to 2%. After culturing, the culture medium was taken and filtered with a filter to remove impurities such as cells, and concentrated 30 times at low temperature to obtain an exosome-rich culture medium of immortalized stem cells (hereinafter referred to as 'exosome-rich culture medium' or 'ERCM').
  • Immortalized amniotic stem cells (Accession No. KCTC12634BP) were cultured in DMEM culture medium under conditions of 5% CO 2 and 37 ° C. The culture medium was taken and filtered through a filter to remove impurities such as cells, and concentrated 30 times at low temperature to immortalized stem cells. A culture medium (hereinafter 'normal culture medium' or 'CM') was obtained.
  • exosomes present in the exosome-rich culture medium obtained above was analyzed by confirming the expression of CD9, a spore of exosomes.
  • the CD9 expression level in the exosome-rich culture medium was significantly higher than about 50 times compared to the normal culture medium.
  • bFGF basic fibroblast growth factor
  • EFG elongation factor G
  • IGF insulin-like growth factor
  • VEGF vascular endothelial growth factor
  • PDGF platelet-derived growth factor
  • TGF- ⁇ transforming growth factor- ⁇
  • the expression level of growth factors and neurotrophic factors present in the exosome-rich culture medium was significantly higher than that of the normal culture medium.
  • bGFG, EFG, IGF, VEGF, and PDFG proteins increased about 10-fold or more, and in particular, the expression level of TGF- ⁇ protein increased about 17-fold or more.
  • the collagen degrading enzyme inhibitory effect of the obtained exosome-rich culture medium was confirmed through inhibition of MMP-1 (matrix metalloproteinase-1) protein activity.
  • reaction solution containing substrate (MCA-Lys-Pro-Leu-Gly-Leu-DPA-Ala-Arg-NH 2 ) and recombinant human MMP-1 protein (Cat. #M9195, Sigma-Aldrich), 100 ⁇ l/ml of exosome-rich culture medium and 5 units of botulinum toxin type A (Medytox, Korea) were added. Absorbance was measured for 5 minutes at 320 nm for excitation and 405 nm for emission.
  • substrate MCA-Lys-Pro-Leu-Gly-Leu-DPA-Ala-Arg-NH 2
  • recombinant human MMP-1 protein Cat. #M9195, Sigma-Aldrich
  • a normal control group without any treatment a botulinum toxin-treated group treated with only botulinum toxin, and a botulinum toxin and normal culture medium-treated group treated with botulinum toxin and normal culture medium were used.
  • the activity of the MMP-1 protein was calculated as a percentage based on the activity of the normal control group and is shown in FIG. 3 .
  • the elastin-degrading enzyme inhibitory effect of the obtained exosome-rich culture medium was confirmed through inhibition of MMP-12 (matrix metalloproteinase-12) protein activity.
  • the collagen synthesis promoting effect of the obtained exosome-rich culture medium was confirmed as follows.
  • CCD986SK (Thermo Fisher Scientific) cell line, a human dermal fibroblast cell line, was cultured in a conventional method using medium 106 culture medium.
  • the prepared cells were dispensed in a 6-well plate at 5 ⁇ 10 4 per well, and 100 ⁇ l/ml of exosome-rich culture medium and 5 units of botulinum toxin type A were added thereto. This was cultured for 72 hours, and the collagen fibers of the cultured cells were stained with Masson's Trichrome and observed under a microscope.
  • the cell culture medium was collected and ELISA was performed using a goat anti-type 1 collagen-UNLB antibody (Southern Biotech), and absorbance was measured at 450 nm to confirm the content of type 1 collagen.
  • control groups a normal control group treated with nothing, a botulinum toxin treated group treated with only botulinum toxin, and a botulinum toxin and normal culture medium treated group treated with botulinum toxin and normal culture medium were used.
  • a botulinum toxin treated group treated with only botulinum toxin a botulinum toxin treated group treated with only botulinum toxin
  • a botulinum toxin and normal culture medium treated group treated with botulinum toxin and normal culture medium were used.
  • microscopic observation and ELISA analysis results are shown in FIG. 5 .
  • collagen synthesis was not promoted when only botulinum toxin was treated, but collagen synthesis was significantly increased when exosome-rich culture medium was simultaneously treated with botulinum toxin. In particular, this effect was remarkably higher than that of the case of simultaneous treatment of botulinum toxin and normal culture medium.
  • the elastin synthesis promoting effect of the obtained exosome-rich culture medium was confirmed as follows.
  • the skin wrinkle improvement effect of the obtained exosome-rich culture medium was confirmed as follows.
  • UVB is irradiated with 1 minimum erythema dose (MED) in the first week, 2 MED in the second week, 3 MED in the third week, and 4 MED in the fourth to tenth weeks.
  • MED minimum erythema dose
  • Each irradiation induced skin wrinkles.
  • a mixture of 50 ⁇ l of the exosome-rich culture medium and 5 units of botulinum toxin type A was subcutaneously injected into the mice with skin wrinkles.
  • the injection was divided into a total of 5 locations at 1 cm intervals and injected in a circular shape, and wrinkles were observed on the 1st, 2nd and 4th weeks after the injection.
  • a control group a normal skin group treated with nothing, a UVB treated group treated with only UVB, a botulinum toxin treated group treated with only botulinum toxin, and a botulinum toxin and normal culture medium treated group treated with botulinum toxin and normal culture medium were used.
  • the wrinkles were replicated using a silicone polymer (CharmFlex® Impression Material), and the light and shade images were taken with a camera by fixing the incident angle of light to 20 degrees.
  • the roughness was analyzed using an image analysis program (Skin Visiometer SV600 software) from the photographed picture. As a result, the result of confirming the wrinkle score by analyzing the roughness of the skin in FIG. 7 is shown in FIG.
  • wrinkles formed by UVB irradiation continued at 11.7 points until 4 weeks after observation.
  • the score was greatly improved to 5.6 points after 1 day of treatment, but wrinkles were formed again with 7.5 points and 10.3 points after 2 weeks and 4 weeks, respectively.
  • the remodeling of wrinkles was significantly blocked, and in particular, when exosome-rich culture medium was treated with botulinum toxin, the wrinkle remodeling rate was 6.4 even after 4 weeks. was completely blocked, and the wrinkle improvement effect continued.
  • the anti-wrinkle effect is significantly increased and the effect is maintained for a long time, compared to the case of treating the botulinum toxin alone or together with the normal culture medium. And it was found.
  • the skin regeneration effect of the obtained exosome-rich culture medium was confirmed by a wound scratch assay method.
  • NHEK cell line (Guangdong BioCell Biotechnology Co., Ltd.), which is a human epidermal keratinocyte cell line, was cultured in a conventional manner using EpiLife (Gibco) culture medium.
  • the prepared cells were dispensed in a 6-well plate at 3 ⁇ 10 5 cells per well, and scratch wounds were induced with a 100 ⁇ l pipette tip.
  • 100 ⁇ l/ml of exosome-rich culture medium and 5 units of botulinum toxin type A were added thereto, followed by culture for 24 hours and observation.
  • control groups a normal control group without any treatment, a botulinum toxin-treated group treated with only botulinum toxin, and a botulinum toxin and normal culture medium-treated group treated with botulinum toxin and normal culture medium were used.
  • the degree of cell regeneration was quantitatively evaluated by photographing using a phase-contrast microscope. As a result, the results taken with a phase contrast microscope are shown in FIG. 9 .

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Abstract

본 발명은 불멸화 줄기세포의 엑소좀 풍부 배양액 및 보툴리눔 독소를 포함하는 기능성 조성물에 관한 것이다. 구체적으로, 본 발명에 따른 기능성 조성물은 콜라겐 및 엘라스틴의 분해를 억제하는 동시에 합성을 촉진하고, 주름을 개선시키며, 세포의 재생을 촉진함으로써, 주름개선, 피부재생, 피부탄력 개선, 피부노화 억제 및 주름발생 억제 등을 위한 기능성 소재나 창상 치료 용도에 유용하게 사용될 수 있다.

Description

불멸화 줄기세포의 엑소좀 풍부 배양액 및 보툴리눔 독소를 포함하는 기능성 조성물
본 발명은 불멸화 줄기세포의 엑소좀 풍부 배양액 및 보툴리눔 독소를 포함하는 기능성 조성물에 관한 것이다.
피부는 인체를 보호하거나 방어하는 1차 기관이면서, 신체 표면을 전체로 덮고 있는 가장 넓은 기관으로 표피, 진피 및 피하조직으로 구성된다. 이 중에서도 표피의 가장 바깥층에 위치하는 각질층은 각질과 지질로 구성되어 있으면서 유해물질의 침투나 수분증발을 억제하고, 박테리아나 외부 자극으로부터 인체를 보호한다. 각질층은 2주를 주기로 탈피되어 새로 형성된다.
피부는 다양한 스트레스 요인이나 자외선과 같은 자극에 의해 손상이 종종 일어나는데, 이와 같이 피부손상을 유도하는 인자들에 의해 각질층 및 지질층이 손상되고 경피 수분손실이 급격히 증가한다. 뿐만 아니라, 피부건조, 주름생성, 가려움증, 세균감염에 따른 염증이 발생하기도 한다. 사람의 각질형성 세포는 외부의 자극에 의해 IL-1α를 시작으로 IL-6, IL-8, TNF-α 등 다양한 사이토카인을 만들어 방출할 수 있는데, 이러한 사이토카인은 피부의 자극유발이나 국소적인 염증반응을 매개한다.
특히 자외선과 같은 외부자극에 의한 각질층의 손상이 반복되거나, 정상적인 각질층의 복원이 지연되면 피부노화가 가속화되면서 피부질환으로 진행될 수 있다. 외부손상에 의한 각질층의 신속한 복원은 피부건조, 피부노화, 가려움 등을 경감시킬 수 있으며, 이는 사람 각질형성세포의 정상적인 분화 및 증식을 유도하는 피부재생을 촉진함으로써 예방할 수 있다. 피부재생은 조직의 손상 크기나 정도에 따라 그 치유 기간이 달라진다. 치유는 지혈, 염증, 증식 및 리모델링의 4가지 개발적 과정이 순차적으로 조절되어 일어나는 과정이며 다양한 세포의 상호작용, 성장인자 및 사이토카인이 요구된다.
이와 관련하여, 대한민국 등록특허 제10-2214378호는 피부 재생, 주름 개선, 항염증 또는 피부 미백용 조성물에 관한 것으로, 컴플라나토사이드 에이(complanatoside A)가 피부 섬유아세포의 콜라겐 총량을 증가시키고, 콜라게나제 활성을 억제하며 피부 재생 또는 주름 개선 효과를 높이고, 산화질소 생성을 억제하여 항염증 효과를 나타내며, 멜라닌 총량을 감소시켜 미백 효과를 나타냄으로써, 약학적 조성물, 피부외용제, 화장료 조성물 또는 건강기능식품으로 사용할 수 있음을 개시하고 있다.
본 발명의 목적은 불멸화 줄기세포의 엑소좀 풍부 배양액 및 보툴리눔 독소를 포함하는 기능성 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 불멸화 줄기세포의 엑소좀 풍부 배양액 및 보툴리눔 독소의 용도를 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 불멸화 줄기세포의 엑소좀 풍부 배양액(exosome-rich conditioned medium, ERCM) 및 보툴리눔 독소를 포함하는 기능성 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 불멸화 줄기세포의 엑소좀 풍부 배양액 및 보툴리눔 독소를 유효성분으로 포함하는 창상의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 불멸화 줄기세포의 엑소좀 풍부 배양액을 유효성분으로 포함하는 제1 조성물, 및 보툴리눔 독소를 유효성분으로 포함하는 제2 조성물을 포함하는 창상의 예방 또는 치료용 키트를 제공한다.
또한, 본 발명은 불멸화 줄기세포의 엑소좀 풍부 배양액 및 보툴리눔 독소를 개체에 투여하는 단계를 포함하는 피부개선 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 피부 개선을 위한 조성물의 제조에 사용하기 위한 불멸화 줄기세포의 엑소좀 풍부 배양액 및 보툴리눔 독소의 용도를 제공한다.
또한, 본 발명은 불멸화 줄기세포의 엑소좀 풍부 배양액 및 보툴리눔 독소를 개체에 투여하는 단계를 포함하는 창상의 예방, 개선 또는 치료 방법을 제공한다.
나아가, 본 발명은 창상의 예방, 개선 또는 치료를 위한 약제의 제조에 사용하기 위한 불멸화 줄기세포의 엑소좀 풍부 배양액 및 보툴리눔 독소의 용도를 제공한다.
본 발명에 따른 기능성 조성물은 콜라겐 및 엘라스틴의 분해를 억제하는 동시에 합성을 촉진하고, 주름을 개선시키며, 세포의 재생을 촉진함으로써, 주름개선, 피부재생, 피부탄력 개선, 피부노화 억제 및 주름발생 억제 등을 위한 기능성 소재나 창상 치료 용도에 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에서 제조된 엑소좀 풍부 배양액 내 존재하는 엑소좀 표지자인 CD9을 확인한 결과 도면이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에서 제조된 엑소좀 풍부 배양액 내 존재하는 성장인자 및 신경영양인자의 함량을 확인한 결과 그래프이다(*표시는 정상 배양액 대비 유의한 차이를 나타냄).
도 3은 본 발명의 일 실시예에서 제조된 엑소좀 풍부 배양액 및 보툴리눔 독소 A형에 의한 콜라겐 분해효소 MMP-1의 활성 억제 효과를 확인한 결과 그래프이다(*표시는 정상 활성 대비 유의한 차이를 나타냄).
도 4는 본 발명의 일 실시예에서 제조된 엑소좀 풍부 배양액 및 보툴리눔 독소 A형에 의한 엘라스틴 분해효소 MMP-12의 활성 억제 효과를 확인한 결과 그래프이다(*표시는 정상 활성 대비 유의한 차이를 나타냄).
도 5는 본 발명의 일 실시예에서 제조된 엑소좀 풍부 배양액 및 보툴리눔 독소 A형에 의한 콜라겐 합성 촉진 효과를 확인한 결과 그래프이다(*표시는 정상 배양 조건 대비 유의한 차이를 나타냄).
도 6은 본 발명의 일 실시예에서 제조된 엑소좀 풍부 배양액 및 보툴리눔 독소 A형에 의한 엘라스틴 합성 촉진 효과를 확인한 결과 그래프이다(*표시는 정상 배양 조건 대비 유의한 차이를 나타냄).
도 7은 본 발명의 일 실시예에서 제조된 엑소좀 풍부 배양액 및 보툴리눔 독소 A형에 의한 피부 주름 개선 효과를 촬영한 결과 도면이다.
도 8은 본 발명의 일 실시예에서 제조된 엑소좀 풍부 배양액 및 보툴리눔 독소 A형에 의한 피부 주름 개선 효과를 정량적으로 나타낸 결과 그래프이다(*표시는 UVB로 유발된 피부주름 대비 유의한 차이를 나타냄).
도 9는 본 발명의 일 실시예에서 제조된 엑소좀 풍부 배양액 및 보툴리눔 독소 A형에 의한 피부 재생 효과를 촬영한 결과 도면이다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 불멸화 줄기세포의 엑소좀 풍부 배양액(exosome-rich conditioned medium, ERCM) 및 보툴리눔 독소를 포함하는 기능성 조성물을 제공한다.
본 명세서에서 사용된 용어, '줄기세포(stem cell)'는 상대적으로 발생이 덜된 미분화된 세포로서 특정 조직의 세포로 분화할 수 있는 능력을 지닌 세포를 의미한다. 줄기세포는 분화 능력을 기준으로 만능줄기세포(pluripotent stem cell), 다분화능 줄기세포(multipotent stem cell) 또는 단분화능 줄기세포(unipotent stem cell)로 나눌 수 있다. 또한, 상기 줄기세포는 기원이 되는 세포에 따라 배아 줄기세포(embryonic stem cell), 성체 줄기세포(adult stem cell) 또는 인간 체세포로부터 제조된 유도만능 줄기세포(induced pluripotent stem cell, iPSC)로 구분될 수 있다. 구체적으로, 본 발명에 따른 줄기세포는 성체 줄기세포일 수 있다. 상기 용어, 성체 줄기세포는 성체의 조직 또는 기관에 존재하고, 원하는 세포로 분화가 가능하며 자기복제(self-renew)를 할 수 있는 미분화된 세포를 의미한다. 일례로, 본 발명에 따른 줄기세포는 양수 유래 성체줄기세포일 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어, '불멸화(immortalization)'는 세포의 계대배양 과정에서 정상적인 세포 노화 및 파멸의 과정을 거치지 않고 지속적으로 증식할 수 있는 세포를 의미한다. 일반적으로, 세포는 계대배양하는 과정에서 증식능이 떨어지고 배양액 내 유효성분의 함량이 감소하는데, 불멸화된 세포는 증식능 및 배양액 내 유효성분의 함량을 일정하게 유지할 수 있다. 본 발명에 따른 불멸화 줄기세포는 통상의 기술분야에 잘 알려진 방법에 따라 제조될 수 있다. 또한, 상기 제조는 원하는 불멸화 줄기세포의 특성을 최대화하기 위해 통상의 기술자에 의해 적절히 변형될 수 있다. 일례로, 본 발명에 따른 불멸화 줄기세포는 불멸화된 인간 양수 유래의 줄기세포일 수 있고, 구체적으로, 상기 불멸화 줄기세포는 기탁번호 KCTC12634BP로 수탁된 세포일 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어, '엑소좀 풍부 배양액(exosome-rich conditioned medium, ERCM)'은 상기 서술한 바와 같은 특징을 갖는 불멸화 줄기세포를 배양하여 수득된 배양액을 의미한다. 불멸화 줄기세포를 배양하여 엑소좀의 함량이 증가된 배양액을 수득하는 방법은 통상의 기술분야에 잘 알려져 있다. 상기 용어, '엑소좀(exosome)'은 여러 종류의 세포로부터 분비되는 막 구조의 세포외소포체(extracellular vesicle, EV)를 의미한다. 상기 엑소좀은 다른 세포나 조직에 결합하여 막 구성요소, 단백질, RNA를 전달하는 등 다양한 기능을 하며, 일반적으로 약 50 내지 200 ㎚의 평균 직경을 가질 수 있다. 상기 엑소좀은 이에 포함되는 마커 단백질을 이용하여 확인할 수 있다. 상기 마커 단백질은 통상의 기술분야에 알려진 모든 종류의 마커 단백질을 포함할 수 있고, 구체적으로, 상기 마커 단백질은 CD9일 수 있다.
일례로, 본 발명에 따른 엑소좀 풍부 배양액은 TNF-α가 포함된 배양배지에서 불멸화 줄기세포를 배양함으로써 수득된 배양액일 수 있다. 이때, 상기 TNF-α는 3 내지 100 ng/㎖, 3 내지 90 ng/㎖, 3 내지 80 ng/㎖, 3 내지 60 ng/㎖, 10 내지 100 ng/㎖, 10 내지 90 ng/㎖, 10 내지 80 ng/㎖, 10 내지 70 ng/㎖, 10 내지 60 ng/㎖, 20 내지 100 ng/㎖, 20 내지 90 ng/㎖, 20 내지 80 ng/㎖, 20 내지 70 ng/㎖, 20 내지 60 ng/㎖, 30 내지 100 ng/㎖, 30 내지 90 ng/㎖, 30 내지 80 ng/㎖, 30 내지 70 ng/㎖, 30 내지 60 ng/㎖, 40 내지 100 ng/㎖, 40 내지 90 ng/㎖, 40 내지 80 ng/㎖, 40 내지 70 ng/㎖ 또는 40 내지 60 ng/㎖의 농도로 포함될 수 있다.
또한, 상기 엑소좀 풍부 배양액은 낮은 산소 농도하에서 불멸화 줄기세포를 배양함으로써 수득될 수 있다. 상기 낮은 산소 농도는 통상적인 대기하에서의 평균 산소농도인 약 20%보다 낮은 농도일 수 있다. 구체적으로, 상기 낮은 산소 농도는 10% 이하, 0.1 내지 10%, 0.1 내지 8%, 0.1 내지 5%, 0.1 내지 3%, 0.5 내지 10%, 0.5 내지 8%, 0.5 내지 5%, 0.5 내지 3%, 1 내지 10%, 1 내지 8%, 1 내지 5% 또는 1 내지 3%일 수 있다. 또한, 상기 배양은 1 내지 80시간, 1 내지 70시간, 1 내지 60시간, 1 내지 50시간, 10 내지 80시간, 10 내지 70시간, 10 내지 60시간, 10 내지 50시간, 20 내지 80시간, 20 내지 70시간, 20 내지 60시간, 20 내지 50시간, 30 내지 80시간, 30 내지 70시간, 30 내지 60시간, 30 내지 50시간, 40 내지 80시간, 40 내지 70시간, 40 내지 60시간 또는 40 내지 50시간 동안 수행될 수 있다.
본 발명에 따른 엑소좀 풍부 배양액은 필요에 따라 불순물을 제거하기 위해 여과되거나, 농축될 수 있다.
상기 엑소좀 풍부 배양액은 성장인자 및 신경영양인자를 포함할 수 있다. 일례로, 상기 성장인자 및 신경영양인자는 통상의 기술분야에 알려진 모든 종류의 인자를 포함할 수 있고, 구체적으로, 상기 성장인자 및 신경영양인자는 bFGF (basic fibroblast growth factor), EFG (elongation factor G), IGF (insulin-like growth factor), VEGF (vascular endothelial growth factor), PDGF (platelet-derived growth factor) 및 TGF-β (transforming growth factor-β)로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있다. 더욱 구체적으로, 상기 성장인자 및 신경영양인자는 bFGF, EFG, IGF, VEGF, PDGF 및 TGF-β를 포함할 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어, '보툴리눔 독소(botulinum toxin)'는 클로스트리디움 보툴리누스균(Clostridium botulinum)이라는 그람 양성 혐기성 박테리아에 의해 생성되는 약 150 kDa의 분자량을 갖는 독소 단백질을 의미한다. 상기 보툴리눔 독소는 A형, B형, C형, D형, E형, F형 및 G형의 총 7가지 혈청형(serotype)이 있으며, 각 혈청형에 따라 신경에서의 작용부위가 다를 수 있다. 구체적으로, 상기 보툴리눔 독소는 보툴리눔 독소 A형, B형, C형, D형, E형, F형 및 G형으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있고, 더욱 구체적으로 보툴리눔 독소 A형일 수 있다.
상기 보툴리눔 독소 A형은 피부에 분포하는 콜린성 신경계(cholinergic nervous system)의 신경 말단으로부터 신경근 접합부(neuromuscular junction)로의 아세틸콜린 분비를 차단할 수 있다.
상기 보툴리눔 독소는 분리된 것, 추출된 것 또는 시판되는 것을 모두 포함할 수 있으며, 보툴리눔 독소의 변이체 또는 융합 단백질도 모두 포함할 수 있다. 상기 보툴리눔 독소의 변이체는 보툴리눔 독소의 활성을 갖는 한 이의 일부를 포함하는 것일 수 있다. 또한, 상기 변이체는 보툴리눔 독소의 하나 이상의 아미노산 잔기에 화학적 또는 기능적 변형이 수반된 것일 수 있다. 일례로, 상기 변형은 하나 또는 그 이상의 아미노산 잔기가 치환, 결실 또는 변형된 것일 수 있다.
본 발명에 따른 조성물은 1 내지 200 유닛, 1 내지 150 유닛, 1 내지 100 유닛, 1 내지 50 유닛, 1 내지 30 유닛, 1 내지 10 유닛, 3 내지 200 유닛, 3 내지 150 유닛, 3 내지 100 유닛, 3 내지 50 유닛, 3 내지 30 유닛 또는 3 내지 10 유닛의 양으로 포함될 수 있다. 본 발명에 따른 조성물은 보툴리눔 독소를 불멸화 줄기세포의 엑소좀 풍부 배양액과 혼합 또는 병용으로 사용함으로써, 소량의 사용으로도 유의적인 효과를 확인할 수 있고, 과량의 보툴리눔 독소에 의한 피부늘어짐, 국소마비, 근육 기능상실 등의 부작용을 없앨 수 있다.
본 발명에 따른 조성물은 피부 개선용 조성물일 수 있다. 구체적으로, 상기 피부 개선은 자외선, 노화, 스트레스 등과 같은 다양한 자극인자에 의해 손상된 피부를 개선하는 것일 수 있다. 일례로, 상기 피부 개선은 피부재생, 주름개선, 피부탄력 개선, 피부노화 억제 및 주름발생 억제로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 기능에 의해 피부를 개선시키는 것일 수 있다. 또한, 상기 조성물은 건강기능식품, 화장료 조성물 또는 피부외용제일 수 있다.
즉, 본 발명에 따른 조성물은 피부 개선용 건강기능식품, 화장료 조성물 또는 피부외용제일 수 있다.
상기 건강기능식품은 이의 유효성분인 본 발명에 따른 조성물을 식품에 그대로 첨가하거나, 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용될 수 있다. 이때, 첨가되는 유효성분의 함량은 목적에 따라 결정될 수 있고, 일반적으로는 전체 식품 중량의 0.01 내지 90 중량부일 수 있다.
상기 건강기능식품의 형태 및 종류는 특별히 제한되지 않는다. 구체적으로, 상기 건강기능식품은 정제, 캅셀, 분말, 과립, 액상 및 환의 형태일 수 있다. 상기 건강기능식품은 추가성분으로서 여러 가지 향미제, 감미제 또는 천연 탄수화물을 포함할 수 있다. 상기 감미제는 천연 또는 합성 감미제일 수 있고, 천연 감미제의 예로는 타우마틴, 스테비아 추출물 등이 있다. 한편, 합성 감미제의 예로는 사카린, 아스파르탐 등이 있다. 또한, 상기 천연 탄수화물은 모노사카라이드, 디사카라이드, 폴리사카라이드, 올리고당 및 당알코올 등일 수 있다.
본 발명의 건강기능식품은 상기 서술한 추가성분 외에, 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙스탄 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올 등을 더 포함할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합으로 사용될 수 있다. 상기 첨가제의 비율은 본 발명의 조성물의 100 중량부당 0.01 내지 0.1 중량부의 범위에서 선택될 수 있다.
또한, 상기 화장료 조성물은 이의 유효성분인 본 발명에 따른 조성물을 0.1 내지 50 중량%, 구체적으로 1 내지 10 중량%로 포함할 수 있다. 상기 화장료 조성물은 피부개선을 목적으로 피부에 직접 도포될 수 있다.
상기 화장료 조성물은 통상적으로 제조되는 화장료 제형으로 제제화될 수 있다. 상기 화장료 조성물은 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 로션, 크림, 파우더, 비누, 계면활성제-함유 클렌징, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션 및 스프레이 등으로 제형화될 수 있다. 구체적으로는, 유연 화장수, 영양 화장수, 영양 크림, 마사지 크림, 에센스, 아이 크림, 클렌징크림, 클렌징 폼, 클렌징 워터, 팩, 스프레이 또는 파우더일 수 있다.
본 발명의 화장료 조성물의 제형이 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는 담체로서 동물성유, 식물성유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라가칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크, 산화아연 또는 이의 혼합물을 포함할 수 있다. 또한, 상기 화장료 조성물의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 하이드록시드, 칼슘 실리케이트, 폴리아미드 파우더 또는 이의 혼합물을 포함할 수 있다. 특히, 스프레이인 경우에는 추가로 클로로플루오로하이드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸에테르 등을 더 포함할 수 있다.
본 발명의 화장료 조성물의 제형이 용액 또는 유탁액인 경우에는 담체로서 용매, 용매화제, 유탁화제 또는 이의 혼합물을 포함할 수 있다. 이의 예로는, 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸카보네이트, 에틸아세테이트, 벤질알코올, 벤질벤조에이트, 프로필렌글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌글리콜, 소르비탄 지방산 에스테르 등이 있다.
본 발명의 화장료 조성물의 제형이 현탁액인 경우에는 담체로서 물, 에탄올 또는 프로필렌글리콜과 같은 액상의 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미세결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가, 트라가칸트 또는 이의 혼합물을 포함할 수 있다. 또한, 상기 화장료 조성물의 제형이 계면활성제 함유 클렌징인 경우에는 담체로서 지방족 알코올 설페이트, 지방족 알코올 에테르설페이트, 설포숙신산 모노에스테르, 이세티오네이트, 이미다졸리늄 유도체, 메틸타우레이트, 사르코시네이트, 지방산 아미드 에테르설페이트, 알칼아미도베타인, 지방족 알코올, 지방산 글리세리드, 지방산 디에탄올아미드, 식물성유, 라놀린 유도체, 에톡실화 글리세롤 지방산 에스테르 또는 이의 혼합물을 포함할 수 있다.
본 발명의 화장료 조성물은 담체 성분 이외에도, 보조제로서 항산화제, 안정화제, 용해화제, 보습제, 안료, 향료, 자외선 차단제, 발색제, 계면활성제 또는 이의 혼합물을 포함할 수 있다. 상기 보조제는 화장료 조성물의 제조에 통상적으로 사용되는 물질이라면 모두 사용가능하다.
또한, 상기 피부외용제는 약학적으로 허용가능한 담체 및 부형제를 포함할 수 있다. 상기 담체 및 부형제는 방부제, 안정화제, 수화제, 유화 촉진제 및 완충제 등을 포함할 수 있다. 구체적으로, 상기 부형제는 유당, 덱스트린, 전분, 만니톨, 소르비톨, 글루코스, 사카로스, 미세결정 셀룰로스, 젤라틴, 폴리비닐피롤리돈 또는 이의 혼합물일 수 있다. 상기 피부외용제는 당업계에 잘 알려진 방법에 따라 적절히 제조될 수 있다. 상기 피부외용제는 파우더, 젤, 연고, 크림, 액체 및 에어로졸의 형태로 제조될 수 있다.
또한, 본 발명은 불멸화 줄기세포의 엑소좀 풍부 배양액 및 보툴리눔 독소를 유효성분으로 포함하는 창상의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명에 따른 약학적 조성물에 유효성분으로 포함되는 불멸화 줄기세포의 엑소좀 풍부 배양액 및 보툴리눔 독소는 상기 서술한 바와 같은 특징을 가질 수 있다. 일례로, 상기 줄기세포는 인간 양수 유래의 줄기세포일 수 있고, 구체적으로 상기 불멸화 줄기세포는 기탁번호 KCTC12634BP로 수탁된 것일 수 있다. 또한, 상기 엑소좀 풍부 배양액은 불멸화 줄기세포를 TNF-α가 포함된 배양배지에서 배양하여 수득된 배양액일 수 있다. 또한, 상기 엑소좀 풍부 배양액은 낮은 산소 농도하에서 배양된 것일 수 있다.
한편, 상기 보툴리눔 독소는 보툴리눔 독소 A형, B형, C형, D형, E형, F형 및 G형으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있고, 구체적으로 보툴리눔 독소 A형일 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어, '창상(wound)'은 생체가 손상된 상태를 의미하며, 생체 내부 또는 외부 표면을 이루는 조직, 예를 들면 피부, 근육, 신경조직, 뼈, 연조직, 내부기관 또는 혈관조직이 분단 또는 파괴된 병리학적 상태를 모두 포함할 수 있다. 구체적으로, 상기 창상은 찰과상, 열상, 자상, 절상, 결출상, 욕창, 와창, 방사선 조사에 의한 조직의 파괴, 관통상, 총상, 화상, 동상, 수술상, 성형수술 후 봉합부위, 화학적 창상 등을 포함할 수 있다.
상기 불멸화 줄기세포의 엑소좀 풍부 배양액 및 보툴리눔 독소는 각각의 성분으로 제형화하거나, 이를 혼합하여 제형화하는 것을 모두 포함할 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 약학적 조성물은 조성물 전체 중량에 대하여 유효성분인 불멸화 줄기세포의 엑소좀 풍부 배양액 및 보툴리눔 독소를 0.1 내지 95 중량%로 포함할 수 있다. 또한, 본 발명의 약학적 조성물은 상기 유효성분 이외에 추가로 동일 또는 유사한 기능을 나타내는 유효성분을 1종 이상 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 생물학적 제제에 통상적으로 사용되는 담체, 희석제, 부형제 또는 이의 혼합물을 포함할 수 있다. 약학적으로 허용가능한 담체는 조성물을 생체 내에 전달하는데 적합한 것이면 모두 사용할 수 있다. 구체적으로, 상기 담체는 Merck Index, 13th ed., Merck & Co. Inc.에 기재된 화합물, 식염수, 멸균수, 링거액, 덱스트로스 용액, 말토덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 또는 이의 혼합물일 수 있다. 또한, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등과 같은 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다.
상기 조성물을 제제화하는 경우, 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 첨가할 수 있다.
본 발명의 조성물은 경구용 제제 또는 비경구용 제제로 제형화될 수 있다. 경구용 제제로는 고형 제제 및 액상 제제가 포함될 수 있다. 상기 고형 제제는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 또는 트로키제일 수 있고, 이러한 고형 제제는 상기 조성물에 적어도 하나 이상의 부형제를 첨가하여 조제할 수 있다. 상기 부형제는 전분, 탄산칼슘, 수크로스, 락토오스, 젤라틴 또는 이의 혼합물일 수 있다. 또한, 상기 고형 제제는 윤활제를 포함할 수 있고, 그 예로는 마그네슘 스티레이트, 탈크 등이 있다. 한편, 상기 액상 제제는 현탁제, 내용액제, 유제 또는 시럽제일 수 있다. 이때, 상기 액상 제제에는 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등과 같은 부형제가 포함될 수 있다.
상기 비경구용 제제는 주사제, 좌제, 호흡기 흡입용 분말, 스프레이용 에어로졸제, 파우더 및 크림 등을 포함할 수 있다. 상기 주사제는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁용제, 유제 등을 포함할 수 있다. 이때, 비수성용제 또는 현탁용제로서는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름이나, 에틸올레이트와 같이 주사가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다.
또한, 본 발명은 불멸화 줄기세포의 엑소좀 풍부 배양액을 유효성분으로 포함하는 제1 조성물, 및 보툴리눔 독소를 유효성분으로 포함하는 제2 조성물을 포함하는 창상의 예방 또는 치료용 키트를 제공한다.
본 발명에 따른 치료용 키트에 유효성분으로 포함되는 불멸화 줄기세포의 엑소좀 풍부 배양액 및 보툴리눔 독소는 상기 서술한 바와 같은 특징을 가질 수 있다. 일례로, 상기 줄기세포는 인간 양수 유래의 줄기세포일 수 있고, 구체적으로 상기 불멸화 줄기세포는 기탁번호 KCTC12634BP로 수탁된 것일 수 있다. 또한, 상기 엑소좀 풍부 배양액은 불멸화 줄기세포를 TNF-α가 포함된 배양배지에서 배양하여 수득된 배양액일 수 있다. 또한, 상기 엑소좀 풍부 배양액은 낮은 산소 농도하에서 배양된 것일 수 있다.
한편, 상기 보툴리눔 독소는 보툴리눔 독소 A형, B형, C형, D형, E형, F형 및 G형으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있고, 구체적으로 보툴리눔 독소 A형일 수 있다.
또한, 상기 창상은 상술한 바와 같은 특징을 가질 수 있다.
상기 제1 조성물 및 제2 조성물은 상기 서술한 바와 같은 약학적 조성물의 특징을 가질 수 있다. 또한, 이들은 동시, 순차적 또는 역순으로 병용 투여될 수 있다. 구체적으로, 불멸화 줄기세포의 엑소좀 풍부 배양액 및 보툴리눔 독소는 동시에 투여될 수 있다. 또한, 상기 불멸화 줄기세포의 엑소좀 풍부 배양액을 투여한 후, 상기 보툴리눔 독소를 투여할 수 있다. 나아가, 상기 보툴리눔 독소를 투여한 후, 상기 불멸화 줄기세포의 엑소좀 풍부 배양액을 투여할 수 있다. 이때, 불멸화 줄기세포의 엑소좀 풍부 배양액 및 보툴리눔 독소를 순차적 또는 역순으로 투여하는 경우, 투여 간격은 통상의 기술자에 의해 적절히 조절될 수 있다.
또한, 본 발명은 불멸화 줄기세포의 엑소좀 풍부 배양액 및 보툴리눔 독소를 개체에 투여하는 단계를 포함하는 피부개선 방법을 제공한다.
본 발명에 따른 피부개선 방법에 유효성분으로 사용되는 불멸화 줄기세포의 엑소좀 풍부 배양액 및 보툴리눔 독소는 상기 서술한 바와 같은 특징을 가질 수 있다. 일례로, 상기 줄기세포는 인간 양수 유래의 줄기세포일 수 있고, 구체적으로 상기 불멸화 줄기세포는 기탁번호 KCTC12634BP로 수탁된 것일 수 있다. 또한, 상기 엑소좀 풍부 배양액은 불멸화 줄기세포를 TNF-α가 포함된 배양배지에서 배양하여 수득된 배양액일 수 있다. 또한, 상기 엑소좀 풍부 배양액은 낮은 산소 농도하에서 배양된 것일 수 있다.
한편, 상기 보툴리눔 독소는 보툴리눔 독소 A형, B형, C형, D형, E형, F형 및 G형으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있고, 구체적으로 보툴리눔 독소 A형일 수 있다.
상기 개체는 포유동물일 수 있고, 구체적으로 인간일 수 있다.
상기 투여는 목적하는 방법에 따라 경구 또는 비경구 투여일 수 있다. 비경구 투여는 복강내, 직장내, 피하, 정맥, 근육내 또는 흉부내 주사 방식을 포함할 수 있다. 또한, 상기 비경구 투여는 피부 도포일 수 있다.
또한, 본 발명은 피부 개선을 위한 조성물의 제조에 사용하기 위한 불멸화 줄기세포의 엑소좀 풍부 배양액 및 보툴리눔 독소의 용도를 제공한다.
본 발명에 따른 피부 개선을 위한 조성물의 제조에 사용되는 불멸화 줄기세포의 엑소좀 풍부 배양액 및 보툴리눔 독소는 상기 서술한 바와 같은 특징을 가질 수 있다. 일례로, 상기 줄기세포는 인간 양수 유래의 줄기세포일 수 있고, 구체적으로 상기 불멸화 줄기세포는 기탁번호 KCTC12634BP로 수탁된 것일 수 있다. 또한, 상기 엑소좀 풍부 배양액은 불멸화 줄기세포를 TNF-α가 포함된 배양배지에서 배양하여 수득된 배양액일 수 있다. 또한, 상기 엑소좀 풍부 배양액은 낮은 산소 농도하에서 배양된 것일 수 있다.
한편, 상기 보툴리눔 독소는 보툴리눔 독소 A형, B형, C형, D형, E형, F형 및 G형으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있고, 구체적으로 보툴리눔 독소 A형일 수 있다.
또한, 본 발명은 불멸화 줄기세포의 엑소좀 풍부 배양액 및 보툴리눔 독소를 개체에 투여하는 단계를 포함하는 창상의 예방, 개선 또는 치료 방법을 제공한다.
본 발명에 따른 창상의 예방, 개선 또는 치료 방법에 사용되는 불멸화 줄기세포의 엑소좀 풍부 배양액 및 보툴리눔 독소는 상기 서술한 바와 같은 특징을 가질 수 있다. 일례로, 상기 줄기세포는 인간 양수 유래의 줄기세포일 수 있고, 구체적으로 상기 불멸화 줄기세포는 기탁번호 KCTC12634BP로 수탁된 것일 수 있다. 또한, 상기 엑소좀 풍부 배양액은 불멸화 줄기세포를 TNF-α가 포함된 배양배지에서 배양하여 수득된 배양액일 수 있다. 또한, 상기 엑소좀 풍부 배양액은 낮은 산소 농도하에서 배양된 것일 수 있다.
한편, 상기 보툴리눔 독소는 보툴리눔 독소 A형, B형, C형, D형, E형, F형 및 G형으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있고, 구체적으로 보툴리눔 독소 A형일 수 있다.
상기 개체는 포유동물일 수 있고, 구체적으로 인간일 수 있다.
상기 투여는 목적하는 방법에 따라 경구 또는 비경구 투여일 수 있다. 비경구 투여는 복강내, 직장내, 피하, 정맥, 근육내 또는 흉부내 주사 방식을 포함할 수 있다. 또한, 상기 비경구 투여는 피부 도포일 수 있다. 상기 투여는 약학적으로 유효한 양으로 투여될 수 있다. 이는 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 환자의 민감도, 투여 시간, 투여 경로, 치료기간, 동시에 사용되는 약물 등에 따라 달라질 수 있다. 그러나, 바람직한 효과를 위해서, 본 발명에 따른 유효성분은 0.0001 내지 1,000 ㎎/㎏, 구체적으로 0.001 내지 500 ㎎/㎏의 양으로 투여될 수 있고, 상기 투여는 하루에 1회 또는 수회일 수 있다.
또한, 상기 투여는 단독 또는 다른 치료제와 병용하여 수행될 수 있다. 병용 투여시, 투여는 순차적 또는 동시일 수 있다.
나아가, 본 발명은 창상의 예방, 개선 또는 치료를 위한 약제의 제조에 사용하기 위한 불멸화 줄기세포의 엑소좀 풍부 배양액 및 보툴리눔 독소의 용도를 제공한다.
본 발명에 따른 창상의 예방, 개선 또는 치료를 위한 약제의 제조에 사용되는 불멸화 줄기세포의 엑소좀 풍부 배양액 및 보툴리눔 독소는 상기 서술한 바와 같은 특징을 가질 수 있다. 일례로, 상기 줄기세포는 인간 양수 유래의 줄기세포일 수 있고, 구체적으로 상기 불멸화 줄기세포는 기탁번호 KCTC12634BP로 수탁된 것일 수 있다. 또한, 상기 엑소좀 풍부 배양액은 불멸화 줄기세포를 TNF-α가 포함된 배양배지에서 배양하여 수득된 배양액일 수 있다. 또한, 상기 엑소좀 풍부 배양액은 낮은 산소 농도하에서 배양된 것일 수 있다.
한편, 상기 보툴리눔 독소는 보툴리눔 독소 A형, B형, C형, D형, E형, F형 및 G형으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있고, 구체적으로 보툴리눔 독소 A형일 수 있다.
이하, 본 발명을 하기 실시예에 의해 상세히 설명한다, 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 이들에 의해 본 발명이 제한되는 것은 아니다. 본 발명의 청구범위에 기재된 기술적 사상과 실질적으로 동일한 구성을 갖고 동일한 작용 효과를 이루는 것은 어떠한 것이라도 본 발명의 기술적 범위에 포함된다.
실시예 1. 불멸화 줄기세포 엑소좀 풍부 배양액의 준비
불멸화 줄기세포를 배양하여 엑소좀 풍부 배양액(exosome-rich conditioned medium, ERCM)을 다음과 같은 방법으로 수득하였다.
먼저, 1×106 cells/㎖의 불멸화 양수줄기세포(기탁번호 KCTC12634BP)는 DMEM(Dulbecco's modified Eagle's medium) 배양배지를 이용하여 5% CO2 및 37℃의 조건하에서 배양하였다. 24시간 후, 50 ng/㎖의 TNF-α를 배양배지에 첨가하고, 산소농도를 2%로 낮추어 48시간을 더 배양하였다. 배양 후, 배양액을 취하여 필터로 여과함으로써 세포 등의 불순물을 제거하고, 저온에서 30배 농축하여 불멸화 줄기세포의 엑소좀 풍부 배양액(이하, '엑소좀 풍부 배양액' 또는 'ERCM')을 수득하였다.
비교예 1. 불멸화 줄기세포 배양액의 준비
불멸화 양수줄기세포(기탁번호 KCTC12634BP)를 DMEM 배양배지에서 5% CO2 및 37℃의 조건하에서 배양한 배양액을 취하여 필터로 여과함으로써 세포 등의 불순물을 제거하고, 저온에서 30배 농축하여 불멸화 줄기세포 배양액(이하, '정상 배양액' 또는 'CM')을 수득하였다.
실험예 1. 엑소좀 함량 분석
상기에서 수득된 엑소좀 풍부 배양액 내 존재하는 엑소좀의 함량을 엑소좀의 포지자인 CD9의 발현을 확인하여 분석하였다.
구체적으로, 6 ㎖의 엑소좀 풍부 배양액으로부터 토탈 엑소좀 분리 키트(total exosome isolation kit, Invitrogen)를 사용하여 엑소좀을 수집한 후, CD9에 대한 웨스턴 블롯팅을 통상적인 방법으로 수행하고, 그 결과를 도 1에 나타내었다. 이때, 대조군으로서 비교예 1의 정상 배양액을 사용하였다.
도 1에 나타난 바와 같이, 엑소좀 풍부 배양액 내에서의 CD9 발현수준이 정상 배양액과 비교하여 약 50배 이상 유의적으로 높았다.
실험예 2. 성장인자 및 신경영양인자의 분석
상기에서 수득된 엑소좀 풍부 배양액 내 존재하는 성장인자 및 신경영양인자를 다음과 같이 분석하였다. 실험은 통상적인 ELISA 방법으로 수행하였으며, 구체적으로, bFGF (basic fibroblast growth factor), EFG (elongation factor G), IGF (insulin-like growth factor), VEGF (vascular endothelial growth factor), PDGF (platelet-derived growth factor) 및 TGF-β (transforming growth factor-β) 단백질의 발현 수준을 확인하였다. 이때, 대조군으로서는 정상 배양액을 사용하였고, 확인된 성장인자 및 신경영양인자의 발현 수준은 도 2에 나타내었다.
도 2에 나타난 바와 같이, 정상 배양액과 비교하여 엑소좀 풍부 배양액 내 존재하는 성장인자 및 신경영양인자의 발현 수준이 유의적으로 높았다. 구체적으로, bGFG, EFG, IGF, VEGF 및 PDFG 단백질은 약 10배 이상 증가하였고, 특히 TGF-β 단백질은 그 발현 수준이 약 17배 이상 증가하였다.
실험예 3. 콜라겐 분해효소 억제 확인
상기 수득된 엑소좀 풍부 배양액의 콜라겐 분해효소 억제 효과를 MMP-1(matrix metalloproteinase-1) 단백질의 활성 억제를 통해 확인하였다.
구체적으로, 기질(MCA-Lys-Pro-Leu-Gly-Leu-DPA-Ala-Arg-NH2) 및 재조합 인간 MMP-1 단백질(Cat. #M9195, Sigma-Aldrich)을 포함하는 반응액에 100 ㎕/㎖의 엑소좀 풍부 배양액 및 5 유닛(units)의 보툴리눔 독소 A형((주)메디톡스, 한국)을 첨가하였다. 이를 여기(excitation) 320 ㎚ 및 방출(emission) 405 ㎚에서 5분 동안 흡광도를 측정하였다. 이때, 대조군으로서, 아무것도 처리하지 않은 정상 대조군, 보툴리눔 독소만 처리한 보툴리눔 독소 처리군, 및 보툴리눔 독소와 정상 배양액을 처리한 보툴리눔 독소 및 정상 배양액 처리군을 사용하였다. 그 결과, MMP-1 단백질의 활성을 정상 대조군의 활성을 기준으로 백분율로 계산하여 도 3에 나타내었다.
도 3에 나타난 바와 같이, 보툴리눔 독소만 처리한 경우에는 MMP-1 단백질의 활성을 억제하지 못했으나, 엑소좀 풍부 배양액을 보툴리눔 독소와 동시에 처리한 경우, MMP-1 단백질의 활성이 이들 각각을 처리한 경우에 비해 유의적으로 감소하였다. 특히, 이와 같은 효과는 보툴리눔 독소와 정상 배양액을 동시에 처리한 경우에 비해서도 유의적으로 높았다.
실험예 4. 엘라스틴 분해효소 억제 확인
상기 수득된 엑소좀 풍부 배양액의 엘라스틴 분해효소 억제 효과를 MMP-12(matrix metalloproteinase-12) 단백질의 활성 억제를 통해 확인하였다.
구체적으로, 기질(N-succinyl-Ala-Ala-Ala-p-nitroanilide) 및 인간 호중구 엘라스타제(elastase, Cat. #MAK246, Sigma-Aldrich)를 포함하는 반응액에 100 ㎕/㎖의 엑소좀 풍부 배양액 및 5 유닛의 보툴리눔 독소 A형을 첨가하였다. 이를 ELISA 리더(reader)를 이용하여 410 ㎚에서 흡광도를 측정하였다. 이때, 대조군으로서, 아무것도 처리하지 않은 정상 대조군, 보툴리눔 독소만 처리한 보툴리눔 독소 처리군, 및 보툴리눔 독소와 정상 배양액을 처리한 보툴리눔 독소 및 정상 배양액 처리군을 사용하였다. 그 결과, MMP-12 단백질의 활성을 정상 대조군의 활성을 기준으로 백분율로 계산하여 도 4에 나타내었다.
도 4에 나타난 바와 같이, 보툴리눔 독소만 처리한 경우에는 MMP-12 단백질의 활성을 억제하지 못했으나, 엑소좀 풍부 배양액을 보툴리눔 독소와 동시에 처리한 경우, MMP-12 단백질의 활성이 이들 각각을 처리한 경우에 비해 유의적으로 감소하였다. 특히, 이와 같은 효과는 보툴리눔 독소와 정상 배양액을 동시에 처리한 경우에 비해서도 유의적으로 높았다.
실험예 5. 콜라겐 합성 촉진 확인
상기 수득된 엑소좀 풍부 배양액의 콜라겐 합성 촉진 효과를 다음과 같이 확인하였다.
먼저, 인간 진피 섬유아세포주인 CCD986SK(Thermo Fisher Scientific) 세포주는 미디엄 106(medium 106) 배양배지를 사용하여 통상적인 방법으로 배양하였다. 상기 준비된 세포를 6웰 플레이트에 웰당 5×104개가 되도록 분주하고, 여기에 100 ㎕/㎖의 엑소좀 풍부 배양액 및 5 유닛의 보툴리눔 독소 A형을 첨가하였다. 이를 72시간 동안 배양하고, 배양된 세포의 콜라겐 섬유를 메이슨 트리크롬(Masson's Trichrome)으로 염색하여 현미경으로 관찰하였다. 또한, 세포 배양액을 채취하여 염소 항-제1형 콜라겐-UNLB 항체(Southern Biotech)를 사용하여 ELISA를 수행하고 450 ㎚에서 흡광도를 측정함으로써, 제1형 콜라겐의 함량을 확인하였다. 이때, 대조군으로서, 아무것도 처리하지 않은 정상 대조군, 보툴리눔 독소만 처리한 보툴리눔 독소 처리군, 및 보툴리눔 독소와 정상 배양액을 처리한 보툴리눔 독소 및 정상 배양액 처리군을 사용하였다. 그 결과, 현미경 관찰 및 ELISA 분석 결과를 도 5에 나타내었다.
도 5에 나타난 바와 같이, 보툴리눔 독소만 처리한 경우에는 콜라겐 합성이 촉진되지 않았으나, 엑소좀 풍부 배양액을 보툴리눔 독소와 동시에 처리한 경우, 콜라겐 합성이 유의하게 증가하였다. 특히, 이와 같은 효과는 보툴리눔 독소와 정상 배양액을 동시에 처리한 경우에 비해서도 현저히 높았다.
실험예 6. 엘라스틴 합성 촉진 확인
상기 수득된 엑소좀 풍부 배양액의 엘라스틴 합성 촉진 효과를 다음과 같이 확인하였다.
구체적으로, 실험예 3과 동일한 조건 및 방법으로 엑소좀 풍부 배양액 및 보툴리눔 독소 A형이 처리된 세포를 7일 동안 배양하였다. 배양된 세포의 엘라스틴 섬유를 토끼 항-인간 α-엘라스틴 항체(Bio-Rad)로 염색하여 통상적인 방법으로 면역염색을 수행하고 현미경으로 관찰함으로써 확인하였다. 또한, 세포 배양액을 채취하여 동일한 항체를 이용한 ELISA를 수행하고, 450 ㎚에서 흡광도를 측정함로써, 엘라스틴의 함량을 확인하였다. 이때, 대조군으로서, 아무것도 처리하지 않은 정상 대조군, 보툴리눔 독소만 처리한 보툴리눔 독소 처리군, 및 보툴리눔 독소와 정상 배양액을 처리한 보툴리눔 독소 및 정상 배양액 처리군을 사용하였다. 그 결과, 현미경 관찰 및 ELISA 분석 결과를 도 6에 나타내었다.
도 6에 나타난 바와 같이, 보툴리눔 독소만 처리한 경우에는 엘라스틴 합성이 촉진되지 않고 오히려 억제되는 경향을 보였으나, 엑소좀 풍부 배양액을 보툴리눔 독소와 동시에 처리한 경우, 엘라스틴 합성이 유의하게 증가하였다. 특히, 이와 같은 효과는 보툴리눔 독소와 정상 배양액을 동시에 처리한 경우에 비해서도 현저히 높았다.
실험예 7. 피부주름 개선 확인
상기 수득된 엑소좀 풍부 배양액의 피부주름 개선 효과를 다음과 같이 확인하였다.
먼저, 7주령의 수컷 무모(hairless) 마우스(SKH-1)의 등쪽 피부에 UVB 램프(월드코포레이션)를 이용하여 UVB를 조사하였다. 구체적으로, UVB는 첫 번째 주에 1 최소홍반량(minimun erythema dose, MED)으로 조사하고, 두 번째 주에는 2 MED 씩, 세 번째 주에는 3 MED 씩, 네 번째 주부터 열 번째 주까지는 4 MED 씩 조사하여 피부 주름을 유발하였다. 피부 주름이 유발된 마우스에 50 ㎕의 엑소좀 풍부 배양액 및 5 유닛의 보툴리눔 독소 A형을 혼합하여 피하주사하였다. 이때, 주사는 1 ㎝ 간격으로 총 5개 위치에 나눠서 원형으로 주사하였으며, 주사 후 1일, 2주 및 4주째에 주름을 관찰하였다. 이때, 대조군으로서, 아무것도 처리하지 않은 정상 피부군, UVB만 처리한 UVB 처리군, 보툴리눔 독소만 처리한 보툴리눔 독소 처리군, 및 보툴리눔 독소와 정상 배양액을 처리한 보툴리눔 독소 및 정상 배양액 처리군을 사용하였다. 이후, 실리콘폴리머(CharmFlex® Impression Material)를 이용하여 주름을 복제하고, 빛의 입사각을 20도로 고정하여 주름의 명암 영상을 카메라로 촬영하였다. 촬영된 사진으로부터 이미지 분석 프로그램(Skin Visiometer SV600 software)을 이용하여 거칠기(roughness)를 분석하였다. 그 결과, 촬영된 사진을 도 7에 피부의 거친 정도를 분석하여 주름 스코어(score)를 확인한 결과를 도 8에 나타내었다.
도 7 및 8에 나타난 바와 같이, UVB 조사에 의해 형성된 주름은 관찰 4주 후까지 11.7점으로 지속되었다. 한편, 보툴리눔 독소만을 처리한 경우에는 처리 1일 후에 5.6점까지 크게 개선되었지만, 2주 및 4주 후에는 각각 7.5점 및 10.3점으로 다시 주름이 형성되었다. 그러나, 보툴리눔 독소를 엑소좀 풍부 배양액 또는 정상 배양액과 함께 처리한 경우에는 주름의 재형성이 상당히 차단되었고, 특히 엑소좀 풍부 배양액을 보툴리눔 독소와 처리한 경우에는 4주 후에도 6.4점으로 주름의 재형성이 완전히 차단되어 주름 개선 효과가 지속되었다.
따라서, 상기로부터 엑소좀 풍부 배양액 및 보툴리눔 독소를 동시에 처리한 경우, 보툴리눔 독소를 단독으로 처리하거나, 이를 정상 배양액과 함께 처리한 경우보다 주름생성 억제 효과가 현저히 증가할 뿐 아니라 상기 효과를 장시간 유지시킴을 알 수 있었다.
실험예 8. 피부재생 효과 확인
상기 수득된 엑소좀 풍부 배양액의 피부재생 효과를 창상 스크래치 시험(wound scratch assay) 방법으로 확인하였다.
먼저, 인간 표피 각질세포주인 NHEK 세포주(Guangdong BioCell Biotechnology Co., Ltd.)는 에피라이프(EpiLife, Gibco) 배양배지를 사용하여 통상적인 방법으로 배양하였다. 상기 준비된 세포를 6웰 플레이트에 웰당 3×105개가 되도록 분주하고, 100 ㎕ 파이펫 팁으로 스크래치 창상을 유발하였다. 여기에 100 ㎕/㎖의 엑소좀 풍부 배양액 및 5 유닛의 보툴리눔 독소 A형을 첨가하고, 24시간 동안 배양하며 관찰하였다. 이때, 대조군으로서, 아무것도 처리하지 않은 정상 대조군, 보툴리눔 독소만 처리한 보툴리눔 독소 처리군, 및 보툴리눔 독소와 정상 배양액을 처리한 보툴리눔 독소 및 정상 배양액 처리군을 사용하였다. 세포의 재생 정도는 위상차 현미경(phase-contrast microscope)을 이용하여 촬영함으로써 정량적으로 평가하였다. 그 결과, 위상차 현미경으로 촬영된 결과를 도 9에 나타내었다.
도 9에 나타난 바와 같이, 정상 대조군에서는 약 20%, 보툴리눔 독소 처리군에서는 약 35%의 세포 재생이 확인되었다. 반면, 보툴리눔 독소를 엑소좀 풍부 배양액 또는 정상 배양액과 함께 처리한 경우에 세포 재생이 유의적으로 증가하였고, 특히 엑소좀 풍부 배양액을 보툴리눔 독소와 동시 처리한 경우에 약 85 내지 90%의 세포가 재생되었다.
따라서, 상기로부터 엑소좀 풍부 배양액 및 보툴리눔 독소를 동시에 처리한 경우에 세포 재생 효과가 현저히 증가함을 알 수 있었다.
[수탁번호]
기탁기관명 : 한국생명공학연구원
수탁번호 : KCTC12634BP
수탁일자 : 20140725
Figure PCTKR2021009264-appb-img-000001

Claims (19)

  1. 불멸화 줄기세포의 엑소좀 풍부 배양액(exosome-rich conditioned medium, ERCM) 및 보툴리눔 독소를 포함하는 기능성 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 줄기세포는 인간 양수 유래 줄기세포인, 기능성 조성물.
  3. 제1항에 있어서, 상기 불멸화 줄기세포는 기탁번호 KCTC12634BP로 수탁된, 기능성 조성물.
  4. 제1항에 있어서, 상기 엑소좀 풍부 배양액은 불멸화 줄기세포를 TNF-α가 포함된 배양배지에서 배양하여 수득된, 기능성 조성물.
  5. 제4항에 있어서, 상기 TNF-α는 3 내지 100 ng/㎖의 농도로 포함되는, 기능성 조성물.
  6. 제1항에 있어서, 상기 엑소좀 풍부 배양액은 불멸화 줄기세포를 10% 이하의 산소 농도하에서 배양하여 수득된, 기능성 조성물.
  7. 제6항에 있어서, 상기 엑소좀 풍부 배양액은 불멸화 줄기세포를 1 내지 5%의 산소 농도하에서 배양하여 수득된, 기능성 조성물.
  8. 제1항에 있어서, 상기 보툴리눔 독소는 보툴리눔 독소 A형, B형, C형, D형, E형, F형 및 G형으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인, 기능성 조성물.
  9. 제8항에 있어서, 상기 보툴리눔 독소는 보툴리눔 독소 A형인, 기능성 조성물.
  10. 제1항에 있어서, 상기 조성물은 피부 개선용인, 기능성 조성물.
  11. 제10항에 있어서, 피부재생, 주름개선, 피부탄력 개선, 피부노화 억제 및 주름발생 억제로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 기능에 의해 피부를 개선시키는, 기능성 조성물.
  12. 제1항에 있어서, 상기 조성물은 건강기능식품, 화장료 조성물 또는 피부외용제인, 기능성 조성물.
  13. 불멸화 줄기세포의 엑소좀 풍부 배양액 및 보툴리눔 독소를 유효성분으로 포함하는 창상의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  14. 불멸화 줄기세포의 엑소좀 풍부 배양액을 유효성분으로 포함하는 제1 조성물, 및
    보툴리눔 독소를 유효성분으로 포함하는 제2 조성물을 포함하는 창상의 예방 또는 치료용 키트.
  15. 제14항에 있어서, 상기 불멸화 줄기세포의 엑소좀 풍부 배양액 및 보툴리눔 독소가 동시, 순차적 또는 역순으로 병용 투여되는, 창상의 예방 또는 치료용 키트.
  16. 불멸화 줄기세포의 엑소좀 풍부 배양액 및 보툴리눔 독소를 개체에 투여하는 단계를 포함하는 피부개선 방법.
  17. 피부 개선을 위한 조성물의 제조에 사용하기 위한 불멸화 줄기세포의 엑소좀 풍부 배양액 및 보툴리눔 독소의 용도.
  18. 불멸화 줄기세포의 엑소좀 풍부 배양액 및 보툴리눔 독소를 개체에 투여하는 단계를 포함하는 창상의 예방, 개선 또는 치료 방법.
  19. 창상의 예방, 개선 또는 치료를 위한 약제의 제조에 사용하기 위한 불멸화 줄기세포의 엑소좀 풍부 배양액 및 보툴리눔 독소의 용도.
PCT/KR2021/009264 2021-06-18 2021-07-19 불멸화 줄기세포의 엑소좀 풍부 배양액 및 보툴리눔 독소를 포함하는 기능성 조성물 WO2022265150A1 (ko)

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