WO2023128426A1 - 솔잎 발효 추출물을 포함하는 화장료 조성물 - Google Patents

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WO2023128426A1
WO2023128426A1 PCT/KR2022/020523 KR2022020523W WO2023128426A1 WO 2023128426 A1 WO2023128426 A1 WO 2023128426A1 KR 2022020523 W KR2022020523 W KR 2022020523W WO 2023128426 A1 WO2023128426 A1 WO 2023128426A1
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WO
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genus
extract
pine needle
cosmetic composition
needle extract
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PCT/KR2022/020523
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French (fr)
Inventor
김정미
문정미
문헌
염현숙
오태헌
이혜자
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대봉엘에스 주식회사
유씨엘 주식회사
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    • A—HUMAN NECESSITIES
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    • A61K2800/80—Process related aspects concerning the preparation of the cosmetic composition or the storage or application thereof
    • A61K2800/85—Products or compounds obtained by fermentation, e.g. yoghurt, beer, wine

Definitions

  • vitamin P promotes blood circulation and has excellent effects in preventing high blood pressure and aging.
  • vitamin P rutin
  • fatty acids with linolenic acid accounting for about 20% and palmitic acid accounting for 10%.
  • polyunsaturated fatty acids including 5-olefin acid that is not easily oxidized, so it can prevent aging.
  • Korean Patent Registration No. 10-0955087 discloses a skin moisturizing composition obtained by fermenting pine needle extract at room temperature, but the method using this natural fermentation has a problem in that the concentration of the pine needle extract is low and the physiological and nutritional functionality is low.
  • the concentration of the pine needle extract is low and the physiological and nutritional functionality is low.
  • physiological components of pine needles and fermentation methods for increasing their activity there is a demand for physiological components of pine needles and fermentation methods for increasing their activity.
  • the fermented extract of pine needles of the present invention fermented with lactic acid bacteria can exhibit excellent moisturizing, antioxidant, skin barrier strengthening, sebum control, anti-inflammatory, whitening and wrinkle improvement effects, and can also be used as a component of a pharmaceutical composition or food. .
  • the pine needle extract may be obtained by extracting water or C 1 to C 4 alcohol as a solvent, but preferably extracted using hot water.
  • solvent extraction methods widely known in the art, such as immersion extraction, ultrasonic extraction, and vacuum extraction, may be applied, and the method is not limited.
  • the lactic acid bacteria fermenting the pine needle extract include Streptococcus, Lactococcus , Enterococcus , Lactobacillus , Pediococcus , Leuconostoc ) Genus, Visella ( Weissella ), and Bifidobacterium ( Bifidobacterium )
  • One or more strains selected from the group consisting of genus may be used, but preferably Lactobacillus ( Lactobacillus ), Pediococcus ( Pediococcus ) genus or lactobacillus
  • a strain of the genus Lactococcus may be used, and more preferably Pediococcus acidilactici BDD10 ( KCTC 19034P) may be used.
  • the fermentation may be performed at a temperature of 20 °C to 60 °C for 2 to 10 days. If fermentation is performed less than the above range, fermentation may not be sufficiently performed, and if fermentation is performed in excess of the above range, overfermentation may occur.
  • the cosmetic composition of the present invention can be prepared in any formulation commonly prepared in the art, for example, a solution, suspension, emulsion, paste, gel, cream, lotion, powder, soap, surfactant-containing cleansing, It may be formulated as an oil, powder foundation, emulsion foundation, wax foundation and spray, but is not limited thereto.
  • lactose, talc, silica, aluminum hydroxide, calcium silicate or polyamide powder may be used as a carrier component, and in particular, in the case of a spray, additional chlorofluorohydrocarbon, propane / May contain a propellant such as butane or dimethyl ether.
  • a solvent, solubilizing agent or emulsifying agent is used as a carrier component, such as water, ethanol, isopropanol, ethyl carbonate, ethyl acetate, benzyl alcohol, benzyl benzoate, propylene glycol, 1 ,3-butyl glycol oil, fatty acid esters of glycerol, polyethylene glycol or sorbitan.
  • the formulation of the present invention is surfactant-containing cleansing
  • carrier components aliphatic alcohol sulfate, aliphatic alcohol ether sulfate, sulfosuccinic acid monoester, isethionate, imidazolinium derivative, methyl taurate, sarcosinate, fatty acid amide ether Sulfates, alkylamidobetaines, fatty alcohols, fatty acid glycerides, fatty acid diethanolamides, vegetable oils, lanolin derivatives or ethoxylated glycerol fatty acid esters and the like can be used.
  • the cosmetic composition of the present invention is a soap, surfactant-containing cleansing or surfactant-free cleansing formulation
  • the soap is liquid soap, powder soap, solid soap, and oil soap
  • the surfactant-containing cleansing formulation is a cleansing foam, cleansing water, cleansing towel, and a cleansing pack
  • the surfactant-free cleansing formulation is a cleansing cream. , cleansing lotion, cleansing water and cleansing gel, but are not limited thereto.
  • Example 1 Preparation of pine needle fermented extract by lactic acid bacteria of the genus Lactobacillus
  • Example 2 Preparation of pine needle fermented extract by lactic acid bacteria belonging to the genus Pediococcus
  • a fermented pine needle extract was obtained in the same manner as in Example 1, except for natural fermentation without using lactic acid bacteria.
  • Sebocyte cells which are sebaceous gland cells, were purchased from Celprogen and cultured in an incubator at 37°C, 5% CO 2 using Human Sebocyte Complete Media with Serum, a medium exclusively for sebocytes, and subcultures were performed at 7-day intervals.
  • EZ-cytox assay is a representative method for measuring cell viability using the principle that water solution tetrazolium salt (WST) reacts with dehydrogenase of living cells to produce orange water-soluble formazan.
  • WST water solution tetrazolium salt
  • Sebocyte cells were dispensed at 3.0 ⁇ 10 4 cells/well in a 24 well plate and cultured for 48 hours at 37 °C and 5% CO 2 conditions. It was exchanged with Human Sebocyte Serum-free Media, treated with the extract to be evaluated, and cultured for 5 days. After removing the culture medium and washing with PBS for each group, a Lipid Extraction kit (abcam) and a Lipid Assay kit (abcam) were used, and the procedure was performed according to the method provided by the manufacturer.
  • abcam Lipid Extraction kit
  • abcam Lipid Assay kit
  • Sebocyte cells were dispensed at 3.0 ⁇ 10 4 cells/well in a 24 well plate and cultured for 48 hours at 37 °C and 5% CO 2 conditions. It was exchanged with Human Sebocyte Serum-free Media, treated with the extract to be evaluated, and cultured for 5 days. After removing the culture medium and washing with PBS for each group, the EZ-Triglyceride Quantification Assay Kit (DOGEN) was used and proceeded according to the method provided by the manufacturer.
  • DOGEN EZ-Triglyceride Quantification Assay Kit
  • Sebocyte cells were dispensed at 3.0 ⁇ 10 4 cells/well in a 24 well plate and cultured for 48 hours at 37 °C and 5% CO 2 conditions. It was exchanged with Human Sebocyte Serum-free Media, treated with the extract to be evaluated, and cultured for 5 days. After removing the culture medium and washing with PBS for each group, EZ-Cholesterol Assay Kit (DOGEN) was used and proceeded according to the method provided by the manufacturer.
  • DOGEN EZ-Cholesterol Assay Kit
  • HaCaT cells were dispensed in a 24 well plate at 1.0 ⁇ 10 5 cells/mL and cultured for 18 hours at 37°C and 5% CO 2 conditions. Serum-free DMEM was exchanged, and the extracts prepared in Examples and Comparative Examples were treated and cultured for 24 hours. Thereafter, the culture medium was removed and centrifuged at 15,000 rpm for 5 minutes, and the supernatant was removed and stored frozen (-20 ° C) until quantification. Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA) was performed using a Hyaluronic Acid ELISA kit (Elabscience Biotechnology Co., Ltd) according to the method provided by the manufacturer. The results are shown in Table 3 below.
  • ELISA Enzyme-Linked Immunosorbent Assay
  • tyrosinase a key enzyme in the melanin synthesis process.
  • Tyrosine is metabolized into DOPA and dopaquinone, which are precursors of melanin production, by the enzyme tyrosinase. Therefore, inhibition of tyrosinase can expect a skin whitening effect through the control of melanin pigment in the skin.
  • the tyrosinase inhibitory effect was measured using the dopachrome method.
  • Elastase known as an enzyme that decomposes elastin, an elastic fiber, exists in low concentrations in healthy skin, and the concentration of elastase increases rapidly during skin inflammatory reactions.
  • This elastase is known as an enzyme that is the main cause of wrinkle formation by decomposing elastin, an elastic fiber protein, to break the dermal tissue of the skin, and can inhibit skin aging by reducing the activity of elastase. Therefore, it is possible to support the effect of the skin wrinkle improvement substance of the extract by testing the ability to inhibit elastase activity.
  • Elastase inhibitory activity is measured by measuring the amount of p-nitoanilide produced using N-succinyl-Ala-Ala-Ala-p-nitroanilide (sigma) as a substrate.
  • Example 6 As shown in Table 6, it was confirmed that the sample of Example had an excellent NO production inhibitory effect compared to the sample of Comparative Example 1 in which fermentation was not performed.
  • Test Example 8 Confirmation of atopic improvement effect

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Abstract

본 발명은 솔잎 추출물을 유산균으로 발효한 발효 추출물을 포함하는 화장료 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 솔잎 추출물을 유산균으로 발효한 발효 추출물은 우수한 보습, 항산화, 피부장벽 강화, 피지조절, 항염, 미백 및 주름 개선 효과를 나타낼 수 있으며, 약학 조성물 또는 식품의 일 성분으로도 활용될 수 있다.

Description

솔잎 발효 추출물을 포함하는 화장료 조성물
본 발명은 솔잎 추출물을 유산균으로 발효한 발효 추출물을 포함하는 화장료 조성물에 관한 것이다.
소나무는 우리나라 전국의 산에 야생하고 있는 상록침엽교목으로, 주로 내륙지방에 많이 자라는 적송(육송)이 주를 이루며, 잣나무, 리기다 소나무, 곰솔(해송), 백송 등이 있다. 소나무의 잎인 솔잎은 예로부터 한방 또는 민간요법의 약용이나 건강식품으로 이용되고 있다. 동의보감에 의하면 솔잎은 위장병, 중풍, 고혈압, 신경통, 천식 등에 치료 효과가 있다고 알려져 있다.
솔잎에는 주활성 성분이며 휘발성 항생물질인 테르펜은 솔잎에 약 7-12% 가량 들어 있으며, 항생, 항암, 혈압강하, 호르몬 분비촉진, 항산화 등과 같은 독특한 약리작용 효과가 있어 아로마테라피(aroma theraphy)에 사용되기도 한다.
또한 솔잎에 함유되어 있는 정유 성분, 단백질, 비타민 A, 비타민 C, 비타민 K, 비타민 P (루틴), 인, 철분, 효소, 탄닌, 엽록소, 고미성 물질, 플라보노이드 등의 기능성 물질에 의해 약리작용 이루어진다. 특히 비타민 P(루틴)는 혈액순환을 촉진하고 고혈압과 노화를 방지하는 데 탁월한 효과가 있다. 뿐만 아니라 지방산도 많이 함유되어 있으며, 리놀렌산이 약 20%, 팔미트산으로 10%를 차지한다. 이외에도 쉽게 산화되지 않는 5-올레핀산을 비롯한 고도불포화지방산이 많이 들어 있어서 노화도 방지시킬 수 있다.
한국등록특허 제10-0955087호에서는 솔잎 추출물을 상온 발효한 피부보습용 조성물을 개시하고 있으나, 이러한 자연 발효를 이용한 방법은 솔잎 추출물의 농도가 묽어서 생리학적 및 영양학적 기능성이 낮다는 문제가 있으며, 솔잎의 생리학적 성분과 그 활성을 높이기 위한 발효방법 등이 요구되는 실정이다.
[선행기술문헌]
[특허문헌]
(특허문헌 0001) 한국등록특허공보 제10-0955087호(2010.04.28)
이에 본 발명자들은 생리학적 및 영양학적 기능성을 확보한 솔잎 추출물의 발효물을 얻고자 연구, 노력한 결과, 솔잎 추출물을 특정 유산균으로 발효한 발효 추출물이 우수한 보습, 항산화, 피부장벽 강화, 피지조절, 항염, 주름개선 및 미백 효과를 나타내는 것을 발견함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서 본 발명은 솔잎 추출물을 유산균으로 발효한 발효 추출물을 포함하는 화장료 조성물을 제공하는 것을 그 목적으로 한다.
본 발명은 솔잎 추출물을 유산균으로 발효한 발효 추출물을 포함하는 화장료 조성물을 제공한다.
상기 유산균은 스트렙토코커스(Streptococcus) 속, 락토코커스(Lactococcus) 속, 엔테로코커스(Enterococcus) 속, 락토바실러스(Lactobacillus) 속, 페디오코커스(Pediococcus) 속, 류코노스톡(Leuconostoc) 속, 비셀라(Weissella) 속 및 비피도박테리움(Bifidobacterium) 속으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 균주일 수 있다.
상기 화장료 조성물은 보습, 항산화, 피부장벽 강화, 피지조절, 항염, 미백 및 주름 개선 용도로 사용될 수 있다.
본 발명의 솔잎 추출물을 유산균으로 발효한 발효 추출물은 우수한 보습, 항산화, 피부장벽 강화, 피지조절, 항염, 미백 및 주름 개선 효과를 나타낼 수 있으며, 약학 조성물 또는 식품의 일 성분으로도 활용될 수 있다.
이하, 본 발명에 대하여 상세히 설명하기로 한다. 이에 앞서, 본 명세서 및 청구범위에 사용된 용어나 단어는 통상적이거나 사전적인 의미로 한정해서 해석되어서는 아니되며, 발명자는 그 자신의 발명을 가장 최선의 방법으로 설명하기 위해 용어의 개념을 적절하게 정의할 수 있다는 원칙에 입각하여 본 발명의 기술적 사상에 부합하는 의미와 개념으로 해석되어야만 한다. 따라서, 본 명세서에 기재된 실시예에 기재된 구성은 본 발명의 가장 바람직한 일 실시예에 불과할 뿐이고 본 발명의 기술적 사상을 모두 대변하는 것은 아니므로, 본 출원시점에 있어서 이들을 대체할 수 있는 다양한 균등물과 변형예들이 있을 수 있음을 이해하여야 한다.
본 발명의 화장료 조성물은 솔잎 추출물을 유산균으로 발효한 발효 추출물을 포함한다.
상기 솔잎 추출물은 물 또는 C1 ~ C4의 알코올을 용매로 추출한 것을 사용할 수 있으나, 바람직하게는 열수를 사용하여 추출한 것을 사용할 수 있다.
상기 용매는 솔잎의 5 ~ 20 배의 중량으로 사용할 수 있으며, 바람직하게는 7 ~ 15배의 중량을 사용할 수 있다. 상기 용매가 한정 범위 미만으로 사용되면 유효 성분이 충분히 추출되지 않으면서 그 추출 수율이 떨어지며, 한정 범위를 초과하여 사용되면 추출 공정이 비효율적인 문제가 있다.
상기 추출은 침지 추출, 초음파 추출, 감압 추출 등 당업계에 널리 알려진 용매 추출법이 적용될 수 있으며, 그 방법에 제한이 있는 것은 아니다.
이 때, 상기 추출 시 열수를 사용하는 경우 40 ~ 90℃에서 1 ~ 36시간 동안 추출이 이루어질 수 있으며, 바람직하게는 50 ~ 70 ℃ 에서 1 ~ 12 시간 동안 추출할 수 있다. 상기 한정 온도 범위 미만에서 추출이 이루어지는 경우 유효 성분의 추출이 충분히 이루어지지 못한다.
상기 솔잎 추출물을 발효하는 유산균으로는 스트렙토코커스(Streptococcus) 속, 락토코커스(Lactococcus) 속, 엔테로코커스(Enterococcus) 속, 락토바실러스(Lactobacillus) 속, 페디오코커스(Pediococcus) 속, 류코노스톡(Leuconostoc) 속, 비셀라(Weissella) 속 및 비피도박테리움(Bifidobacterium) 속으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 균주가 사용될 수 있으나, 바람직하게는 락토바실러스(Lactobacillus) 속, 페디오코커스(Pediococcus) 속 또는 락토코커스(Lactococcus) 속 균주가 사용될 수 있으며, 더욱 바람직하게는 페디오코커스 에시디락티시 BDD10(Pediococcus acidilactici BDD10, KCTC 19034P)가 사용될 수 있다.
상기 유산균은 상기 솔잎 추출물 중량 대비 2 내지 10% 미만으로 접종될 수 있으며, 바람직하게는 3 내지 7%일 수 있다. 상기 유산균 접종농도가 2% 미만이면, 발효가 충분히 일어나지 않고, 10%를 초과하면 과발효될 수 있다.
상기 발효는 20℃ 내지 60℃ 온도 조건에서 및 2 내지 10 일간 이루어질 수 있다. 상기 범위 미만의 발효가 이루어지면 발효가 충분하게 이루어지지 못하고, 상기 범위를 초과하여 발효가 이루어지면 과발효될 수 있다.
본 발명의 화장료 조성물은 화장품 조성물에 통상적으로 이용되는 성분들을 포함할 수 있으며, 예컨대 항산화제, 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료 및 향료와 같은 통상적인 보조제, 그리고 담체를 포함할 수 있다.
본 발명의 화장료 조성물은 당 업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있으며, 예를 들어 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 파우더, 비누, 계면활성제-함유 클렌징, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션 및 스프레이 등으로 제형화될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
보다 상세하게는, 유연 화장수, 영양 화장수, 영양 크림, 마사지 크림, 에센스, 아이 크림, 클렌징 크림, 클렌징 폼, 클렌징 워터, 팩, 스프레이 또는 파우더의 제형으로 제조될 수 있다.
본 발명의 제형이 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는 담체 성분으로서 동물성유, 식물성유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 또는 산화아연 등이 이용될 수 있다.
본 발명의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록시드, 칼슘 실리케이트 또는 폴리아미드 파우더가 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로히드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸에테르와 같은 추진체를 포함할 수 있다.
본 발명의 제형이 용액 또는 유탁액인 경우에는 담체 성분으로서 용매, 용해화제 또는 유탁화제가 이용되고, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르가 있다.
본 발명의 제형이 현탁액인 경우에는 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상의 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소 결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 등이 이용될 수 있다.
본 발명의 제형이 계면활성제 함유 클렌징인 경우에는 담체 성분으로서 지방족 알코올 설페이트, 지방족 알코올 에테르 설페이트, 설포숙신산 모노에스테르, 이세티오네이트, 이미다졸리늄 유도체, 메틸타우레이트, 사르코시네이트, 지방산 아미드 에테르 설페이트, 알킬아미도베타인, 지방족 알코올, 지방산 글리세리드, 지방산 디에탄올아미드, 식물성 유, 라놀린 유도체 또는 에톡실화 글리세롤 지방산 에스테르 등이 이용될 수 있다.
본 발명의 화장료 조성물이 비누, 계면활성제 함유 클렌징 또는 계면활성제 비함유 클렌징 제형일 경우, 피부에 도포한 후 닦아내거나 떼거나 물로 씻어낼 수도 있다. 구체적인 예로서, 상기 비누는 액상비누, 가루비누, 고형비누 및 오일비누이며, 상기 계면활성제 함유 클린징 제형은 클렌징폼, 클렌징 워터, 클렌징 수건 및 클렌징 팩이며, 상기 계면활성제 비함유 클렌징 제형은 클렌징크림, 클렌징 로션, 클렌징 워터 및 클렌징 겔이며, 이에 한정되는 것은 아니다.
또한, 상기 솔잎 추출물을 유산균으로 발효한 발효 추출물은 피부외용 약학조성물에 포함될 수 있으며, 상기 약학조성물은 크림, 젤, 패취, 분무제, 연고제, 경고제, 로션제, 리니멘트제, 파스타제 또는 카타플라스마제 제형일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
이하, 본 발명을 구체적으로 설명하기 위해 실시예 및 실험예를 들어 상세하게 설명하기로 한다. 그러나 본 발명에 따른 실시예들은 여러 가지 다른 형태로 변형될 수 있으며, 본 발명의 범위가 아래에서 상술하는 실시예들에 한정되는 것으로 해석되어서는 안 된다. 본 발명의 실시예들은 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해서 제공되는 것이다.
실시예 1 : 락토바실러스 속 유산균에 의한 솔잎 발효 추출물의 제조
건조된 솔잎에 정제수를 10배 부피로 가한 후, 60℃에서 90분 동안 열수 추출하여 솔잎을 제거한 추출액을 얻었다. 상기 솔잎 추출액에 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis) 유산균을 추출물 중량 대비 5.0% 접종하여 32 ~ 40℃에서 3 ~ 4일 발효시킨 후, 균을 제거하고 솔잎 발효 추출물을 수득하였다. 여과한 추출액을 감압 농축 및 동결건조기를 이용하여 수분을 완전히 제거한 후 추출 파우더를 얻어 실험에 사용하였다.
실시예 2 : 페디오코커스 속 유산균에 의한 솔잎 발효 추출물의 제조
유산균으로 페디오코커스 에시디락티시 BDD10(Pediococcus acidilactici BDD10, KCTC 19034P)를 사용하는 것을 제외하고는 상기 실시예 1과 동일하게 진행하여 솔잎 발효 추출물을 수득하였다.
비교예 1 : 솔잎 추출물의 제조
건조된 솔잎에 정제수를 10배 부피로 가한 후, 60℃에서 90분 동안 열수 추출하여 솔잎을 제거한 추출액을 얻었다. 다음 상기 추출액을 감압 농축 및 동결건조기를 이용하여 수분을 완전히 제거한 후, 추출 파우더를 얻어 실험에 사용하였다.
비교예 2 : 자연 발효에 의한 솔잎 발효 추출물의 제조
유산균을 사용하지 않고 자연 발효시키는 것을 제외하고는 상기 실시예 1과 동일하게 진행하여 솔잎 발효 추출물을 수득하였다.
시험예 1 : 세포 배양
피지선세포 배양
피지선세포인 sebocyte 세포는 Celprogen으로부터 분양받아 sebocyte 전용 배지인 Human Sebocyte Complete Media with Serum 배지를 사용하여 37℃, 5% CO2 항온기에서 배양하였으며, 7일 간격으로 계대배양을 시행하였다.
피부 각질 형성세포 배양
피부 각질 형성세포인 HaCaT 세포는 Cell Line Service GmbH.(Germany)에서 분양받아 사용하였다. 1% 페니실린-스트렙토마이신(penicillin-streptomycin)과 10% 소태아 혈청(fetal bovine serum, FBS)이 함유된 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's Medium) 배지를 사용하여 37℃, 5% CO2 항온기에서 배양하였으며, 2 내지 3일 간격으로 계대배양을 시행하였다.
시험예 2 : 세포 독성 평가
EZ-cytox assay
EZ-cytox assay는 water solution tetrazolium salt(WST)가 살아있는 세포의 탈수소효소(Dehydrogenase)와 반응하여 주황색의 수용성 formazan을 생성하는 원리를 이용하여 세포생존율을 측정하는 대표적인 방법이다.
세포 독성을 확인하기 위하여 피지선세포를 Human Sebocyte Complete Media with Serum 배지를 이용하여 3.0×104 cells/well로 24 well plate에 분주한 후, 37 ℃, 5% CO2 조건에서 48 시간 동안 배양하였다. 배양된 sebocyte 세포에 Human Sebocyte Serum-free Media로 교환하여 평가하고자 하는 추출물을 처리하였다. 이후 EZ-cytox를 각 well에 첨가하여 37 ℃, 5% CO2 조건에서 30분 동안 반응시킨 후, microplate reader를 사용하여 450 nm에서 흡광도를 측정하였다. 각 시료군에 대한 평균 흡광도 값을 구하였고, 대조군의 흡광도 값과 비교하여 세포생존율을 평가하였으며, 그 결과를 하기 표 1에 나타내었다.
구분 농도(μg/mL) 측정값(%)
비교예 1 100 100.6
비교예 2 100 107.1
실시예 1 100 109.8
실시예 2 100 108.7
상기 표 1에서 보는 바와 같이, 비교예 및 실시예의 시료는 피지선 세포에서 세포 독성이 관찰되지 아니하였다.
시험예 3 : 피지분비 억제 효과 확인
지질 함량 측정
Sebocyte 세포를 24 well plate에 3.0 × 104 cells/well로 분주하여 37 ℃, 5% CO2 조건에서 48 시간 동안 배양하였다. Human Sebocyte Serum-free Media로 교환하고, 평가하고자 하는 추출물을 처리하여 5일 동안 배양하였다. 이후 각 군마다 배양액 제거 및 PBS로 세척 후, Lipid Extraction kit (abcam) 및 Lipid Assay kit (abcam)를 이용하였으며, 제조사에서 제공한 방법에 의해 진행하였다.
트리글리세라이드(TG) 함량 측정
Sebocyte 세포를 24 well plate에 3.0 × 104 cells/well로 분주하여 37 ℃, 5% CO2 조건에서 48 시간 동안 배양하였다. Human Sebocyte Serum-free Media로 교환하고, 평가하고자 하는 추출물을 처리하여 5일 동안 배양하였다. 이후 각 군마다 배양액 제거 및 PBS로 세척 후, EZ-Triglyceride Quantification Assay Kit (DOGEN)를 이용하였으며, 제조사에서 제공한 방법에 의해 진행하였다.
콜레스테롤 함량 측정
Sebocyte 세포를 24 well plate에 3.0 × 104 cells/well로 분주하여 37 ℃, 5% CO2 조건에서 48 시간 동안 배양하였다. Human Sebocyte Serum-free Media로 교환하고, 평가하고자 하는 추출물을 처리하여 5일 동안 배양하였다. 이후 각 군마다 배양액 제거 및 PBS로 세척 후, EZ-Cholesterol Assay Kit (DOGEN)를 이용하였으며, 제조사에서 제공한 방법에 의해 진행하였다.
구분 피지분비 억제 효과
농도(μg/mL) 지질함량(mg/mL) TG함량(mg/mL) 콜레스테롤(mg/mL)
비교예 1 100 100.9 0.51 0.33
비교예 2 100 96.1 0.42 0.25
실시예 1 100 91.3 0.43 0.21
실시예 2 100 87.7 0.21 0.14
상기 표 2에서 보는 바와 같이, 실시예의 시료는 비교예 1의 시료에 비하여 우수한 피지 분비 억제 효과를 나타내는 것을 확인할 수 있었다.
시험예 4 : 보습 효과 확인
히알루론산 생성
HaCaT세포를 24 well plate에 1.0 × 105 cells/mL로 분주하여 37℃, 5% CO2 조건에서 18시간동안 배양하였다. Serum-free DMEM으로 교환하고, 실시예 및 비교예 제조된 추출물을 처리하여 24시간 동안 배양하였다. 이후 배양 배지를 걷어 15,000 rpm으로 5분간 원심분리하고 상층액을 걷어내어 정량 전까지 냉동보관(-20℃) 하였다. 효소면역측정법(ELISA: Enzyme-Linked Immunosorbent Assay)은 히알루론산(Hyaluronic Acid) ELISA kit (Elabscience Biotechnology Co.,Ltd )를 이용하였으며 제조사에서 제공한 방법에 의해 진행하였다. 그 결과를 하기 표 3에 나타내었다.
구분 농도(μg/mL) HA (% of control)
비교예 1 100 101.2
비교예 2 100 110.8
실시예 1 100 114.9
실시예 2 100 137.7
상기 표 3에서 보는 바와 같이, 실시예의 시료는 비교예의 시료에 비하여 우수한 히알루론산 생성 효과를 나타내는 것을 확인할 수 있었다.
시험예 5 : 미백 효과 확인
Tyrosinase inhibition assay
멜라닌 합성과정에서의 핵심 효소인 티로시나아제(tyrosinase)의 저해활성을 평가하여 미백효과의 가능성을 유추할 수 있다. 티로신(Tyrosine)은 효소인 티로시나아제에 의하여 멜라닌 생성의 전구체가 되는 DOPA 와 dopaquinone으로 대사된다. 따라서 티로시나아제의 억제는 피부의 멜라닌 색소의 조절을 통하여 피부 미백 효과를 기대할 수 있다. dopachrome법을 이용하여 티로시나아제 억제 효과를 측정하였다. mushroom Tyrosinase -300 unit 50 uL와 1.5 mM L-tyrosine 25 uL, 또는 시료 75 uL를 혼합한 후 배양 전, 15분간 배양 후의 각각의 흡광도를 490 nm의 파장에서 측정하여, 그 결과를 하기 표 4에 나타내었다.
Tyrosinase 억제활성 (%) = (1 - Asample/Acontrol)× 100
Asample = 시료 첨가구의 흡광도
Acontrol = 무첨가구의 흡광도
구분 농도(μg/mL) Tyrosinase inhibition activity (%)
비교예 1 1000 0
비교예 2 1000 10.0
실시예 1 1000 31.2
실시예 2 1000 52.3
상기 표 4에서 보는 바와 같이, 실시예의 시료는 비교예의 시료에 비하여 우수한 티로시나아제 억제 효과를 나타내는 것을 확인할 수 있었다.
시험예 6 : 주름 개선 효과 확인
Elastase inhibition assay
탄력섬유인 엘라스틴을 분해하는 효소로 알려진 엘라스타아제(elastase)는 건강한 피부에서 낮은 농도로 존재하며, 피부 염증반응 시에는 엘라스타아제 농도가 급격히 증가하기도 한다. 이러한 엘라스타아제는 탄성 섬유단백질인 엘라스틴을 분해시켜 피부의 진피조직의 그물망을 끊어 줌으로서 주름생성의 주원인 효소로 알려져 있으며, 엘라스타아제 활성을 저하시킴으로써 피부노화를 억제할 수 있다. 따라서 엘라스타아제 활성 저해능력을 실험하여 추출물의 피부 주름개선 물질의 효력을 뒷받침할 수 있다. 엘라스타아제 저해 활성 측정은 기질로서 N-succinyl-Ala-Ala-Ala-p-nitroanilide (sigma)를 사용하여 생성된 p-nitoanilide의 생성량을 측정한다.
Elastase inhibition assay는 0.2M Tris-HCl buffer (pH8.0)에 시료 20 uL를 가한 후, 기질을 20 uL 가하여 25℃에서 10분간 반응 후, 1 unit 엘라스타아제를 20 uL 가하였다. 반응 혼합물은 다시 25℃에서 15분간 반응 후, 냉침으로 반응을 중지시킨 후 405 nm에서 흡광도를 측정하였으며, 그 결과를 하기 표 5에 나타내었다.
Elastase inhibition activity (%) = (1 - Asample/Acontrol)× 100
Asample = 시료 첨가구의 흡광도
Acontrol = 무첨가구의 흡광도
구분 농도(μg/mL) Elastase inhibition activity (%)
비교예 1 1000 6.3
비교예 2 1000 16.7
실시예 1 1000 38.0
실시예 2 1000 58.6
상기 표 5에서 보는 바와 같이, 실시예의 시료는 비교예의 시료에 비하여 우수한 엘라스타아제 억제 효과를 나타내는 것을 확인할 수 있었다.
시험예 7 : 항염 개선 효과 확인
Nitric oxide (NO)생성 억제 활성 확인
RAW264.7세포를 24 well plate에 1.5 × 105 cells/mL로 분주하여 37℃, 5% CO2 조건에서 18시간동안 배양하였다. 10 % fetal bovine serum(FBS)이 함유된 DMEM으로 교환하고 상기 표 1에 의해 제조된 추출물을 처리하여 24시간 동안 배양하였다. 96 well plate에 세포 배양 상등액 100 uL를 회수하고 griess 시약 100 uL를 첨가하여 상온에서 10분간 반응시켰다. 이후 microplate reader를 이용하여 540 nm에서 흡광도를 측정하였으며, 그 결과를 하기 표 6에 나타내었다.
구분 농도(μg/mL) NO (%)
비교예 1 100 97.8
비교예 2 100 87.8
실시예 1 100 89.7
실시예 2 100 74.2
상기 표 6에서 보는 바와 같이, 실시예의 시료는 발효가 이루어지지 아니한 비교예 1의 시료에 비하여 NO 생성 억제 효과가 우수한 것을 확인할 수 있었다.
시험예 8 : 아토피 개선 효과 확인
아토피성인자인 TARC 생성 억제 활성 측정
상기 시료의 아토피개선 효과를 확인하기 위하여, 아토피성 chemokine (TARC: Thymus and activation regulated chemokine) 생성 억제 활성을 분석하고자 하였다.
HaCaT 세포를 24 well plate에 1.5 × 105 cells/mL로 분주하여 37℃, 5% CO2 조건에서 18시간 동안 배양하였다. Serum-free DMEM으로 교환하고 시료와 interferon-γ(IFN-γ를 함께 처리하여 일정시간 동안 배양하였다. 이후 배양 배지를 원심분리(12,000 rpm, 3 min)하여 얻어진 상층액의 아토피성 chemokine 생성 함량을 측정하였다. 모든 시료는 정량 전까지 냉동보관 (-20℃) 하였다. TARC 함량은 human enzyme-linked immnunosorbent assay (ELISA) kit (R&D Systems Inc.,Minneapolis, MN, USA)를 이용하였으며 standard에 대한 표준곡선의 r2값은 0.99 이상이었다.
구분 농도(μg/mL) TARC (%)
비교예 1 100 92.1
비교예 2 100 58.2
실시예 1 100 42.1
실시예 2 100 27.4
상기 표 7에서 보는 바와 같이, 실시예의 시료는 비교예의 시료에 비하여 우수한 TARC 생성 억제 효과를 나타내는 것을 확인할 수 있었다.

Claims (3)

  1. 솔잎 추출물을 유산균으로 발효한 발효 추출물을 포함하는 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 유산균은 스트렙토코커스(Streptococcus) 속, 락토코커스(Lactococcus) 속, 엔테로코커스(Enterococcus) 속, 락토바실러스(Lactobacillus) 속, 페디오코커스(Pediococcus) 속, 류코노스톡(Leuconostoc) 속, 비셀라(Weissella) 속 및 비피도박테리움(Bifidobacterium) 속으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 균주인 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 조성물은 보습, 항산화, 피부장벽 강화, 피지조절, 항염, 미백 및 주름개선 효과가 우수한 화장료 조성물.
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